專利名稱：：一種豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于動物分子標(biāo)記制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種與豬肉質(zhì)相關(guān)基因BTG2基因的克隆，分子標(biāo)記的制備及在標(biāo)記輔助選擇上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬肉作為中國人民的傳統(tǒng)肉食品，與人民生活品質(zhì)的提高息息相關(guān)。長期以來，豬的育種以提高生長速度、減少飼料消耗、增加瘦肉率為主要目標(biāo)，并已取得顯著成績。但伴隨著生產(chǎn)水平的提高，豬肉品質(zhì)卻大幅降低了。隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們飲食觀念發(fā)生從"吃飽"到"吃好"的變化，消費者對豬肉品質(zhì)的要求越來越高。因此，在提高豬的瘦肉率時如何兼顧肌肉品質(zhì)成為當(dāng)今豬育種工作的重點。20世紀(jì)80年代以來，隨著分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的發(fā)展，豬的定向育種工作效率大為提高。目前，標(biāo)記輔助選擇(MAS)、影響豬重要數(shù)量性狀的基因組區(qū)域定位(QTL)、用基因組掃描(genomescanning)法和候選基因法(Candidategenea卯roach)研究影響豬重要經(jīng)濟(jì)性狀的主效基因(Economictraitsloci，ETLs)已經(jīng)成功地應(yīng)用到國內(nèi)外的豬育種實踐當(dāng)中。其中，通過對氟烷(Hal)基因的基因型進(jìn)行直接選擇以降低豬只的應(yīng)激敏感性、提高豬肉品質(zhì)，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得到了成功的應(yīng)用(彭中鎮(zhèn)等，豬數(shù)量性狀基因及其標(biāo)記研究進(jìn)展.國外畜牧科技，1999,26(1):28-32)。LeRoy等(LeRoy等，Evidenceforanewmajorgeneinfluencingmeatqualityinpigs.GenetRes，1990，55(1):33-40)在漢普夏豬及其雜種中發(fā)現(xiàn)不利等位基因RN—可使肌肉中肌糖原含量升高，終端pH值降低，造成酸肉和烹調(diào)損失，豬肉工藝學(xué)品質(zhì)下降，影響火腿的產(chǎn)量。Milan等(Milan等，AmutationinPRKAG3associatedwithexcessglycogencontentinpigskeletalmuscle.Science,2000,288(5469):1248-51)通過對候選區(qū)域進(jìn)行大規(guī)模的測序分析，發(fā)現(xiàn)單磷酸腺苷活化酶y3亞基基因(AMP-activatedproteinkinase(AMPK)，Y_subunit3，PRKAG3)編碼第200位氨基酸的密碼子的錯義突變與漢普夏豬的酸肉表型直接相關(guān)，RN—豬的該位點均為不利的等位基因Q(即谷氨酰胺)。Cioba皿等(Cioba皿等，Evidencefornewallelesintheproteinkinaseadenosinemonophosphate-activatedgamma(3)-subimitgeneassociatedwithlowglycogencontentinpigskeletalmuscleandimprovedmeatquality.Genetics,2001，159(3):1151-62)在1800個商品豬群中對該基因進(jìn)行分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了新的等位基因與肌糖原含量相關(guān)并進(jìn)一步影響肉質(zhì)性狀。與Milan等發(fā)現(xiàn)的位點不同的是，這個位點的不同等位基因不僅僅在漢普夏豬中分離，它在典型的商品豬群中多態(tài)性也比較豐富，對育種具有更廣泛的適用價值。我們通過SAGE文庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)，BTG2基因在中外兩豬種的骨骼肌中表達(dá)差異十分顯著。BTG2基因是抗增殖基因家族BTG/T0B家族成員之一，該家族成員蛋白質(zhì)N端110個氨基酸具有高度同源性，這個同源區(qū)包括兩個短的、高度保守的同源區(qū)A-box和B-box，A-box具有抗增殖作用，B-box具有同許多靶分子結(jié)合的功能。越來越多的研究表明，該基因家族成員抑制多種細(xì)胞的增殖并剌激它們的分化(Matsuda等，InsearchofafunctionfortheTIS21/PC3/BTG2/T0Bfamily.FEBSLett,2001，497:67-72)。