專利名稱：用于產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的組合化學(xué)遺傳方法
用于產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的組合化學(xué)遺傳方法
對(duì)相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉參考
本申請(qǐng)要求于2008年3月17日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/069,956和于2008 年10月31日提交的61/197,986的優(yōu)先權(quán)利益，通過(guò)參考將其結(jié)合于此。
發(fā)明背景
干細(xì)胞通常分類為全能的或多能的。全能干細(xì)胞具有完全的分化潛力它產(chǎn)生 體內(nèi)全部不同類型的細(xì)胞。受精卵細(xì)胞是全能干細(xì)胞的實(shí)例。多能干細(xì)胞可以在體內(nèi)產(chǎn) 生源自三個(gè)主要生殖細(xì)胞層或其胚胎的任一細(xì)胞類型。
多能干細(xì)胞，諸如胚胎干細(xì)胞(ESCs)，快速增殖，同時(shí)保持多能性，即分化 為多種細(xì)胞類型的能力。胚胎干細(xì)胞是對(duì)于細(xì)胞移植治療有前景的供體來(lái)源。然而， 人ESC還與關(guān)于人胚胎使用的倫理問(wèn)題和異源移植后的排斥反應(yīng)有關(guān)。通過(guò)直接由 患者體細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞來(lái)克服這些問(wèn)題是可能的。體細(xì)胞核通過(guò)與ESCs融合獲 得胚胎干樣狀態(tài)，這提示“多能性誘導(dǎo)”因子的存在。以前的研究近期已經(jīng)顯示， 反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的將在ESCs中高度表達(dá)的四種轉(zhuǎn)錄因子(Oct-3/4，Sox2, KLF4和 c-Myc)轉(zhuǎn)染進(jìn)入小鼠成纖維細(xì)胞導(dǎo)致誘導(dǎo)的多能干GPS)細(xì)胞的產(chǎn)生。參見(jiàn)Takahashi， K.&Yamanaka，S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic andadult fibroblast cultures by defined factors(通過(guò)確定的因子由小鼠胚胎和成熟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo) 多能干細(xì)胞).Cell(細(xì)胞)1 ，663-676Q006) ； Okita，K., Ichisaka，T.&Yamanaka， S.Generation of germline-competentinduced pluripotent stem cells(產(chǎn)生禾中系言旨性誘導(dǎo)的多 能干細(xì)胞).Nature (自然)448，313-317 (2007) ； Wernig, M.等 In vitro reprogramming offibroblasts into a pluripotent ES-celHike state(體外重編程成纖維細(xì)胞進(jìn)入多能 ES-細(xì) 胞樣狀態(tài)).Nature(自然)448，318-324(2007) ； Maherali, N.等 Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling andwidespread tissue contribution (直接重 編程的成纖維細(xì)胞顯示整體外遺傳重建和普遍的組織貢獻(xiàn)).Cell Stem Cell(細(xì)胞干細(xì) 胞)1, 55-70 (2007) ； Meissner, A., Wernig, M.&Jaenisch, R.Direct reprogramming of geneticallyunmodifed fibroblasts into pluripotent stem cells (將未遺傳修飾的成纖維細(xì)胞 直接重編程為多能干細(xì)胞).Nature BiotechnoK自然生物技術(shù))25，1177-1181 (2007)； Takahashi, K.等 Induction of pluripotent stem cells fromadult human fibroblasts by defined faCt0rS(通過(guò)確定的因子由成熟的人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞).Cell(細(xì)胞)131， 861-872 (2007) ； Yu, J.等，Inducedpluripotent stem cell lines derived from human somatic cells(源自人體細(xì)胞的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系).Science(科學(xué))318，1917-1920(2007)； Nakagawa, M.等 Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouseand human fibroblasts (在無(wú)Myc的條件下由小鼠和人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞) Nature Biotechnol(自然生物技術(shù))26，101-106(2007) ； Wernig, M.，Meissner, Α., Cassady， J.P.&Jaenisch, R.c-Myc is dispensablefor direct reprogramming of mouse fibroblasts (c-Myc對(duì)于小鼠成纖維細(xì)胞直接重編程不是必要的).Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì) 胞)2，10-12(2008)。iPS細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、增殖、和多能性方面類似于ESCs，這通過(guò)畸胎瘤形成和嵌合體貢獻(xiàn)來(lái)判斷。
近期在將小鼠和人體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞中使用確定的遺傳 操作，即在小鼠或人胚胎干(ES)細(xì)胞中高度和/或特異性表達(dá)的少數(shù)基因的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的 突破已經(jīng)揭示了大量在無(wú)常規(guī)人ES細(xì)胞相關(guān)爭(zhēng)議的條件下產(chǎn)生用于不同應(yīng)用(例如， 基于細(xì)胞的治療或藥物發(fā)現(xiàn))的患者特異性干細(xì)胞，以及研究外遺傳反轉(zhuǎn)過(guò)程的機(jī)會(huì)。 iPS-細(xì)胞方法的最終臨床應(yīng)用應(yīng)該在很大程度上需要定向分化人PS細(xì)胞以產(chǎn)生譜系特 異性細(xì)胞類型的同源群體以及消除與當(dāng)前遺傳操作的iPS-細(xì)胞缺陷和低效率/慢動(dòng)力學(xué) 相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。近期的研究已經(jīng)顯示以前需要的四種基因之一，cMyc，對(duì)于在產(chǎn)生iPS 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)不是必須的。參見(jiàn)，Nakagawa, M.等，Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse andhuman fibroblasts (在無(wú) Myc 條件下由小鼠禾口人成纖 維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)Nature BiotechnoK自然生物技術(shù)06，101-106(2007)； Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J.P.&Jaenisch, R.c-Myc is dispensable for directreprogramming of mouse fibroblasts (c_Myc對(duì)于小鼠成纖維細(xì)胞直接重編程不是必要 的).Cell Stem Cell (細(xì)胞干細(xì)胞)2，10-12(2008)。然而，在缺乏cMyc條件下，重編程 效率隨著也慢得多的重編程動(dòng)力學(xué)而充分減小。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供用于篩選誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞重編程或去分化成為多能干細(xì)胞的試劑 的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括
a)將Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一種，但非全部引入非多能細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；
b)使所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與不同試劑文庫(kù)相接觸；
C)針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選所接觸的細(xì)胞；和
d)使干細(xì)胞特征的形成與來(lái)自所述文庫(kù)的特定試劑相關(guān)聯(lián)，由此鑒定刺激細(xì)胞 去分化成為多能干細(xì)胞的試劑。
在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括將一個(gè)或多個(gè)用于表達(dá)Oct多肽、Iilf多肽、 Myc多肽、和Sox多肽中的至少一種，但非全部的表達(dá)盒引入所述非多能細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括將外源Oct多肽、外源Klf多肽、外源Myc多 肽、和外源Sox多肽中的至少一種，但非全部引入所述非多能細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述特定試劑在50-1500道爾頓之間。
在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括將兩個(gè)表達(dá)盒引入所述細(xì)胞，其中每個(gè)表達(dá)盒 包括編碼不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和 Sox多肽組成的組，且不將所述組的其余成員引入所述細(xì)胞內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括將三個(gè)表達(dá)盒引入所述細(xì)胞，其中每個(gè)表達(dá)盒 包括編碼不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和 Sox多肽組成的組，且不將所述組的其余成員引入所述細(xì)胞內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是非人 哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述非多能細(xì)胞是祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所 述祖細(xì)胞是神經(jīng)祖細(xì)胞、皮膚祖細(xì)胞或毛囊祖細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述Oct多肽是0ct4，所述Klf多肽是Klf 4，所述Myc多肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
本發(fā)明還提供篩選具有多能干細(xì)胞特征的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方 案中，所述方法包括
a)使細(xì)胞與MAPK/ERK激酶(MEU抑制劑相接觸，從而抑制非多能細(xì)胞生長(zhǎng) 并促進(jìn)多能干細(xì)胞生長(zhǎng)；和
b)針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選所接觸的細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括
在步驟a)之前，使所述細(xì)胞與試劑文庫(kù)相接觸；
和，在步驟b)之后，基于步驟b)的結(jié)果篩選誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的試劑。
在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是小 鼠、狗、牛、豬、大鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述MEK抑制劑是PD0325901。
本發(fā)明還提供用由哺乳動(dòng)物非多能細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。在一些 實(shí)施方案中，所述方法包括
a)將Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的一種或多種引入至所述非多能細(xì)胞中；
b)使所述細(xì)胞與抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑相接觸，由此生 成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括使所述非多能細(xì)胞與一種或多種選自Klf多 肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox多肽的外源多肽相接觸。在一些實(shí)施方案中，步驟a) 包括以下的至少兩個(gè)(例如，2，3，4，5，或更多個(gè))循環(huán)
i.使所述非多能細(xì)胞與一種或多種選自Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox多肽的外源多肽相接觸；
