專利名稱：制備包含酪蛋白膠束和富含色氨酸的肽的有包裝的、熱防腐的水性飲品的方法及藉此獲 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備有包裝的經(jīng)熱防腐(例如巴氏滅菌或滅菌)的水性可飲用制品的 方法以及藉此獲得的制品，所述制品包含(例如來(lái)自乳制品的)酪蛋白膠束和肽級(jí)分，所述 肽級(jí)分富含色氨酸。
背景技術(shù)：
近期有多種報(bào)道認(rèn)為，色氨酸被腦吸收時(shí)，對(duì)人的行為、心境、腦功能、腦發(fā)育的若 干方面具有益處。此類報(bào)道的例子是WO 99/55174、WO 00/42868、WO 2005/023017。色氨酸是存在于許多蛋白質(zhì)例如乳清蛋白中的一種氨基酸，動(dòng)物蛋白也含有色氨 酸。色氨酸可以在攝入含有色氨酸的蛋白質(zhì)后被吸收進(jìn)在血中，以及從血吸收進(jìn)腦。然而， 色氨酸不是被吸收的唯一氨基酸，事實(shí)上，當(dāng)攝入平均動(dòng)物蛋白組合物(average animal protein composition)時(shí)，其他氨基酸的競(jìng)爭(zhēng)性吸收，被腦吸收的色氨酸水平由于低至通 常不能觀察到可歸因于色氨酸的顯著效應(yīng)。因此，上文引用的大部分報(bào)道使用富含色氨酸 的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)級(jí)分，或者使用游離氨基酸色氨酸(后者任選地與其他游離氨基酸和/ 或蛋白質(zhì)組合)。色氨酸作為游離氨基酸的用途具有下述缺點(diǎn)許多國(guó)家的食品立法限制在食品中 使用作為游離氨基酸的色氨酸。富含色氨酸的蛋白質(zhì)對(duì)色氨酸水平及其與大的中性氨基酸的比例具有天然的限 制，這與腦對(duì)色氨酸的吸收相關(guān)。最近的觀點(diǎn)是，富含色氨酸的肽可以是在腦中為期望的效應(yīng)得到足夠色氨酸的良 好來(lái)源，并且與游離色氨酸相比其可以更容易地應(yīng)用于食品中。優(yōu)選地，富含色氨酸的此類 肽中下述氨基酸含量低，所述氨基酸是被認(rèn)為吸收進(jìn)入腦的競(jìng)爭(zhēng)較高的氨基酸所謂的大 的中性氨基酸(Large Neutral Amino Acid, LNAA)，它們是亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪 氨酸、苯丙氨酸(取決于LNAA的定義，也可以使用甲硫氨酸)。因此，優(yōu)選地，制造和使用含 有高水平色氨酸并具有高色氨酸/LNAA比例的肽制劑。在本發(fā)明的上下文中，甲硫氨酸被 認(rèn)為不具有任何有益的代謝效應(yīng)，因此就本發(fā)明的目的而言不被認(rèn)為是LNAA之一。WO 02/46210描述了通過(guò)水解例如α-乳白蛋白和選擇性沉淀來(lái)制備色氨酸/ LNAA比例以重量計(jì)至少為0. 3的富含色氨酸的肽的方法。富含色氨酸的肽制劑(例如上文所述的)可用于食品中。這類食品可以是干燥 的，例如點(diǎn)心棒，或者是早餐谷物，或是可以分散/溶解于液體如水或奶中以獲得可飲用制 品的粉末。還期望制造含有色氨酸來(lái)源的液體制品(優(yōu)選地含有屬于富含色氨酸的肽級(jí)分 并具有有益的色氨酸/LNAA比例的色氨酸來(lái)源)，所述液體制品例如是即時(shí)飲用(RTD)的 制品，因?yàn)槔鐨W洲存在以即時(shí)飲用飲料形式提供功能性食物的遞增趨勢(shì)。由于營(yíng)養(yǎng)和/ 或易于配制成被兒童消耗(或可能被兒童消耗)和/或由父母為其兒童購(gòu)買的配制物的原 因，優(yōu)選這類RTD配制物中存在乳組分如酪蛋白膠束。
特別地，對(duì)在口中具有與奶相關(guān)或類似的口感和/或質(zhì)地的這類RTD制品存在需 求，因?yàn)槔鏡TD制品可以兒童(例如年齡6-12歲的學(xué)齡兒童)為目標(biāo)，并且(在一定程 度上)模擬奶(也就是說(shuō)，與例如果汁或軟飲相比與奶更加相似)的制品通常被這類兒童 和/或他們的父母認(rèn)為是有營(yíng)養(yǎng)的制品。盡管可以通過(guò)著色劑和/或調(diào)味劑制造顏色和香 味(并且在目標(biāo)為兒童的奶樣健康飲品中非常常見(jiàn)，如用巧克力、香蕉或草莓調(diào)味)，但是 奶或奶樣飲品的口感較難實(shí)現(xiàn)。還要求優(yōu)選地使沉降物的形成最小化，更優(yōu)選地避免沉降 物形成。盡管可以添加調(diào)味劑，但是優(yōu)選地避免存在經(jīng)烹調(diào)的異味。除了口中的奶樣口感或質(zhì)地以外，還期望RTD是有包裝并(例如通過(guò)熱巴氏滅菌 或熱滅菌)經(jīng)過(guò)熱防腐的。除此之外，還期望制品在生產(chǎn)中顯示最小的沉降，并優(yōu)選地在生 產(chǎn)中完全不顯示沉降。DE 4130284公開(kāi)了制備具有高營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值的蛋白質(zhì)制劑的方法。所述方法公開(kāi)了 用胃蛋白酶水解下述乳清蛋白，并將得到的產(chǎn)物與蛋白質(zhì)例如酪蛋白摻合，所述乳清蛋白 包含富含色氨酸和半胱氨酸(cystein)的α-乳白蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
因此，期望開(kāi)發(fā)出下述RTD(即時(shí)飲用)組合物，所述組合物富含包含色氨酸的肽， 優(yōu)選地富含具有良好的色氨酸/LNAA比例的含色氨酸的肽，所述RTD經(jīng)熱防腐處理，含有酪 蛋白膠束以模擬或?qū)崿F(xiàn)奶或奶樣制品的口感或質(zhì)地，并且所述制品在熱防腐處理(例如熱 巴氏滅菌或熱滅菌)中顯示最小的沉降(少于的12%蛋白質(zhì)沉降，優(yōu)選地小于6%沉降，更 優(yōu)選無(wú)沉降)。因此，優(yōu)選地避免或最小化沉降物的形成。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，發(fā)現(xiàn)至少0.5%酪 蛋白膠束(當(dāng)像在奶中一樣聚集時(shí))的存在能夠至少部分模擬奶或奶樣飲品在口中的口感 和/或質(zhì)地。然而，為了實(shí)現(xiàn)期望的防腐和/或貨架穩(wěn)定性并避免經(jīng)烹調(diào)的異味，優(yōu)選地通 過(guò)熱巴氏滅菌或熱滅菌、最優(yōu)選地通過(guò)UHT滅菌處理進(jìn)行熱防腐處理是必需的。這(至少部分)通過(guò)用于制備下述有包裝的水性液體組合物的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述 組合物包含0.5-4% (干重，基于總液體組合物)的酪蛋白膠束和0. 1-5% (干重，基于總 液體組合物)的具有1-10% (按重量計(jì)，基于含色氨酸的肽)色氨酸水平的含色氨酸的肽 組合物，所述方法涉及以下步驟-獲得包含以下的混合物水(優(yōu)選地以總組合物為基礎(chǔ)按重量計(jì)50-97%)， 0. 5-4% (干重)的酪蛋白膠束和0. 1-5% (干重)的具有1-10% (按重量計(jì)，基于含色氨 酸的肽)色氨酸水平的含色氨酸的肽組合物，-在80_150°C、優(yōu)選地120_150°C下對(duì)所述混合物進(jìn)行熱防腐處理，通過(guò)無(wú)菌包裝 來(lái)包裝藉此獲得的液體制品，其中進(jìn)行了熱防腐處理的混合物的PH低于8. 1并高于下述式 子給出的pH(下式中酪蛋白膠束被表述為基于總配制物的重量％ )pH > 0. 02*T(°C )+0. 23* (以干重％計(jì)的酪蛋白膠束)+3. 8。本發(fā)明還涉及有包裝的經(jīng)熱防腐(優(yōu)選地經(jīng)熱巴氏滅菌或熱滅菌，更優(yōu)選地經(jīng)熱 滅菌)的組合物，所述組合物包含-50-97% (以總組合物為基礎(chǔ)按重量計(jì))的水，-0. 5-4% (干重，基于總液體組合物)的酪蛋白膠束，