其中BTG1基因更多次被報道直接剌激成肌細(xì)胞分化，BTG2基因的過表達(dá)能減小動物身體體積(Matsuda等，Insearchofaf獄tionfortheTIS21/PC3/BTG1/T0Bfamily.FEBSLett,2001，497:67_725Buss0n等，Coactivationofnuclearrec印torsandmyogenicfactorsinducesthemajorBTG1influenceonmuscledifferentiation.Oncogene,2005，24(10):1698-710)。因此，我們推測BTG2基因有可能在肌纖維的早期發(fā)育過程中起重要作用。而肌纖維的早期發(fā)育會直接影響豬瘦肉產(chǎn)量和質(zhì)量(Nissen等，Within-littervariationinmusclefibercharacteristics,pigperformance，andmeatqualitytraits.JAnimSci，2004，82，414-21)，Rehfeld認(rèn)為肌纖維的數(shù)量和體積的遺傳變異與遺傳力很高(Rehfeld等，Myogenesisandpostnatalskeletalmusclecellgrowthasinfluencedbyselection.LivestockProductionScience,2000，66:177-188)，因而利用影響肌纖維早期發(fā)育的基因進(jìn)行育種選擇能定向改造豬的肉質(zhì)和生長性狀。到目前為止，除申請人之外，仍沒見到研究豬BTG2基因功能的報道。研究突變位點在群體中的多態(tài)性，并進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的有力手段。所以申請人對這個基因進(jìn)行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析，以期能夠發(fā)現(xiàn)它對豬肉質(zhì)性狀的影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克隆豬肉質(zhì)相關(guān)基因BTG2，尋找BTG2基因的突變位點以及作為豬肉質(zhì)基因的多態(tài)性檢測方法，為標(biāo)記輔助育種提供一種有用的分子標(biāo)記。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的—種豬肉質(zhì)性狀基因BTG2作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所述，PCR擴(kuò)增的BTG2基因的目的片段全長為229bp。在序列表的第191位有1個C191-T191堿基突變(或參見附圖5所示的C191-T191處堿基突變，即括號內(nèi)所顯示的堿基突變)，導(dǎo)至文Mval-RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)多態(tài)性?！N適用于豬生產(chǎn)性狀的分子標(biāo)記的制備方法，按照以下步驟制備用人BTG2基因的mRNA序列為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90%以上的豬ESTs(片段長度大于100bp)序列，然后拼接豬EST-重疊群，獲得豬BTG2基因的eDNA序列，在內(nèi)含子兩端設(shè)計上下游引物擴(kuò)增內(nèi)含子并測序，最后獲得如序列表SEQIDN0:1所示的核苷酸序列。設(shè)計擴(kuò)增引物，從豬血液基因組提取DNA，PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測序的方法檢測豬BTG2基因擴(kuò)增目的片段第191位的多態(tài)性，并進(jìn)行其基因型與豬的部分生產(chǎn)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析。本發(fā)明為豬的分子育種提供了一個新的遺傳標(biāo)記。擴(kuò)增豬肉質(zhì)性狀基因BTG2基因的引物，它的核苷酸序列如下所示正向引物5'-GAGCCTCTCACTGATTCCC-3'反向引物5'-AGGACCCTCTTCAAGTGCT-3'依照本發(fā)明，本發(fā)明克隆與豬肉質(zhì)相關(guān)基因BTG2可以用于豬標(biāo)記輔助選擇中。本發(fā)明的效果是1、豬BTG2基因部分DNA序列的克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆測序，測序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物的長度為229bp，為BTG2基因DNA5'UTR到內(nèi)含子間序列(主要是第一外顯子部分，如序列表SEQIDNO:l中所示)。測序結(jié)果表明在該片段的191bp處存在C、T兩個等位基因突變(見附圖5)，測序峰圖見圖3。2、PCR-RFLP診斷方法建立用B2P0LF和B2P0LR擴(kuò)增豬基因組DNA得到229bp特異擴(kuò)增片段(詳見圖2)。測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該229bp片段中存在Mval限制性內(nèi)切酶的酶切位點(5'CCIA/TGG3')，其中第192-193bp間為Mval酶的多態(tài)性切點，在該片段60bp處還存在一個該酶的固定切點。