專利名稱：一種能產(chǎn)廣譜抗生素的綠僵菌 gyya0601菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種能產(chǎn)廣譜抗生素的戴氏綠僵菌菌株 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
動植物、微生物在生物進(jìn)化的歷史長河中，為適應(yīng)或抵御外界不良環(huán)境，形成了結(jié) 構(gòu)和功能具有多樣性特點的代謝產(chǎn)物。微生物代謝產(chǎn)物的多樣性與生物活性的多樣性是一 般合成化合物不能比擬的，幾乎所有藥物篩選模型都能從微生物中篩選到生理活性物。自 上世紀(jì)青霉素的發(fā)現(xiàn)與研制成功以來，人類已經(jīng)從微生物代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了大量的醫(yī)用或 農(nóng)用藥物。但已研究檢測的微生物卻僅占微生物種類的3%左右。此外，在天然藥源中，微 生物具有種類多、代謝途徑和代謝產(chǎn)物豐富、生產(chǎn)方式和藥用方式多、輕道地、易實現(xiàn)工業(yè) 化生產(chǎn)等植物藥無法媲美的優(yōu)勢，因此，微生物是創(chuàng)新藥物的天然寶庫和有效途徑。抗生素 是微生物來源藥物的主要組成部分之一。無論是醫(yī)用抗生素還是農(nóng)用抗生素，目前都無法 回避一個問題，即，如何獲得高效、廣譜、低毒、安全的抗生素。對醫(yī)用抗生素而言，還有一個 更嚴(yán)重的耐藥性問題。長期以來濫用抗生素帶來的抗生素耐藥性已可能威脅到人類生存發(fā) 展。因此，新結(jié)構(gòu)、新靶點、新作用機(jī)理、尤其是抗耐藥性抗生素類藥物的研究是全球醫(yī)藥業(yè) 的重大課題。微生物作為創(chuàng)新藥物的天然藥源寶庫，從中發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計的各種類型的抗 生素，為人類社會的發(fā)展的創(chuàng)造了一個又一個奇跡。而今所面臨的新問題，除了利用化學(xué)修飾、基因工程等技術(shù)手段改造傳統(tǒng)抗生素 或生產(chǎn)菌外，更重要是從絕大多數(shù)未曾發(fā)現(xiàn)的微生物資源中尋找新的有益資源，尤其是極 端環(huán)境微生物或特殊類型微生物。而蟲草(蟲生真菌)就是特殊類型微生物中的杰出代表 之一，它與昆蟲或其它節(jié)肢動物形成寄生或共生關(guān)系，是生態(tài)圈中物種生態(tài)平衡的自然調(diào) 節(jié)者，或者說對有害昆蟲是天然的生物農(nóng)藥。因此，很可能在某些種類的蟲草中發(fā)掘結(jié)構(gòu)新 穎、作用方式特殊的新型農(nóng)用或醫(yī)用抗微生物抗生素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抑菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣的新的戴氏綠僵菌 菌株，該綠僵菌能產(chǎn)廣譜性抗生素，可以用于制備抗細(xì)菌、抗真菌醫(yī)用或農(nóng)用抗生素類藥 物。本發(fā)明新的戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株CGMCC NO. 2880。發(fā)明 人在貴州省貴陽市羊艾茶場土壤中采集到一種蟲草，利用多途徑多批次和次生子囊孢子微 循環(huán)產(chǎn)孢方法(參見梁宗琦.中國真菌志(第23卷)蟲草屬.北京科學(xué)出版社，2007.) 分離培養(yǎng)獲得二十余株菌株，所采的蟲草和分離獲得的菌株經(jīng)鑒定為戴氏蟲草Cordyceps taii和戴氏綠僵菌Metarhizium taii。經(jīng)抗生活性篩選，戴氏綠僵菌GYYA0601菌株抑菌 能力強(qiáng)、抑菌譜廣。GYYA0601菌株已于2009年1月16日保藏在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 2880，分類命名為戴氏綠僵菌，拉丁文學(xué)名為Metarhizium taii。上述戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株的生物學(xué)形態(tài)特征描述為在 PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)12天后，菌絲有隔無色至暗色，平展，菌落中央白色，外圍產(chǎn)孢結(jié)構(gòu) 及分生孢子形成明顯的8-10條墨綠色環(huán)帶，分生孢子瓶梗(8. 