專利名稱：：植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物是一個(gè)非常脆弱的有機(jī)體，很容易受到周圍環(huán)境的影響，其中溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的最重要因素之一。植物遇到低溫冷害會(huì)影響到其生長(zhǎng)發(fā)育的方方面面，包括不能正常發(fā)芽、生長(zhǎng)緩慢、育性低甚至不結(jié)實(shí)等。其中有關(guān)低溫影響發(fā)芽以及低溫影響育性是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)并已有諸多文章報(bào)道。然而，對(duì)于低溫影響植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程的研究卻報(bào)道甚少。水稻(0ryzasativaL.)是我國(guó)最重要的糧食作物，年種植面積占糧食作物的近三分之一，總產(chǎn)占40%左右，對(duì)保障我國(guó)糧食安全具有極其重要地位。優(yōu)良水稻品種的選育是確保我國(guó)糧食需求的一條重要途徑，然而，由于各個(gè)地區(qū)種植環(huán)境的差異，導(dǎo)致了一大批優(yōu)良的水稻品種不能被廣泛的推廣，其中低溫是影響優(yōu)良水稻品種向北方推廣的最重要限制因素之一。因此克隆控制低溫生長(zhǎng)的基因具有重要的理論意義與實(shí)用價(jià)值。水稻控制低溫生長(zhǎng)的基因大多是數(shù)量性狀，其分離和克隆非常復(fù)雜，而染色體片段置換系(CSSL)或近等基因系(NIL)是研究水稻數(shù)量性狀的理想材料。目前，利用近等基因系策略，水稻中已報(bào)道一個(gè)低溫影響發(fā)芽的基因，但是有關(guān)控制低溫生長(zhǎng)基因的分離和克隆還未見報(bào)道。所有CKI蛋白都具有以下類似的結(jié)構(gòu)，NH2—端含有短的具有9-76個(gè)氨基酸殘基的NH廠末端區(qū)，一個(gè)高度保守、具催化功能并在底物識(shí)別中有重要作用的約300AA的激酶區(qū)，和序列高度可變(13-200AA)且同源性很低的C00N-端延伸區(qū)。CKI蛋白的COON-末端區(qū)具有幾方面的功能，包括決定底物識(shí)別的特異性、調(diào)節(jié)催化活力和/或決定激酶的亞細(xì)胞定位及與不同的效應(yīng)因子相互作用。liu等從水稻cDNA文庫(kù)中篩選克隆到OsCKIl，發(fā)現(xiàn)該基因在水稻根的發(fā)育以及植物激素響應(yīng)兩個(gè)方面起作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(OsCKIl)，來(lái)源于稻屬水稻(Oryzasativa)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列1由463個(gè)氨基酸殘基組成。為了使(a)中的OsCKIl便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))朋朋朋FLAG8DYKDDDDKStr印一tagII8WSHPQFEKc_myc10EQKLISEEDL上述(b)中的OsCKIl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的OsCKIl的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表l所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼上述植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的基因(OsCKIl)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的DNA分子。序列表中的序列2由1392個(gè)核苷酸組成。所述嚴(yán)格條件可為在O.IXSSPE(或O.IXSSC)，O.1%SDS的溶液中，在65。C下雜交并洗膜。含有以上任一所述基因的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體可為將所述基因插入pGA1611質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。具體來(lái)說(shuō)，所述重組表達(dá)載體可為將pGA1611質(zhì)粒HindIII和Sacl位點(diǎn)間的小片段取代為所述基因(OsCKIl)得到的重組質(zhì)粒。含有以上任一所述基因(OsCKIl)的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增所述基因(OsCKIl)全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育溫度不敏感轉(zhuǎn)基因水稻的方法。本發(fā)明提供的培育溫度不敏感轉(zhuǎn)基因水稻的方法，是將所述基因?qū)肽康乃?如細(xì)胞或組織)中，得到溫度不敏感的轉(zhuǎn)基因水稻。具體來(lái)說(shuō)，可以將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中，得到溫度不敏感的轉(zhuǎn)基因水稻。