ii.隨后在缺乏所述外源多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括將用于表達(dá)Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、 和Sox多肽的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒引入至所述非多能細(xì)胞中。
在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選相接觸的細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，將用于表達(dá)Oct多肽的表達(dá)盒和用于表達(dá)Sox多肽的表達(dá)盒 引入至所述非多能細(xì)胞中。
在一些實(shí)施方案中，所述引入步驟包括向所述非多能細(xì)胞中引入一個(gè)或多個(gè)用 于表達(dá)KLF多肽和Oct多肽的表達(dá)盒，其中用于Myc多肽和/或Sox多肽的表達(dá)盒不引 入至所述細(xì)胞中。
在一些實(shí)施方案中，所述Wf多肽是Klf4且所述Oct多肽是0ct4。
在一些實(shí)施方案中，所述非多能細(xì)胞是體細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述非多能細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，用于表達(dá)Myc多肽的表達(dá)盒或用于表達(dá)Iilf多肽的表達(dá)盒均 不引入所述非多能細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述引入步驟在體內(nèi)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述引入 步驟在體外進(jìn)行。11
在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括，
c)選擇表現(xiàn)出多能干細(xì)胞特征的細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述非多能細(xì)胞獲自動(dòng)物；且所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞分化 為所需的細(xì)胞類型。
在一些實(shí)施方案中，將所述所需的細(xì)胞類型引入至動(dòng)物中。在一些實(shí)施方案 中，所述動(dòng)物是人。在一些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物是非人動(dòng)物。
在一些實(shí)施方案中，所選擇的細(xì)胞不包括用于表達(dá)Oct4的外源表達(dá)盒。
在一些實(shí)施方案中，所述試劑抑制H3K9甲基化。在一些實(shí)施方案中，抑制 H3K9甲基化的試劑是BIX0U94。
在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是小鼠 細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述非多能細(xì)胞是祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞 是神經(jīng)祖細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述引入步驟包括引入下述
第一載體，其包含與第一表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第一表達(dá)盒包括編 碼IClf4的多核苷酸；
第二載體，其包含與第二表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第二表達(dá)盒包括編 碼Sox2的多核苷酸；和
第三載體，其包含與第三表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第三表達(dá)盒包括編 碼c-Myc的多核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，所述載體是反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒(Ientiviral)載體、腺 病毒載體、標(biāo)準(zhǔn)非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體。
本發(fā)明還包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑的 混合物，其中所述細(xì)胞表達(dá)Oct多肽、Klf多肽、Sox多肽、和Myc多肽中的至少一種或 多種；和/或與外源Oct多肽、外源Klf多肽、外源Sox多肽、和外源Myc多肽中的至 少一種或多種相接觸。
在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括第一、第二和第三重組表達(dá)盒，所述第一表 達(dá)盒包括與編碼Klf多肽的多核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子，所述第二表達(dá)盒包括與編碼 Sox多肽的多核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子；且所述第三表達(dá)盒包括與編碼Myc多肽的多 核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子。
在一些實(shí)施方案中，所述試劑抑制H3K9甲基化。在一些實(shí)施方案中，抑制 H3K9甲基化的試劑是BIX0U94。
在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括一種或多種反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、 腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體，所述一種或多種反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病 毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體包括所述第一、第二和第三表達(dá)品.ο
在一些實(shí)施方案中，所述混合物包括第一、第二和第三反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病 毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體，所述第一反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢 病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體包括所述第一表達(dá)盒；所述第 二反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體包括所述第二表達(dá)盒；所述第三反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或 附加型表達(dá)載體包括所述第三表達(dá)盒。
在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是小鼠 細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞是神 經(jīng)祖細(xì)胞、皮膚祖細(xì)胞或毛囊祖細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述Klf多肽是Klf4，所述Myc多肽是c-Myc，且所述Sox 多肽是Sox2。
本發(fā)明還提供內(nèi)源性表達(dá)選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽 組成的組的至少一種蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞不內(nèi)源性表達(dá)所述組中的至 少一種蛋白，其中所述不內(nèi)源性表達(dá)的蛋白由所述細(xì)胞內(nèi)存在的異源重組表達(dá)盒編碼的 RNA來(lái)表達(dá)，其中所述細(xì)胞內(nèi)源性或異源性表達(dá)Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox 多肽的每一種；且經(jīng)由所述異源表達(dá)盒的蛋白表達(dá)導(dǎo)致所述細(xì)胞由非多能細(xì)胞重編程或 去分化成為多能干細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述Oct多肽是Oct 4，所述Klf多肽是Klf 4，所述Myc多 肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)Sox多 肽和Myc多肽且異源性表達(dá)Oct多肽和Klf多肽。在一些實(shí)施方案中，所述Oct多肽是 0ct4，所述Klf多肽是Klf 4，所述Myc多肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
本發(fā)明還提供誘導(dǎo)細(xì)胞中0ct4表達(dá)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法使所 述細(xì)胞與抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑相接觸，由此誘導(dǎo)細(xì)胞中的0ct4 表達(dá)。
在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在即將進(jìn)行所述接觸步驟前不表達(dá)0ct4。在一些 實(shí)施方案中，相接觸的細(xì)胞不是多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在所述接觸步 驟后誘導(dǎo)為多能性。
本發(fā)明還提供將非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為多能細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，所述 方法包括使所述非多能細(xì)胞與一種或多種誘導(dǎo)多能性的試劑相接觸和/或?qū)⒈磉_(dá)盒引入 到細(xì)胞中以表達(dá)誘導(dǎo)多能性的蛋白，其中所述細(xì)胞不在飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)且所述細(xì)胞附著 于固體培養(yǎng)物表面。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選所述 接觸的細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞通過(guò)分子粘連(molecular tether)附著于固體培養(yǎng)物 表面，所述分子粘連選自由基質(zhì)膠(matrigel)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)或ECM類似物、層粘 連蛋白、纖連蛋白、和膠原蛋白組成的組。
在一些實(shí)施方案中，所述接觸步驟包括以下步驟
a)將一種或多種用于表達(dá)Wf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox多肽的表達(dá)盒 引入非多能細(xì)胞中；
b)使所述細(xì)胞與抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑相接觸，由此生 成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
本發(fā)明還提供由哺乳動(dòng)物非多能細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。在一些實(shí) 施方案中，所述方法包括
a)使所述細(xì)胞與以下至少一種(例如，1、2、3、4或更多種)相接觸13
抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑(包括但不僅限于BIX)；
L-型Ca通道激動(dòng)劑(包括但不僅限于Bay K)；
cAMP途徑活化劑(包括但不僅限于毛喉素(forskoKn))；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑(包括但不僅限于RG 108或5_氮雜_C)；
核受體配體(包括但不僅限于地塞米松Wecamethasone))；
GSK3抑制劑(包括但不僅限于CHIR99021)；
MEK 抑制劑，
TGF β受體/ALK5抑制劑(包括但不僅限于SB431542，Α-83-01，或 2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-IH-吡唑-4-基)-1，5-二氮雜萘)，
HDAC抑制劑(包括但不僅限于TSA，VPA, 丁酸鈉，SAHA等)；和
Erk 抑制劑。
由此生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括針對(duì)多能干細(xì)胞特征對(duì)所述接觸的細(xì)胞進(jìn) 行篩選。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括
a)使所述細(xì)胞與以下相接觸
i.抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑；和
ii.選自由以下組成的組的試劑
L-型Ca通道激動(dòng)劑(包括但不僅限于BayK)；
cAMP途徑活化劑(包括但不僅限于毛喉素)；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑(包括但不僅限于RG108或5_氮雜_C)；
核受體配體(包括但不僅限于地塞米松)；
GSK3抑制劑(包括但不僅限于CHIR99021)；
MEK 抑制劑，
TGF β受體/ALK5抑制劑(包括但不僅限于SB431542，Α-83-01，或 2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-IH-吡唑-4-基)-1，5-二氮雜萘)，
HDAC抑制劑(包括但不僅限于TSA，VPA, 丁酸鈉，SAHA等)；和Erk抑制劑。
在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括
b)將一種或多種用于表達(dá)Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和/或Sox多肽的表達(dá)盒引入所述非多能細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，將Klf4和Oct 4引入所述細(xì)胞(且任選地，不引入Myc和 Sox) ο