-0. 1-5% (干重，基于總液體組合物)的具有1-10% (按重量計(jì)，基于含色氨酸 的肽)色氨酸水平的含色氨酸的肽組合物，所述組合物的PH為6到8. 1，優(yōu)選地為6. 2到 7. 5，更優(yōu)選地為6. 5到7。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，熱防腐處理包含通過(guò)熱巴氏滅菌，或通過(guò)熱滅 菌，最優(yōu)選UHT滅菌處理。還期望在這類RTD配制物中使用的含色氨酸的肽組合物，以及這類色氨酸來(lái)源的 制備方法，所述含色氨酸的肽組合物具有良好的色氨酸水平和良好的色氨酸/LNAA水平 (LNAA表述為酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的總和)。在根據(jù)本發(fā)明的RTD配制物中，含色氨酸的肽組合物優(yōu)選地包含能夠通過(guò)用于生 產(chǎn)下述組合物的方法獲得的含色氨酸的肽，所述組合物包含水溶性含色氨酸的肽、優(yōu)選地 至少兩種水溶性含色氨酸的肽，并優(yōu)選地具有多于0. 15、優(yōu)選地在0. 15和1. 8之間的色氨 酸/LNAA比例，所述方法包括水解溶菌酶，優(yōu)選地水解雞卵溶菌酶，以制備具有5和45之 間DH的水解產(chǎn)物，以及任選地去除部分含精氨酸或賴氨酸的肽。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的RTD 配制物中的此類含色氨酸的肽包含AW或GNW，更優(yōu)選地包含AW和GNW。所述水解產(chǎn)物優(yōu)選 地具有10和40之間的DH。在根據(jù)本發(fā)明的RTD配制物中，含色氨酸的肽組合物優(yōu)選地是包含至少兩種不同 的水溶性肽的組合物形式，并且其中所述組合物的色氨酸/LNAA比例至少為0. 15，優(yōu)選地 在0. 15和1. 8之間。優(yōu)選地，所述含色氨酸的肽組合物包含AW或GNW，優(yōu)選地AW和GNW， 最優(yōu)選地AW和GNW并且其中AW與GNW的摩爾比例在1 2到10 1之間，優(yōu)選地在 1 2和5 1之間。因此，在本發(fā)明的配制物中，含色氨酸的肽組合物優(yōu)選地是富含色氨 酸的水溶性肽的組合物。有利地，在本發(fā)明的RTD配制物中，含色氨酸的肽組合物優(yōu)選地 包含至少兩種不同的二肽或三肽，其中選自二肽或三肽的兩種肽以二肽和三肽總量的至少 5mol %的量存在，并且在含色氨酸的肽組合物中，與肽結(jié)合的色氨酸中多于30mol %，優(yōu)選 地多于40mol %，更優(yōu)選地多于50mol %，進(jìn)一步更優(yōu)選地多于60mol %，仍然更優(yōu)選地多于 70mol %和最優(yōu)選地多于SOmol %以二肽或三肽的形式存在，優(yōu)選地所述含色氨酸肽組合物 具有多于0. 15，優(yōu)選地在0. 15和1. 8之間的色氨酸/LNAA比例。與肽結(jié)合的色氨酸表示作 為肽中氨基酸存在的色氨酸。優(yōu)選地在根據(jù)本發(fā)明的RTD配制物中使用的含色氨酸的肽組合物優(yōu)選地是溶菌 酶水解產(chǎn)物或經(jīng)純化的溶菌酶水解產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述溶菌酶水解產(chǎn)物特別富含精氨酸殘 基。精氨酸不屬于大的中性氨基酸(LNAA)類，但其胰島素刺激作用是已知的。已發(fā)現(xiàn)本 文公開(kāi)的水解產(chǎn)物能夠產(chǎn)生體內(nèi)高血漿色氨酸/LNAA比例。發(fā)現(xiàn)在血漿中檢測(cè)的色氨酸/ LNAA比例高于水解產(chǎn)物的色氨酸/LNAA比例。本文所述的含色氨酸的肽組合物的又一個(gè)優(yōu) 點(diǎn)是含色氨酸的肽非常小，使得甚至與具有較不利的色氨酸/LNAA比例的富含蛋白質(zhì)的制 品組合時(shí)，水解產(chǎn)物仍可立即產(chǎn)生高血漿色氨酸/LNAA比例。這使得這類含色氨酸的肽組 合物良好地適用于本發(fā)明的配制物。本發(fā)明配制物中使用的含色氨酸的肽組合物可還包含 游離的色氨酸。優(yōu)選地，含色氨酸的肽組合物的水解產(chǎn)物不含有多于(以干物質(zhì)計(jì)) 的游離色氨酸。發(fā)明詳述非常令人驚訝的是，為了避免沉降物形成而在熱防腐處理之前需要的pH不僅取決于酪蛋白膠束(或其來(lái)源)的存在或不存在，也取決于這類酪蛋白膠束的濃度。不希望 受任何理論束縛的情況下，我們相信這一點(diǎn)和變量(variables)導(dǎo)致對(duì)pH要求的相對(duì)復(fù) 雜性。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，要進(jìn)行熱防腐(如例如巴氏消毒、消毒例如UHT處理)的 混合物的PH應(yīng)當(dāng)在一定界限內(nèi)。根據(jù)所選擇的成分，pH可以已然處于期望的范圍內(nèi)，但是 在許多情況下需要將要進(jìn)行熱防腐(例如巴氏消毒或消毒，優(yōu)選地UHT處理)的物質(zhì)的pH 調(diào)節(jié)至上述數(shù)值。這類調(diào)節(jié)可以通過(guò)任何合適的手段實(shí)現(xiàn)，例如在熱防腐(優(yōu)選地通過(guò)熱 巴氏滅菌或熱滅菌，最優(yōu)選地通過(guò)UHT滅菌)步驟前通過(guò)對(duì)例如要熱防腐(優(yōu)選地巴氏滅 菌或滅菌，最優(yōu)選地UHT滅菌)的混合物或所述混合物中使用的一種或多種組分添加堿或 緩沖劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。UHT滅菌在本文中應(yīng)當(dāng)如本領(lǐng)域所已知地理解溫度在120-150°C的范圍 內(nèi)，時(shí)間長(zhǎng)度足以實(shí)現(xiàn)至少3、優(yōu)選地至少5的Ftl值。根據(jù)酪蛋白膠束的濃度和熱防腐處理溫度(例如UHT條件)，進(jìn)行熱防腐(優(yōu)選地 UHT滅菌)處理的混合物的pH優(yōu)選地在6. 2到7. 5之間，優(yōu)選地在6. 5到7之間。在根據(jù)本發(fā)明的方法和制品中，組合物優(yōu)選地包含0.5-3% (干重，基于總液體組 合物)的酪蛋白膠束，優(yōu)選地包含0. 6-2%的酪蛋白膠束。還優(yōu)選的是6. 2到7. 5、優(yōu)選地6. 5到7的pH與0. 5-3% (干重，基于總液體組合 物)、優(yōu)選地0. 6-2%的酪蛋白膠束濃度的組合。在本發(fā)明中特別優(yōu)選的是6. 