所述目的水稻具體可為CSSL13水稻；所述溫度不敏感具體體現(xiàn)在株高和/或生長(zhǎng)速度和/或抽穗期時(shí)間性狀上。所述蛋白、所述基因、所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌或所述方法均可應(yīng)用于水稻育種。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將編碼所述蛋白的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如煙草、百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發(fā)明的植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白是首次通過(guò)圖位克隆的方法分離得到的，將該蛋白導(dǎo)入植物后，可以使植物由低溫敏感變?yōu)榈蜏夭幻舾?，所以可以將其?yīng)用于植物遺傳改良等工作，提高植物(如水稻)對(duì)低溫的耐受力。如可將該基因?qū)氩荒偷蜏氐钠贩N中以提高其耐低溫能力，從而用于長(zhǎng)江中下游地區(qū)早稻和我國(guó)北方地區(qū)水稻育種。圖1為L(zhǎng)TG1的初步定位和精細(xì)定位；a:LTG1的初步定位；b:LTG1的精細(xì)定位；c:交換單株驗(yàn)證。圖2為L(zhǎng)TG1在自然環(huán)境下的表型(左Asominori;右NIL(ltgl));a:Asominori和NIL(ltgl)在南京自然條件下的生長(zhǎng)變化曲線;b:A達(dá)inori和NIL(ltgl)在海南自然條件下的生長(zhǎng)變化曲線；c:Asominori和NIL(ltgl)在南京自然條件下的抽穗期表型；d:Asominori和NIL(ltgl)在南京自然條件下的成熟時(shí)的表型；e:Asominori和NIL(ltgl)在海南自然條件下的抽穗期表型；f:Asominori和NIL(ltgl)在海南自然條件下的成熟時(shí)的表型。圖3為L(zhǎng)TG1在不同環(huán)境下的抽穗期；E1:南京自然環(huán)境；E2:南京人工遮光環(huán)境；E3:海南溫室環(huán)境；E4:海南自然環(huán)境。圖4為L(zhǎng)TG1在人工氣候室條件下的表型(左Asominori;右NIL(ltgl));a:Asominori和NIL(ltgl)在高溫(28-33度)條件下的苗期表型；b:Asominori和NIL(ltgl)在低溫(20-25度)條件下的苗期表型；c:Asominori和NIL(ltgl)在高溫和低溫條件下的抽穗期。圖5為轉(zhuǎn)OsCKIl基因植株的表型(左轉(zhuǎn)OsCKIl基因植株；右轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株)；a:播種后40天；b:播種后80天。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。CSSL13水稻中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所；KuboT等，Developmentofaseriesofindicachromosomesegmentsubstitutionlinesinj即onicabackgro皿dofrice.RiceGenetNewsl，1999，16:104-106;網(wǎng)絡(luò)鏈接為http:〃www.shigen.nig.ac.jp/rice/rgn/voll6/vl6p104.html。實(shí)施例1、OsCKIl及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)—、水稻控制低溫生長(zhǎng)基因的遺傳分析和初步定位從一套以Asominori為遺傳背景攜帶IR24插入片段的染色體片段置換系(該置換系共66個(gè)家系)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)家系CSSL13具有低溫敏感表型，該家系在第二染色體長(zhǎng)臂上攜帶IR24插入片段。CSSL13與背景親本Asominori雜交其Fl表現(xiàn)為Asominori表型，證實(shí)對(duì)低溫敏感的表型是隱性表型。通過(guò)調(diào)查144個(gè)F2植株的分離比，我們發(fā)現(xiàn)有36個(gè)植株呈現(xiàn)出和CSSL13—樣的表型(3:1比例；x2"2.68<3.84;P=0.05)，表明一對(duì)單隱性基因控制該低溫敏感表型，將該基因命名為L(zhǎng)TG1。隨后利用該36個(gè)極端隱性單株進(jìn)行初步定位，初步將該基因定位在第2染色體上，位于標(biāo)記RM3762和RM263之間(如圖la所示)。初步定位的方法如下(1)提取上述選取單株的總DNA作為模板，具體方法如下①取0.2克左右的水稻幼嫩葉片，置于E卯endorf管中，管中放置一粒鋼珠，把裝好樣品的E卯endorf管在液氮中冷凍5min，置于2000型GEN0/GRINDER儀器上粉碎樣品lmin。②加入660ii1提取液(含100mMTris-Hcl(pH8.0)，20mMEDTA(pH8.0)，1.4MNaCl，0.2g/mlCTAB的溶液)，漩渦器上劇烈渦旋混勻，冰浴30min。