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)Mval酶切產(chǎn)生三種基因型，CC基因型有60bp，132bp和37bp三條帶，雜合子CT型有60bp，169bp，132bp和37bp四條帶，TT型只有60bp和169bp兩條帶，用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測能明顯的判別帶型(見圖4)。更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實施方式》所。序列表SEQIDNO:1是本發(fā)明克隆的豬生長性狀相關(guān)基因BTG2的部分核苷酸序列。圖1:是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2:是本發(fā)明中豬BTG2基因第一外顯子和內(nèi)含子區(qū)擴(kuò)增序列的電泳圖譜，片段大小為229bp(瓊脂糖膠濃度為2.5%)。圖中M:DNA分子量標(biāo)記(DL2000ladder)。圖3:是本發(fā)明中豬BTG2基因測序發(fā)現(xiàn)的191bp處存在C、T兩個等位基因的突變。圖4:是本發(fā)明中豬BTG2基因第一外顯子和內(nèi)含子區(qū)的Mval-RFLP三種基因型電泳圖譜。圖中M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000ladder).圖5:是本發(fā)明所擴(kuò)增得到的豬BTG2基因第一外顯子和內(nèi)含子區(qū)序列，片段大小為229bp，圖中下劃線分別為正、反向引物序列。括號內(nèi)所顯示的是堿基突變。具體實施例方式實施例1(制備實施例)1、BTG2基因的cDNA3'UTR部分序列的克隆(1)引物設(shè)計用人BTG2基因的mRNA序列(GenBank登錄號NM_005310)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90%以上的豬ESTs(片段長度大于100bp)序列，然后用DNAstar中的SeqMan程序構(gòu)建豬EST-重疊群，并獲得由重疊群拼接構(gòu)成的一致序列(consensus)，將獲得的一致序列與人的mRNA作同源性比對以確認(rèn)序列的正確性。對該序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析后，分別在第一外顯子和第二外顯子中設(shè)計上下游引物擴(kuò)增內(nèi)含子并測序，再將一致序列與內(nèi)含子序列按順序拼接得到BTG2基因的DNA序列，如序列表SEQIDN0:1所示。然后用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物擴(kuò)增BTG2基因第一外顯子到內(nèi)含子間長度為229bp的片段。引物序列如下B2P0LF:5'-GAGCCTCTCACTGATTCCC—3，(正向)，B2P0LR:5，-AGGACCCTCTTCAAGTGCT-3，(反向)(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入l.5mLEpendorff管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自Promega公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是每lOOmg的凝膠中300iiL的Sl液，于65。C溫育10min至凝膠完全融化，將S1/DNA混合物轉(zhuǎn)入回收柱，9200g離心30s，使?jié){液通過Minicolumn擠出。將下面管子中的廢液倒掉，再加入500iiL的Wl液至管中，9200g離心15s，倒掉管中的廢液。再加入500iiL的W1液，靜置lmin，9200g離心30s，取下Minicolumn裝入1.5mlEpendorff管中，加入25yL的滅菌水或者TE液，靜置lmin之后，9200g離心lmin，以洗脫DNA存于Ependorff管中。連接反應(yīng)將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(購自TAKARA公司)連接，連接反應(yīng)總體積是5iiL，其中包括2.5ii12Xligationbuffer，O.5iil載體，lii1純化PCR產(chǎn)物，最后加入1y1滅菌水置4t:水浴過夜。感受態(tài)細(xì)胞的制備從37t:培養(yǎng)了1620h的新鮮平板上挑取一個DH5a單菌落接種于2mlLB中，于37t:振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接lml菌液于含有30mlLB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37t:振蕩培養(yǎng)約4h，待0D600達(dá)到0.30.