0-22. 5umX0. 9-1. 8 um)近 柱形，具短尖，單生于氣生菌絲或緊密地輪生于分生孢子梗或原瓶梗上，也可通過微循環(huán)產(chǎn) 孢直接從次生子囊孢子上產(chǎn)生，分生孢子(3.9-13. liimX2.4-3. 2iim)多串生，柱狀，中部 稍縊縮，兩端圓或一端稍細(xì)，未見雙生孢子，由次生子囊孢子微循環(huán)產(chǎn)孢形成的分生孢子， 其形狀大小基本與無性繁殖的分生孢子相同。本發(fā)明還提供了前述戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株用于發(fā)酵生產(chǎn) 抗生素的用途。本發(fā)明還提供了前述戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株的發(fā)酵方法(1)菌種活化將純菌種接種于斜面菌種培養(yǎng)基上；(2) 一級種子制備挑取菌絲塊到種子培養(yǎng)液中，26 28°C、轉(zhuǎn)速150 180r/min
培養(yǎng)3 4天；(3)發(fā)酵接種一級種子到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 28°C、轉(zhuǎn)速150 180r/min培養(yǎng) 7 9天，得發(fā)酵產(chǎn)物。進(jìn)一步的，上述發(fā)酵方法為(1)菌種活化將純菌種接種于斜面菌種培養(yǎng)基上；(2) 一級種子制備挑取5 10mm2大小的菌絲塊到100ml種子培養(yǎng)液中，26 28°C、轉(zhuǎn)速150 180r/min培養(yǎng)3 4天；(3)發(fā)酵按發(fā)酵培養(yǎng)基總體積3 5%的比例接種一級種子到發(fā)酵培養(yǎng)基中， 26 28°C、轉(zhuǎn)速150 180r/min培養(yǎng)7 9天，得發(fā)酵產(chǎn)物。前述發(fā)酵方法中所述斜面菌種培養(yǎng)基為沙氏培養(yǎng)基。前述發(fā)酵方法中所述種子培養(yǎng)液為葡萄糖40g、蛋白胨10g、KH2P04lg、 MgS040. 5g、蒸餾水 1L。前述發(fā)酵方法中所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖25g、黃豆粉5g、酵母膏2g、KH2P04lg、 MgS040. 5g、蒸餾水 1L。用前述發(fā)酵方法所得的戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株的發(fā)酵產(chǎn) 物，該發(fā)酵產(chǎn)物富含廣譜抗生素物質(zhì)。本發(fā)明的戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株具有如下的微生物學(xué)特 性1、形態(tài)學(xué)特性(1)無性世代(見圖4)菌絲有隔無色至暗色，平展。菌落中央白色，外圍產(chǎn)孢結(jié) 構(gòu)及分生孢子形成明顯的8 10條墨綠色環(huán)帶。分生孢子瓶梗(8. 0 22. 5iimX0. 9 1.8um)近柱形，具短尖，單生于氣生菌絲或緊密地輪生于分生孢子?；蛟抗Ｉ希部赏?過微循環(huán)產(chǎn)孢直接從次生子囊孢子上產(chǎn)生。分生孢子(3. 9 13. 1 ii mXO. 4 3. 2 ii m)多 串生，柱狀，中部稍縊縮，兩端圓或一端稍細(xì)，未見雙生孢子。由次生子囊孢子微循環(huán)產(chǎn)孢形 成的分生孢子，形狀大小基本與前者相同。
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(2)有性世代(見圖5)戴氏綠僵菌GYYA0601菌株是戴氏蟲草Cordyc印s taii (參見梁宗琦.中國真菌志(第23卷)蟲草屬.北京科學(xué)出版社，2007.)。2、培養(yǎng)性狀(1)查氏(Czapek Dox)培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落 直徑分別為0. 98cm、1. 70cm、2. 50cm、3. 05cm、3. 80cm、4. 45cm, 13天時的菌落中央部分為黃 綠色，微隆起，周邊大部分(4/5面積)為墨綠至草綠色產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子，粒狀，環(huán)帶不明顯， 菌落邊緣菌絲乳白至淡乳黃，絨狀，平展。背面中央近芥黃，邊緣乳白色。GYYA0601菌株的 菌落形態(tài)見圖3(a)。(2)PDA培養(yǎng)基，28 °C培養(yǎng)3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落直徑分別為 1. 21cm、2. 15cm、3. 10cm、4. 25cm、5. 35cm、5. 78cm, 13 天時的菌落有 8 10 條鮮明的墨綠色
