專利名稱：枯草芽孢桿菌及脂肽類生物表面活性劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物表面活性劑和枯草芽孢桿菌，具體地說是屬于利用枯草芽孢桿菌 生產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑Surfactin的方法。
背景技術：
生物表面活性劑是由微生物在一定條件下產(chǎn)生的同時具有親水性和疏水性兩種 結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物。除具有化學合成的表面活性劑相同或相似的理化性質(zhì)外，生物表面 活性劑還具有結(jié)構(gòu)復雜，專一性強，低毒性，可生物降解，環(huán)境友好，可利用廉價農(nóng)副產(chǎn)品進 行發(fā)酵生產(chǎn)，某些生物表面活性劑還具有抗菌，抗病毒，抗腫瘤等藥理作用及生理活性。生 物表面活性劑已在石油，食品，化妝品以及醫(yī)藥學等領域獲得廣泛使用。1968年由Arima等人發(fā)現(xiàn)枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis生產(chǎn)的產(chǎn)一種脂肽 類表面活性劑，活性極強，命名為Surfactin。Surfactin是目前所知表面活性最強的生物 表面活性劑之一，自從被發(fā)現(xiàn)以來，受到持續(xù)的關注。但由于產(chǎn)量很低，達不到商業(yè)化用 途，許多發(fā)明者致力于提高Surfactin的產(chǎn)量。1968年Arima發(fā)現(xiàn)Surfactin時產(chǎn)量只有 0. 05-0. 10g/L，1981年Cooper等人采用含4%葡萄糖的基本無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)ATCC21332， 并收集泡沫分離surfactin，產(chǎn)量達到0. 78g/L，1989年MulIigan等人發(fā)現(xiàn)一株枯草芽抱桿 菌ATCC21332的紫外突變株，產(chǎn)surfactin可以達到1. 124g/L，1997年Kim等人采用一個 改進的Cooper培養(yǎng)基并在限氧條件下培養(yǎng)枯草芽抱桿菌C9，Surfactin產(chǎn)量達到7. Og/L, 2002年魏毓宏等人采用一種強化無機鹽培養(yǎng)基伴以控制pH使surfactin產(chǎn)量接近3. 5g/ L0如何降低成本是目前開發(fā)的主要目標，這需要選育優(yōu)良的高產(chǎn)菌株，合適的廉價 的培養(yǎng)基，開發(fā)高附加值產(chǎn)品，同時也考慮產(chǎn)品生產(chǎn)時的環(huán)境因素，這正是本發(fā)明要解決的 技術問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供枯草芽孢桿菌及一種高效生產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑 Surfactin的方法，生物表面活性劑Surfactin產(chǎn)物以1007，1021和1035Da的物質(zhì)為主，臨 界膠束濃度CMC值為21mg/L產(chǎn)品主要用于油田采油。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為枯草芽孢桿菌，其為以下三株枯草芽孢桿菌中的一株或多株；它們分別為 Bacillussubtilis BIT09S1，保藏號為CGMCC No. 2947 ；Bacillus subtilis BIT09S2, 保藏號為CGMCC No. 2948 ；Bacillus amyloliquefaciens BIT09A2,保藏號為CGMCC No. 2945 ；它們均已經(jīng)于2009年3月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。以上枯草芽孢桿菌菌株是對生長于油井地 層水或黃渤海海泥中含有的芽孢桿 菌進行富集培養(yǎng)后，LB瓊脂平板上挑取單一菌落，篩選高品質(zhì)菌株BIT09S 1、BIT09S2、BIT09A2。所述液體培養(yǎng)基中包括碳源、氮源和無機鹽，碳源選自葡萄糖、蔗糖、可溶性淀 粉、麥芽糖、糖蜜、油田用植物膠(瓜爾膠或改性瓜爾膠，優(yōu)選羥丙基瓜爾膠)的破膠液中 的一種或多種；氮源選自谷氨酸、大豆粉、蛋白胨、NH4NO3^ (NH4)2SO4中的一種或多種；無機 鹽及營養(yǎng)元素選自 K2HPO4 · 3H20、MgSO4 · 7H20、CaCl2 · 2H20、FeSO4 · 7H20、NaH2PO4 · 2H20、 MnCl2 · 4H20、CuSO4 · 5H20、KC1、NaCl 和酵母粉中的一種或多種。