5到7的pH 與0.5-2%、進(jìn)一步更優(yōu)選地0.6-2% (干重，基于總液體組合物)的酪蛋白膠束濃度的組合。在根據(jù)本發(fā)明的方法和制品中，組合物優(yōu)選地還包含0.01-0. 1% (優(yōu)選地0.01 到0. 08%，更優(yōu)選地0. 02到0. 05%，以總組合物為基礎(chǔ)按重量計(jì))的選自下組的增稠膠 質(zhì)，所述組由角叉菜膠、刺槐豆膠、瓜爾膠、塔拉膠或其混合物構(gòu)成，因?yàn)檫@可進(jìn)一步支持口 中的口感和/或質(zhì)地接近奶或乳制品(也就是說(shuō)，比例如果汁或軟飲更接近奶或乳制品)。 在這一方面，以所述濃度使用角叉菜膠是最優(yōu)選的。還優(yōu)選在本發(fā)明的方法和組合物中使 用0. 01-0. 1% (優(yōu)選地0. 01到0. 08%，更優(yōu)選地0. 02到0. 05%，以總組合物為基礎(chǔ)按重 量計(jì))的選自下組的增稠膠質(zhì)，所述組由角叉菜膠、刺槐豆膠、瓜爾膠、塔拉膠或其混合物 構(gòu)成(優(yōu)選角叉菜膠)，與要滅菌的混合物和/或RTD配制物的6. 2到7. 5、優(yōu)選地6. 5到 7的pH和/或0. 5-3% (干重，基于總液體組合物)、優(yōu)選地0. 6-2%的酪蛋白膠束的酪蛋 白膠束濃度組合，特別是與(要滅菌的混合物和/或終產(chǎn)物)的6.5到7的pH和0. 5-2%, 進(jìn)一步更優(yōu)選地0.6-2% (干重，基于總液體組合物)的酪蛋白膠束濃度組合。除了或代替 上文所述選自角叉菜膠、刺槐豆膠、瓜爾膠、塔拉膠或其混合物構(gòu)成(優(yōu)選角叉菜膠)的組 的膠質(zhì)的使用或存在，組合物可包含0. 5-5% (優(yōu)選地0. 5-3%、更優(yōu)選地0. 8-2%，以總組 合物為基礎(chǔ)按重量計(jì))的淀粉或淀粉衍生物或淀粉水解產(chǎn)物，優(yōu)選地，麥芽糖糊精。其中， 這些范圍的下限更適用于淀粉，而麥芽糖糊精可以在更大范圍使用。淀粉或淀粉衍生物或 水解產(chǎn)物如麥芽糖糊精的存在可因?yàn)榕c上文公開(kāi)的膠質(zhì)應(yīng)用相同的原因而是優(yōu)選的，并同 樣與優(yōu)選的PH范圍和/或酪蛋白膠束濃度組合。酪蛋白膠束可以來(lái)自任何合適的來(lái)源，例如來(lái)自濃縮奶、奶、奶粉、脫脂奶粉、酪乳 (butter milk)、酪乳粉、奶蛋白質(zhì)濃縮物、奶蛋白質(zhì)分離物和/或其混合物。經(jīng)熱防腐(優(yōu)選地經(jīng)UHT處理)的制品要被無(wú)菌包裝，這可以是任何合適的包裝，優(yōu)選地這類包裝是Tetrapak、DOY包(囊)、瓶、袋或罐。優(yōu)選地用于本發(fā)明RTD配制物中的含色氨酸的肽組合物提供了包含以肽形式存 在的色氨酸的組合物，所述組合物非常適用于在非常短的時(shí)間間隔內(nèi)給予血漿中色氨酸/ LNAA比例的有效提高。含色氨酸的二肽和三肽有利地有助于這一提高。在本發(fā)明RTD配 制物中含色氨酸的肽組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，在工業(yè)工藝中酶促(預(yù))水解溶菌酶，優(yōu)選 地雞卵溶菌酶，即優(yōu)選地以水解產(chǎn)物的形式提供(雞卵)溶菌酶。以水解產(chǎn)物形式提供時(shí)， 含色氨酸的肽的胃腸道吸收被大幅促進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，對(duì)用于本發(fā)明RTD配制物的 含色氨酸的肽組合物而言，雞卵溶菌酶被轉(zhuǎn)化成下述水解產(chǎn)物，其中包含帶正電的精氨酸 和賴氨酸殘基的肽水平被降低。后一水解產(chǎn)物的一個(gè)特征是分子的色氨酸/LNAA比例高于 0. 15。在包含優(yōu)選的含色氨酸的肽組合物的本發(fā)明RTD配制物的又一個(gè)實(shí)施方案中，雞卵 溶菌酶被轉(zhuǎn)化成包含下述肽的群(P印tide population)的水解產(chǎn)物，所述肽的群中存在的 多于50%、優(yōu)選地多于60%、更優(yōu)選地多于75%的肽具有低于500Da的分子量。這樣的前 提是水解產(chǎn)物中存在的肽的分子量分布分析如本申請(qǐng)的材料和方法章節(jié)中所述進(jìn)行。關(guān)于 優(yōu)選的(至少0. 15的)色氨酸/LNAA比例水解產(chǎn)物的氨基酸分析如本申請(qǐng)的材料和方法 章節(jié)中所述進(jìn)行?！暗鞍踪|(zhì)”或“多肽”在本文中被定義為包含多于30個(gè)氨基酸殘基的鏈?！半摹被颉肮央摹痹诒疚闹斜欢x為通過(guò)肽鍵連接的至少兩個(gè)氨基酸的鏈。術(shù)語(yǔ)“肽” 和“寡肽”被認(rèn)為是同義的(如通常所認(rèn)為的那樣)，且每種術(shù)語(yǔ)可根據(jù)上下文的需要交換使用?！八苄浴彪氖窃?. 0的pH下可溶于水的肽。本文中所有(寡)肽和多肽式根據(jù)通常的實(shí)踐從左到右以氨基端到羧基端的方 向書寫。本文中使用的氨基酸的單字母密碼是本領(lǐng)域通常已知的，并可見(jiàn)于Sambrook，et al. (Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989)中。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、水解產(chǎn)物或經(jīng)水解的蛋白質(zhì)表示通過(guò)蛋白質(zhì)的酶水解形成的產(chǎn) 物，富集的水解產(chǎn)物是下述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物級(jí)分，其例如富含選定的肽，或其中肽或多肽已 從水解產(chǎn)物中被去除。因此，富集的水解產(chǎn)物優(yōu)選地是肽的混合物(或肽混合物)。因此， 本發(fā)明的肽混合物是至少兩種，優(yōu)選地至少三種，更優(yōu)選地至少四種含色氨酸的肽的混合 物。更優(yōu)選地，混合物包含肽的群，所述群的多于50%、優(yōu)選地甚至多于60%、最優(yōu)選地多 于75%的存在的肽具有低于500Da的分子量。含色氨酸的肽表示包含至少一個(gè)L-色氨酸 氨基酸殘基的肽。色氨酸/LNAA比例表示色氨酸相對(duì)于其它大的中性氨基酸(LNAA ；即酪氨 酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的總和)水平的摩爾比例。除了血漿色氨酸/LNAA 比例外，色氨酸/LNAA比例僅涉及與肽結(jié)合的氨基酸。因此，游離的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸不被考慮進(jìn)色氨酸/LNAA比例中。與肽結(jié)合的氨基酸是屬于肽部分的氨基酸，并且不是游離的氨基酸。Tyr/LNAA比例表示酪氨酸相對(duì)于支鏈氨基酸(BCAA ；即亮氨酸、異亮氨酸和纈氨 酸的總和)水平的摩爾比例。優(yōu)選地，Tyr/BCAA比例高于0. 1，優(yōu)選地高于0. 12。本發(fā)明RTD配制物中優(yōu)選地使用的含色氨酸的肽組合物可以通過(guò)本文公開(kāi)的方 法生產(chǎn)，具有以蛋白質(zhì)色氨酸為基礎(chǔ)多于30%的色氨酸產(chǎn)率，并產(chǎn)生包含色氨酸的水溶性肽組合物。