專利名稱：一種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白及其編碼基因和伴孢晶體蛋白的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一個具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白及其編碼基因和伴孢晶體蛋白的
制備方法。
背景技術：
肝癌是目前對人類健康威脅三大疾病之一，現(xiàn)行肝癌治療藥物以阿霉素和氟尿嘧 啶等最為常用，但這些藥物對晚期肝癌治療有效率低，且無明顯延命效果，因此，目前肝癌 治療藥物遠未滿足臨床需求。為此，各大制藥公司競相從天然存在的自然資源(植物、微生 物、海洋生物、昆蟲、礦物等)中開發(fā)高效低毒的肝癌治療藥物。統(tǒng)計表明抗腫瘤藥物市場 規(guī)模2003年較1999年翻了一番，達到70億元人民幣，每年用藥金額增長速度超過25% ，其 中2001年的增長速度高于50%，可見其市場潛力巨大。 國際統(tǒng)計表明，我國迄今仍屬肝癌高發(fā)區(qū)域。近幾年，我國研究結果也認為，由于 我國幅員廣闊，各地生活環(huán)境及習慣均有差異，肝癌發(fā)病率又與甚為流行的乙型和丙型肝 炎病毒感染密切相關，而現(xiàn)有治療手段卻極有限，迄今尚無正式獲準有效治療藥物，加之某 些區(qū)域尚有嗜好烈酒風俗，有些地區(qū)飲食(霉變谷物中含有強力肝癌致病物質(zhì)黃曲毒霉 素)和飲水不太衛(wèi)生，所以預期國內(nèi)肝癌發(fā)病率有上升趨向。據(jù)我國有關統(tǒng)計報告表明，我 國肝癌發(fā)病率較西方國家高10倍以上。 天然藥物是以現(xiàn)代科學理論為基礎，以天然存在的自然資源(植物、微生物、海洋 生物、昆蟲、礦物等)為原料，應用現(xiàn)代生物技術獲得其有效結構和活性成分物質(zhì)并研制開 發(fā)為人類有益的產(chǎn)品。天然藥物在制藥工業(yè)中占有重要的地位，由天然物質(zhì)制成的藥品已 占30%，為全世界醫(yī)藥總銷售額的35%左右，2000年約1100億美元。世界各國各大制藥公 司都投入巨資研究天然藥物，以生物資源為基礎的天然藥物將成為未來全球制藥業(yè)實現(xiàn)繁 榮的直接動因。 相對于化學合成的藥物來說，來源于天然的具有抗腫瘤活性的化合物，具有許多 不可替代的優(yōu)越性，但也有大量的不確定性。首先，盡管其抗腫瘤活性較強，往往在生物體 內(nèi)含量甚微，使得提取制備的成本很高，所以制約了其在臨床上的應用；其次，有一些活性 成分的抗腫瘤活性較高，在生物體內(nèi)含量也不低，但因其毒性和副作用較大，同樣制約了其 在臨床上的應用。 芽孢桿菌屬的一些成員，如蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis， Bt)、 球形芽孢桿菌(B. sphaericus)、日本甲蟲芽孢桿菌(B. popilliae)、緩病芽孢桿菌 (Paenibacillus lentimorbus)、以及厭氧的雙酶梭菌(Clostridium bifermentans)在芽 孢形成的同時產(chǎn)生蛋白質(zhì)結晶內(nèi)含物，稱為伴孢晶體蛋白。1999年，日本學者Mizuki等首 先發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)菌株A1190所含的81kDa大小的伴孢晶 體蛋白經(jīng)蛋白酶處理激活后對體外培養(yǎng)的人癌細胞(人白血病T細胞M0LT-4、人子宮頸癌 細胞)具有殺傷力，而且不表現(xiàn)溶血作用。蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白有望被開發(fā)成為一類新型廣譜高效低毒的抗癌藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白及其編碼基因和伴 孢晶體蛋白的制備方法。本發(fā)明制備的蛋白能識別肝癌細胞并將其殺死，效果顯著；對正常 肝細胞安全性高；蛋白表達條件簡單，易于純化，生產(chǎn)成本低廉，因而適宜進行工業(yè)化生產(chǎn)。
為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是 —種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序列的蛋白或 其融合蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物中的一種。 —種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的編碼基因，它具有序列表2所示的核苷酸序 列。 —種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，采用序列表2所示核苷酸序列的 編碼基因融合表達之后經(jīng)親和層析的方法進行分離制備具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白。
所述的利用編碼基因融合表達之后經(jīng)親和層析的方法進行分離制備具有抗癌活 性的伴孢晶體蛋白的方法采用序列表2所示的編碼基因插入到高效表達載體pET-21b，用 熱擊法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中(BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞，為商業(yè)化菌株， 可直接從公司購買，購買廠商為上海超研生物科技有限公司或上海滬峰生物科技有限公 司)。其基因型F_omp T hsd SB (rB_mB_) dcm gal (DE3) pLysS Cam r，特點該菌株帶有質(zhì) 粒pLysS，具有氯霉素抗性。該質(zhì)粒含有表達T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能降低目的基因 的背景表達水平，但不干擾IPTG誘導的表達。該菌適合毒性蛋白和非毒性蛋白的表達)，經(jīng) 過質(zhì)粒酶切分析、PCR鑒定，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)異丙基_ 13 -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)誘導使編碼基因獲得高效表達，用Ni-Agarose柱(鎳柱)對表達的蛋白進行純化。