LB液體培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，利用三株枯草芽孢桿菌 發(fā)酵生產(chǎn)脂肽表面活性劑。發(fā)酵培養(yǎng)基包括麥芽糖培養(yǎng)基麥芽糖(6.7 % )、豆粉(4 % K2HPO4(0.5 % )、 MgSO4 · 7H20(0. 05% )、CaCl2 · 2H20(0. 018% ), FeSO4 · 7H20(25ppm)、MnCl2 · 4Η20(22ppm)、 酵母粉(0. )、水，pH 7. 0，接種量37°C培養(yǎng)36h ；糖蜜培養(yǎng)基糖蜜(2%)、NH4NO3(0. 2 % K2HPO4 · 3Η20(0· 3 % NaH2PO4 ·2Η20(1% ) ,MgSO4 ·7Η20(0. 02% ) ,MnCl2 · 4H20 (2ppm)、酵母提取物(0.02% )、水， pH 7. 2 ；葡萄糖培養(yǎng)基葡萄糖(2 % )、L-谷氨酸(0. 5 % )、KH2PO4 (0. 1 % MgSO4 · 7H20 (0. 05 % ) , KCl (0. 05 % ) , MnSO4 (5ppm)、FeSO4 · 7H20 (0. 15ppm)、 CuSO4 · 5H20(0. 16ppm)、水 ρΗ7· 0 ；瓜爾膠培養(yǎng)基瓜爾膠破膠液(20g瓜爾膠經(jīng)酶博i.^GLZ-l生物酶破膠劑破 膠)，0. 5% 的 ΝΗ4Η2Ρ04、0· 3% 的(NH4)2HP04, K2HPO4 · 3Η20(0. 3% ), MgSO4 · 7Η20(0· 02% ), MnCl2 · 4H20(2ppm)、酵母提取物(0· 02% )、水，pH 7. 2 ；淀粉培養(yǎng)基淀粉(2% )、(NH4)2S04(1 % )、K2HPO4 · 3H20(0. 06 % )、 KH2PO4 (0. 25% ), MgSO4 · 7Η20 (0. 03% ),NaCl(2% )、酵母粉(0. 5% )、水，pH = 6. 0 ；具體為采用液體培養(yǎng)基，在恒溫搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-37 °C，培養(yǎng)時間 48-72h，搖床轉(zhuǎn)速150-200r/min，利用三株枯草芽孢桿菌BIT09S1、BIT09S2、BIT09A2中的 一株或多株發(fā)酵生產(chǎn)表面活性劑Surfactin ；發(fā)酵液分離提純，得到脂肽類生物表面活性 劑。所述液體培養(yǎng)基以麥芽糖、糖蜜、魔芋膠精粉或瓜爾膠破膠液為碳源，以谷氨酸、 大豆粉、蛋白胨、NH4N03、(NH4)2SO4中的一種或多種為氮源；以K2HPO4 · 3H20、MgSO4 · 7H20、 CaCl2 · 2H20、FeSO4 · 7H20、NaH2PO4 · 2H20、MnCl2 · 4H20、CuSO4 · 5H20、KC1、NaCl 和酵母粉中 的一種或多種為無機鹽和營養(yǎng)元素，可高效制備脂肽生物表面活性劑。如果其中加入0.5% 的NH4H2PO4和0. 3%的(NH4)2HPO4后，可優(yōu)化產(chǎn)量，由原來的5. 7g/L提高到8. 9g/L。 所述分離提純是指，發(fā)酵液經(jīng)過8000r/min離心IOmin除去菌體，上清液用6mol/ L鹽酸調(diào)制pH = 2，置于4°C冰箱中過夜；8000r/min離心IOmin后，收集沉淀；蒸餾水清洗 除酸，SOOOr/min離心lOmin，洗滌兩次，60°C干燥獲得粗提物；酸化粗提物用甲醇抽提，獲 得初步提純產(chǎn)物。甲醇抽提物，用于HPLC以及質(zhì)譜分析。HPLC分析使用大連依利特分析儀 器有限公司的EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站，P1201高壓恒流泵，色譜柱為Sinochrom ODS-BP (4. 6mmX 200mm, 5mm)，UV1201紫外可見檢測器，Zff II色譜柱恒溫箱(大連依利特 分析儀器有限公司)。流動相為乙腈(0. 1% TFA)和水(0. 1% TFA)的混合物，乙腈水=85 15卜八)，流速1.00ml/min，紫外檢測波長為21011111。質(zhì)譜實驗使用Brucker Daltons AutoflexMALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀、N2激光器、激光波長337nm，激光能量為134. 3 μ J，基體來 自Sigma公司，儀器校正使用HP-G2503A蛋白標準品。脂肽生物表面活性劑的確定根據(jù)相 同條件下已知脂肽生物表面活性劑surfactin在高效液相色譜上的保留時間和其在質(zhì)譜 中的分子量判斷。