色氨酸殘基的較大部分包含在二肽和三肽中這一事實(shí)暗示立即吸收進(jìn)血流中。 本發(fā)明RTD配制物中優(yōu)選地使用的含色氨酸的肽組合物也可以產(chǎn)生比實(shí)際的水解產(chǎn)物的 色氨酸/LNAA比例更高的血漿色氨酸/LNAA比例。最后，在本發(fā)明的RTD配制物中優(yōu)選地 使用的含色氨酸的肽組合物還有抗原性非常低的特征。在本發(fā)明的RTD配制物中優(yōu)選地使用的含色氨酸的肽組合物中，雞卵溶菌酶被優(yōu) 選地用作便利的底物，用于提供具有高色氨酸/LNAA比例的制劑。溶菌酶以3-4%的濃度 存在于卵白中。通過(guò)利用其格外高的等電點(diǎn)，使用簡(jiǎn)單的陽(yáng)離子色譜純化步驟將其從卵白 中工業(yè)分離。得到的產(chǎn)物幾乎是純的，并且該工業(yè)可獲得的產(chǎn)物具有7. 8%的分子色氨酸 含量和至少0.15的分子色氨酸/LNAA比例。因此，純?nèi)芫妇哂斜燃儲(chǔ)?乳白蛋白和/或 β-乳白蛋白更高的色氨酸/LNAA比例。因此，用于優(yōu)選地在本發(fā)明RTD配制物中使用的 含色氨酸的肽組合物的溶菌酶水解產(chǎn)物(以及優(yōu)選地用于RTD配制物中的含色氨酸的肽組 合物自身)優(yōu)選地具有高于0. 15的摩爾色氨酸/LNAA比例，更優(yōu)選地色氨酸/LNAA比例高 于0. 20，進(jìn)一步更優(yōu)選地色氨酸/LNAA比例高于0. 23，仍然更優(yōu)選地色氨酸/LNAA比例高 于0. 25，最優(yōu)選地色氨酸/LNAA比例高于0. 30。通常，摩爾色氨酸/LNAA比例低于3. 0。同 樣，這類溶菌酶代表了含色氨酸的肽或組合物的優(yōu)選的起點(diǎn)。溶菌酶(EC3. 2. 1. 17)是能夠 水解細(xì)菌細(xì)胞壁中特異肽聚糖鍵，導(dǎo)致細(xì)胞裂解的酶。如果被摻入以例如乳制品為代表的含高蛋白質(zhì)的食物基質(zhì)中，優(yōu)選地用于本發(fā)明 RTD配制物中含色氨酸的肽組合物的水解產(chǎn)物也是有效的。這是非常驚人的，因?yàn)楹鞍踪|(zhì) 的食物基質(zhì)表現(xiàn)出高LNAA負(fù)荷，并因此可被期望為降低具有高色氨酸/LNAA比例制品的作 用。對(duì)這種預(yù)料之外的現(xiàn)象的一種可能的解釋是通常的食物制品摻入了完整的而不是充 分水解的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的含色氨酸肽組合物中摻入色氨酸和酪氨酸的肽中的大部分具有低 于500Da的分子量。考慮到色氨酸(MW = 186)和酪氨酸(MW = 163)的非常高的分子量和 只存在非常低水平的游離色氨酸，意味著這些肽中大部分應(yīng)該是三肽或二肽。通過(guò)一種優(yōu)選的方式，溶菌酶，優(yōu)選地雞卵溶菌酶在工業(yè)過(guò)程中被酶(預(yù))水解， 即(雞卵)溶菌酶優(yōu)選地以水解產(chǎn)物或富集的水解產(chǎn)物形式提供。以這類(富集的)水解 產(chǎn)物形勢(shì)提供時(shí)，極大地便利了含色氨酸的肽的腸吸收。在本申請(qǐng)的另一實(shí)施方案中，雞卵 溶菌酶被轉(zhuǎn)化為包含色氨酸的水解產(chǎn)物或富集的水解產(chǎn)物，其包含下述肽的群，其中存在 的肽中多于50 %、優(yōu)選地多于60 %、更優(yōu)選地多于75 %具有低于500Da的分子量。優(yōu)選地， 這類(富集的)水解產(chǎn)物不含有多于(以干物質(zhì)計(jì))的游離色氨酸。存在于水解產(chǎn) 物中包含色氨酸的肽的分子量分析如材料和方法章節(jié)中所述進(jìn)行。還可優(yōu)選地，對(duì)優(yōu)選地在本發(fā)明的RTD配制物中使用的含色氨酸的肽組合物而 言，(雞卵)溶菌酶水解產(chǎn)物被分級(jí)分離，從而提高水解產(chǎn)物級(jí)分的色氨酸含量。該級(jí)分或 富集的水解產(chǎn)物與分級(jí)分離前的水解產(chǎn)物相比優(yōu)選地具有提高的色氨酸/LNAA比例。水解 產(chǎn)物或具有額外的游離色氨酸的經(jīng)富集的水解產(chǎn)物的富集，這也形成了本發(fā)明的部分。在 制備這類經(jīng)富集的水解產(chǎn)物的一個(gè)優(yōu)選的選項(xiàng)中，利用了下述觀察結(jié)果溶菌酶摻入罕見(jiàn) 大量的堿性精氨酸和賴氨酸殘基。驚人地，作為選擇的酶孵育條件(即選擇具有正確切割 偏好的內(nèi)切蛋白酶如枯草桿菌蛋白酶，與產(chǎn)生高粱二肽和三肽的孵育條件組合，所述二肽 和三肽摻入色氨酸但是幾乎沒(méi)有精氨酸或賴氨酸殘基)的結(jié)果，能夠生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的富 集的溶菌酶水解產(chǎn)物。因此，摻入精氨酸或賴氨酸殘基的含LNAA的肽能夠從不具有這類堿性殘基的含色氨酸的肽中分離。例如，通過(guò)將水解產(chǎn)物的PH調(diào)節(jié)至4和6之間、更優(yōu)選地 5. 0和5. 5之間的數(shù)值，不具有這類堿性殘基的肽會(huì)不帶電荷，并因而具有降低的親水性。 這些特征可例如在色譜或其它分離過(guò)程中使用，以選擇性地去除大部分含精氨酸或賴氨酸 的肽。因此，含色氨酸的肽的含量被顯著提高，并任選地提高了該富集的水解產(chǎn)物的色氨 酸/LNAA比例?？赏ㄟ^(guò)已知的技術(shù)，如離子色譜、疏水作用色譜或電滲析，來(lái)去除帶電的摻 入精氨酸或賴氨酸的肽。在相關(guān)肽的層析分離中使用這類特征的實(shí)踐背景可見(jiàn)于a. ο. the Protein Purification Handbook(issued by Amersham Pharmacia Biotech,nowadays GE Healthcare Bio-Sciences, Diegem, Belgium)。在朝向下述制劑的進(jìn)一步更先進(jìn)的純化途 徑中，有利地使用溶菌酶中帶有酸性側(cè)基的氨基酸如谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)殘基 的存在，所述制劑將高色氨酸含量與高色氨酸/LNAA比例結(jié)合。在該途徑中，根據(jù)本發(fā)明的 溶菌酶水解產(chǎn)物的PH首先被調(diào)節(jié)至3. 0，然后在陽(yáng)離子樹(shù)脂上進(jìn)行色譜。在該pH值下，摻 入Glu或Asp的肽會(huì)通過(guò)柱，其它肽則會(huì)結(jié)合。隨后用pH 5緩沖液的洗脫會(huì)解吸附如所述 的不含賴氨酸或精氨酸殘基的所有結(jié)合的肽。大部分含有色氨酸的肽會(huì)在經(jīng)解吸附的該級(jí) 分中。然后通過(guò)用具有甚至更高PH值的緩沖液洗脫，從柱上去除剩余的結(jié)合肽。盡管對(duì)于優(yōu)選地在本發(fā)明的RTD配制物中使用的含色氨酸的肽組合物的制備而 言，優(yōu)選地使用離子交換色譜和/或疏水作用色譜，但是也可使用其它合適的色譜分離方 法，包括親和色譜和尺寸排除色譜?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法完成從得到的水性級(jí)分中回 收富含色氨酸的肽。