專利名稱：利用環(huán)境壓力提高芽胞桿菌發(fā)酵聚-γ-谷氨酸產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用環(huán)境壓力方法來(lái)提高芽胞桿 菌發(fā)酵聚-Y -谷氨酸產(chǎn)量的方法，該環(huán)境壓力選擇方法包括鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力、熱沖 擊壓力或pH壓力等，以期獲得提高聚-、-谷氨酸產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
聚-Y -谷氨酸是由微生物合成的一種胞外高分子粘性物質(zhì)，是由L-和D-谷氨 酸單體形成的同聚酰胺。聚-Y-谷氨酸具有水溶性、成膜性、可食用性、生物降解性，對(duì) 人類(lèi)和環(huán)境無(wú)毒害作用，可以廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、輕化工、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域(參見(jiàn) Buescher JM 禾口 Margaritis A. Crit Rev Biotechnol，2007，27 1—19.)。聚 谷氨 酸可增強(qiáng)菌體對(duì)多種環(huán)境壓力的抗性(Oppermann-Sanio FB和Steinbuchel A. Naturwi ssenschaften,2002,89 :11_22.)。當(dāng)生物體面臨環(huán)境壓力條件的脅迫時(shí)，合成具有保護(hù) 功能的代謝產(chǎn)物是其維持生存的重要策略。因此，通過(guò)環(huán)境壓力來(lái)提高具有保護(hù)功能的代 謝產(chǎn)物的產(chǎn)量是一種重要的策略(Umakoshi H, Yoshimoto M. Shimanouchi T. Biotechnol Prog, 1998，14 =218-226)。幾位學(xué)者發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中高含量的NaCl可增強(qiáng)聚-、-谷氨酸的 合成，顯示了 NaCl介導(dǎo)的高滲透壓力可增強(qiáng)聚-Y-谷氨酸的合成(Hezayen FF等，Appl Microbiol Biotechnol,2000, 54319-325 ；Shimizu K等，Appl Environ Microbiol,2007, 73 =2378-2379) 但未見(jiàn)通過(guò)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力、熱沖擊壓力和pH壓力的選擇和調(diào)整 來(lái)提高聚_ Y _谷氨酸產(chǎn)量的報(bào)道，因此通過(guò)多種環(huán)境壓力方法來(lái)提高聚_ Y _谷氨酸的發(fā) 酵產(chǎn)量是一個(gè)新課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，通過(guò)環(huán)境壓力選擇等措施提高聚_ Y _谷 氨酸產(chǎn)量。即在發(fā)酵過(guò)程中選擇應(yīng)用鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力、熱沖擊壓力和PH壓力來(lái)達(dá)到 提高聚_ Y _谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的采用冷凍保藏的地衣芽胞桿菌或枯草芽胞桿菌(地衣芽胞桿菌WX-02，于2008年 4月28日送交中國(guó)湖北，武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào) 為CCTCCM208065)為生產(chǎn)菌種發(fā)酵生產(chǎn)聚-Y _谷氨酸。在發(fā)酵過(guò)程中，采用鉀離子介導(dǎo)的 滲透壓力或/和熱沖擊壓力或/和pH壓力方法來(lái)提高聚-Y _谷氨酸產(chǎn)量。所述通過(guò)鉀離 子介導(dǎo)的滲透壓力提高聚_ Y _谷氨酸產(chǎn)量的方法，具體步驟為在發(fā)酵第0-18h，向培養(yǎng)基 中添加1-5 %的KC1或者K2S04 (優(yōu)選條件為在發(fā)酵第0h，添加3 %的KC1)；所述通過(guò)熱沖擊 壓力提高聚_ Y _谷氨酸產(chǎn)量的方法是在液體種子液制備好后，于42-55°C加熱液體種子液 5-20min (優(yōu)選熱沖擊壓力條件為50°C熱沖擊15min)；所述通過(guò)pH壓力提高聚-Y _谷氨酸 產(chǎn)量的方法是在在發(fā)酵第0-24h，調(diào)整發(fā)酵液pH至7. 5-9. 0 (優(yōu)選條件為在發(fā)酵第0h，調(diào)整發(fā)酵液PH至8. 5)；所述采用鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力方法和pH壓力聯(lián)用來(lái)提高聚-Y -谷 氨酸產(chǎn)量是在發(fā)酵第Oh，向發(fā)酵液中添加3%的氯化鉀，調(diào)整發(fā)酵液pH至8. 5 ；采用鉀離子 介導(dǎo)的滲透壓力和熱沖擊壓力聯(lián)用提高聚_ Y _谷氨酸產(chǎn)量的方法，是在液體種子液制備 好后，于50°C加熱液體種子液15min，在發(fā)酵第Oh，向發(fā)酵液中添加3%的氯化鉀；采用熱沖 擊壓力和PH壓力聯(lián)用提高聚-Y -谷氨酸產(chǎn)量的方法，是在液體種子液制備好后，于50°C 加熱液體種子液15min，在發(fā)酵第Oh，調(diào)整發(fā)酵液pH至8. 