③加入40iU20%SDS，65t:溫浴10min，每隔兩分鐘輕輕上下顛倒混勻。④加入100ill5MNaCl，溫和混勻。⑤加入100iil10XCTAB，65。C溫浴10min，間斷輕輕上下顛倒混勻。加入900ii1氯仿，充分混勻，12000rpm離心3min。⑦轉(zhuǎn)移上清液至1.5mLE卯endorf管中，加入600yl異丙醇，混勻，12000rpm離心5min。@棄上清液，沉淀用70%(體積百分含量)乙醇漂洗一次，室溫涼干。⑨加入100ii1lXTE(121克Tris溶于l升水中，用鹽酸調(diào)ra值至8.O得到的溶液)溶解DNA。取2iil電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并用DU800分光光度儀測(cè)定濃度(BechmanlnstrumentInc.U.S.A)。(2)將上述提取的DNA稀釋成約20ng/y1，作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系(10ii1):DNA(20ng/ul)lul，上游引物(2pmol/ul)lul，下游引物(2pmol/ul)lul，10xBuffer(MgCl2free)lul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl2(25mM)0.6ul，rTaq(5u/u1)0.lul，ddH205.lul，共lOul。PCR反應(yīng)程序94.(TC變性5min;94.(TC變性30s、55。C退火30s、72。C延伸lmin，共循環(huán)35次；72t:延伸7min;1(TC保存。PCR反應(yīng)在MJResearchPTC-225熱循環(huán)儀中進(jìn)行。(3)SSR標(biāo)記的PCR產(chǎn)物檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。以50bp的DNALadder為對(duì)照比較擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小，銀染顯色。2、表型描述根據(jù)初步定位的結(jié)果，進(jìn)一步構(gòu)建了近等基因系NIL(ltgl)，該近等基因系僅攜帶一個(gè)初步定位區(qū)間的片段。利用該近等基因系，描述LTG1的表型如下在南京自然高溫(25°C_39°C)長(zhǎng)日照條件下，在成熟以前，NIL(ltgl)的株高只比Asominori稍矮一點(diǎn)，抽穗期無(wú)顯著差異，成熟后NIL(ltgl)和Asominori的各種農(nóng)藝性狀無(wú)顯著差異；在海南旱季自然低溫(10-30°C)短日環(huán)境下，在成熟以前，NIL(ltgl)的株高比Asominori明顯要矮并且到Asominori抽穗時(shí)株高差異達(dá)到最大，這樣導(dǎo)致NIL(ltgl)的抽穗期比Asominori明顯延遲，然而，成熟以后NIL(ltgl)和Asominori的各種農(nóng)藝性狀又無(wú)顯著差異(見圖2)。為了避免日照長(zhǎng)短對(duì)抽穗期的影B向，隨后設(shè)置了兩個(gè)人工高溫(25_45°C)短日環(huán)境，結(jié)果NIL(ltgl)和Asominori株高和抽穗期均無(wú)顯著差異，這些結(jié)果暗示正是由于海南的自然低溫才導(dǎo)致了NIL(ltgl)比Asominori生長(zhǎng)速度遲緩，從而導(dǎo)致成熟以前株高變矮以及抽穗期延遲(見圖3)。為了進(jìn)一步確定NIL(ltgl)比Asominori對(duì)低溫更敏感，又設(shè)置了一個(gè)高溫(28-33°C)和一個(gè)低溫(20-25°C)兩個(gè)人工氣候室環(huán)境，結(jié)果證實(shí)了以上結(jié)果，即在高溫條件下，NIL(ltgl)和Asominori無(wú)明顯差異，而在低溫條件下，NIL(ltgl)比Asominori生長(zhǎng)要慢導(dǎo)致株高變矮，抽穗期延遲(見圖4)。二、水稻控制低溫生長(zhǎng)基因LTG1的精細(xì)定位根據(jù)初步定位的結(jié)果，在LTGl基因所在區(qū)域附近尋找公共圖譜上的分子標(biāo)記，并自行開發(fā)SSR標(biāo)記。用&:3群體中的極端隱性家系驗(yàn)證，在該染色體的相關(guān)區(qū)段篩選更多標(biāo)記進(jìn)一步定位LTG1基因。在Asominori與NIL(ltgl)雜交衍生的F2:3群體中選取2213個(gè)極端隱性單株用于LTG1基因精細(xì)定位。利用公共圖譜上的分子標(biāo)記和基于水稻基因組序列數(shù)據(jù)，自行開發(fā)SSR、Indel、dCAPS等分子標(biāo)記，具體方法如下1、SSR標(biāo)記開發(fā)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2、InDel標(biāo)記的開發(fā)根據(jù)LTG1初定位的結(jié)果，從IRGSP(http:〃rgp.dna.affrc.go.jp/IRGSP/index.html)下載界定區(qū)域已測(cè)序克隆的粳稻品種日本晴序列，利用powerblast軟件將下載的日本晴序列與已公布的秈稻品種9311相應(yīng)的序列進(jìn)行同源比較，尋找重復(fù)次數(shù)有差異的或插入缺失4bp以上的序列，然后按10kb左右的距離，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度在200bp左右的引物進(jìn)行合成。