產(chǎn)孢環(huán)帶，粒狀，最外層環(huán)帶為淡黃綠至乳黃色，菌落邊緣，由里朝外菌絲層絨狀、平展，乳 黃至乳白色，最邊緣的菌落成白色蠟狀平展。背面中央色深，深黃褐至芥黃。GYYA0601菌株 的菌落形態(tài)見圖3(b)。(3)沙氏(Sabouraud's)培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落 直徑分別為 1. 21cm、2. 03cm、3. 13cm、3. 85cm、4. 45cm、5. 25cm, 13 天時的菌落平展，有 5 6 條不同顏色的產(chǎn)孢環(huán)帶，中央白色，近中央微隆起，米黃至黃綠色，周圍是草綠粒狀物環(huán)帶， 然后是土黃、棕黃和黃綠的粒狀物環(huán)帶相間，產(chǎn)孢環(huán)帶外圍乳白至乳黃絨狀菌絲層，最外緣 對光看有蠟狀暈圈。菌落平板背面芥黃，中央皺縮。GYYA0601菌株的菌落形態(tài)見圖3(c)。3、生理特性Metarhizium taii GYYA0601 菌株(CGMCC NO. 2880)產(chǎn)孢能力強(qiáng)，培養(yǎng)5-7天后均 能產(chǎn)生大量孢子，且無需特殊培養(yǎng)基。4、代謝特性Metarhizium taii GYYA0601 菌株(CGMCC NO. 2880)能代謝生成具廣譜抗生活性
的抗生素。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明是一種新的戴氏綠僵菌菌株，發(fā)明人對其廣譜抗生活性 進(jìn)行了一系列檢測1、待測定物質(zhì)戴氏綠僵菌 Metarhizium taii GYYA0601 菌株(CGMCC NO. 2880) 菌絲體的乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮提取部位和菌絲體粗多糖；戴氏綠僵菌Metarhizium taiiGYYA0601菌株發(fā)酵濃縮液的乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮提取部位和胞外粗多糖。2、待測定病原細(xì)菌包括⑴金黃色葡萄球菌、⑵枯草芽孢桿菌、(3)肺炎克雷伯 氏菌、(4)大腸埃希氏菌、(5)糞腸球菌和(6)銅綠假單胞，病原真菌包括(7)法式念珠菌、 (8)鐮刀菌和(9)立枯絲核菌(法式念珠菌是直接在臨床上分離到的病原菌株)。3、方法3. 1純培養(yǎng)菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分級分離發(fā)酵終止后，6層濾紙抽濾，用蒸餾水洗3 次后的菌絲體60°C真空干燥至恒重，再粉碎至60 100目。發(fā)酵液減壓濃縮到原體積的 1/4 1/8。(1)準(zhǔn)確稱取各純培養(yǎng)菌株發(fā)酵所得的菌絲體粉50g，然后加入250 500ml 乙醚常溫浸提12小時，過濾后的殘渣再加入250 500ml乙醚浸提12小時。過濾后合并 濾液，揮發(fā)干后獲得乙醚提取部分。乙醚提取后的殘渣按lg 5 10ml的比例加入氯仿， 60°C恒溫水浴萃取2小時，過濾，濾后的殘渣再加入5 10倍量的氯仿提取1次，過濾后合
5并濾液，45-60°C減壓濃縮，獲得氯仿提取部分。氯仿提取后的殘渣再依次用乙酸乙酯和丙 酮萃取，條件同氯仿提取條件，獲得相應(yīng)的乙酸乙酯和丙酮部分，丙酮提取后的殘渣用蒸餾 水提取，即按lg 5 10ml的比例加入蒸餾水，70°C恒溫水浴萃取3小時，過濾后同條件 再提取2次，合并濾液，55 65°C減壓濃縮至原體積的1/5 1/10，加入終濃度85%乙醇 醇析，沉淀依次用70%乙醇和乙醚洗滌1次，獲得菌絲體粗多糖部分；(2)各純培養(yǎng)菌株的 發(fā)酵濃縮液分別加入分液漏斗后，按1 5 10的體積比加入乙醚常溫萃取12小時，其間 劇烈振蕩10次左右，分離出有機(jī)相部分，然后再加入5 10倍量乙醚，萃取12小時，分離 并合并有機(jī)相，揮發(fā)干后即為乙醚提取部位，按乙醚的萃取方法依次加入氯仿、乙酸乙酯和 丙酮，獲得氯仿、乙酸乙酯和丙酮提取部位。丙酮萃取后的水相部分濃縮至1/3 1/5體積， 加入終濃度85%乙醇醇析，沉淀用依次用70%乙醇和乙醚洗滌1次，獲得胞外粗多糖部位。