5 ；采用鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力、 熱沖擊壓力和調(diào)整pH壓力聯(lián)用提高聚-Y -谷氨酸產(chǎn)量的方法，是在液體種子液制備好后， 于50°C加熱液體種子液15min，在發(fā)酵第Oh，向發(fā)酵液中添加3%的氯化鉀，同時(shí)調(diào)整發(fā)酵 液pH至8. 5。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下突出特點(diǎn)(1)對(duì)聚-Y -谷氨酸的增產(chǎn)效果顯著，通過(guò)熱沖擊壓力、鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力 和PH壓力處理后，聚-γ -谷氨酸產(chǎn)量增產(chǎn)顯著。(2)本發(fā)明的方法發(fā)酵操作簡(jiǎn)單，成本低，通過(guò)簡(jiǎn)單的加熱處理，添加少量的鉀離 子，調(diào)控發(fā)酵液PH值，易于操作，成本低廉。(3)本發(fā)明為聚-Y-谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)提供了一系列新的方法，增產(chǎn)效果顯著， 發(fā)酵操作簡(jiǎn)單，為聚-Y-谷氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《具體實(shí)施方式
。》


序列表SEQ ID NO 1是地衣芽胞桿菌WX-02的16S rRNA序列。圖1 鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力(1% KCl)對(duì)地衣芽胞桿菌WX-02菌體生長(zhǎng)的影響。圖2 熱沖擊壓力(45°C，IOmin)對(duì)地衣芽胞桿菌WX-02菌體生長(zhǎng)的影響。圖3 :pH壓力(pH7. 5)對(duì)地衣芽胞桿菌WX-02菌體生長(zhǎng)的影響。圖4 是本發(fā)明是本發(fā)明前期研究獲得的地衣芽胞桿菌WX-02的16S rRNA序列的 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但所有實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限 制。實(shí)施例1通過(guò)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力提高聚-Y-谷氨酸產(chǎn)量(1)用冷凍保藏的菌種地衣芽胞桿菌WX-02 (見(jiàn)《發(fā)明內(nèi)容》中的CCTCC M208065) 為生產(chǎn)菌株，該菌株的相關(guān)信息如下地衣芽胞桿菌WX-02的鑒定1、菌株WX-02的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)菌體形狀為桿狀，長(zhǎng)2-3微米，寬0. 8-1微米。該菌株在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落 形態(tài)可發(fā)生變化生長(zhǎng)在LB固體培養(yǎng)基，菌落表面粗糙，邊緣褶皺，形狀不規(guī)則；當(dāng)LB培養(yǎng) 基中含有2%的L-谷氨酸鈉時(shí)，菌落表面光滑，菌落圓形，形狀規(guī)則，呈乳液狀能拉絲。2、菌株WX-02的生理生化特點(diǎn)生理生化鑒定結(jié)果如表1所示。
表1地衣芽胞桿菌WX-02WX-02的生理生化特點(diǎn) 3、地衣芽胞桿菌WX-02的16S rRNA序列鑒定將本發(fā)明分離的地衣芽胞桿菌WX-02的16S rRNA序列(見(jiàn)序列表SEQ ID NO 1 所示，序列登錄號(hào)ETO64336)與Genebank的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)(Blastn)，結(jié)果顯 示本發(fā)明分離的地衣芽胞桿菌WX-02同Bacillus licheniformis strain DSM 13的相似 性達(dá)到99%。同相近種屬模式菌株16S rRNA序列進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果 如圖4所示，本發(fā)明分離的地衣芽胞桿菌WX-02同Bacillus licheniformis位于同一個(gè)聚 類(lèi)。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析方法，申請(qǐng)人將WX-02菌株鑒定為地 衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)。該菌株已于2009年4月28日送交湖北省武漢市 武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏，其保藏號(hào)為CCTCC M208065。(2)斜面菌種活化將冷凍保藏的地衣芽胞桿菌WX-02，接種到LB固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸 出物 5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂 15g/L、pH 7. 0)，37°C培養(yǎng) 24h，得到種子菌。(3)種子液培養(yǎng)將LB固體斜面活化的種子菌轉(zhuǎn)接到含蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 10g/ L, pH為7. 