為了獲得濃縮的和保質(zhì)期穩(wěn)定的產(chǎn)物，回收優(yōu)選地包括蒸發(fā)和(噴霧) 干燥步驟。另外，之后是蒸發(fā)/沉淀步驟的納米過(guò)濾和涉及有機(jī)溶劑的萃取過(guò)程代表了對(duì) 期望的純化的選項(xiàng)。優(yōu)選地通過(guò)蒸發(fā)溶劑進(jìn)行從有機(jī)溶劑中回收富含色氨酸的肽。盡管事實(shí)上溶菌酶在生理?xiàng)l件(即在酸性pH下使用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白 酶作為蛋白酶)下顯示高度抵抗蛋白水解，但是在這類較不優(yōu)良的酸性條件下也可獲得優(yōu) 選地在本發(fā)明的RTD配制物中使用的溶菌酶水解產(chǎn)物。然而，在這類條件下需要相對(duì)苛刻 的孵育條件，例如高得多的酶濃度、更高的溫度和任選地額外的內(nèi)切蛋白酶。發(fā)現(xiàn)通過(guò)在堿 性PH下用枯草桿菌蛋白酶孵育溶菌酶獲得的溶菌酶水解產(chǎn)物尤其富含Ala-Trp (AW) 二肽。 該發(fā)現(xiàn)提出化學(xué)合成的AW 二肽可能為本發(fā)明溶菌酶水解產(chǎn)物提供合適的備選方案。盡管 合成的二肽的使用具有明顯的立法缺點(diǎn)，但是重要的優(yōu)點(diǎn)是其成本有效性及其理想的Trp/ LNAA比例。材料和方法材料商品名為‘Trotex 6L”的枯草桿菌蛋白酶得自Genencor (Leiden，荷蘭)，胃蛋白 酶來(lái)自Sigma且胰蛋白酶/糜蛋白酶(Porcine PEM)來(lái)自Novozymes (Bagsvaerd，丹麥)。 溶菌酶作為 Delvozyme L(22%干物質(zhì))從 DSM Food Specialities (Delft，荷蘭)獲得。SDS-PAGE通過(guò)SDS-PAGE檢查使用的溶菌酶制劑的純度。用于SDS-PAGE和染色的所有材料 均購(gòu)自^witrogen (Carload，CA，US)。使用SDS緩沖液根據(jù)制造商的說(shuō)明制備樣品，并使 用MES-SDS緩沖體系根據(jù)制造商的說(shuō)明在12% Bis-Tris凝膠上分離。使用Simply Blue Safe Stain(Collodial Coomassie G250)進(jìn)行染色。水解前，溶菌酶在凝膠上作為具有約 14kDa分子量的單一條帶出現(xiàn)。
LC/MS/MS 分析使用HPLC測(cè)定通過(guò)本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的酶蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中含色氨酸的肽(主 要是二肽或三肽)的存在，所述HPLC使用與P4000泵(Thermo Electron, Breda，荷蘭) 偶聯(lián)的離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Electron，Breda，荷蘭)。使用 Inertsil 3 ODS 3,3ym, 150*2. Imm 柱(Varian Belgium, Belgium)，與 Milli Q 水(Millipore，Bedford, MA, USA) 中0. 甲酸(溶液Α)和乙腈中0. 甲酸(溶液B)的梯度組合用于洗脫，來(lái)分離形成的 肽。所述梯度從100%溶液A開(kāi)始，保持10分鐘，在25分鐘內(nèi)線性化提高至20% B，立即 進(jìn)入起始條件，并保持15分鐘用于穩(wěn)定。使用的注射體積為50微升，流速為每分鐘200微 升，柱溫度維持在55°C。注射的樣品的蛋白質(zhì)濃度約為50微克/毫升。以滯留時(shí)間、質(zhì)子 化的分子為基礎(chǔ)，并通過(guò)使用對(duì)感興趣的肽專用的MS/MS，使用約30 %的最適碰撞能量，鑒 定感興趣的肽。通過(guò)使用外標(biāo)法進(jìn)行含色氨酸的特異肽的定量。使用四肽VVPP(M = 410. 2)調(diào)節(jié)MS模式中的最優(yōu)靈敏度和MS/MS模式中的最優(yōu) 斷裂(fragmentation)，進(jìn)行5 μ g/ml的恒量輸注，得到MS模式中的質(zhì)子化分子和MS/MS模 式中約30%的最優(yōu)碰撞能量，產(chǎn)生B-離子和Y-離子系列。在LC/MS/MS之前，在室溫和13000rpm下將酶蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物離心10分鐘，并用 濾經(jīng)Millipore水過(guò)濾裝置的去礦物質(zhì)水(MilliQ水)以1 100稀釋上清液。水解稈度使用快速 OPA 測(cè)試(Nielsen, P. M. ；Petersen, D. ；Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. Journal of Food Science 2001, 66,642-646)，監(jiān)測(cè)用多種水解混合物孵育期間獲得的水解程度(DH)?？耸隙ǖ?KjeldahlNitrogenl通過(guò)流動(dòng)注射分析(Flow Injection Analysis)測(cè)量總克氏氮。使用Tecator FIASTAR 5000流動(dòng)注射體系，在590nm處定量從含蛋白質(zhì)的溶液中釋放的氨，所述體系裝 備有 TKN Method Cassette 5000-040、具有 SOFIA 軟件的 Pentium 4 計(jì)算機(jī)，和 Tecator 5027自動(dòng)采樣器。將對(duì)應(yīng)于本發(fā)明動(dòng)態(tài)范圍(0. 5-20mg Ν/1)的樣品量與95-97%硫酸和 Kjeltab 一起置于消化管中，并進(jìn)行200°C下30分鐘隨后360°C下90分鐘的消化程序。注 射進(jìn)FIASTAR 5000體系中后，測(cè)量氮峰，從中可推理出被測(cè)量的蛋白質(zhì)量。ymrm^^mmm&mm^t^在自動(dòng)HPLC體系上完成經(jīng)蛋白酶處理的蛋白質(zhì)樣品的肽大小分布分析，所述體 系裝備有高壓泵、能夠注射10-100微升樣品的注射設(shè)備，和能夠在214nm監(jiān)測(cè)柱流出物的 UV檢測(cè)器。用于該分析的柱是用20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉pH 7. 0緩沖液平衡的Superdex Peptide HR 10/300GL(Amersham)。注射樣品(典型地為50微升)后，在90分鐘內(nèi)以.5ml/ min的流速用緩沖液從柱中洗脫多種組分。使用細(xì)胞色素C(Mw 13 500Da)、抑肽酶(Mw 6510Da)和四甘氨酸(Mw 246Da)的混合物作為分子量標(biāo)記物校準(zhǔn)該體系。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法和RTD配制物中，含色氨酸的肽組合物優(yōu)選地包含色 氨酸與LNAA的(重量)比例至少為0. 1、優(yōu)選地至少為0. 15、更優(yōu)選地為0. 15-1. 8的肽組 合物，并且優(yōu)選地通過(guò)下述方法獲得，所述方法包括水解溶菌酶(更優(yōu)選地雞卵溶菌酶)， 以制備DH在5和45之間的水解產(chǎn)物，以及任選地去除部分含精氨酸或賴氨酸的肽。其中，