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻1015min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4t:4，OOOg離心10min以收集細(xì)胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10ml冰預(yù)冷的0.lmol/L的CaC12重懸沉淀，冰浴30min，重復(fù)4°C4，OOOg離心10min—次，用4ml冰預(yù)冷的0.lmol/L的CaC12重懸沉淀，置fC保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100120iil感受態(tài)細(xì)胞于1.5mlEpendorff管中，將5iU的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min后42t:熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴34min，加入400y1無抗生素的LB液體養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)45min。取100yl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-P-D-galactoside，異丙基硫代-P_D_半乳糖苷)和X-gal的含Amp的瓊脂平板上，37t:平放lh后倒置培養(yǎng)?？寺∽油ㄟ^PCR鑒定為陽性的用于送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將大白、杜洛克和梅山三個品種的各一個克隆子分別測序或混合測序，測序結(jié)果用SeqmanTM軟件比對尋找可能的SNP。2.標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析利用申請人與中國湖北省通城縣畜牧局種畜場合作組建的試驗群體(含純種通城豬、長白豬、大白豬、大白X長白X通城、長白X大白X通城)為實驗對象進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析。所分析的性狀有部分生長性狀，部分胴體性狀和部分肉質(zhì)性狀。對基因型資料用如下模型進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>Yijkl表示觀測值，y表示均值，Gi表示基因型效應(yīng)，Bj表示組合效應(yīng)，Sk表示性別效應(yīng)，eijkl表示殘差，假定服從N(O，Io2)分布。標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果對豬BTG2基因第一外顯子Mval-RFLP多態(tài)性位點與部分生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，基因型檢測結(jié)果表明在通城試驗豬群131個個體中，CC基因型有105個，CT基因型有21個，TT基因型有5個。不同基因型與性狀之間顯著差異的結(jié)果(最小二乘均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤分析)見表l，其它性狀在不同的基因型之間沒有顯著的差異。分析結(jié)果表明，該位點的基因型與肩部膘厚、肉色評分及肌肉剪切力存在顯著關(guān)聯(lián)，TT基因型的肩部膘厚及肌肉剪切力顯著高于CC和CT基因型，TT基因型的肉色評分顯著高于CC基因型。TT基因型是有利于提高膘厚、肌肉剪切力和肉色的選擇標(biāo)記。C等位基因是肉質(zhì)性狀的有利標(biāo)記。見表l所示。表1豬BTG2基因Mval-酶切基因型與幾個生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析基鵬f沐教身繊屋應(yīng)經(jīng)伊々雄詹力CC1054.347±0.0543.025±0.02941.893±0.945CT214.227±0.1223.157±0.06742.712±2.154TT54.842±0.2403.338±0.13352.078±4.235CC-CT0.3160.1340.737CC—TT0.042'0.026*0.018*CT—TT0.019*0.1810.043'*表示差異顯著(p<0.05)，**表示差異極顯著(p<0.01)。實施例2(應(yīng)用實施例1)(1)PCR-RFLP-Mval多態(tài)性在各豬品種中的分布情況在BTG2基因擴(kuò)增片段利用PCR-Mval-RFLP檢測了大白、長白、杜洛克、通城、二花臉、清平和江西玉山七個豬品種。該酶切基因型在各豬品種的基因頻率分布如表2所示，發(fā)現(xiàn)各豬品種中都是C等位基因占優(yōu)勢，其中三個國外豬品種C等位基因占絕對優(yōu)勢。表2豬BTG2基因在七個豬品種中的基因型頻率與等位基因頻率品種動物數(shù)量基因型等位基因頻率ccCTTTCT幾個品種間基因型頻率的卡方檢驗結(jié)果如表3。xs檢驗表明，大白和杜洛克與四個國內(nèi)品種豬之間存在顯著或極顯著差異，清平豬長白之間差異不顯著，與其它豬品種之間差異顯著或及顯著。表3豬BTG2基因PCR-RFLP-Mval基因型分布x2檢驗結(jié)果26260251863431328125191043322103414801010.840.1600.9558820.044118110.5178570.48214350.6315790.36842110.8181820.181818120.5294120.470588大白豬玉山豬豬克豬臉p白洛城花平長杜通清<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>肩注氺表示P<0.05;肩注材表示P<0.01;df=2，x2。。