該脂肽類生物表面活性劑可以用于油氣田壓裂、酸化、解堵、調(diào)剖堵水、油污水處 理及環(huán)境修復等諸多鉆采工藝。本發(fā)明的產(chǎn)生菌的發(fā)酵工藝操作簡單，原料為價廉的豆粉、糖蜜、魔芋膠精粉、或 油田工業(yè)廢棄物，即瓜爾膠或改性瓜爾膠的破膠液為碳源。條件經(jīng)無機磷鹽和銨鹽復合物 的優(yōu)化，可高效生產(chǎn)生物表面活性劑。


三株枯草芽孢桿菌分別為，Bacillus subtilis BIT09S1,保藏號 為CGMCC No. 2947 ；Bacillus subtilis BIT09S2,保藏號為CGMCC No. 2948 ； Bacillusamyloliquefaciens BIT09A2，保藏號為=CGMCC No. 2945 ；保藏日期2009 年 3 月 11日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，地址北 京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101。圖1為BIT09S1 (a)、BIT09S2 (b)和BIT09A2 (c)在麥芽糖培養(yǎng)基中生長發(fā)酵液中 脂肽成分的HPLC分析。保留時間9. 0-27. Omin內(nèi)出現(xiàn)的峰為脂肽組分的峰。圖2為BIT09S1 (a)、BIT09S2 (b)和BIT09A2 (c)在糖蜜為碳源的培養(yǎng)基中生長發(fā) 酵液中脂肽成分的HPLC分析。保留時間9. 0-27. Omin內(nèi)出現(xiàn)的峰為脂肽組分的峰。圖3為BIT09S1在以瓜爾膠破膠產(chǎn)物為碳源(a)和加入0. 5%的NH4H2PO4和0. 3% (NH4)2HPO4的后(b)代謝產(chǎn)物的HPLC譜圖。相同條件下，峰高代表產(chǎn)量，從圖中可以看出加 入磷酸銨鹽后產(chǎn)量提高。圖4為BIT09S1在以瓜爾膠破膠產(chǎn)物為碳源和0. 5 %的NH4H2PO4和0. 3 % (NH4)2HPO4W培養(yǎng)基中培養(yǎng)后代謝產(chǎn)物的MALDI-MS譜圖。根據(jù)譜圖，主要峰的分子量 ([M+K]+)為 1046. 3，1060. 6和 1075. 2,BIT09S1 所產(chǎn)的化合物主要分子量為 1007. 3，1021. 6 及1036. 2為surfactin類脂肽化合物。
具體實施例方式實施例1 取斜面保存的菌株BIT09S1，BIT09S2和BIT09A2，接種于裝量25mL/250mL的LB培 養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)36h ；所得種子液按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基麥芽糖(6. 7% )、豆粉 (4% )、K2HPO4(0. 5% )、MgSO4 ·7Η20(0· 05% )、CaCl2 ·2Η20(0· 018% )、FeSO4 ·7H20(25ppm)、 MnCl2 · 4H20 (22ppm)、酵母粉(0· )、水，pH 7. 0，裝量 100mL/250mL，37°C培養(yǎng) 72h。培養(yǎng) 結(jié)束后，取發(fā)酵液40mL，8000r/min離心IOmin除去菌體，所得上清液用于表面張力的測定， 測完后用6mol/L HCl調(diào)pH = 2. 0，置4°C冰箱過夜，離心得酸沉淀.60°C烘干24h，取出后 加0. 6mL甲醇溶解，超聲lh，取上清液，留作HPLC分析。表面張力的測定先測得發(fā)酵液上清 液的密度，用JYW-200全自動表界面張力儀(承德鼎盛試驗機檢測有限公司)在室溫下測定發(fā)酵液的表面張力，每次測量重復三次，取平均值。HPLC分析在EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工 作站上進行高效液相色譜分析，P1201高壓恒流泵，UV1201紫外可見檢測器，Zff II色譜柱 恒溫箱(大連依利特分析儀器有限公司)。酸沉淀的甲醇萃取液先通過0. 