11含色氨酸的肽組合物優(yōu)選地包含AW或GNW，優(yōu)選地包含AW和GNW (其中所述AW與GNW的摩 爾比例優(yōu)選地在1 2和10 1之間，更優(yōu)選地在1 2和5 1之間)。考慮上文，還優(yōu)選在根據(jù)本發(fā)明的方法和RTD配制物中，含色氨酸的肽組合物包 含色氨酸與LNAA的(重量)比例至少為0. 1、優(yōu)選地至少為0. 15、更優(yōu)選地為0. 15-1. 8的 肽組合物，并且優(yōu)選地通過(guò)下述方法獲得，所述方法包括水解溶菌酶(更優(yōu)選地雞卵溶菌 酶)，以制備DH在5和45之間的水解產(chǎn)物，并任選地去除部分含精氨酸或賴氨酸的肽，和/ 或優(yōu)選地，含色氨酸的肽組合物優(yōu)選地包含AW或GNW，更優(yōu)選地包含AW和GNW，其中AW與 GNW的摩爾比例優(yōu)選地在1 2和10 1之間，更優(yōu)選地在1 2和5 1之間)，并且所 述組合物還包含0. 01-0. 1 % (優(yōu)選地0. 01到0. 08%，更優(yōu)選地0. 02到0. 05%，以總組合 物為基礎(chǔ)按重量計(jì))的選自下組的增稠膠，所述組由角叉菜膠、刺槐豆膠、瓜爾膠、塔拉膠 或其混合物構(gòu)成，因?yàn)檫@可進(jìn)一步支持口中的口感和/或質(zhì)地接近奶或乳制品(也就是說(shuō)， 比例如果汁或軟飲更接近奶或乳制品)。在這一方面，以所述濃度使用角叉菜膠是最優(yōu)選 的。還優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物中使用包含下述肽組合物的含色氨酸的 肽組合物，所述肽組合物的色氨酸與LNAA的(重量)比例至少為0. 1、優(yōu)選地至少為0. 15、 更優(yōu)選地為0. 15-1. 8的肽組合物，并可通過(guò)下述方法獲得，所述方法包括水解溶菌酶，與 6. 2到7. 5、優(yōu)選地6. 5到7的要熱防腐(優(yōu)選地滅菌)的混合物和/或RTD-配制物的pH 和/或與0. 5-3% (干重，基于總液體組合物)的酪蛋白膠束、優(yōu)選地0. 6-2%的酪蛋白膠束 濃度組合，特別是與6. 5到7的pH和0. 5-2 %、進(jìn)一步更優(yōu)選地0. 6-2 % (干重，基于總液體 組合物)的酪蛋白膠束濃度組合。除了或代替上文所述選自角叉菜膠、刺槐豆膠、瓜爾膠、 塔拉膠或其混合物組成(優(yōu)選角叉菜膠)的組的膠質(zhì)的使用或存在，組合物可包含0. 5-5% (優(yōu)選地0. 5-3%、更優(yōu)選地0. 8-2%，以總組合物為基礎(chǔ)按重量計(jì))的淀粉或淀粉衍生物或 淀粉水解產(chǎn)物，優(yōu)選地為麥芽糖糊精。其中，這些范圍的下限(0.5-2% )更適用于淀粉，而 麥芽糖糊精可以在更大范圍(0. 5-5% )使用。淀粉或淀粉衍生物或水解產(chǎn)物如麥芽糖糊精 的存在可因?yàn)榕c上文公開(kāi)的膠質(zhì)應(yīng)用相同的原因而是優(yōu)選的。在根據(jù)本發(fā)明的方法和根據(jù)本發(fā)明的RTD中，優(yōu)選含色氨酸的肽制劑包含選自二 肽或三肽的至少兩種不同的肽，其中選自二肽或三肽的兩種肽各自以二肽和三肽總量的至 少5m0l%的量存在，并且其中總色氨酸的多于30mOl%作為與肽結(jié)合的色氨酸存在，優(yōu)選 地多于40mo 1 %、更優(yōu)選地多于50mo 1 %、甚至更優(yōu)選地多于60mo 1 %、仍然更優(yōu)選地多于 70mol %和最優(yōu)選地多于SOmol %的與肽結(jié)合的色氨酸以二肽或三肽的形式存在，優(yōu)選地所 述組合物具有多于0. 15的、優(yōu)選地在0. 15和1. 8之間的色氨酸/LNAA比例。在這一方法 和RTD配制物中，優(yōu)選地，這類含色氨酸的肽配制物優(yōu)選地通過(guò)包括水解溶菌酶(更優(yōu)選地 雞卵溶菌酶，以制備DH在5和45之間的水解產(chǎn)物，并任選地去除部分含精氨酸或賴氨酸的 肽，和/或優(yōu)選地含色氨酸的肽組合物優(yōu)選地包含AW或GNW，更優(yōu)選地包含AW和GNW，其中 所述AW與GNW的摩爾比優(yōu)選地在1 2和10 1之間，更優(yōu)選地在1 2和5 1之間) 的方法獲得。本發(fā)明還涉及包含本文公開(kāi)的RTS配制物的食物、寵物食物、飼料、膳食補(bǔ)充劑或 營(yíng)養(yǎng)藥物組合物和/或腸組合物。以下的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1使用ftx)tex水解溶菌酶并鑒定形成的肽。使用NaOH將含10% (w/w)純?nèi)芫傅娜芤赫{(diào)節(jié)至pH 8. 2，并加熱至52°C。通過(guò) 添加25微升I^otex/g存在的蛋白質(zhì)開(kāi)始水解。在連續(xù)的攪拌下和將pH維持于8. 2時(shí)，將 水解持續(xù)5. 5小時(shí)，得到?jīng)]有可見(jiàn)沉淀物的幾乎澄清的溶液。在用于失活ftOtex活性的加 熱步驟后，取樣用于DH分析。溶液的DH顯示約為30%。在IOkDa濾器上超濾經(jīng)熱處理的 溶液，得到完全澄清的液體。該澄清液體被用于LC/MS分析，用于存在的肽和蛋白質(zhì)的分子 量分布分析，以及用于離子交換色譜。為了得到存在的肽和蛋白質(zhì)的分子量分布的印象，按照材料和方法章節(jié)中所述對(duì) 澄清的液體進(jìn)行分子量分析。獲得的結(jié)果清楚地表明幾乎所有摻入帶有芳香族側(cè)鏈的氨基 酸(即色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的肽具有低于500kDa的分子量?？紤]到這些氨基酸的 高分子量，意味著大部分這些小肽是三肽或二肽。根據(jù)材料和方法章節(jié)中所述步驟進(jìn)行LC/MS分析。通過(guò)選擇這些含有色氨酸 (“W”)的肽，可以檢測(cè)肽 AW、GNW、WIR、NAW、WVA、VAW、AWR、SLGNW 和小量 Wff 和 SRffff。孵育 后水解產(chǎn)物中游離色氨酸的水平被確立為代表少于的存在的總(溶菌酶)色氨酸。因?yàn)槎暮腿娜菀妆荒c壁中存在的肽運(yùn)載體吸收，所以在口服攝入本發(fā)明的溶 菌酶水解產(chǎn)物后，這類肽中存在的色氨酸殘基會(huì)被快速吸收并導(dǎo)致提高的血漿色氨酸水平 幾乎是沒(méi)有疑問(wèn)的。實(shí)施例2提高水解產(chǎn)物的色氨酸含量。溶菌酶摻入了驚人的大量堿性精氨酸和賴氨酸殘基。另外，溶菌酶分子摻入了顯 著量的酸性谷氨酸和天冬氨酸殘基。該數(shù)據(jù)已被用于設(shè)計(jì)朝向具有高色氨酸/LNAA比例的 水解產(chǎn)物的創(chuàng)新和優(yōu)良的純化途徑。然而，該純化途徑的關(guān)鍵需求是，在還含有精氨酸或 賴氨酸殘基或谷氨酸或天冬氨酸殘基任一的肽中，僅出現(xiàn)非常少的色氨酸殘基。如實(shí)施例 1中所示，本文使用的特異水解途徑僅產(chǎn)生很少的含有精氨酸殘基的含色氨酸的肽，并且不 產(chǎn)生含有賴氨酸、谷氨酸或天冬氨酸殘基的肽。