3. 2抗細(xì)菌的測定方法采用雙層瓊脂擴(kuò)散法(參見陳奇.中藥藥理研究方法學(xué) (第2版).北京人民衛(wèi)生出版社，2006.)，分離純培養(yǎng)菌株發(fā)酵液和菌絲體的各萃取部位 的濃度為1. 56 50mg/ml，同時設(shè)置陽性對照30 u g/100ml的頭孢曲松鈉和陰性對照，37°C 培養(yǎng)24小時，十字交叉法測量并記錄抑菌圈直徑大小。3. 3抗真菌測定方法除法式念珠菌采用雙層瓊脂擴(kuò)散法外，其它采用平板稀釋 法(參見 Ernst EJ & Rogers PD. Antifungal Agents :Methods and Protocols. USA, New Jersey :Human Press. 2005.)，分離純培養(yǎng)菌株發(fā)酵液和菌絲體的各萃取部位的濃度為 4mg/ml,同時設(shè)置陽性對照20 u g/disc廣譜抗真菌藥尹曲康唑和陰性對照，28°C培養(yǎng)48 72小時，十字交叉法測量并記錄菌落直徑大小，真菌生長抑制率=(陰性對照菌落直徑_待 測物菌落直徑大小)/陰性對照菌落直徑X 100%。3. 4雙層瓊脂擴(kuò)散法用無菌生理鹽水洗下已被活化3代的供試病原細(xì)菌(金黃 色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌、糞腸球菌、銅綠假單胞)和病 原真菌法式念珠菌斜面，轉(zhuǎn)入三角瓶中，充分振蕩搖勻，調(diào)節(jié)至1. 5 4. 5乂108個/!^濃度 的菌懸液。然后取15mL滅菌后的MH藥敏培養(yǎng)基到入9cm無菌培養(yǎng)皿中，凝固后再倒入10mL 混菌培養(yǎng)基?；炀囵B(yǎng)基是按照菌懸液與MH藥敏培養(yǎng)基體積比25 1的比例配置而成的。各分離純培養(yǎng)菌株所制備的乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和多糖部位浸膏配制成 1. 56 50mg/mL濃度待用。制備好的雙層培養(yǎng)基用無菌打孔器在平板上打孔(6 6mm)，每一平板上打7個 孔，挖去培養(yǎng)基，分別在孔內(nèi)注入50 yl待測藥液。同時設(shè)置對照。病原細(xì)菌陽性對照用 30ug/100ml頭孢曲松鈉，病原真菌陽性對照用20 y g/disc廣譜抗真菌藥尹曲康唑，陰性 對照采用配制藥物相應(yīng)的溶劑，37°C培養(yǎng)24 72小時，十字交叉法測量并記錄抑菌圈直徑 大小。3. 5平板稀釋法病原真菌鐮刀菌和立枯絲核菌活化2代后，斜面用0. 05%吐溫 80無菌生理鹽水洗后，轉(zhuǎn)入經(jīng)滅菌的帶玻璃珠三角瓶中，充分振蕩，制成均一的菌懸液。然 后取500 u 1涂布在PDA平板上，26 28°C培養(yǎng)4 7天，然后用無菌打孔器在平板上打孔 (小6mm)，取帶病原菌的瓊脂塊置于待用的混藥培養(yǎng)基平板上，26 28°C培養(yǎng)48 72小時 觀察菌落生長情況。十字交叉法測量并記錄菌落直徑大小，真菌生長抑制率=(陰性對照 菌落直徑-待測物菌落直徑)/陰性對照菌落直徑X 100%。4、檢測結(jié)果
Metarhizium taii GYYA0601 菌株(CGMCC NO. 2880)發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液的氯仿、 乙酸乙酯、丙酮等萃取部位對本發(fā)明測定的病原真菌均有明顯的抑制病原真菌生長效應(yīng)。 而拮抗病原細(xì)菌的主要有效部位是胞外乙酸乙酯、胞內(nèi)氯仿和胞內(nèi)丙酮萃取部位，胞外氯 仿和胞內(nèi)乙酸乙酯萃取部位僅對個別種類的病原細(xì)菌有一定的拮抗作用。另外，菌絲體和 發(fā)酵液的乙醚萃取部位均無明顯的抗細(xì)菌和抗真菌作用，這不同于焦彥朝和梁宗琦報道的 一株戴氏蟲草的菌絲體乙醚萃取部位對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有明顯的抗菌活性 (參見焦彥朝，梁宗琦.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，1992，5 (4) :46-48)?？傊?，戴氏綠僵菌Metarhizium taiiGYYA0601菌株是一種極有抗細(xì)菌、抗真菌醫(yī)用或農(nóng)用抗生素藥物開發(fā)潛力的真菌資 源。