所述的高效表達為低溫誘導表達，包括如下步驟l)提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)， 挑取轉(zhuǎn)化子即單克隆，于5mlLB培養(yǎng)基中，LB培養(yǎng)基配方如下胰蛋白胨(Tryptone) 10g/ L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化鈉(NaCl) 10g/L，用NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH，使 其達到7. 4 ;然后在37。C，230rpm，活化12-14h ;2)按1% _2%接種量轉(zhuǎn)接于100ml LB中。 中，37。C，230rpm，培養(yǎng)至光密度0D600 = 0. 5-0. 8，需2-3h ;3)加入終溶度為0. 5mM的異丙 基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG) ， 18°C ， 150rpm，培養(yǎng)10-12h。
所述的LB培養(yǎng)基中含有終溶度100 ii g/ml的Amp (氨芐青霉素)。
所述的純化采用鎳柱分離純化蛋白，包括如下步驟1) 8000rpm，離心2min，于 50ml無菌離心管中收集菌體；2)收集細胞后，將細胞重懸于Binding Buffer中，裂解細 胞；3)將Ni-NTA-Agarose灌柱，依次使用3倍柱體積的去離子水和8倍柱體積的Binding Buffer(結合緩沖液)平衡；4)將細胞裂解液負載上柱，流速為10倍柱體積/小時； 5)使用4倍柱體積的Washing Buffer (洗滌緩沖液)沖洗柱子；6)使用2倍柱體積的 ElutionBuffer(洗脫緩沖液)洗脫；7)收集洗脫液，透析后凍干保存。
所述的Binding Buffer溶液由20mM Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖 液)，5mM imidazole (咪唑)和0. 5M NaCl組成的混合溶液。 所述的Washing Buffer溶液由20mM Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖 液)，60mM imidazole (咪唑)，0. 5M NaCl組成的混合溶液。
所述的Elution Buffer溶液由20mM Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖 液)，500mM imidazole (咪唑)，0. 5M NaCl組成的混合溶液。 本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的蛋白具有以下特點1)能識別肝癌細胞并將其殺 死，效果顯著；2)對正常肝細胞安全性高；3)蛋白表達條件簡單，易于純化，生產(chǎn)成本低廉， 因而適宜進行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明為抗肝癌提供了一條新途徑，在醫(yī)藥學領域具有廣闊的 應用前景。
具體實施例方式
本實施例的一種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序 列的蛋白或其融合蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物中的一種。以及此種具有抗癌活 性的伴孢晶體蛋白的編碼基因，它具有序列表2所示的核苷酸序列。本實施例還提供了一 種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，本方法采用序列表2所示核苷酸序列的編碼 基因融合表達之后經(jīng)親和層析的方法進行分離制備具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白。本實 施例采用序列表2所示的編碼基因插入到高效表達載體pET-21b，用熱擊法轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌BL21(DE3)菌株中，(BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞，為商業(yè)化菌株，可直接從公司購買，
購買廠商為上海超研生物科技有限公司或上海滬峰生物科技有限公司)。經(jīng)過質(zhì)粒酶切分 析、PCR鑒定，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導使編碼基因獲得高效表達高效 表達為低溫誘導表達，包括如下步驟1)提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞(簡 稱BL21)，挑取轉(zhuǎn)化子即單克隆，于5ml含有終溶度100ii g/ml的Amp， 37°C ， 230rpm，活化 12-14h ;2)按1% _2%接種量轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中(含有終溶度100 y g/ml的Amp)， 37°C ， 230rpm，培養(yǎng)至光密度0D600 = 0. 5-0. 8，需2_3h ;3)加入終溶度為0. 5mM(mmo1/1)的 IPTG， 18°C ， 150rpm，培養(yǎng)10-12h。 然后用Ni-Agarose柱(鎳柱)對表達的蛋白進行純化采用鎳柱分離純化蛋白， 包括如下步驟l)8000rpm，離心2min，于50ml無菌離心管中收集菌體；2)收集細胞后，將 細胞重懸于Binding Buffer(20mM Tris-HCl，5mM imidazole,0. 5M(mol/l)NaCl)中，裂解 細胞；3)將Ni-NTA-Agarose灌柱，依次使用3倍柱體積的去離子水和8倍柱體積的Binding Buffer平衡；4)將細胞裂解液負載上柱，流速為10倍柱體積/小時；5)使用4倍柱體積的 Washing Buffer(20mM Tris-HCl，60mM imidazole,0. 5M NaCl)沖洗柱子；6)使用2倍柱體 積的Elution Buffer (20mM Tris-HCl， 500mM imidazole, 0. 5M NaCl)洗脫；7)收集洗脫液，