3、dCAPS標(biāo)記開發(fā)dCAPS標(biāo)記的開發(fā)與分析對(duì)已確定的SNP位點(diǎn)，利用dCAPSFinder2.0在線程序(htto:〃helix.wustl.edu/dcaDs/dcaos.html)，通過(guò)錯(cuò)配1到2個(gè)堿基設(shè)計(jì)5'端引物，引物長(zhǎng)度約24-30個(gè)堿基，然后沿著3'端方向，在大約150-200bp左右的位置設(shè)計(jì)3'端引物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用合適的酶酶切后在8X的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分析?？偣苍O(shè)計(jì)了8對(duì)有多態(tài)SSR、Indel和dCAPs標(biāo)記(表2)dCAPS標(biāo)記分析的PCR反應(yīng)體系DNA(20ng/ul)2ul，Primerl(10pmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl2free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl2(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH204lOul，總體積20ul。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200(MJResearchInc.)PCR儀上進(jìn)行94。C3min;94。C30sec，55°C(引物不同，有所調(diào)整)45sec，72"C2.5min，35個(gè)循環(huán);72。C5min。PCR產(chǎn)物純化回收，按試劑盒(北京Tiangen公司)步驟進(jìn)行。PCR產(chǎn)物酶切消化過(guò)夜后，用8%的非變性PAGE膠分離，銀染。根據(jù)F2:3群體中極端隱性家系的分子數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)，將LTG1定位于標(biāo)記dCAPSl和indl4之間約25.4kb，結(jié)果如圖1所示。圖1中，a為初步定位的結(jié)果，b為精細(xì)定位結(jié)果，橫線下方數(shù)字表示各個(gè)標(biāo)記與LTG1基因位點(diǎn)間的交換家系數(shù)，c為重組家系的表型和基因型。三、植物控制低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(OsCKIl)及其編碼基因的獲得根據(jù)定位的位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物primerl和primer2。primerl:5'-GTggatccATGGAGCATGTGATCGGG-3，(下劃線所示的序列為BamHI酶識(shí)別位點(diǎn))；primer2:5'-TTgagctcTTATTTCCTTCTGTCAGCACT_3，(下劃線所示的序列為Sacl酶識(shí)別位點(diǎn))。以primerl和primer2為引物，以Asominori(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源庫(kù)；購(gòu)買得到，原始來(lái)源不清)的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200(MJResearchInc.)PCR儀上進(jìn)行94。C3min;94。C30sec，58°C30sec，72。C1.5min，35個(gè)循環(huán)；72。C7min。將PCR產(chǎn)物回收純化。用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sacl酶切PCR產(chǎn)物，然后連接入pMD18_T(購(gòu)自大連寶生物有限公司)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京Tiangen公司)，挑選陽(yáng)性克隆后，提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。序列測(cè)定結(jié)果表明，PCR反應(yīng)獲得的片段具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，編碼463個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(見序列表的序列1)。將序列l(wèi)所示的蛋白命名為OsCKIl，將序列1所示的蛋白的編碼基因命名OsCKIl，將含有OsCKIl的pMD18-T命名為pMD18-0sCKI1。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定—、重組表達(dá)載體構(gòu)建將實(shí)施例1的步驟三構(gòu)建的pMD18-0sCKI1用HindIII和Sacl雙酶切，回收含OsCKIl基因的片段，連接到經(jīng)HindIII和Sacl雙酶切處理的pGA1611載體(uniprotNo:245199，網(wǎng)絡(luò)鏈接為http:〃www.uniprot.org/taxonomy/245199;GENBANKACCESSIONN0.AY373338.1)上，得到重組表達(dá)載體。