本發(fā)明還提供哺乳動(dòng)物和以下至少一種(例如，1、2、3、4或更多種)的混合 物
抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑，
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制劑；
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；和
Erk 抑制劑。
在一些實(shí)施方案中，所述混合物包括
i.抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑，和
ii.選自由以下組成的組的試劑
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制齊[J;
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；和
Erk 抑制劑。
在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括用于表達(dá)Oct多肽的異源表達(dá)盒和用于表達(dá) Sox多肽的異源表達(dá)盒。
在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是非多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是 成纖維細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，用于表達(dá)Myc多肽的表達(dá)盒和用于表達(dá)Iilf多肽的表達(dá)盒均 不引入至所述非多能細(xì)胞中。
本發(fā)明還提供組合物，其包括抑制H3K9甲基化的試劑和選自由以下組成的組的 試劑
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制齊[J;
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；和
Erk 抑制劑。
本發(fā)明還提供試劑盒，其包括
i.抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑；和
ii.選自由以下組成的組的試劑
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制劑；
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；和
Erk 抑制劑。
在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案在下文中直接以權(quán)利要求的形式描述
1. 一種由哺乳動(dòng)物非多能細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括
a)將Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的一種或多種引入所述非多 能細(xì)胞中；
b)使所述細(xì)胞與抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑相接觸，由此生 成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟a)包括使所述非多能細(xì)胞與一種或多種選 自Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox多肽的外源多肽相接觸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述步驟a)包括以下至少2個(gè)循環(huán)
i.使所述非多能細(xì)胞與一種或多種選自Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox 多肽的外源多肽相接觸；
ii.隨后在缺乏所述外源多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟a)包括將用于表達(dá)Klf多肽、Oct多肽、 Myc多肽、和Sox多肽的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒引入至所述非多能細(xì)胞中。
5.權(quán)利要求1的方法，其中將用于表達(dá)Oct多肽的表達(dá)盒和用于表達(dá)Sox多肽的 表達(dá)盒引入所述非多能細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述引入步驟包括向所述非多能細(xì)胞中引入一個(gè)或多 個(gè)用于表達(dá)KlF多肽和Oct多肽的表達(dá)盒，其中用于Myc多肽和/或Sox多肽的表達(dá)盒 不引入至所述細(xì)胞中。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述:Klf多肽是Klf4且所述Oct多肽是 0ct4。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述非多能細(xì)胞是體細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述非多能細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中用于表達(dá)Myc多肽的表達(dá)盒和用于表達(dá) Klf多肽的表達(dá)盒均不引入所述非多能細(xì)胞中。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述引入步驟在體內(nèi)進(jìn)行。
12.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述引入步驟在體外進(jìn)行。
13.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，還包括
c)選擇表現(xiàn)出多能干細(xì)胞特征的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述非多能細(xì)胞獲自動(dòng)物；且所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞分化為需要的細(xì)胞類型。
15.權(quán)利要求14的方法，其中將所述需要的細(xì)胞類型引入所述動(dòng)物中。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述動(dòng)物是人。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述動(dòng)物是非人動(dòng)物。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所選擇的細(xì)胞不包括用于表達(dá)Oct4的外源表達(dá)品.ο
19.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑抑制H3K9甲基化。
20.權(quán)利要求19的方法，其中抑制H3K9甲基化的所述試劑是BIX01294。
21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
22.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是小鼠、狗、牛、豬、大鼠和 非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述非多能細(xì)胞是祖細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述祖細(xì)胞是神經(jīng)祖細(xì)胞、皮膚祖細(xì)胞或毛囊祖細(xì) 胞。
25.權(quán)利要求1或4- 中任一項(xiàng)的方法，其中所述引入步驟包括引入下述
第一載體，其包含與第一表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第一表達(dá)盒包括編 碼IClf4的多核苷酸；
第二載體，其包含與第二表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第二表達(dá)盒包括編 碼Sox2的多核苷酸；和
第三載體，其包含與第三表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第三表達(dá)盒包括編 碼c-Myc的多核苷酸。
26.權(quán)利要求1或4-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體是反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病 毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體。
27.—種篩選誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞重編程或去分化成為多能干細(xì)胞的試劑的方法， 所述方法包括
a)將Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一種，但非全部引入非多能細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；
b)使所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與不同試劑的文庫(kù)相接觸；
c)針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選所接觸的細(xì)胞；和
d)使干細(xì)胞特征的形成與來(lái)自所述文庫(kù)的特定試劑相關(guān)聯(lián)，由此鑒定刺激細(xì)胞 去分化成為多能干細(xì)胞的試劑。
28.權(quán)利要求27的方法，其中步驟a)包括將一個(gè)或多個(gè)用于表達(dá)Oct多肽、Klf 多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一種，但非全部的表達(dá)盒引入至所述非多能細(xì)胞 中。
29.權(quán)利要求27的方法，其中步驟a)包括將外源Oct多肽、外源Klf多肽、外源 Myc多肽、和外源Sox多肽中的至少一種，但非全部引入至所述非多能細(xì)胞中。
30.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述特定試劑在50-1500道爾頓之間。
31.權(quán)利要求27的方法，其中步驟a)包括將兩個(gè)表達(dá)盒引入所述細(xì)胞，其中每個(gè)表達(dá)盒包括編碼不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc 多肽、和Sox多肽組成的組，且所述組的其余成員不引入至所述細(xì)胞內(nèi)。
32.權(quán)利要求27的方法，其中步驟a)包括將三個(gè)表達(dá)盒引入所述細(xì)胞，其中每 個(gè)表達(dá)盒包括編碼不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc 多肽、和Sox多肽組成的組，且所述組的其余成員不引入至所述細(xì)胞內(nèi)。
33.權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
34.權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
35.權(quán)利要求27-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述非多能細(xì)胞是祖細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述祖細(xì)胞是神經(jīng)祖細(xì)胞、皮膚祖細(xì)胞或毛囊祖細(xì) 胞。
37.權(quán)利要求27-36中任一項(xiàng)的方法，其中所述Oct多肽是0ct4，所述Klf多肽 是Klf4，所述Myc多肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
38. 一種篩選具有多能干細(xì)胞特征的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括
a)使細(xì)胞與MAPK/ERK激酶(MEU抑制劑相接觸，從而抑制非多能細(xì)胞生長(zhǎng) 并促進(jìn)多能干細(xì)胞生長(zhǎng)；和
b)針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選所接觸的細(xì)胞。
39.權(quán)利要求38的方法，其包括
在步驟a)之前，使所述細(xì)胞與試劑文庫(kù)相接觸；
和，在步驟b)之后，基于步驟b)的結(jié)果篩選誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的試劑。
40.權(quán)利要求38-39中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
41.權(quán)利要求38-39中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是小鼠、狗、牛、豬、大鼠 和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。
42.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)的方法，其中所述MEK抑制劑是PD0325901。
43. 一種包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑的 混合物，其中所述細(xì)胞
表達(dá)Oct多肽、Klf多肽、Sox多肽、和Myc多肽中的至少一種或多種；和/或
與外源Oct多肽、外源Klf多肽、外源Sox多肽、和外源Myc多肽中的至少一種或多種相接觸。
44.權(quán)利要求43的混合物，其中所述細(xì)胞包括第一、第二和第三重組表達(dá)盒，
所述第一表達(dá)盒包括與編碼Iilf多肽的多核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子，
所述第二表達(dá)盒包括與編碼Sox多肽的多核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子；和
所述第三表達(dá)盒包括與編碼Myc多肽的多核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子。
45.權(quán)利要求43-44中任一項(xiàng)的混合物，其中所述試劑抑制H3K9甲基化。
46.權(quán)利要求45的混合物，其中抑制H3K9甲基化的試劑是BIX01294。