理論預(yù)測(cè)，在pH 3左右能夠達(dá)到含和不含谷氨酸或天冬氨酸殘基的肽之間的最 大電荷差異。在PH 5左右能夠達(dá)到含和不含精氨酸或賴氨酸殘基的肽之間的最大電荷差異。為了闡述該途徑的選擇能力，根據(jù)實(shí)施例1中說(shuō)明的步驟制備溶菌酶水解產(chǎn)物。 然后使用乙酸將水解產(chǎn)物的pH調(diào)節(jié)至pH 3. 1，并將約0. 5克蛋白質(zhì)應(yīng)用在用20mm檸檬酸 鈉 pH 3. 1 平衡的 SP Sepharose FF (GE Healthcare, Diegem, Belgium)柱的 15ml 柱床體積 上。用一倍柱體積的檸檬酸鈉緩沖液洗滌柱，去除摻有谷氨酸或天冬氨酸的大部分肽后，將 洗脫緩沖液變更為20mm檸檬酸鈉緩沖液pH 5. 1。用三倍體積的后一緩沖液洗滌柱時(shí)，洗脫 了一系列含有色氨酸的肽。根據(jù)LC/MS分析，二肽AW以及三肽GNW、NAff, WVA、VAff大量存 在，并存在小量戊肽SLGNW。多種pH 5.1級(jí)分的氨基酸分析顯示，選擇性合并(selective pooling)產(chǎn)生具有1. 75的分子色氨酸/LNAA比例的溶液和約30%的色氨酸產(chǎn)率。更少選擇性的合并產(chǎn)生具有0. 4的分子比例的溶液和70%的色氨酸產(chǎn)率。隨后，用三倍體積的 20mM檸檬酸鈉pH 7. 1洗滌柱。根據(jù)LC/MS數(shù)據(jù)，該步驟洗脫了含精氨酸的肽WIR、A\WR并 驚人地洗脫了肽鼎。用IM NaOH、水和IM乙酸最后洗滌柱制備了用于下一輪的柱。實(shí)施例3大規(guī)模溶菌酶水解。在更大規(guī)模的溶菌酶水解步驟中，基本上遵循實(shí)施例1中所述的步驟，但有一些 較小的改動(dòng)。將含7. 3% (w/w)純?nèi)芫傅娜芤杭訜嶂?5°C，然后使用NaOH將pH調(diào)節(jié)至 PH 8.2。通過(guò)添加25微升ftOtex 6L/g干物質(zhì)開(kāi)始水解。在連續(xù)攪拌下和將pH維持于 8. 2并將溫度維持于53°C時(shí)，將水解持續(xù)2小時(shí)。然后將pH值提高至9. 0并將孵育再繼續(xù) 3. 5小時(shí)，得到含有一些沉淀物的溶液。然后將溶液的pH降低至4. 5，并將溶液冷卻至低于 4°C。為了獲得完全澄清的產(chǎn)物，將液體濾過(guò)Z 2000濾器0^11)，隨后通過(guò)納米過(guò)濾去除過(guò) 量的水和鹽。然后在120°C對(duì)得到的濃縮物進(jìn)行UHT處理7秒，蒸發(fā)并最終干燥，獲得干燥 形式的溶菌酶水解產(chǎn)物。由此獲得的產(chǎn)物具有約0. 19的摩爾色氨酸/LNAA比例。實(shí)施例4根據(jù)實(shí)施例3所述制備包含具有色氨酸的肽的肽組合物。獲得的產(chǎn)物是具有約 83%的肽水平、約5. 5%的與肽結(jié)合的色氨酸含量并具有約0. 19的TRP/LNAA比例的水性液 體。所述產(chǎn)物具有淺黃色粉末外觀，并且在溶于水中后給出PH約為4. 3的溶液。使用上述肽制劑能夠制備如下表1(水基質(zhì)中成分的干重％，剩余部分為水)中所 示組成的飲品，所述表還給出組合物的PH，所述pH通過(guò)氫氧化鈉和檸檬酸設(shè)定。制備這些 組合物的方法可以是-在水中制備所有成分的預(yù)混物(除水之外的其他所有成分均為顆粒材料)，-將其攪拌10分鐘，需要時(shí)調(diào)節(jié)pH至攪拌結(jié)束，-進(jìn)行UHT過(guò)程，-通過(guò)高壓勻化器勻化，-無(wú)菌裝填。還制備了不含有含色氨酸肽制劑的兩種制劑(對(duì)照A和B)，來(lái)觀察色氨酸肽制劑 的存在造成的影響。還制備了 PH在所述范圍之外的制劑(對(duì)照C)。表1 實(shí)施例4的組成和pH。對(duì)照 A對(duì)照 B實(shí)施 例4a實(shí)施 例4b實(shí)施 例4c對(duì)照 C含色氨酸的肽制劑 (wt.%)001.141.141.141.14脫脂奶粉(％)2.12.14.22.12.11.0角叉菜膠(wt.%)0.020.020.020.020.020,02麥芽糖糊精(Wt.%)2.02.02.02.02.02.0蔗糖(wt.%)6.66.66.66.66.66.6pH6.07.07.06.577來(lái)自SMP的酪蛋白膠束含 量(wt.%)0.840.841.680.840.844通過(guò)在143°C (+/-I0C )加熱約8秒到約8. 5秒，對(duì)所有這些組合物進(jìn)行生產(chǎn)線 (in-line)UHT (超高溫)滅菌，這足以造成6到8的F。值。UHT處理后立即將產(chǎn)物填充進(jìn)350ml體積(約250ml液體)的透明瓶中，24小時(shí) 后檢驗(yàn)是否形成沉降物，如果形成的話形成多少沉降物(以cm為單位測(cè)量，將其計(jì)算為瓶 中飲品高度的百分比)。表2 實(shí)施例4形成的沉降物。
對(duì)照A對(duì)照B實(shí)施例 4a實(shí)施例 4b實(shí)施例 4c對(duì)照C形成的沉降物(cm)000.80.503.5以％高度計(jì)的沉降物0010%5%030%實(shí)施例5按照實(shí)施例4中公開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)制備包含具有色氨酸的肽的肽組合物，并用相同的加 工方法制造，不同之處是UHT處理在125°C (+/-rc)的更低溫度下進(jìn)行。樣品組合物列于 表3中。表3 實(shí)施例5的組成和pH。
權(quán)利要求
1.用于制備有包裝的水性液體組合物的方法，所述有包裝的水性液體組合物包含以總 液體組合物為基礎(chǔ)按干重計(jì)0. 5% -4%的酪蛋白膠束，和以總液體組合物為基礎(chǔ)按干重計(jì) 0. -5%的含色氨酸的肽組合物，所述含色氨酸的肽組合物具有以含色氨酸的肽為基礎(chǔ) 按重量計(jì)-10%的色氨酸水平，所述方法包括下述步驟-獲得包含以下物質(zhì)的混合物優(yōu)選地以總組合物為基礎(chǔ)按重量計(jì)50% -97%量的水， 以干重為基礎(chǔ)0.5% -4%的酪蛋白膠束，和以干重為基礎(chǔ)0. 1% -5%的含色氨酸的肽組合 物，所述含色氨酸的肽組合物具有以含色氨酸的肽為基礎(chǔ)按重量計(jì)-10%的色氨酸水 平，-在80-150°C、優(yōu)選地120-150°C的溫度下下對(duì)所述混合物進(jìn)行熱防腐處理，-通過(guò)無(wú)菌包裝，包裝藉此獲得的液體制品，其中進(jìn)行了熱防腐處理的所述混合物的PH低于8. 1并高于下述式子給出的pH，下式中 酪蛋白膠束被表述為基于總配制物的重量％PH > 0. 02*T(°C )+0. 23* (以干重％計(jì)的酪蛋白膠束)+3. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述熱防腐處理前，將要進(jìn)行所述熱防腐的物 質(zhì)的PH調(diào)節(jié)至PH > 0. 02*T(°C )+0. 23* (以干重％計(jì)的酪蛋白膠束)+3. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在所述熱防腐處理前，向一種或多種所述組分 或所述混合物中添加堿或緩沖劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的方法，其中進(jìn)行了所述熱防腐處理的混合物具 有6. 