透析后凍干保存。 附錄1 :序列表 〈no〉華僑大學 林毅 〈120〉 一種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白及其制備方法與編碼基因 〈160>2 〈210>1 〈211>288 〈212>PRT 〈213〉蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) 〈400〉具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的氨基酸序列
MetAspVallieArgGluTyrLeuMETPheAsnGluLeuSerAla1611LeuSerSerSerProGluSerValArgSerArgPheSerSerlie162126TyrGlyThrAsnProAspGlylieAlaLeuAsnAsnGluThrTyr313641PheAsnAlaValLysProProlieThrAlaGinTyrGlyTyrTyr465156CysTyrLysAsnValGlyThrValGinTyrValAsnArgProThr616671AsplieAsnProAsnVallieLeuAlaGinAspThrLeuThrAsn768186AsnThrAsnGluProPheThrThrThrlieThrMETThrGlySer9196101PheThrAsnThrSerThrValThrSerSerThrThrThrGlyPhe106111116LysPheThrSerLysLeuSerlieLysLysAlaPheGlulieGly121126131GlyGluValSerPheSerThrThrlieGlyThrSerGluThrThr136141146ThrGluThrlieThrValSerLysSerValThrValThrValPro151156161AlaGinSerArgArgThrlieGinLeuThrAlaLyslieAlaLys166171176GluSerAlaAspPheSerAlaProlieThrValAspGlyTyrPhe181186191GlyAlaAsnPheProLysArgValGlyProGlyGlyHisTyrPhe196201206TrpPheAsnProAlaArgGlyValLeuAsnThrThrSerGlyThr211216221LeuArgGlyThrValThrAsnValSerSerPheAspPheGinThr226231236lieValGinProAlaArgSerLeuLeuAspGluGinGinGluThr241246251LeuGluTyrAlalieProGlyAspProSerGlyGluGinLeuGin256261266GinMETGluGinArgMETPhePheSerLysCysGinCysProLys271276281TrpGlyAsnStop
286 〈210>2 〈211>867 〈212>DNA 〈213〉蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) 〈400〉具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白其編碼基因的核苷酸序列ATGGATGTGATTCGTGAATATCTGATGTTTAACGAACTGAGCGCGCTGAGCAGCAGCCCG60GAAAGCGTGCGTAGCCGTTTTAGCAGCATTTATGGCACCAACCCGGATGGCATTGCGCTG120AACAACGAAACCTATTTTAACGCGGTGAAACCGCCGATTACCGCGCAGTATGGCTATTAT180TGCTATMAAACGTGGGCACCGTGCAGTATGTGAACCGTCCGACCGATATTAACCCGAAC240GTGATTCTGGCGCAGGATACCCTGACCAACAACACCAACGAACCGTTTACCACCACCATT300ACCATGACCGGCAGCTTTACCAACACCAGCACCGTGACCAGCAGCACCACCACCGGCTTT360AMTTTACCAGCAAACTGAGCATTAMAAAGCGTTTGAAATTGGCGGCGAAGTGAGCTTT420AGCACCACCATTGGCACCAGCGAAACCACCACCGMACCATTACCGTGAGCAAMGCGTG480ACCGTGACCGTGCCGGCGCAGAGCCGTCGTACCATTCAGCTGACCGCGAAAATTGCGAAA540GMAGCGCGGATTTTAGCGCGCCGATTACCGTGGATGGCTATTTTGGCGCGAACTTTCCG600AMCGTGTGGGCCCGGGCGGCCATTATTTTTGGTTTAACCCGGCGCGTGGCGTGCTGAAC660ACCACCAGCGGCACCCTGCGTGGCACCGTGACCAACGTGAGCAGCTTTGATTTTCAGACC720ATTGTGCAGCCGGCGCGTAGCCTGCTGGATGAACAGCAGGAAACCCTGGAATATGCGATT780CCGGGCGATCCGAGCGGCGAACAGCTGCAGCAGATGGAACAGCGTATGTTTTTTAGCAAA840TGCCAGTGCCCGAAATGGGGCAACTAG86權利要求