0的LB三角瓶液體種子培養(yǎng)基中，于37°C，200r/min下培養(yǎng)12h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。(4)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)按照以下組份配制發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸鈉40g/L，葡萄糖70g/L，檸檬酸鈉8g/L，氯 化銨 8g/L, MnS04 H20 0. 01g/L, MgS04 7H20 0. 2g/L, K2HP040. 8g/L, ZnS04 7H20 0. 2g/L, CaCl2 2H20 0. 2g/L，pH 7. 0，補(bǔ)充蒸餾水至1L，在本實(shí)施例中該培養(yǎng)基配制150mL，將所述
5的發(fā)酵培養(yǎng)基分裝250mL的三角瓶，每瓶裝液量50mL，以121°C高壓蒸汽滅菌維持30min， 冷卻至37°C，按照1. 5ml的接種量接入種子液，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵至 48h結(jié)束發(fā)酵。(5)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力試驗(yàn)在發(fā)酵第0h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的氯化鉀。(6)聚_ Y _谷氨酸的檢測(cè)將上述發(fā)酵液離心除去菌體、收集上清液，取5mL發(fā)酵離心上清液，加3倍體積酒 精沉淀聚_ Y _谷氨酸，溶解產(chǎn)物，加等體積濃鹽酸，密封于沸水浴中水解24h，水解后將水 解液加lOmol/L的NaOH中和定容，經(jīng)0. 22um的微孔濾膜過(guò)濾，測(cè)定聚-Y _谷氨酸的含量由 高壓液相色譜儀(HPLC)完成，色譜柱Agilent 1100，流動(dòng)相為100mmol/L KH2P04加5. 0% 甲醇(用磷酸調(diào)PH值至2. 5)過(guò)濾，超聲波除氣，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，流速為lmL/min， 谷氨酸作為定量的標(biāo)準(zhǔn)物。按照下列公示計(jì)算聚-Y-谷氨酸濃度=水解后谷氨酸濃度X 129/147。在發(fā)酵第0h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的氯化鉀，菌體生長(zhǎng)情況如圖1所示，表明 添加的氯化鉀后，菌體在短時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，延遲期延長(zhǎng)，添加的氯化鉀對(duì)菌體而 言，在短期內(nèi)是一種滲透壓力脅迫作用，發(fā)酵結(jié)束后兩組產(chǎn)量對(duì)比如下表2 表2、鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力對(duì)聚_ Y _谷氨酸發(fā)酵的影響 表2結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，在發(fā)酵第0h，通過(guò)的氯化鉀介導(dǎo)的滲透壓力方 法，聚1-谷氨酸產(chǎn)量較對(duì)照組增產(chǎn)36%。實(shí)施例2通過(guò)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力提高聚_ Y _谷氨酸產(chǎn)量(1)本實(shí)施例采用的原始菌種同實(shí)施例1 (1)。(2)斜面菌種活化同實(shí)施例1⑵。(3)種子液培養(yǎng)同實(shí)施例1 (3)。(4)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)同實(shí)施例1⑷。(5)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力在發(fā)酵第0h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5%的氯化鉀，發(fā)酵48h。(6) M-y-谷氨酸的檢測(cè)同實(shí)施例1 (6)。以不施加滲透壓力的處理作為對(duì)照，發(fā)酵結(jié)束后兩組產(chǎn)量對(duì)比如下表3 表3、氯化鉀介導(dǎo)的滲透壓力對(duì)聚_ Y _谷氨酸發(fā)酵的影響 表3結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，在發(fā)酵0h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5%的氯化鉀， 聚-Y-谷氨酸產(chǎn)量較對(duì)照組增產(chǎn)89%。實(shí)施例3通過(guò)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力提高聚_ Y _谷氨酸產(chǎn)量(1)原始菌種同實(shí)施例1 (1)。(2)斜面菌種活化同實(shí)施例1 (2)。(3)種子液培養(yǎng)同實(shí)施例1 (3)。(4)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)同實(shí)施例1⑷。(5)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓沖擊在發(fā)酵第0h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3%的氯化鉀，發(fā)酵48h。