本發(fā)明的戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株已于2009年1月16 號保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.2880。圖1 (a)為戴氏綠僵菌GYYA0601菌株有效部位抑制立枯絲核病原真菌的生長(作 用24小時)。圖1 (b)為戴氏綠僵菌GYYA0601菌株有效部位抑制鐮刀病原真菌的生長(作用72 小時)。圖2(a)為戴氏綠僵菌GYYA0601菌株胞外乙酸乙酯有效部位使多種病原細(xì)菌形成 抑菌圈(① 25mg/ml ；② 12. 5mg/ml ；③ 6. 25mg/ml ；④ 3. 13mg/ml ；⑤ 1. 56mg/ml ；⑥陰性對 照；⑦陽性對照)。圖2(b)為戴氏綠僵菌GYYA0601菌株胞內(nèi)丙酮有效部位使多種病原細(xì)菌形成抑菌 圈(① 50mg/ml ；② 25mg/ml ；③ 12. 5mg/ml ；④ 6. 25mg/ml ；⑤ 3. 13mg/ml ；⑥陰性對照；⑦ 陽性對照)。圖2(c)為戴氏綠僵菌GYYA0601菌株胞內(nèi)氯仿有效部位使多種病原細(xì)菌形成抑菌 圈(① 50mg/ml ；② 25mg/ml ；③ 12. 5mg/ml ；④ 6. 25mg/ml ；⑤ 3. 13mg/ml ；⑥陰性對照；⑦ 陽性對照)。圖3為戴氏綠僵菌GYYA0601菌株的菌落形態(tài)特征。(a)查氏培養(yǎng)基上；(b) :PDA 培養(yǎng)基上；(c)沙氏培養(yǎng)基上。圖4為戴氏綠僵菌GYYA0601菌株營養(yǎng)菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子(①菌絲體、② 孢子梗、③分生孢子)。圖5為戴氏綠僵菌GYYA0601菌株有性型的形態(tài)圖。
具體實施例方式實施例1 本發(fā)明戴氏綠僵菌菌株的獲得在貴州省貴陽市羊艾茶場采集到一種蟲草，置于無菌試管中，帶回實驗室按以下 兩種方法分離和培養(yǎng)。方法一根據(jù)組織分離法(方中達(dá)，植物病原研究法(第3版).北京中國農(nóng)業(yè)出 版社，1998)，將采集到的蟲草用水清洗表面泥污，陰干，分別用無菌小刀把菌核和子實體切
7開，從中用無菌接種針挑取小塊組織，70%酒精或0. 升汞液消毒，無菌蒸餾水清洗2-3 次后置入PDA培養(yǎng)基平板，25-28°C培養(yǎng)2-4天，挑取單菌落，即獲得純培養(yǎng)菌株。置于沙氏 培養(yǎng)基斜面中，4°C保存。方法二、根據(jù)次生子囊孢子微循環(huán)法分離(參見梁宗琦.中國真菌志(第23卷) 蟲草屬.北京科學(xué)出版社，2007.)。表面消毒蟲草，讓其子實體中的子囊自動彈射子囊孢 子到PDA培養(yǎng)基平板中，25-28°C培養(yǎng)2-4天，挑取單菌落，即獲得純培養(yǎng)菌株。從6根蟲草 中一共分離到21株純培養(yǎng)菌株，4°C保存在沙氏培養(yǎng)基斜面中。實施例2 :GYYA0601菌株發(fā)酵產(chǎn)物的制備各菌株活化后，挑取約5-10mm2大小的菌絲塊到裝有100mL種子培養(yǎng)液(沙氏培養(yǎng) 基葡萄糖40g，蛋白胨10g，KH2P04lg，MgS040. 5g，蒸餾水1L)的250mL搖瓶中，26_28°C培養(yǎng) 3-4天，轉(zhuǎn)速150-180r/min。發(fā)酵終止后，把培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)物按3 5% (v/v)比例接種 到裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)液(發(fā)酵培養(yǎng)基為改良沙氏培養(yǎng)基葡萄糖25g，黃豆粉5g，酵母膏 2g，KH2P04lg, MgS040. 5g，蒸餾水 1L)的 500mL 搖瓶中，26_28°C培養(yǎng) 7-9 天，轉(zhuǎn)速 150-180r/ min，發(fā)酵終止后，即得發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)酵產(chǎn)物具有廣譜抗生活性。
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權(quán)利要求
戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株，其保藏編號為CGMCC NO.2880。