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，獲得了含有0sCKIl基因的重組質(zhì)粒，將其命名為pGA1611-0sCKIl(骨架載體為pGA1611，在HindIII和Sacl位點(diǎn)間插入了序列2所示的OsCKIl基因)。二、重組農(nóng)桿菌的獲得用電擊法將pGA1611-0sCKI1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌株(購(gòu)自美國(guó)INVITROGEN公司)，得到重組菌株，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定。PCR鑒定用引物primer3:5'-ATGGAGCATGTGATCGGG-3';primer45，-TTATTTCCTTCTGTCAGCACT3，；擴(kuò)增產(chǎn)物為1.4kb左右即為鑒定陽(yáng)性。將PCR及酶切鑒定正確的重組菌株命名為EH-pGA1611-0sCKI1。三、轉(zhuǎn)基因植物的獲得(1)28t:培養(yǎng)EH-pGA1611-0sCKI116小時(shí)，收集菌體，并稀釋到含有100iimol/L卡那霉素的N6液體培養(yǎng)基(Sigma公司，C1416)中至濃度為0D6。。"0.5，獲得菌液；(2)將培養(yǎng)至一個(gè)月的CSSL13水稻成熟胚胚性愈傷組織與步驟(1)的菌液混合侵染30min，濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(N6固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，Sigma公司)中，24"C共培養(yǎng)3天；(3)將步驟(2)的愈傷接種在含有150mg/L潮霉素(Sigma公司)的N6固體篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行第一次篩選(16天)；(4)挑取健康愈傷轉(zhuǎn)入含有200mg/L潮霉素的N6固體篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行第二次篩選，每15天繼代一次；(5)挑取抗性愈傷轉(zhuǎn)入含有150mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上分化。得到分化成苗的T。代陽(yáng)性植株。用電擊法將pGA1611轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌株，得到對(duì)照菌株，用對(duì)照菌株轉(zhuǎn)化CSSL13水稻，得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株，方法同上。四、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定1、PCR分子鑒定將步驟三獲得的T。代陽(yáng)性植株的種子在海南種植。在苗2葉1心期提取總DNA，以primer3和primer4為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(primer3:5'-ATGGAGCATGTGATCGGG-3';primer4:5，-TTATTTCCTTCTGTCAGCACT-3，)。PCR反應(yīng)體系模板DNA(20ng/ul)2ul，Primer3(10pmol/ul)2ul，Primer4(10pmol/ul)2ul，10XBuffer(MgCl2free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl2(25mM)l.2ul，rTaq酶(5u/ul)0.4ul，ddH20410ul，總體積20ul。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200(MJResearchInc.)PCR儀上進(jìn)行94。C3min;94。C30sec，55°C45sec，72。Clmin，35個(gè)循環(huán);72。C5min。用試劑盒(北京Tiangen公司)純化回收PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖膠分離，結(jié)果表明獲得15個(gè)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)OsCKIl基因植株株系。2、低溫環(huán)境中的表型鑒定12月5日，將T。代轉(zhuǎn)0sCKIl基因植株的種子、Asominori種子、CSSL13水稻種子和T。代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的種子在海南種植(每個(gè)株系50棵)(整個(gè)生長(zhǎng)期的溫度為10-30°C)，整個(gè)生長(zhǎng)期中觀察表型，自播種起，第40天和第85天拍照。