2到7. 5、優(yōu)選地6. 5到7的pH。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述熱防腐處理包括熱巴氏滅菌、熱 滅菌或UHT滅菌處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含以總液體組合物為 基礎(chǔ)按重量計(jì)0.5% -3%、優(yōu)選地0.6% -2%的酪蛋白膠束。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酪蛋白膠束是乳蛋白質(zhì)、濃縮 奶、奶、奶粉、脫脂奶粉、酪乳、酪乳粉、奶蛋白質(zhì)濃縮物和/或其混合物的形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包裝在Tetrapak、囊、瓶、 袋或罐中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物還包含0.01 % -0. 1 %的選 自由角叉菜膠、刺槐豆膠、瓜爾膠、塔拉膠或其混合物構(gòu)成的組的增稠膠質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物還包含0.5-5%的淀粉或 淀粉衍生物或淀粉水解產(chǎn)物，優(yōu)選地包含麥芽糖糊精。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述含色氨酸的肽組合物包含色氨 酸與LNAA的(重量)比例至少為0. 1、優(yōu)選地至少為0. 15、更優(yōu)選地為0. 15-1. 8的肽組合 物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述含色氨酸的肽組合物通過(guò)下述方法獲得， 所述方法包括水解溶菌酶，優(yōu)選地水解雞卵溶菌酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述溶菌酶被水解至5和45之間、優(yōu)選地10-40 之間的DH。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中在水解后去除含有精氨酸或賴氨酸的肽部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述含色氨酸的肽組合物包含至少 兩種不同的二肽或三肽，其中選自二肽或三肽的兩種肽以占二肽和三肽總量的至少5mol % 的量存在，并且在所述含色氨酸的肽組合物中，與肽結(jié)合的色氨酸中多于30mol%、優(yōu)選地 多于40mOl%以二肽或三肽的形式存在。
16.根據(jù)權(quán)利要求11到15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含含有氨基酸序列 Aff或GNW、優(yōu)選地AW和GNW的肽。
17.有包裝的經(jīng)熱巴氏滅菌或熱滅菌的組合物，所述組合物包含-以總組合物為基礎(chǔ)按重量計(jì)50% -97%的水，-以總液體組合物為基礎(chǔ)按干重計(jì)0. 5% -4%的酪蛋白膠束，-以總液體組合物為基礎(chǔ)按干重計(jì)0. -5%的含色氨酸的肽組合物，所述含色氨酸 的肽組合物具有以含色氨酸的肽為基礎(chǔ)按重量計(jì)-10%的色氨酸水平，所述組合物具有6到8. 1、優(yōu)選地6. 2到7. 5、更優(yōu)選地6. 5到7的pH。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的有包裝的組合物，其中所述酪蛋白膠束的量以總液體組合 物為基礎(chǔ)按干重計(jì)為0. 5 % -3 %，優(yōu)選地0. 6 % -2 %。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的有包裝的組合物，其中所述酪蛋白膠束是濃縮奶、奶、 奶粉、脫脂奶粉、酪乳、酪乳粉、奶蛋白質(zhì)濃縮物、奶蛋白質(zhì)分離物和/或其混合物的形式。
20.根據(jù)權(quán)利要求17到19中任一項(xiàng)所述的有包裝的組合物，其中所述組合物還包含 0. 01% -0. 的選自由角叉菜膠、刺槐豆膠、瓜爾膠、塔拉膠或其混合物構(gòu)成的組的增稠膠 質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求17到20中任一項(xiàng)所述的有包裝的組合物，其中所述組合物還包含 0. 5% -5%的淀粉或淀粉衍生物或淀粉水解產(chǎn)物，優(yōu)選地，麥芽糖糊精。
22.根據(jù)權(quán)利要求17到21中任一項(xiàng)所述的有包裝的組合物，其中所述含色氨酸的肽組 合物包含具有至少0. 1、優(yōu)選地至少0. 15、更優(yōu)選地0. 15-1. 8的色氨酸/LNAA重量比的肽 組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求17到22中任一項(xiàng)所述的有包裝的組合物，其中通過(guò)水解溶菌酶，優(yōu) 選地水解雞卵溶菌酶，來(lái)獲得所述含色氨酸的肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的有包裝的組合物，其中所述含色氨酸的肽具有5和45之 間、優(yōu)選地10和40之間的DH。
25.根據(jù)權(quán)利要求17到M中任一項(xiàng)所述的有包裝的組合物，其中所述含色氨酸的肽 組合物包含至少兩種不同的二肽或三肽，其中選自二肽或三肽的兩種肽以占二肽和三肽總 量的至少5mol%的量存在，并且在所述含色氨酸的肽組合物中，與肽結(jié)合的色氨酸中多于 30mol%、優(yōu)選地多于40mol%的以二肽或三肽的形式存在。
26.根據(jù)權(quán)利要求17到25中任一項(xiàng)所述的有包裝的組合物，其中所述含色氨酸的肽組 合物包含含有氨基酸序列AW或GNW、優(yōu)選地AW和GNW的肽組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈中所述的有包裝的組合物，其中AW與GNW的摩爾比例在1 2和 10 1之間，優(yōu)選地在1 2和5 1之間。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備有包裝的經(jīng)巴氏滅菌或經(jīng)滅菌的水性可飲用制品的方法，以及由此獲得的制品，所述制品包含(例如來(lái)自乳蛋白質(zhì)的)酪蛋白膠束和肽級(jí)分，所述肽級(jí)分富含色氨酸。所述方法需要在特定的pH下進(jìn)行熱防腐處理。
文檔編號(hào)A23C9/152GK102076221SQ200980125141
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日
發(fā)明者亞歷山大·露西雅·萊昂納德斯·迪沙托, 魯斯 安德烈·利納爾杜斯·德, 瓊?cè)鹚埂た藙诳? 路泊·埃登斯, 阿杰恩·波特, 比克霍文 魯?shù)婪颉じダ涮K斯·W·M·范 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司