2.按照權(quán)利要求1所述的戴氏綠僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株，其特征在于 生物學(xué)形態(tài)特征描述為在PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)12天后，菌絲有隔無色至暗色，平展，菌落中央白色，外圍產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子形成明顯的8-10條墨綠色環(huán)帶，分生孢子瓶 梗近柱形，具短尖，單生于氣生菌絲或緊密地輪生于分生孢子?；蛟抗Ｉ?，也可通過微循 環(huán)產(chǎn)孢直接從次生子囊孢子上產(chǎn)生，分生孢子多串生，柱狀，中部稍縊縮，兩端圓或一端稍 細(xì)，未見雙生孢子，由次生子囊孢子微循環(huán)產(chǎn)孢形成的分生孢子，其形狀大小基本與無性繁 殖的分生孢子相同。
3.戴氏綠僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)抗生素的用途。
4.一種戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株的發(fā)酵方法，其特征在于(1)菌種活化將純菌種接種于斜面菌種培養(yǎng)基上；(2)—級種子制備挑取菌絲塊到種子培養(yǎng)液中，26 28°C、轉(zhuǎn)速150 180r/min培養(yǎng)3 4天；(3)發(fā)酵接種一級種子到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 28°C、轉(zhuǎn)速150 180r/min培養(yǎng)7 9 天，得發(fā)酵產(chǎn)物。
5.按照權(quán)利要求4所述戴氏綠僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株的發(fā)酵方法，其 特征在于(1)菌種活化將純菌種接種于斜面菌種培養(yǎng)基上；(2)—級種子制備挑取5 10mm2大小的菌絲塊到100ml種子培養(yǎng)液中，26 28°C、 轉(zhuǎn)速150 180r/min培養(yǎng)3 4天；(3)發(fā)酵按發(fā)酵培養(yǎng)基總體積3 5%的比例接種一級種子到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 28°C、轉(zhuǎn)速150 180r/min培養(yǎng)7 9天，得發(fā)酵產(chǎn)物。
6.按照權(quán)利要求4或5所述戴氏綠僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株的發(fā)酵方 法，其特征在于所述斜面菌種培養(yǎng)基為沙氏培養(yǎng)基。
7.按照權(quán)利要求4或5所述戴氏綠僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株的發(fā)酵方 法，其特征在于所述種子培養(yǎng)液為葡萄糖40g、蛋白胨10g、KH2P041g、MgS040. 5g、蒸餾水 1L。
8.按照權(quán)利要求4或5所述戴氏綠僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株的發(fā)酵方法， 其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖25g、黃豆粉5g、酵母膏2g、KH2P041g、MgS040. 5g、 蒸餾水1L。
9.利用權(quán)利要求4至8任一項所述戴氏綠僵菌MetarhiziumtaiiGYYA0601菌株的發(fā) 酵方法所得的發(fā)酵產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能產(chǎn)廣譜抗生素的戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株及其用途，戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601的保藏編號為CGMCC NO.2880，用于發(fā)酵生產(chǎn)抗生素，發(fā)酵方法包括菌種活化、一級種子制備和發(fā)酵步驟，所得的發(fā)酵產(chǎn)物具有廣譜抗生活性。
文檔編號C12N1/14GK101857842SQ200910301440
公開日2010年10月13日 申請日期2009年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月9日
發(fā)明者肖代敏, 肖建輝, 鐘建江 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院