播種后40天和85天的株高及從播種至抽穗所需的時(shí)間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。其中一個(gè)轉(zhuǎn)OsCKIl基因植株和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的的表型見圖5。表3播種后40天和80天的株高及從播種至抽穗所需的時(shí)間(50棵的平均值)轉(zhuǎn)OsCKIl基因植株AsominoriCSSL13轉(zhuǎn)空載體對(duì)照播種后40天株高35.12cm34.23cm27.12cm26.81cm播種后85天株高82.3cm81.5cm64.4cm63.3cm從種植種子至抽穗的時(shí)間82.5天81.8天98.7天99.2天3、高溫環(huán)境中的表型鑒定播種期，將T。代轉(zhuǎn)0sCKI1基因植株的種子、Asominori種子、CSSL13水稻種子和T。代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的種子在南京種植(每個(gè)株系50棵)(整個(gè)生長(zhǎng)期的溫度為25-39°C)，整個(gè)生長(zhǎng)期中觀察表型。播種后40天和90天的株高及從播種至抽穗所需的時(shí)間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。表4播種后40天和90天的株高及從播種至抽穗所需的時(shí)間(50棵的平均值)轉(zhuǎn)OsCKIl基因植株AsominoriCSSL13轉(zhuǎn)空載體對(duì)照播種后40天株高36.93cm36.15cm36.59cm37.18cm播種后95天株高79.10cm78.15cm79.13cm79.34cm從種植種子至抽穗的時(shí)間89.3天91.2天89.5天90.6天結(jié)果表明，所有轉(zhuǎn)OsCKIl基因植株的表型均為低溫不敏感，與Asominori的表型相同；CSSL13水稻和T。代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的表型均為低溫敏感。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因前的<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2.編碼權(quán)利要求l所述蛋白的基因。3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下l)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與l)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性且編碼植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的DNA分子。4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是將權(quán)利要求2或3所述基因插入pGA1611質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長(zhǎng)及其任意片段的引物對(duì)。7.—種培育溫度不敏感轉(zhuǎn)基因水稻的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康乃局校玫脚c所述目的植物相比溫度不敏感的轉(zhuǎn)基因水稻。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過(guò)權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的水稻中。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述目的水稻為CSSL13水稻；所述溫度不敏感體現(xiàn)在株高和/或生長(zhǎng)速度和/或抽穗期時(shí)間性狀上。10.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌或權(quán)利要求7至9中任一所述方法在水稻育種中的應(yīng)全文摘要本發(fā)明公開了一種植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物低溫生長(zhǎng)相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。將該蛋白導(dǎo)入植物后，可以使植物由低溫敏感變?yōu)榈蜏夭幻舾?，所以可以將其?yīng)用于植物遺傳改良等工作，提高植物(如水稻)對(duì)低溫的耐受力。如可將該基因?qū)氩荒偷蜏氐钠贩N中以提高其耐低溫能力，從而用于長(zhǎng)江中下游地區(qū)早稻和我國(guó)北方地區(qū)水稻育種。文檔編號(hào)C12N15/82GK101701038SQ20091023696公開日2010年5月5日申請(qǐng)日期2009年10月29日優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日發(fā)明者萬(wàn)建民,吳偉勛,張欣,王久林,程志軍,蘇寧,郭秀萍,陸廣文,雷財(cái)林申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所