47.權(quán)利要求43-46中任一項(xiàng)的混合物，其中所述細(xì)胞包括一種或多種反轉(zhuǎn)錄病 毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體，所述一種或多種 反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體包括所述 第一、第二禾口第三表達(dá)盒。
48.權(quán)利要求47的混合物，所述混合物包括第一、第二和第三反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、18慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體，
所述第一反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型 表達(dá)載體包括所述第一表達(dá)盒；
所述第二反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型 表達(dá)載體包括所述第二表達(dá)盒；和
所述第三反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型 表達(dá)載體包括所述第三表達(dá)盒。
49.權(quán)利要求43-48中任一項(xiàng)的混合物，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
50.權(quán)利要求43-48中任一項(xiàng)的混合物，其中所述細(xì)胞是小鼠、狗、牛、豬、大 鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。
51.權(quán)利要求43-50中任一項(xiàng)的混合物，其中所述細(xì)胞包括祖細(xì)胞。
52.權(quán)利要求51的混合物，其中所述祖細(xì)胞是神經(jīng)祖細(xì)胞、皮膚祖細(xì)胞或毛囊祖 細(xì)胞。
53.權(quán)利要求43-52中任一項(xiàng)的混合物，其中所述Klf多肽是Klf 4，所述Myc多 肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
54. —種內(nèi)源性表達(dá)選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽組成的 組的至少一種蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，
其中
所述細(xì)胞不內(nèi)源性表達(dá)所述組中的至少一種蛋白，其中不內(nèi)源性表達(dá)的所述蛋 白由所述細(xì)胞內(nèi)存在的異源重組表達(dá)盒編碼的RNA來(lái)表達(dá)，
所述細(xì)胞內(nèi)源性或異源性表達(dá)Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽的每 一種；和
經(jīng)由所述異源表達(dá)盒的蛋白表達(dá)導(dǎo)致所述細(xì)胞由非多能細(xì)胞重編程或去分化成 為多能干細(xì)胞。
55.權(quán)利要求M的細(xì)胞，其中所述Oct多肽是Oct 4，所述Klf多肽是Klf4，所 述Myc多肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
56.權(quán)利要求M-55中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)Sox多肽和Myc 多肽且異源性表達(dá)Oct多肽和Klf多肽。
57.權(quán)利要求56的細(xì)胞，其中所述Oct多肽是0ct4，所述Klf多肽是:Klf4，所述 Myc多肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
58. —種誘導(dǎo)細(xì)胞中0ct4表達(dá)的方法，所述方法包括
使所述細(xì)胞與抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑相接觸，由此誘導(dǎo) 細(xì)胞中的0ct4表達(dá)。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述細(xì)胞在即將進(jìn)行所述接觸步驟前不表達(dá)0ct4。
60.權(quán)利要求58-59中任一項(xiàng)的方法，其中相接觸的所述細(xì)胞不是多能細(xì)胞。
61.權(quán)利要求58-59中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞在所述接觸步驟后誘導(dǎo)為多 能性。
62. 一種將非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為多能細(xì)胞的方法，所述方法包括
使所述非多能細(xì)胞與一種或多種誘導(dǎo)多能性的試劑相接觸和/或?qū)⒈磉_(dá)盒引入19所述細(xì)胞以表達(dá)誘導(dǎo)多能性的蛋白，其中所述細(xì)胞不在飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)且所述細(xì)胞附著 于固體培養(yǎng)物表面。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述細(xì)胞通過(guò)分子粘連附著于固體培養(yǎng)表面，所述 分子粘連選自由基質(zhì)膠、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)或ECM類似物、層粘連蛋白、纖連蛋白、 和膠原蛋白組成的組。
64.權(quán)利要求62的方法，其中所述接觸步驟包括權(quán)利要求1或引用權(quán)利要求1的 權(quán)利要求的步驟。
65. 一種由哺乳動(dòng)物非多能細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括
a)使所述細(xì)胞與以下至少兩種相接觸
抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑；
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制劑；
MEK 抑制劑；
TGF β 受體 /ALK5 抑制劑；
HDAC抑制劑；和
erk 抑制劑，
由此生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述接觸步驟包括
使所述細(xì)胞與以下至少兩種相接觸
i.抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑，和
ii.選自由以下組成的組的試劑
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制劑；
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；和
erk 抑制劑。
67.權(quán)利要求65或66的方法，其還包括
b)將一種或多種用于表達(dá)Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和/或Sox多肽的表達(dá)盒引入所述非多能細(xì)胞。
68.權(quán)利要求65-67中任一項(xiàng)的方法，其中將Klf4和Oct 4引入所述細(xì)胞。
69. 一種哺乳動(dòng)物和以下至少兩種的混合物
抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑，
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制劑；
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；和
erk 抑制劑。
70.權(quán)利要求69的混合物，其中所述混合物包括
i.抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑，和
ii.選自由以下組成的組的試劑
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制劑；
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；和
erk 抑制劑。
71.權(quán)利要求69-70中任一項(xiàng)的混合物，其中所述細(xì)胞包括用于表達(dá)Oct多肽的 異源表達(dá)盒和用于表達(dá)Sox多肽的異源表達(dá)盒。
72.權(quán)利要求69-71中任一項(xiàng)的混合物，其中所述細(xì)胞是非多能細(xì)胞。
73.權(quán)利要求69-72中任一項(xiàng)的混合物，其中所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
74.權(quán)利要求69-73中任一項(xiàng)的混合物，其中用于表達(dá)Myc多肽的表達(dá)盒和用于 表達(dá)Klf多肽的表達(dá)盒均不引入至所述非多能細(xì)胞中。
75.—種組合物，其包括以下至少兩種
抑制H3K9甲基化的試劑；
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制劑；
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；和
erk 抑制劑。
76.權(quán)利要求75的組合物，其包括
i.抑制H3K9甲基化的試劑，禾口
ii.選自由以下組成的組的試劑
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制劑；
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；和
erk 抑制劑。
77.試劑盒，其包括以下至少兩種
抑制H3K9甲基化的試劑；
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制劑；
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；和
erk 抑制劑。
78.權(quán)利要求77的試劑盒，其包括
i.抑制H3K9甲基化的試劑，禾口
ii.選自由以下組成的組的試劑
L-型Ca通道激動(dòng)劑；
cAMP途徑活化劑；
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；
核受體配體；
GSK3 抑制劑；
MEK 抑制劑，
TGF β 受體/ALK5 抑制劑，
HDAC抑制劑；禾口
erk 抑制劑。
79.權(quán)利要求77或78的試劑盒，其還包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
通過(guò)閱讀整個(gè)本申請(qǐng)將清楚本發(fā)明的其他實(shí)施方案。
附圖簡(jiǎn)述


圖1.通過(guò)Oct4/Klf4病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和BIX01294處理由確定的原代神經(jīng)祖細(xì)胞(primary neural progenitor cells)產(chǎn)生iPS細(xì)胞。在有或無(wú)BIX01294處理的條件下，通過(guò)Oct4/Klf4/Sox2/c_Myc，Oct4/Klf4/Sox2,或 Oct4/Klf4 的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)由 3.5xl04 個(gè)原代 OG2 神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生的GFP+iPS細(xì)胞集落數(shù)量的比較。
圖2.通過(guò)Klf4/Sox2/c_Myc病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和BIX01294處理由原代神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生 iPS細(xì)胞。在有或無(wú)BIX01294處理的條件下，通過(guò)Klf4/Sox2/c-Myc的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) 由3加104個(gè)原代OG2神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生的GFP+iPS細(xì)胞集落數(shù)量。
圖3.由原代OG2MEFS產(chǎn)生OK2BiPSCs。 柱形圖表示在3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中由 OG2-MEFS誘導(dǎo)的平均GFP+集落數(shù)量。該圖顯示關(guān)于用四種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)(Oct4，Klf4， Sox2，禾Π cMyc ； 4F)；用 OK 轉(zhuǎn)導(dǎo)(OK)；用 OK 轉(zhuǎn)導(dǎo)并用 1 μ M 處理 ΒΙΧ(ΟΚ+ΒΙΧ)； 用OK轉(zhuǎn)導(dǎo)并用1 μ M ΒΙΧ+2 μ M BayK處理(OK+BIX+BayK)；用OK轉(zhuǎn)導(dǎo)并用1 μ M ΒΙΧ+0.04 μ M RG108 處理(OK+BIX+RG108)的 OG2MEF 細(xì)胞的數(shù)據(jù)，η = 3，誤差條表 示使用Excel計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖4.0K2B iPSC具有與mESCs之一類似的轉(zhuǎn)錄特征。(A) OK2B
iPSCs的RT-PCR分析說(shuō)明它們表達(dá)特異于多能mESCs的基因。RlmESCs用作 陽(yáng)性對(duì)照，而OG2MEFS用作陰性對(duì)照。GAPDH用作加樣對(duì)照。(B)亞磷酸氫鹽測(cè)序 法揭示OK2B iPSCs的nanog啟動(dòng)子去甲基化，進(jìn)一步提示特異于mESCs的內(nèi)源基因的再 活化。示意性描述為進(jìn)行該分析擴(kuò)增的Nanog啟動(dòng)子區(qū)域中存在的胞嘧啶。空心圓表示 去甲基化的胞嘧啶，而實(shí)心圓/黑色圓表示甲基化的胞嘧啶。
圖5.用BIX、BayK或二者的組合處理不增加mES細(xì)胞的增殖。散點(diǎn)圖表示用 DMSO (對(duì)照)，2 μ M BayK, 1 μ M BIX 和二者的組合(BayK+BIX)處理后的 RlmES 細(xì)胞數(shù)。η = 3。誤差條表示在Excel中計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差。如在Excel中利用t檢驗(yàn)計(jì)算 的，對(duì)于各種處理均沒(méi)有獲得與DMSO相比的顯著差異。