一種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白，其特征在于它具有序列表1所示的氨基酸序列的蛋白或其融合蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物中的一種。
2. —種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的編碼基因，其特征在于它具有序列表2所示 的核苷酸序列。
3. —種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，其特征在于采用序列表2所示核 苷酸序列的編碼基因融合表達之后經(jīng)親和層析的方法進行分離制備具有抗癌活性的伴孢 晶體蛋白。
4. 根據(jù)權利要求3所述的具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，其特征在于所 述的利用編碼基因融合表達之后經(jīng)親和層析的方法進行分離制備具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的方法采用序列表2所示的編碼基因插入到高效表達載體pET-21b，用熱擊法轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，經(jīng)過質(zhì)粒酶切分析、PCR鑒定，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化 子經(jīng)異丙基_ P -D-硫代半乳糖苷誘導使編碼基因獲得高效表達，用Ni-NTA-Agarose柱對 表達的蛋白進行純化。
5. 根據(jù)權利要求4所述的具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，其特征在于所述 的高效表達為低溫誘導表達，包括如下步驟1)提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE 3)菌株，挑取轉(zhuǎn)化 子即單克隆，于5ml LB培養(yǎng)基中，37。C，230rpm，活化12-14h ;2)按1%_2%接種量轉(zhuǎn)接于 100ml LB中，37。C，230rpm，培養(yǎng)至光密度0D600 = 0. 5-0. 8，2_3h ;3)加入終溶度為0. 5mM 的異丙基_ P -D-硫代半乳糖苷，18°C ， 150rpm，培養(yǎng)10-12h。
6. 根據(jù)權利要求4所述的具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，其特征在于所述 的LB培養(yǎng)基中含有終溶度100 ii g/ml的Amp。
7. 根據(jù)權利要求4所述的具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，其特征在于所述 的純化采用鎳柱分離純化蛋白，包括如下步驟1)8000rpm，離心2min，于50ml無菌離心管中收集菌體；2)收集細胞后，將細胞重懸于 Binding Buffer中，裂解細胞；3)將Ni-NTA-Agarose灌柱，依次使用3倍柱體積的去離子 水和8倍柱體積的Binding Buffer平衡；4)將細胞裂解液負載上柱，流速為10倍柱體積 /小時；5)使用4倍柱體積的Washing Buffer沖洗柱子；6)使用2倍柱體積的Elution Buffer洗脫；7)收集洗脫液，透析后凍干保存得到具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白。
8. 根據(jù)權利要求7所述的具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，其特征在于所述 的Binding Buffer溶液由20mM Tris -HCl，5mM imidazole和O. 5M NaCl組成的混合溶液。
9. 根據(jù)權利要求7所述的具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，其特征在于所述 的Washing Buffer溶液由20mM Tris-HCl， 60mM imidazole, 0. 5M NaCl組成的混合溶液。
10. 根據(jù)權利要求7所述的具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，其特征在于所 述的Elution Buffer溶液由20mM Tris-HCl， 500mMimidazole， 0. 5M NaCl組成的混合溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開一種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序列的蛋白或其融合蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物中的一種；一種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的編碼基因，它具有序列表2所示的核苷酸序列；一種具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白的制備方法，采用序列表2所示核苷酸序列的編碼基因融合表達之后經(jīng)親和層析的方法進行分離制備具有抗癌活性的伴孢晶體蛋白。本發(fā)明制備的蛋白能識別肝癌細胞并將其殺死，效果顯著；對正常肝細胞安全性高；蛋白表達條件簡單，易于純化，生產(chǎn)成本低廉，因而適宜進行工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/32GK101724028SQ200910266679
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權日2009年12月31日
發(fā)明者林毅 申請人:華僑大學