45mm濾膜過濾， 然后進樣20 μ L進行HPLC分析，色譜柱為Sinochrom ODS-BP (4. 6mmX 200mm, 5um)，流動相 為乙腈(0. 1 % TFA)和水(0. 1% TFA)的混合物，乙腈水=85 15 (ν/ν)，流速1. OOmL/ min，紫外檢測波長為210nm。從表1可以看出，枯草芽孢桿菌BIT09S2在麥芽糖培養(yǎng)基中生長發(fā)酵液的表面張 力最低，為27.49mN/m(表1)；經(jīng)HPLC分析酸沉淀中脂肽的含量，結(jié)果表明在相同條件下， BIT09S2產(chǎn)生的脂肽比BIT09S1和BIT09A2多(圖1)。因此，以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中， BIT09S2是脂肽生物表面活性劑的高效生產(chǎn)菌。表1麥芽糖培養(yǎng)基，37 "C，150r培養(yǎng)36h 實施例2 取斜面保存的菌株:BIT09S1, BIT09S2和BIT09A2，分別接種于25mL/250mL LB 培養(yǎng)基，37°C 200rpm培養(yǎng)36h，所得種子培養(yǎng)液按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基糖蜜 (2% ),NH4NO3(0.2%)、K2HPO4 · 3H20(0.3%)、NaH2PO4 · 2H20(1 % )、MgSO4 · 7H20(0· 02% ), MnCl2 · 4H20(2ppm)、酵母粉(0. 02% )、水，pH 7. 2，28°C 150rpm 培養(yǎng) 72h。培養(yǎng)結(jié)束后取 發(fā)酵液30mL，8000r/min離心IOmin除去菌體，所得上清液用于表面張力的測定，測完后用 6mol/LHCl調(diào)pH = 2. 0，置4°C冰箱過夜，離心得酸沉淀.60°C烘干24h，取出后加0. 6mL甲醇 溶解，超聲lh，取上清液，留作HPLC分析。表面張力的分析先測定發(fā)酵液上清液的密度，然 后用JYW-200全自動表界面張力儀(承德鼎盛試驗機檢測有限公司)在室溫下測定發(fā)酵液 的表面張力，每次測量重復三次，取平均值。HPLC分析在EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站上進 行高效液相色譜分析，P1201高壓恒流泵，UV1201紫外可見檢測器，ZW II色譜柱恒溫箱(大 連依利特分析儀器有限公司)。酸沉淀的甲醇萃取液用0. 45mm濾膜過濾，然后進樣20 μ L 進行 HPLC 分析，色譜柱為 Sinochrom ODS-BP (4. 6mmX 200mm, 5 μ m)，流動相為乙腈(0. 1 % TFA)和水(0. 1% TFA)的混合物，乙腈水=85 15 (ν/ν)，流速1. OOmL/min，紫外檢測波 長為210nm。結(jié)果表明BIT09A2在糖蜜培養(yǎng)基中生長的表面活性劑產(chǎn)量最高，其發(fā)酵液表面 張力值為28.20mN/m，低于同等條件下BIT09S1和BIT09S2發(fā)酵液的表面張力(表2)。在 HPLC分析中，相同條件下，脂肽峰的峰高代表了脂肽的產(chǎn)量，因此，由HPLC分析結(jié)果可以看出BIT09A2所產(chǎn)生的脂肽的量高于BIT09S1和BIT09S2產(chǎn)生的脂肽的量(圖2)。表2糖蜜培養(yǎng)基，280C，150r/min培養(yǎng)36h 實施例3 取斜面保存的菌株BIT09S1，接種于裝量25mL/250mL的LB培養(yǎng)基，37°C 200rpm培 養(yǎng)36h，所得種子液按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基瓜爾膠破膠液(20g瓜爾膠經(jīng)酶博士 GLZ-1 生物酶破膠劑破膠)，0· 5% 的 ΝΗ4Η2Ρ04、0· 3% 的(NH4)2HP04，K2HPO4 ·3Η20(0. 3% MgSO4 ·7Η20(0· 02% ) ,MnCl2 .4H20(2ppm)、酵母提取物(0· 02% )、水，pH 7. 2，37°C培養(yǎng)72h。 培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵液25mL，8000r/min離心IOmin除去菌體，所得上清液用于表面張力的 測定，測完后用6mol/L HCl調(diào)pH = 2. 0，置4°C冰箱過夜，離心得酸沉淀.60°C烘干24h，取 出后加0. 6mL甲醇溶解，超聲lh，取上清液，留作HPLC分析。