圖6.化合物處理后關(guān)于Sox2表達(dá)的RT-PCR分析。OG2v7ROSA^+a(OG2) MEFs用DMSO (對(duì)照)，1 μ M BIX, 2 μ M BayK和二者的組合處理6天。然后利用 Qiagen RNAeasy小型試劑盒提取RNA。通過(guò)半定量PCR評(píng)估Sox2表達(dá)。OK2B iPSCs p37和Rl用作陽(yáng)性對(duì)照，GAPDH作為加樣對(duì)照。
定義
"Oct多肽”意指Octomer轉(zhuǎn)錄因子家族的任一天然存在成員，或其保留與最 接近的相關(guān)天然存在家族成員相比類似的轉(zhuǎn)錄因子活性(在至少50%，80%,或90% 活性之內(nèi))的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和任選包括轉(zhuǎn) 錄活化結(jié)構(gòu)域的多肽。示范性O(shè)ct多肽包括，例如，Oct3/4(本文中稱為"0ct4")， 其包含 POU 結(jié)構(gòu)域。參見(jiàn) Ryan，A.K.&Rosenfeld, M.G.Genes Dev.(基因發(fā)育)11， 1207-1225(1997)。在一些實(shí)施方案中，與天然存在Oct多肽家族成員諸如與以上列出的 那些相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少90%的氨基酸序列同一性。
"Klf多肽”意指Kriippel樣因子CKlfs)家族的任一天然存在成員，含有與果 蠅(Drosophila)胚胎模式調(diào)控子Kriippel類似的氨基酸序列的鋅指蛋白，或保留與最接近 相關(guān)的天然存在家族成員相比類似的轉(zhuǎn)錄因子活性(在至少50%，80%,或90%活性之 內(nèi))的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和任選包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié) 構(gòu)域的多肽。參見(jiàn)，Dang，D.T., Pevsner, J.&Yang，V.W..Cell Biol.(細(xì)胞生物學(xué))32， 1103-1121 (2000) ο 示范性Klf家族成員包括，例如，Klf 1、Klf4、和ΚΙβ，其中每種均顯示能夠彼此替換，以產(chǎn)生iPS細(xì)胞。參見(jiàn)，Nakagawa，等，Nature Biotechnology (自 然生物技術(shù))26: 101-106(2007)。在一些實(shí)施方案中，與天然存在Klf多肽家族成員諸 如與以上列出的那些相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少90%的氨基酸序列同一性。就 本文中描述的KLF多肽而言，其可以用Essrb替換。因此，意圖是對(duì)于本文中所述的各 種Klf多肽實(shí)施方案同等地描述:ESSrb替代Klf4多肽的應(yīng)用。
“ Myc多肽”意指Myc家族的任一天然存在成員(參見(jiàn)，例如Adhikary， S.&Eilers，M.Nat.Rev.Mol Cell Biol.(自然分子細(xì)胞生物學(xué)綜述)6: 635-645(2005)), 或其保留與最接近相關(guān)的天然存在家族成員相比類似的轉(zhuǎn)錄因子活性(在至少50%， 80%,或90%活性之內(nèi))的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 和任選包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的多肽。示范性Myc多肽包括，例如，c-Myc，N_Myc和 L-Myc。在一些實(shí)施方案中，與天然存在Myc多肽家族成員諸如與以上列出的那些相 比，變體在其整個(gè)序列上具有至少90%的氨基酸序列同一性。
“Sox多肽”意指SRY-相關(guān)的HMG-bodSox)轉(zhuǎn)錄因子的任一天然存在成員， 其特征在于存在高運(yùn)動(dòng)基團(tuán)(high-mobility group) (HMG)結(jié)構(gòu)域，或其保留與最接近相 關(guān)的天然存在家族成員相比類似的轉(zhuǎn)錄因子活性(在至少50%，80%,或90%活性之內(nèi)) 的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和任選包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu) 域的多肽。參見(jiàn)，例如，Dang，D.T.，等bitIBiocheriLCell Biol.(國(guó)際生物化學(xué)細(xì)胞生 物學(xué)雜志)32 1103-1121(2000)。示范性 Sox 多肽包括，例如，Soxl, Sox2, Sox3， Soxl5,或Soxl8，其中每種均顯示能夠彼此替換，以產(chǎn)生iPS細(xì)胞。參見(jiàn)，Nakagawa， 等，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))26 101-106(2007)。在一些實(shí)施方案中，與 天然存在Sox多肽家族成員諸如與以上列出的那些相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少 90%的氨基酸序列同一性。
"H3K9”指組蛋白H3賴氨酸9。H3K9可以在K9處去甲基化(di-methylated)。 參見(jiàn)，例如，Kubicek，等，MoLCell (分子細(xì)胞)473-481 0007)。
術(shù)語(yǔ)“多能”或“多能性”意指具有產(chǎn)生這樣的后代的能力的細(xì)胞，所述后代 能夠在適當(dāng)條件下經(jīng)歷分化成為共同展示與來(lái)自全部三胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層) 的細(xì)胞譜系相關(guān)的特征的細(xì)胞類型。多能干細(xì)胞可以形成出生前、出生后或成年動(dòng)物的 許多或全部組織。標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域公認(rèn)測(cè)試，諸如在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的 能力，可以用于確定細(xì)胞群的多能性，然而，不同多能干細(xì)胞特征的鑒定也可以用于檢 測(cè)多能細(xì)胞。
“多能干細(xì)胞特征”意指將多能干細(xì)胞與其他細(xì)胞相區(qū)別的細(xì)胞特征。產(chǎn)生能 夠在適當(dāng)條件下經(jīng)歷分化成為共同展示與來(lái)自全部三胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層) 的細(xì)胞譜系相關(guān)的特征的細(xì)胞類型的后代的能力是多能干細(xì)胞特征。表達(dá)或不表達(dá)某些 分子標(biāo)記物組合也是多能干細(xì)胞特征。例如，人多能干細(xì)胞表達(dá)至少一些，且任選地 全部，來(lái)自以下非限制性列表的標(biāo)記物SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, Ε-鈣黏著蛋白，UTF-1，Oct4, Rexl,和 Nanog。與多 能干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)也是多能干細(xì)胞特征。
術(shù)語(yǔ)“文庫(kù)”，根據(jù)其在本領(lǐng)域中的一般用法，用于表示分子集合，其任選地 以可以鑒別各成員的方式來(lái)組織和/或分類。文庫(kù)可以包括，但不僅限于，組合化學(xué)藥品文庫(kù)，天然產(chǎn)物文庫(kù)，和肽文庫(kù)。
“重組”多核苷酸是不以其天然狀態(tài)存在的多核苷酸，例如，所述多核苷酸包 括自然界中不存在的核苷酸序列，或所述多核苷酸處于除其天然存在的背景以外的背景 中，例如，與其在自然界中典型接近的核苷酸序列分開(kāi)，或與其典型不接近的核苷酸序 列相鄰(或相連)。例如，問(wèn)題序列可以克隆至載體中，或否則與一種或多種另外的核酸重組。
“表達(dá)盒”意指包括啟動(dòng)子或與編碼蛋白的序列可操作相連的其他調(diào)控序列的 多核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”和“表達(dá)控制序列”在本文中用于意指指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控 制序列陣列。用于本文中時(shí)，啟動(dòng)子包括接近轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的必需核酸序列，諸如在聚合 酶II型啟動(dòng)子的情形中，TATA元件。啟動(dòng)子還任選地包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或抑制子元件， 其可以位于距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)多至數(shù)千堿基對(duì)處。啟動(dòng)子包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。“組 成型”啟動(dòng)子是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下處于活性的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在 環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下處于活性的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“可操作相連”意指核酸表達(dá)控制序列(諸 如啟動(dòng)子、或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)陣列)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中所述表 達(dá)控制序列指導(dǎo)對(duì)應(yīng)于所述第二序列的核酸轉(zhuǎn)錄。
“異源序列”或“異源核酸”，用于本文中時(shí)，是來(lái)源于與特定宿主細(xì)胞異源 的來(lái)源的序列或核酸，或如果來(lái)自相同來(lái)源，則由其初始形式進(jìn)行修飾。因此，細(xì)胞中 的異源表達(dá)盒不是特定宿主細(xì)胞內(nèi)源的表達(dá)盒，例如通過(guò)與來(lái)自表達(dá)載體的核酸序列而 非染色體DNA相連，與異源啟動(dòng)子相連，或與報(bào)道基因相連等。
術(shù)語(yǔ)“試劑”或“測(cè)試化合物”意指用于本文中所述的篩選測(cè)定中的任一化合 物。試劑可以是，例如，有機(jī)化合物(例如，小分子諸如藥物)，多肽(例如，肽或抗 體)，核酸(例如，DNA、RNA,雙鏈、單鏈、寡核苷酸、反義RNA、小抑制RNA、 微小RNA、核糖核酸酶等)，寡糖，脂質(zhì)。通常，本發(fā)明篩選方法中使用的試劑具有 小于10,000道爾頓，例如，小于8000，6000，4000，2000道爾頓，例如，50-1500， 500-1500，200-2000，500-5000道爾頓的分子量。測(cè)試化合物可以采用測(cè)試化合物文 庫(kù)的形式，諸如提供充足多樣性范圍的組合文庫(kù)或隨機(jī)文庫(kù)。測(cè)試化合物任選地與融 合配偶體，例如靶向化合物，拯救化合物，二聚化合物，穩(wěn)定化合物，可尋址化合物 (addressable compounds),和其他功能結(jié)構(gòu)部分相連。常規(guī)地，具有有用特性的新化學(xué)個(gè) 體通過(guò)下述來(lái)產(chǎn)生鑒定具有一些理想特性或活性，例如在某些條件下諸如本文中所述 的條件下誘導(dǎo)多能性的能力的測(cè)試化合物(稱為“前導(dǎo)化合物”)，產(chǎn)生所述前導(dǎo)化合物 的變體，和評(píng)估那些變體化合物的特性和活性。通常，將高通量篩選(HTS)方法用于所 述分析。
術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互換地用于意指采用單鏈或雙鏈形 式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術(shù)語(yǔ)包括包含已知的核苷酸類似物或 修飾的主鏈殘基或連鎖的核酸，其是合成的、天然存在的、和非天然存在的，其具有與 參考核酸類似的結(jié)合特性，且其以與參考核苷酸類似的方式代謝。所述類似物的實(shí)例包 括，但不僅限于，硫代磷酸酯，磷酰胺，甲基膦酸酯(methyl phosphonates)，手性-甲基 膦酸酯，2-0-甲基核糖核酸，肽-核酸(PNAs)。
除非另外指出，特定核酸序列還包括其保守修飾變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子置換) 和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。特別地，簡(jiǎn)并密碼子置換可以通過(guò)產(chǎn)生這樣的序 列來(lái)獲得，在所述序列中，一個(gè)或多個(gè)所選(或全部)密碼子的第三個(gè)位置被混合堿基 和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.(核酸研究)19 5081 (1991)； Ohtsuka 等，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)260 26054608 (1985) ； Rossolini 等，Mol. Cell.Probes (分子細(xì)胞探針)8 91-98(1994))。