5(2)=5.99，x2。01(2)=9.21實施例3(應(yīng)用實施例2)豬標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析用BTG2基因檢測了通城試驗豬群131頭豬，對BTG2基因的該位點Mval-RFLP多態(tài)檢測的三種基因型與通城試驗豬群部分生產(chǎn)性能進(jìn)行了初步相關(guān)分析。基因型檢測結(jié)果表明在131個個體中CC基因型有105個，CT基因型有21個，TT基因型有5個。分析結(jié)果表明，該位點的基因型與肩部膘厚、肉色評分及肌肉剪切力存在顯著關(guān)聯(lián)，TT基因型的肩部膘厚及肌肉剪切力顯著高于CC和CT基因型，TT基因型的肉色評分顯著高于CC基因型。檢測效果見表4所示。表4豬BTG2基因Mval-酶切基因型與幾個生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析基因型個體數(shù)肩部膘厚(厘米)肉色評分肌肉剪切力CC1054.347±0.0543.025±0.02941.893±0.945CT214.227±0.1223.157±0.06742.712±2.154TT54.842±0.2403.338±0.13352.078±4.235CC—CT0.3160.1340.737CC—TT0.042*0.026*0.018*CT—TT0.019*0.1810.043**表示差異顯著(p<0.05)，**表示差異極顯著(p<0.01)。序列表〈110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉一種豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用〈130〉〈141>2009-11-17〈160>1〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>229〈212>DNA〈213〉豬(Susscrofa)〈220〉〈221>gene〈222〉(1).(229)豬豬克豬臉F白白洛城花^大長杜通二清8〈223〉〈220〉〈221〉mutation〈222>(191)..(191)<223>〈400>1gagcctctcactgattccccaggcccgctgg3CCggg朋gtcctctccagcctcctcagggcggggctctccaggaggcagccgccaccaccgttccctgagccgcga肌gacatgagcc60agaacagatatgctcccggagatcgctgccgctgtaggtt120acccggggctgcgtgagcgagcagcgactcaaggttttca180ctgacaggtgagcacttgfiagagggtcct229權(quán)利要求一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述，在序列表的第191位有1個C191-T191堿基突變，導(dǎo)致Mva1-RFLP多態(tài)性。2.—種豬肉質(zhì)性狀基因BTG2作為分子標(biāo)記的制備方法，按照以下步驟用人BTG2基因的mRNA序列為信息探針，做同源序列篩選，獲得同源性為90%以上的豬ESTs序列，該序列長度大于lOObp，構(gòu)建豬EST-重疊群，獲得由重疊群拼接構(gòu)成的一致序列，將獲得的一致序列與人的mRNA比對同源性以確證序列的正確性；根據(jù)EST-重疊群設(shè)計引物用于PCR擴(kuò)增，對獲得的PCR產(chǎn)物純化、克隆和測序，進(jìn)行序列分析，獲得如序列表SEQIDNO:l所述的核苷酸序列。3.擴(kuò)增豬肉質(zhì)性狀BTG2基因片段的引物對，它的核苷酸序列如下所示正向引物5'-GAGCCTCTCACTGATTCCC-3',反向引物5'-AGGACCCTCTTCAAGTGCT-3'。4.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在豬標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。5.權(quán)利要求3所述的引物對在豬標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于動物分子標(biāo)記制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及豬BTG2基因片段的克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述，在序列表的第191位有1個C191-T191堿基突變，導(dǎo)致Mval-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了制備該分子標(biāo)記的方法。文檔編號C12P19/34GK101701262SQ20091027276公開日2010年5月5日申請日期2009年11月17日優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日發(fā)明者馮政,劉貴生,梅書棋,武華玉,趙書紅,黃京書申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)