表面張力的測定先測得發(fā)酵液 上清液的密度，然后用JYW-200全自動表界面張力儀(承德鼎盛試驗機檢測有限公司)在 室溫下測定發(fā)酵液的表面張力，每次測量重復三次，取平均值。HPLC分析在EC2006色譜數(shù) 據(jù)處理工作站上進行高效液相色譜分析，P1201高壓恒流泵，UV1201紫外-可見檢測器，Zff II色譜柱恒溫箱(大連依利特分析儀器有限公司)。酸沉淀的甲醇萃取液用0. 45 μ m濾膜 過濾，然后進樣 20 μ L 進行 HPLC 分析，色譜柱為 Sinochrom ODS-BP (4. 6mmX 200mm, 5um)， 流動相為乙腈(0. TFA)和水(0. TFA)的混合物，乙腈水=85 15 (ν/ν)，流速 1. 00mL/min，紫外檢測波長為210nm。酸沉淀的甲醇萃取液用Brucker DaltonsAutoflex MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀、N2為激光源，激光波長337nm、激光能量為134. 3 μ J，基體來與Sigma 公司，先用HP-G2503A蛋白標準品對儀器進行校正后。將脂肽樣品吸取IyL的α-氰 基-4-羥基肉桂酸混勻，再加入1 μ L的0. 三氟乙酸水溶液混勻。取1 μ L此溶液滴于進 樣探頭上抽空除去溶劑，使樣品/基質(zhì)混合物在探頭上形成均勻的結(jié)晶，直接進樣分析。質(zhì) 譜信號為單次掃描累加50次，以正離子譜測定。結(jié)果表明以BIT09S1為出發(fā)菌株，瓜爾膠破膠液為碳源、NH4H2PO4和(NH4)2HPO4為 磷源的條件下，發(fā)酵液的表面張力為29. 17mN/m,脂肽的產(chǎn)量經(jīng)HPLC分析后從原來的5. Sg/ L提高到8. 9g/L，該法證明瓜爾膠破膠液NH4H2PO4和(NH4) 2ΗΡ04是一種可以提高BIT09S1菌 株脂肽生產(chǎn)的高效方法。代謝物經(jīng)MALDI-TOF MS分析，根據(jù)質(zhì)譜圖中顯示的分子量分別為 1007. 3，1021. 6及1036. 2，說明BIT09S1產(chǎn)生的脂肽為surfactin類家族的脂肽，酸沉淀干 燥后，其中的脂肽組分用PH 8-9的堿水溶解，通過稀釋不同倍數(shù)獲得濃度分別為1，2. 5,5, 10，15，30，62. 5，100，125，250，500和1000mg/L的表面活性劑溶液，根據(jù)不同濃度與表面張力之間的曲線關系， 確定脂肽的CMC值為21mg/L。
權(quán)利要求
枯草芽孢桿菌，其特征在于為以下三株枯草芽孢桿菌中的一株或多株；它們分別為，Bacillus subtilis BIT09S1，保藏號為CGMCC No.2947；Bacillus subtilis BIT09S2，保藏號為CGMCC No.2948；Bacillusamyloliquefaciens BIT09A2，保藏號為CGMCC No.2945；保藏日期2009年3月11日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.一種脂肽類生物表面活性劑的制備方法，其特征在于權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿 菌為脂肽類生物表面活性劑的生產(chǎn)菌，其培養(yǎng)方法為，采用液體培養(yǎng)基以葡萄糖、可溶性 淀粉、麥芽糖、糖蜜、油田用植物膠(瓜爾膠或改性瓜爾膠，優(yōu)選羥丙基瓜爾膠)的破膠液 中的一種或多種為碳源，加入其它氮源、無機鹽及營養(yǎng)元素，在恒溫搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 28-37°C，培養(yǎng)時間48-72h，搖床轉(zhuǎn)速150-200r/min，利用權(quán)利要求1所述三株枯草芽孢桿 菌BIT09S1、BIT09S2、BIT09A2中的一株或多株發(fā)酵，所得發(fā)酵液經(jīng)分離提純，制得脂肽生 物表面活性劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基中最經(jīng)濟有效的碳源，按 重量濃度計為糖蜜1_3%、瓜爾膠破膠液1-2%或淀粉1-3%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基以麥芽糖、糖蜜、魔芋 膠精粉或瓜爾膠破膠液為碳源，以谷氨酸、大豆粉、蛋白胨、NH4N03、(NH4)2S04中的一種 或多種為氮源；以 K2HP04. 3H20、MgS04. 7H20、CaC12. 2H20、FeS04. 