表達(dá)或活性的“抑制劑”、“活化劑”和“調(diào)節(jié)劑”分別用來(lái)指利用關(guān)于所述 靶蛋白(或編碼多核苷酸)表達(dá)或活性的體外和體內(nèi)測(cè)定所鑒定的抑制分子、活化分子或 調(diào)節(jié)分子，例如，配體、激動(dòng)劑、拮抗劑、及其同系物和模擬物。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑”包括 抑制劑和活化劑。抑制劑是，例如，抑制表達(dá)或結(jié)合，部分或全部阻斷刺激或蛋白酶抑 制劑活性，降低、防止、延遲活化，失活，去穩(wěn)定化，或下調(diào)所述靶蛋白活性的試劑， 例如拮抗劑?；罨瘎┦抢?，誘導(dǎo)或活化所述靶蛋白表達(dá)或結(jié)合，刺激、增加、開(kāi)放、 活化、促進(jìn)、增強(qiáng)活化或蛋白酶抑制劑活性，致敏或上調(diào)所述靶蛋白(或編碼多核苷酸) 的活性，例如，激動(dòng)劑。調(diào)節(jié)劑包括天然存在的和合成的配體，拮抗劑和激動(dòng)劑(例 如，起激動(dòng)劑或拮抗劑功能的小化學(xué)分子、抗體等)。所述關(guān)于抑制劑和活化劑的測(cè)定包 括，例如，將推定的調(diào)節(jié)劑化合物應(yīng)用到表達(dá)所述靶蛋白的細(xì)胞，然后確定對(duì)所述靶蛋 白活性的功能性作用，如上所述。將用潛在的活化劑、抑制劑、或調(diào)節(jié)劑處理的包括所 述靶蛋白的樣品或測(cè)定與無(wú)抑制劑、活化劑、或調(diào)節(jié)劑的對(duì)照樣品進(jìn)行比較，以檢驗(yàn)作 用程度。對(duì)照樣品(未用調(diào)節(jié)劑處理)被賦予100%的相對(duì)活性值。當(dāng)活性值相對(duì)于對(duì) 照為約80%，任選50%或25，10%, 5%或時(shí)，實(shí)現(xiàn)所述靶蛋白的抑制。當(dāng)活性值 相對(duì)于對(duì)照為約 110%，任選 150%，任選 200，300%, 400%, 500%,或 1000-3000% 或更高時(shí)，實(shí)現(xiàn)所述靶蛋白的活化。
發(fā)明詳述
I.介紹
本發(fā)明部分地基于意外的發(fā)現(xiàn)，即小分子可以用于模擬參與引發(fā)誘導(dǎo)的多能干 細(xì)胞GPS)的轉(zhuǎn)錄因子的作用。例如，如本文中詳細(xì)描述地，Oct4可以用減少組蛋白 3賴氨酸9CH3K9)甲基化的小分子“代替”。因此，例如，BIX01294，一種特異性抑 制G9a(關(guān)于H3K9的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶)的小分子，在與其中已經(jīng)表達(dá)Klf4、c-Myc和 Sox2的哺乳動(dòng)物細(xì)胞相接觸時(shí)，引起多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)。
這些結(jié)果不僅關(guān)于H3K9的甲基化作用及其參與細(xì)胞編程方面令人感興趣，而且 還表明可以鑒定代替以前證明是多能干細(xì)胞誘導(dǎo)所必需的轉(zhuǎn)錄因子的小分子。這可以是 特別令人感興趣的，其中目的是將誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，或隨后分化的細(xì)胞，諸如源自iPS 細(xì)胞的祖細(xì)胞引入(或再引入)至患者中。因?yàn)檫@四種iPS轉(zhuǎn)錄因子中的數(shù)種(例如， Oct4, Myc)具有已知的致癌活性，所以用其他較小致癌性或非致癌性分子代替這些因子 可能是有益的。此外，用不需要轉(zhuǎn)化的小分子代替這四種因子中的一些或每一種(且由 此DNA的潛在致癌作用插入染色體)應(yīng)該進(jìn)一步有助于減少涉及iPS的治療可能的癌癥 副作用。
本發(fā)明還提供誘導(dǎo)的多能細(xì)胞，其中至少一些iPS轉(zhuǎn)錄因子以內(nèi)源性或更低水平 表達(dá)，然而是多能性的。本發(fā)明部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即某些內(nèi)源性表達(dá)Sox2的細(xì)胞可以通過(guò)僅引入和異源表達(dá)Oct4和Klf4來(lái)誘導(dǎo)多能性。
此外，如本文中所示，不內(nèi)源或異源表達(dá)Sox多肽(例如，Sox2)的非多能細(xì)胞 可以利用本發(fā)明的方法來(lái)誘導(dǎo)多能性。例如，多能性可以通過(guò)僅將Oct4和]ilf4引入至 非多能細(xì)胞(例如，成纖維細(xì)胞)來(lái)誘導(dǎo)，所述非多能細(xì)胞也與抑制H3K9甲基化的試劑 相接觸，且任選地也與下述中的至少一種相接觸L-型鈣通道激動(dòng)劑，cAMP途徑活化 劑，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑，核受體激動(dòng)劑，GSK3抑制劑，或MEK抑制劑。 本發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)試劑組合諸如GSK抑制劑和HDAC抑制劑；或GSK抑制劑和cAMP 途徑活化劑；或GSK抑制劑和ALK5抑制劑(有或無(wú)G9a抑制劑)在異源性表達(dá)單獨(dú)的 Oct4，或Oct4/Sox2或Sox2/Klf4的細(xì)胞中有效誘導(dǎo)多能性。因此，本發(fā)明提供細(xì)胞和 試劑的混合物，其中所述細(xì)胞最初不是多能細(xì)胞(例如，是非干細(xì)胞)且任選地異源或內(nèi) 源性表達(dá)Oct4和/或Klf4或否則與Oct4和/或Klf4接觸(in intact with)，且其中所述試 劑是下列中的一種或多種試劑抑制H3K9甲基化的試劑，L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP 途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑；MEK抑 制劑，TGF0受體/ALK5抑制劑，HDAC抑制劑；和/或Erk抑制劑。
如下文中進(jìn)一步討論地，本發(fā)明還提供篩選具有多能干細(xì)胞特征的細(xì)胞的新方 法，其通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)用MEK抑制劑，抑制H3K9甲基化的試劑，L-型Ca通道激 動(dòng)劑；cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制 劑；MEK抑制劑，TGF β受體/ALK5抑制劑，HDAC抑制劑；或Erk抑制劑培養(yǎng)待篩 選細(xì)胞。MEK抑制劑，例如，抑制非iPS細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)iPS細(xì)胞生長(zhǎng)和穩(wěn)定性重 編程，由此富集關(guān)于具有多能干細(xì)胞特征的細(xì)胞的特定細(xì)胞混合物。
II.多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)
A.異源/內(nèi)源表達(dá)
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，鑒定內(nèi)源性表達(dá)來(lái)自由Oct多肽、Klf多肽、Myc 多肽、和Sox多肽組成的組的至少一種(且任選地，2或3種)蛋白的非多能細(xì)胞。然 后，來(lái)自該組的其余(非內(nèi)源性表達(dá)的)蛋白可以在所述細(xì)胞中異源性表達(dá)，且篩選獲得 重編程和/或去分化為多能細(xì)胞，任選地在存在下列中一種或多種的條件下MEK抑制 劑，抑制H3K9甲基化的試劑，L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn) 移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑；MEK抑制劑，TGF β受體/ALK5 抑制劑，HDAC抑制劑；和/或Erk抑制劑。
認(rèn)為可以篩選任何類型的哺乳動(dòng)物非多能細(xì)胞，以獲得蛋白表達(dá)和隨后轉(zhuǎn)變?yōu)?多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，起始細(xì)胞是分離的祖細(xì)胞。示例性祖細(xì)胞包括，但不僅 限于，內(nèi)胚層祖細(xì)胞、中胚層祖細(xì)胞(例如，肌肉祖細(xì)胞、骨骼祖細(xì)胞、血液祖細(xì)胞)、 和外胚層祖細(xì)胞(例如，表皮組織祖細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞)。有效用于本發(fā)明這些方面的細(xì) 胞可以通過(guò)針對(duì)Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽的表達(dá)篩選細(xì)胞系，或通過(guò) 鑒定具有減小的啟動(dòng)子甲基化的細(xì)胞(例如，通過(guò)DNA亞硫酸氫鹽測(cè)序法)或通過(guò)鑒定 具有修飾的組蛋白狀態(tài)以確定這些基因降低的沉默狀態(tài)來(lái)容易地鑒定。然后，不內(nèi)源表 達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可以異源表達(dá)，以在不異源表達(dá)已經(jīng)內(nèi)源表達(dá)的那些因子的條件下誘導(dǎo)多 能性。
如實(shí)施例中所示，一些細(xì)胞(例如，神經(jīng)祖細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示))可以通過(guò)僅異源表達(dá)Oct4和:Klf4來(lái)誘導(dǎo)多能性。這證明Sox和Myc蛋白，且可能的Oct 和Klf蛋白，不需要都被過(guò)表達(dá)(例如，使用高表達(dá)病毒載體)來(lái)獲得多能性。相反，這 些蛋白中的一些可以以內(nèi)源性或甚至更低的可檢測(cè)水平來(lái)表達(dá)，且仍適合通過(guò)異源表達(dá) 該組中其他成員轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芗?xì)胞。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，鑒定內(nèi)源性表達(dá) Sox多肽和/或Myc多肽的細(xì)胞，且Oct多肽和Klf多肽在該細(xì)胞內(nèi)異源性表達(dá)，由此誘 導(dǎo)該細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芗?xì)胞。在一些實(shí)施方案中，鑒定內(nèi)源性表達(dá)Oct多肽和/或Klf多肽 和/或Myc多肽的細(xì)胞，且Sox多肽在該細(xì)胞內(nèi)異源性表達(dá)，由此誘導(dǎo)該細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄?細(xì)胞。任選地，SaU4(Zhang 等，NatCell Biol.(自然細(xì)胞生物學(xué))8 (10) 1114-23(2006)) 可以替換任一或全部的Myc、Klf4、和Sox2進(jìn)行表達(dá)。
誘導(dǎo)本文中所述的多能性的效率可以通過(guò)在非多能細(xì)胞內(nèi)含例如UTF1，SV40, TERT中一種或多種(通過(guò)引入編碼這些基因產(chǎn)物的表達(dá)盒，或通過(guò)使所述細(xì)胞與蛋白本 身相接觸)和/或通過(guò)減少p53表達(dá)(例如，通過(guò)siRNA)來(lái)進(jìn)一步提高。參見(jiàn)，例如， Zhao,等，Cell Stem Cell(細(xì)胞干細(xì)胞)3 475-479(2008)。
B.轉(zhuǎn)錄因子蛋白
如本文中詳述地，本發(fā)明的許多實(shí)施方案涉及將一種或多種多肽引入至細(xì)胞 中，由此在該細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性。如上討論地，將多肽引入至細(xì)胞可以包括將包括一個(gè) 或多個(gè)表達(dá)盒的多核苷酸引入至細(xì)胞中和誘導(dǎo)表達(dá)，由此將所述多肽通過(guò)由所述表達(dá)盒 的轉(zhuǎn)錄和翻譯引入至細(xì)胞中。備選地，可以通過(guò)許多不同的方法將外源多肽(即，由細(xì) 胞外提供的和/或不由細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白)引入至細(xì)胞中，所述方法不涉及引入編碼所述多 肽的多核苷酸。
因此，關(guān)于本文中所述的提到將多肽引入細(xì)胞，或?qū)⒕幋a多肽的表達(dá)盒引入細(xì) 胞的本發(fā)明任一實(shí)施方案，應(yīng)該理解本發(fā)明還明確地提供將多肽作為蛋白外源引入至細(xì) 胞中。因此，在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物非多能細(xì)胞通過(guò)以下來(lái)誘導(dǎo)多能性a)將Klf 多肽、Oct多肽、Myc多肽、和/或Sox多肽中一種或多種外源性引入至非多能細(xì)胞中； 和任選地b)使細(xì)胞與MEK抑制劑，抑制H3K9甲基化的試劑，L-型Ca通道激動(dòng)劑； cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑； MEK抑制劑，TGF β受體/ALK5抑制劑，HDAC抑制劑；或Erk抑制劑中的一種或多 種相接觸，由此生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，鑒定內(nèi)源性表達(dá)來(lái)自由Oct 多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽組成的組中的至少一種(且任選地，2或3種) 蛋白的非多能細(xì)胞。然后來(lái)自該組的其余(非內(nèi)源性表達(dá)的)蛋可以外源性引入至該細(xì) 胞內(nèi)，并篩選重編程和/或去分化為多能細(xì)胞，任選地，在存在下列中的一種或多種的 條件下MEK抑制劑，抑制H3K9甲基化的試劑，L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP途徑活 化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑；MEK抑制劑， TGF β受體/ALK5抑制劑，HDAC抑制劑；或Erk抑制劑。
在一些實(shí)施方案中，鑒定這樣的細(xì)胞，即內(nèi)源性表達(dá)Sox多肽和/或Myc多肽， 且作為第二步將Oct多肽和Klf多肽外源性引入至該細(xì)胞中，由此誘導(dǎo)該細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄?細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，鑒定這樣的細(xì)胞，即內(nèi)源性表達(dá)Oct多肽和/或Klf多肽和/ 或Myc多肽，且將Sox多肽外源性引入至該細(xì)胞中，由此誘導(dǎo)該細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芗?xì)胞。28
向細(xì)胞中外源性引入多肽可以以許多方式發(fā)生。一種或多種蛋白可以簡(jiǎn)單地在 靶細(xì)胞存在下，在容許將該蛋白引入細(xì)胞內(nèi)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，外 源蛋白包括目的轉(zhuǎn)錄因子多肽，其與增強(qiáng)該轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞(且任選地細(xì)胞核)的能力 的多肽相連(例如，作為融合蛋白相連或另外共價(jià)或非共價(jià)相連).