(G)M-Y-谷氨酸的檢測(cè)同實(shí)施例1 (6)。以不施加滲透壓力的處理作為對(duì)照，發(fā)酵結(jié)束后兩組產(chǎn)量對(duì)比如下表4 表4、氯化鉀介導(dǎo)的滲透壓力對(duì)聚_ Y _谷氨酸發(fā)酵的影響 表4結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，在發(fā)酵第0h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3%的氯化鉀， 聚-Y-谷氨酸產(chǎn)量較對(duì)照組增產(chǎn)106%。實(shí)施例4通過(guò)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力提高聚_ Y _谷氨酸產(chǎn)量(1)原始菌種同實(shí)施例1 (1)。(2)斜面菌種活化同實(shí)施例1 (2)。(3)種子液培養(yǎng)同實(shí)施例1 (3)。(4)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)同實(shí)施例1⑷。(5)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力在發(fā)酵第18h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3%的氯化鉀，發(fā)酵48h。(6) M-Y-谷氨酸的檢測(cè)同實(shí)施例1 (6)。以不施加滲透壓力的處理作為對(duì)照，發(fā)酵結(jié)束后兩組產(chǎn)量對(duì)比如表5 表5、氯化鉀介導(dǎo)的滲透壓力對(duì)聚_ Y _谷氨酸發(fā)酵的影響 表5結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，在發(fā)酵第18h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3%的氯化鉀， 聚-Y-谷氨酸產(chǎn)量較對(duì)照組增產(chǎn)15%。實(shí)施例5通過(guò)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力提高聚_ Y _谷氨酸產(chǎn)量(1)原始菌種同實(shí)施例1 (1)。(2)斜面菌種活化同實(shí)施例1 (2)。(3)種子液培養(yǎng)同實(shí)施例1 (3)。(4)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)同實(shí)施例1⑷。(5)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力在發(fā)酵第0h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的硫酸鉀，發(fā)酵48h。(6)聚_ Y _谷氨酸的檢測(cè)同實(shí)施例1 (6)。以不施加滲透壓力的處理作為對(duì)照，發(fā)酵結(jié)束后兩組產(chǎn)量對(duì)比如下表6 表6、硫酸鉀介導(dǎo)的滲透壓力對(duì)聚_ Y _谷氨酸發(fā)酵的影響 表6結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，在發(fā)酵第0h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的硫酸鉀， 聚-Y-谷氨酸產(chǎn)量較對(duì)照組增產(chǎn)23%。實(shí)施例6通過(guò)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力提高聚_ Y _谷氨酸產(chǎn)量(1)原始菌種同實(shí)施例1 (1)。(2)斜面菌種活化同實(shí)施例1 (2)。(3)種子液培養(yǎng)同實(shí)施例1 (3)。(4)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)同實(shí)施例1⑷。(5)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力在發(fā)酵第18h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3%的硫酸鉀，發(fā)酵48h。(6) M-Y-谷氨酸的檢測(cè)同實(shí)施例1 (6)。以不施加滲透壓力的處理作為對(duì)照，發(fā)酵結(jié)束后兩組產(chǎn)量對(duì)比如下表7 表7、硫酸鉀介導(dǎo)的滲透壓力對(duì)聚_ Y _谷氨酸發(fā)酵的影響 表7結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，在發(fā)酵第18h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3%的硫酸鉀， 聚-Y-谷氨酸產(chǎn)量較對(duì)照組增產(chǎn)31 %。實(shí)施例7通過(guò)鉀離子介導(dǎo)的滲透壓力提高聚_ Y _谷氨酸產(chǎn)量(1)原始菌種為枯草芽胞桿菌CCTCC M202048(聚-Y-谷氨酸產(chǎn)生菌及生產(chǎn) 聚-Y-谷氨酸的方法，專利申請(qǐng)?zhí)?03118908. 3 ；專利
發(fā)明者冀志霞, 舒芹, 陳守文, 雍陽(yáng)春, 魏雪團(tuán) 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)