7H20、NaH2P04. 2H20、 MnC12. 4H20、CuS04. 5H20、KCl、NaCl和酵母粉中的一種或多種為無機鹽和營養(yǎng)元素，可高效 制備脂肽生物表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于所述氮源、無機鹽及營養(yǎng)元素，其用量 為(g/L) :NH4N031. 0-4.0，K2HP04. 3H20 3-5, NaH2P04. 2H20 7-15, MgS04. 7H20 0. 1-0. 3， MnC12. 4H20 0. 001-0. 010，酵母粉 0. 1-0. 3。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于所述BacillussubtilisBIT09A2的 最優(yōu)液體培養(yǎng)基為(g/L)糖蜜 20、NH4N032. 0，K2HP04. 3H20 3. 0，NaH2P04. 2H20 10， MgS04. 7H20 0. 2，MnC12. 4H20 0. 002，酵母粉 0. 2 ；所述Bacillus subtilis BIT09S1的最優(yōu)液體培養(yǎng)基為(g/L):瓜爾膠破膠液 IOOOmL (含 0. 45%單糖)，NH4N032. 0，K2HP04. 3H200 3. 0，NaH2P04. 2H20 10，MgS04. 7H20 0. 2，MnC12. 4H20 0. 002，酵母粉 0. 2 ；所述Bacillus subtilis BIT09S2的最優(yōu)液體培養(yǎng)基為(g/L)麥芽糖67、豆粉40、 K2HP045、MgS04. 7H20 0. 5、CaC12. 2H20 0. 18、FeS04. 7H20 0. 025、MnC12. 4H20 0. 022、酵母 提取物1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基中的碳源為油田用植物 膠(瓜爾膠或改性瓜爾膠，優(yōu)選羥丙基瓜爾膠)破膠液是以羥丙基瓜爾膠的水溶液為基液， 向其中加入可市購的酶博士 GLZ-1生物酶破膠劑、助排劑、生物殺菌劑、發(fā)泡劑、溫度穩(wěn) 定劑、粘土穩(wěn)定劑、防膨劑、PH調(diào)節(jié)劑，通過的硼砂水溶液(交聯(lián)比為100 5，ν/ν)交 聯(lián)后經(jīng)破膠得到。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的制備方法，其特征在于所述油田用植物膠為瓜爾膠或改性瓜爾 膠，優(yōu)選羥丙基瓜爾膠。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的制備方法，其特征在于所述油田用植物膠破膠液是以重量濃度1-2的羥丙基瓜爾膠的水溶液為基液，向其中加入可市購的酶博士 生物酶破膠 劑至終濃度15-20ppm、助排劑CF-5C至終重量濃度0. 5%、生物殺菌劑鼠李糖脂至終濃度 20-30ppm、粘土穩(wěn)定劑COP-I至終重量濃度0. 3-0. 5%或KCl至終重量濃度1. 0%,ρΗ調(diào)節(jié) 劑碳酸鈉至終重量濃度0. 05-0. 1%，通過重量濃度的硼砂水溶液交聯(lián)后經(jīng)破膠得到， 交聯(lián)比為100 5, ν/ν ο
全文摘要
本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌及脂肽類生物表面活性劑的制備方法，其特征在于所用菌株為高效脂肽生產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌BIT09S1、BIT09S2、BIT09A2，所用培養(yǎng)基以廉價的糖蜜、豆粉、魔芋膠精粉、瓜爾膠及改性瓜爾膠的破膠液為碳源，加以其它的氮源、磷源和無機鹽成份及營養(yǎng)元素，發(fā)酵后，經(jīng)分離純化，制得脂肽生物表面活性劑。該法生產(chǎn)脂肽所需原料廉價易得，可大量市購。所得的脂肽類生物表面活性劑Surfactin的粗提物可以用于油氣田壓裂、酸化、解堵、調(diào)剖堵水、油污水處理及環(huán)境修復等諸多鉆采工藝，是一前景廣闊的生物表面活性劑。
文檔編號C12R1/125GK101838621SQ200910300898
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日
發(fā)明者劉向陽, 史興來, 葉偉, 孫強, 梅曉丹, 江磊磊, 王薇, 粱瑩, 陳朋, 靳祥 申請人:大連百奧泰科技有限公司