增強(qiáng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽序列的實(shí)例包括，但不僅限于，果蠅同源異型蛋白觸角 足轉(zhuǎn)錄蛋白(AntHD) (Joliot 等，New Biol.(新生物學(xué))3 1121-34，1991 ； Joliot 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，88: 1864-8，1991 ； Le Roux 等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，90: 9120-4，1993)，單純皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋 白 VP22 (Elliott 和 O，Hare，Cell (細(xì)胞)88 223-33，1997) ； HIV-I 轉(zhuǎn)錄活化 TAT 蛋 白(Green 和 Loewenstein, Cell (細(xì)胞)55 1179-1188，1988 ； Frankel 和 Pabo, Cell (細(xì) 胞)55: 1289-1193，1988)；遞送增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白諸如美國(guó)專利號(hào)6,730,四3中記述的(包 括但不僅限于包括至少7-25個(gè)連續(xù)的精氨酸的的肽序列)；和可商購(gòu)的Penetratin 1 肽，和可獲自法國(guó)巴黎的Daitos S.A.的Vectocell 平臺(tái)的Diatos肽載體(“DPVs“)。 還參見(jiàn)，W0/2005/084158和W0/2007/123667和其中記述的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。不僅這些 蛋白可以穿過(guò)質(zhì)膜，而且其他蛋白，諸如本文中所述的轉(zhuǎn)錄因子的附著足以刺激細(xì)胞吸 收這些復(fù)合物。
在一些實(shí)施方案中，本文中所述的轉(zhuǎn)錄因子多肽作為脂質(zhì)體，或脂質(zhì)混合物諸 如可商購(gòu)的Fugene6和Lipofectamine的一部分外源性引入。在另一種備選方案中，轉(zhuǎn)錄 因子蛋白可以顯微注射或另外直接引入到靶細(xì)胞中。
如實(shí)施例中所討論地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子多肽溫育細(xì)胞 一段延長(zhǎng)的時(shí)期對(duì)該細(xì)胞有毒。因此，本發(fā)明用I^lf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和/或 Sox多肽中的一種或多種間歇性溫育非多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞，介于細(xì)胞溫育之間的使其缺乏 所述一種或多種多肽。在一些實(shí)施方案中，使用和不用所述多肽的溫育周期可以重復(fù)2， 3，4，5，6，或更多次，且進(jìn)行足夠長(zhǎng)時(shí)間(即，使用和不用所述蛋白的溫育)，從而實(shí) 現(xiàn)多能細(xì)胞的發(fā)育。可以包括不同試劑(例如，MEK抑制劑和/或GSK抑制劑和/或 TGF0抑制劑)，以提高本方法的效率。
C.iPS轉(zhuǎn)錄因子的小分子替代
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞表達(dá)(內(nèi)源或異源表達(dá))選自O(shè)ct多肽、Klf 多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一種蛋白(例如，這些中的至少1，2，或3種) 并與至少一種試劑相接觸，其中所述試劑足以導(dǎo)致該細(xì)胞在不表達(dá)其余不表達(dá)蛋白中的 一種或多種(即不在該細(xì)胞中表達(dá)的Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、或Sox多肽中的任 一種)的條件下誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞。
如實(shí)施例中所示，細(xì)胞與某些試劑相接觸可以“補(bǔ)償”或替代為了產(chǎn)生多能細(xì) 胞通常另外必需表達(dá)這些蛋白之一的理解。通過(guò)使細(xì)胞與在功能上替代以上所列蛋白之 一的表達(dá)的試劑相接觸，可能產(chǎn)生表達(dá)除被該試劑替代或補(bǔ)償?shù)牡鞍滓酝獾娜恳陨纤?列蛋白的多能細(xì)胞。其余蛋白可以內(nèi)源地、異源地、或以二者的一些組合表達(dá)(例如， Sox和Myc多肽可以內(nèi)源表達(dá)，Klf多肽可以異源表達(dá)，且相反，Oct多肽可以通過(guò)使細(xì) 胞與補(bǔ)償試劑諸如抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑相接觸來(lái)“替代”)。
此外，小分子可以提高用于產(chǎn)生多能細(xì)胞(例如，iPS細(xì)胞)的方法的效率。例如，提高的效率可以通過(guò)加速產(chǎn)生所述多能細(xì)胞的時(shí)間來(lái)證明(例如，通過(guò)與不用所述 小分子的相似或相同方法相比，將發(fā)育多能細(xì)胞的時(shí)間縮短至少一天)。備選地，或組合 地，小分子可以增加由特殊方法產(chǎn)生的多能細(xì)胞數(shù)量(例如，與不用所述小分子的相似 或相同方法相比，增加給定時(shí)期內(nèi)的數(shù)量至少10%，50%, 100%, 200%, 500%等)。
如實(shí)施例中所述，異源性表達(dá)Klf4、Sox2、和Myc的細(xì)胞可以通過(guò)在無(wú)Oct4異 源表達(dá)的條件下使該細(xì)胞與抑制H3K9甲基化的試劑相接觸來(lái)誘導(dǎo)多能性。實(shí)際上，已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)多能性可以通過(guò)使非多能細(xì)胞與抑制H3K9甲基化的試劑相接觸和引入單獨(dú)的Oct 4(例如，也不引入用于表達(dá)Myc多肽、Sox多肽、或Klf多肽的載體)或0ct4與Klf4來(lái) 誘導(dǎo)?？梢哉T導(dǎo)多能性的細(xì)胞包括，但不僅限于，神經(jīng)祖細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。抑制H3K9 甲基化的試劑包括抑制靶向H3K9的甲基化酶(也稱為甲基轉(zhuǎn)移酶)的試劑。例如，0 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶使H3K9甲基化，且已知對(duì)(3 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制減少H3K9的 甲基化。參見(jiàn)，例如，Kubicek，等，MoLCell(分子細(xì)胞)473-481 0007)。根據(jù)本發(fā) 明的方法有效使用的(3 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的實(shí)例是BIX0U94(參見(jiàn)，例如，Kubicek， 等，MoLCell (分子細(xì)胞)473-481 Q007))，或其鹽、水合物、同種型、消旋體、溶劑化 物和前體藥物形式。Bix01294顯示如下
權(quán)利要求
1.一種由哺乳動(dòng)物非多能細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括 a)使所述細(xì)胞與以下至少一種相接觸抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑；L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑；MEK抑制劑；TGF β受體/ALK5抑制劑； HDAC抑制劑；和 erk抑制劑，由此生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸步驟包括a)使所述細(xì)胞與以下至少兩種相接觸i.抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑；和ii.選自由以下組成的組的試劑 L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑；MEK抑制劑；TGF β受體/ALK5抑制劑； HDAC抑制劑；和 erk抑制劑。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其還包括b)將用于表達(dá)Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和/或Sox多肽的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒 引入所述非多能細(xì)胞中。
4.權(quán)利要求3的方法，其中將Klf4和Oct4引入所述細(xì)胞中。
5.一種由哺乳動(dòng)物非多能細(xì)胞生成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括a)向所述非多能細(xì)胞中引入Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的一種或 多種的表達(dá)或修飾Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的一種或多種的表達(dá)；b)使所述細(xì)胞與抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑相接觸，由此生成誘 導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述步驟a)包括使所述非多能細(xì)胞與選自Klf多肽、Oct 多肽、Myc多肽、和Sox多肽的一種或多種外源多肽相接觸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述步驟a)包括以下至少2個(gè)循環(huán)i.使所述非多能細(xì)胞與選自Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox多肽的一種或多種外源多肽相接觸； .隨后在缺乏所述外源多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述步驟a)包括將一個(gè)或多個(gè)用于表達(dá)Klf多肽、Oct多 肽、Myc多肽、和Sox多肽的表達(dá)盒引入至所述非多能細(xì)胞中。
9.權(quán)利要求5的方法，其中將用于表達(dá)Oct多肽的表達(dá)盒和用于表達(dá)Sox多肽的表達(dá) 盒引入至所述非多能細(xì)胞中。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述引入步驟包括向所述非多能細(xì)胞中引入一個(gè)或多個(gè) 用于表達(dá)KLF多肽和Oct多肽的表達(dá)盒，其中用于Myc多肽和/或Sox多肽的表達(dá)盒不 引入至所述細(xì)胞中。
11.權(quán)利要求5中的方法，其中所述Klf多肽是Klf4且所述Oct多肽是0ct4。
12.權(quán)利要求5的方法，其中所述非多能細(xì)胞是體細(xì)胞。
13.權(quán)利要求5的方法，其中所述非多能細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
14.權(quán)利要求5的方法，其中用于表達(dá)Myc多肽的表達(dá)盒和用于表達(dá)Klf多肽的表達(dá) 盒均不引入至所述非多能細(xì)胞中。
15.權(quán)利要求5的方法，其中所述引入步驟在體內(nèi)進(jìn)行。
16.權(quán)利要求5的方法，其中所述引入步驟在體外進(jìn)行。
17.權(quán)利要求5的方法，其還包括C)選擇表現(xiàn)出多能干細(xì)胞特征的細(xì)胞。
18.權(quán)利要求5的方法，其中所述非多能細(xì)胞獲自動(dòng)物；且所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞分化為需要的細(xì)胞類型。
19.權(quán)利要求18的方法，其中將所述需要的細(xì)胞類型引入至所述動(dòng)物中。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述動(dòng)物是人。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述動(dòng)物是非人動(dòng)物。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所選擇的細(xì)胞不包括用于表達(dá)0ct4的外源表達(dá)盒。
23.權(quán)利要求5的方法，其中所述試劑抑制H3K9甲基化。
24.權(quán)利要求23的方法，其中抑制H3K9甲基化的所述試劑是BIX01294。
25.權(quán)利要求5的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
26.權(quán)利要求5的方法，其中所述細(xì)胞是小鼠、狗、牛、豬、大鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物 細(xì)胞。
27.權(quán)利要求5的方法，其中所述非多能細(xì)胞是祖細(xì)胞。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述祖細(xì)胞是神經(jīng)祖細(xì)胞、皮膚祖細(xì)胞或毛囊祖細(xì)胞。
29.權(quán)利要求5的方法，其中所述引入步驟包括引入下述第一載體，其包含與第一表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第一表達(dá)盒包括編碼 Klf4的多核苷酸；第二載體，其包含與第二表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第二表達(dá)盒包括編碼 Sox2的多核苷酸；和第三載體，其包含與第三表達(dá)盒可操作相連的啟動(dòng)子，所述第三表達(dá)盒包括編碼 C-Myc的多核苷酸。
30.權(quán)利要求5的方法，其中所述載體是反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體。
31.一種篩選誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞重編程或去分化成為多能干細(xì)胞的試劑的方法，所述 方法包括a)將Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一種，但非全部引入至非 多能細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；b)使所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與不同試劑的文庫(kù)相接觸；c)針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選所接觸的細(xì)胞；和d)使干細(xì)胞特征的形成與來(lái)自所述文庫(kù)的特定試劑相關(guān)聯(lián)，由此鑒定刺激細(xì)胞去分 化成為多能干細(xì)胞的試劑。
32.權(quán)利要求31的方法，其中步驟a)包括將一個(gè)或多個(gè)用于表達(dá)Oct多肽、Klf多 肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一種，但非全部的表達(dá)盒引入至所述非多能細(xì)胞 中。
33.權(quán)利要求31的方法，其中步驟a)包括將外源Oct多肽、外源Klf多肽、外源Myc 多肽、和外源Sox多肽中的至少一種，但非全部引入至所述非多能細(xì)胞中。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述特定試劑在50-1500道爾頓之間。
35.權(quán)利要求31的方法，其中步驟a)包括將兩個(gè)表達(dá)盒引入所述細(xì)胞，其中每個(gè)表 達(dá)盒包括編碼不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多 肽、和Sox多肽組成的組，且所述組的其余成員不引入至所述細(xì)胞內(nèi)。
36.權(quán)利要求31的方法，其中步驟a)包括將三個(gè)表達(dá)盒引入所述細(xì)胞，其中每個(gè)表 達(dá)盒包括編碼不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多 肽、和Sox多肽組成的組，且所述組的其余成員不引入至所述細(xì)胞內(nèi)。
37.權(quán)利要求31的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
38.權(quán)利要求31的方法，其中所述細(xì)胞是非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
39.權(quán)利要求31的方法，其中所述非多能細(xì)胞是祖細(xì)胞。
40.權(quán)利要求40的方法，其中所述祖細(xì)胞是神經(jīng)祖細(xì)胞、皮膚祖細(xì)胞或毛囊祖細(xì)胞。
41.權(quán)利要求31的方法，其中所述Oct多肽是0ct4，所述Klf多肽是:Klf4，所述Myc 多肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
42.—種篩選具有多能干細(xì)胞特征的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括a)使細(xì)胞與MAPK/ERK激酶(MEK)抑制劑相接觸，從而抑制非多能細(xì)胞生長(zhǎng)并促 進(jìn)多能干細(xì)胞生長(zhǎng)；和b)針對(duì)多能干細(xì)胞特征篩選所接觸的細(xì)胞。
43.權(quán)利要求42的方法，其包括在步驟a)之前，使所述細(xì)胞與試劑文庫(kù)相接觸；和，在步驟b)之后，基于步驟b)的結(jié)果篩選誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的試劑。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述細(xì)胞是小鼠、狗、牛、豬、大鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物 細(xì)胞。
46.權(quán)利要求42的方法，其中所述MEK抑制劑是PD0325901。
47.哺乳動(dòng)物細(xì)胞和抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑的混合物，其中所述細(xì)胞表達(dá)Oct多肽、Klf多肽、Sox多肽、和Myc多肽中的至少一種或多種；和/或 與外源Oct多肽、外源Klf多肽、外源Sox多肽、和外源Myc多肽中的至少一種或多 種相接觸。
48.權(quán)利要求47的混合物，其中所述細(xì)胞包括第一、第二和第三重組表達(dá)盒， 所述第一表達(dá)盒包括與編碼Klf多肽的多核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子， 所述第二表達(dá)盒包括與編碼Sox多肽的多核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子；和 所述第三表達(dá)盒包括與編碼Myc多肽的多核苷酸可操作相連的啟動(dòng)子。
49.權(quán)利要求47的混合物，其中所述試劑抑制H3K9甲基化。
50.權(quán)利要求49的方法，其中抑制H3K9甲基化的試劑是BIX01294。
51.權(quán)利要求47的混合物，其中所述細(xì)胞包括一種或多種反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì) 粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體，所述一種或多種反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、 慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體包括所述第一、第二和第三 表達(dá)盒。
52.權(quán)利要求51的混合物，所述混合物包括第一、第二和第三反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病 毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá)載體，所述第一反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá) 載體包括所述第一表達(dá)盒；所述第二反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá) 載體包括所述第二表達(dá)盒；和所述第三反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒、腺病毒質(zhì)粒、非病毒質(zhì)粒、或附加型表達(dá) 載體包括所述第三表達(dá)盒。
53.權(quán)利要求47的混合物，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
54.權(quán)利要求47的混合物，其中所述細(xì)胞是小鼠、狗、牛、豬、大鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng) 物細(xì)胞。
55.權(quán)利要求47的混合物，其中所述細(xì)胞包括祖細(xì)胞。
56.權(quán)利要求55的混合物，其中所述祖細(xì)胞是神經(jīng)祖細(xì)胞、皮膚祖細(xì)胞或毛囊祖細(xì)胞。
57.權(quán)利要求47的混合物，其中所述Klf多肽是Klf4，所述Myc多肽是C_MyC，且所 述Sox多肽是Sox2。
58.—種內(nèi)源性表達(dá)選自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽組成的組的 至少一種蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞不內(nèi)源性表達(dá)所述組中的至少一種蛋白，其中不內(nèi)源性表達(dá)的蛋白由所述 細(xì)胞內(nèi)存在的異源重組表達(dá)盒編碼的RNA來(lái)表達(dá)，所述細(xì)胞內(nèi)源性或異源性表達(dá)Oct多肽、Iilf多肽、Myc多肽、和Sox多肽的每一 種；和經(jīng)由所述異源表達(dá)盒的蛋白表達(dá)導(dǎo)致所述細(xì)胞由非多能細(xì)胞重編程或去分化成為多 能干細(xì)胞。
59.權(quán)利要求58的細(xì)胞，其中所述Oct多肽是Oct4，所述Klf多肽是Klf4，所述Myc 多肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
60.權(quán)利要求58的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)Sox多肽和Myc多肽且異源性表 達(dá)Oct多肽和Klf多肽。
61.權(quán)利要求60的細(xì)胞，其中所述Oct多肽是0ct4，所述Klf多肽是Klf4，所述Myc 多肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
62.一種誘導(dǎo)細(xì)胞中0ct4表達(dá)的方法，所述方法使所述細(xì)胞與抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑相接觸，由此誘導(dǎo)細(xì)胞 中的0ct4表達(dá)。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述細(xì)胞在即將進(jìn)行所述接觸步驟前不表達(dá)0ct4。
64.權(quán)利要求62的方法，其中相接觸的細(xì)胞不是多能細(xì)胞。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述細(xì)胞在所述接觸步驟后誘導(dǎo)為多能性。
66.一種將非多能細(xì)胞誘導(dǎo)為多能細(xì)胞的方法，所述方法包括使所述非多能細(xì)胞與一種或多種誘導(dǎo)多能性的試劑相接觸和/或?qū)⒈磉_(dá)盒引入所述 細(xì)胞以表達(dá)誘導(dǎo)多能性的蛋白，其中所述細(xì)胞不在飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)且所述細(xì)胞附著于固 體培養(yǎng)物表面。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述細(xì)胞通過(guò)分子粘連附著于固體培養(yǎng)物表面，所述分 子粘連選自由基質(zhì)膠、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)或ECM類似物、層粘連蛋白、纖連蛋白、和 膠原蛋白組成的組。
68.權(quán)利要求66的方法，其中所述接觸步驟包括權(quán)利要求5或引用權(quán)利要求5的權(quán)利 要求的步驟。
69.哺乳動(dòng)物細(xì)胞和以下至少兩種的混合物 抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑； L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑；MEK抑制劑；TGF β受體/ALK5抑制劑； HDAC抑制劑；和 erk抑制劑。
70.權(quán)利要求69的混合物，其中所述混合物包括i.抑制H3K9甲基化或促進(jìn)H3K9去甲基化的試劑，和ii.選自由以下組成的組的試劑 L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑； MEK抑制劑，TGF β受體/ALK5抑制劑， HDAC抑制劑；和 erk抑制劑。
71.權(quán)利要求69的混合物，其中所述細(xì)胞包括用于表達(dá)Oct多肽的異源表達(dá)盒和用于 表達(dá)Sox多肽的異源表達(dá)盒。
72.權(quán)利要求69的混合物，其中所述細(xì)胞是非多能細(xì)胞。
73.權(quán)利要求69的混合物，其中所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
74.權(quán)利要求71的混合物，其中用于表達(dá)Myc多肽的表達(dá)盒和用于表達(dá)Klf多肽的表 達(dá)盒均不引入至所述非多能細(xì)胞中。
75.—種組合物，其包括以下至少兩種 抑制H3K9甲基化的試劑；L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑；MEK抑制劑，TGF β受體/ALK5抑制劑， HDAC抑制劑；和 erk抑制劑。
76.權(quán)利要求75的組合物，其包括i.抑制H3K9甲基化的試劑，和ii.選自由以下組成的組的試劑 L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑；MEK抑制劑，TGF β受體/ALK5抑制劑， HDAC抑制劑；和 erk抑制劑。
77.試劑盒，其包括以下至少兩種 抑制H3K9甲基化的試劑；L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體； GSK3抑制劑； MEK抑制劑，TGF β受體/ALK5抑制劑， HDAC抑制劑；和 erk抑制劑。
78.權(quán)利要求77的試劑盒，其包括i.抑制H3K9甲基化的試劑，和ii.選自由以下組成的組的試劑 L-型Ca通道激動(dòng)劑；cAMP途徑活化劑；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑；核受體配體；GSK3抑制劑；MEK抑制劑，TGF β受體/ALK5抑制劑， HDAC抑制劑；和 erk抑制劑。
79.權(quán)利要求77的試劑盒，其還包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)多能性的小分子的鑒定和應(yīng)用，以及誘導(dǎo)多能性的其他方法。
文檔編號(hào)C12N5/074GK102027105SQ200980117686
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日
發(fā)明者丁生, 卡羅琳·德蓬, 周宏彥, 師巖, 朱賽勇, 李文林, 林通翔 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究所