專利名稱：控制擬南芥維管束發(fā)育的特異性基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種控制擬南芥維管束發(fā)育和莖粗細(xì)的 基因及其在控制植物莖粗細(xì)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
樹(shù)木的粗細(xì)是由于植物的輸導(dǎo)和支持器官莖內(nèi)的維管束組織內(nèi)的維管束形成層 的不斷發(fā)育，也即維管束發(fā)育所形成的年輪是否不斷增多的結(jié)果。因此，調(diào)控植物莖維管束 形成層的發(fā)育特性，可以控制樹(shù)木的粗細(xì)與農(nóng)作物的抗倒伏性能，調(diào)控樹(shù)木枝干和農(nóng)作物 莖的生長(zhǎng)特性，促進(jìn)樹(shù)木成材與造型和農(nóng)作物莖干的粗細(xì)生長(zhǎng)的能力，協(xié)調(diào)光合產(chǎn)物的運(yùn) 輸和分配，對(duì)樹(shù)木的成材與造型，以及農(nóng)作物莖干抗倒伏有重要的意義。在植物的胚胎發(fā)生過(guò)程中，有一部分的分生組織前體細(xì)胞在根_下胚軸的軸性建 立過(guò)程中分化形成束狀結(jié)構(gòu)，這部分分生組織細(xì)胞稱之為原形成層。伴隨著植物的生長(zhǎng)，根 中的胚胎原形成層細(xì)胞分化形成木質(zhì)部和韌皮部，其排列方式和下胚軸中的相類似，而在 莖端分生組織所形成的莖中由木質(zhì)部和韌皮部所組成維管束呈環(huán)狀排列在莖的周圍。在維 管束分化過(guò)程中，木質(zhì)部和韌皮部之間的一小部分細(xì)胞仍然保持了分生組織的活性，這部 分細(xì)胞通常稱之為形成層。維管分生組織包括原形成層和形成層細(xì)胞，其原始細(xì)胞通常被 限定在特定的位置。維管分生組織通過(guò)其極性的細(xì)胞分裂和分化作用參與了高度有序化的 發(fā)育過(guò)程。這種分生組織原始細(xì)胞極性分裂分化的結(jié)果一方面通過(guò)垂周分裂形成新的形成 層細(xì)胞從而維持自身的分裂活性，另一方面通過(guò)平周分裂產(chǎn)生多層的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以 分化成高度特化并且在空間上分割開(kāi)來(lái)的木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞。維管分生組織活性對(duì)于維管系統(tǒng)的形成及其功能的維持至關(guān)重要，同時(shí)維管分生 組織所產(chǎn)生的木質(zhì)部又是木材的主要來(lái)源并且產(chǎn)生了絕大部分植物的生物量。但是相對(duì)于 人們對(duì)于調(diào)控頂端分生組織發(fā)育的分子機(jī)制所進(jìn)行的廣泛研究來(lái)說(shuō)，人們對(duì)于維管分生組 織及其發(fā)育機(jī)制的研究卻很少，對(duì)于維管分生組織細(xì)胞極性的建立及維持所必需的因子幾 乎還是一個(gè)未知數(shù)(Fisher and Turner, 2007, Curr Biol，17，1061-1066)。這是由于維管 分生組織活性的維持主要依賴于細(xì)胞_細(xì)胞相互作用，而在植物體中特別是深入到植物組 織內(nèi)部的維管分生組織中分析細(xì)胞-細(xì)胞相互作用還是比較困難的。初生分生組織的活動(dòng)使得植物具有不確定性的生長(zhǎng)方式，從而在空間上發(fā)育形成 了地上和地下的器官，這些器官在植物體整個(gè)生命活動(dòng)中參與了植物的光合作用以及水 分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和信號(hào)分子的運(yùn)輸。但是，隨著植物體的生長(zhǎng)，植物體表面積的擴(kuò)大需要一定 的生長(zhǎng)特性與之相適應(yīng)，這些生長(zhǎng)特性包括起適當(dāng)支撐作用和輸導(dǎo)作用的組織的出現(xiàn)。這 種在發(fā)育上的適應(yīng)性對(duì)于多年生的植物尤其重要，由于這是它們能夠多年生存的活力來(lái) 源。在進(jìn)化過(guò)程中，這種需求通過(guò)細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)以及植物結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)性改變而獲得了極 大的滿足，從而保證了長(zhǎng)距離的疏導(dǎo)和機(jī)械支持。維管組織是由木質(zhì)部和韌皮部組成的疏導(dǎo)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且具有一定支持功 能的植物組織。在有次生生長(zhǎng)的植物中維管組織包括來(lái)源于原形成層的初生木質(zhì)部和初生韌皮部以及來(lái)源于維管形成層的次生木質(zhì)部和次生韌皮部，大多數(shù)的裸子植物和木本雙子 葉植物都屬于這類植物。在只有初生生長(zhǎng)的植物中維管組織只包括來(lái)源于原形成層的初生 木質(zhì)部和初生韌皮部，大多數(shù)的蕨類植物和單子葉植物屬于這類植物。植物的次生生長(zhǎng)是由次生分生組織(特別是維管形成層)的活動(dòng)不斷產(chǎn)生新的 細(xì)胞組織所導(dǎo)致的生長(zhǎng)。次生生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的木材具有很重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，它們可以作 為可再生的能源，是制造紙漿、建筑業(yè)以及紡織業(yè)的原材料，因此在人們的生產(chǎn)生活中起著 重要的作用。植物的次生生長(zhǎng)過(guò)程起始于維管束內(nèi)原形成層以及束間區(qū)域的薄壁組織細(xì)胞 分化形成維管形成層原始細(xì)胞。形成層的活動(dòng)產(chǎn)生了木質(zhì)部和韌皮部，以及它本身的自我 維持和細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，從而也伴隨著莖的加粗過(guò)程(Savidge，2001，J Plant Growth Regul，20，52-77.)。
另外，莖桿粗壯對(duì)于農(nóng)作物高產(chǎn)群體的抗倒伏性能具有重要作用。新中國(guó)成立60 年來(lái)，矮稈、半矮稈小麥水稻品種的選育和利用，明顯增強(qiáng)了品種的產(chǎn)量潛力。可以用各種 物理或化學(xué)(烯效唑、甲基磺酸乙酯(EMS)、多效唑等)的方法處理植株，使植株莖粗。如適 當(dāng)濃度的烯效唑能促進(jìn)發(fā)芽，使植株的莖變粗，增加生物量，提高可溶性糖、淀粉、葉綠素的 含量，降低可溶性蛋白和游離氨基酸的含量。但是單純依靠常規(guī)品種選育，效果有限。近幾年，開(kāi)展了一些關(guān)于莖粗相關(guān)功能基因的研究。如蘋果屬顯性莖粗主基因Dw 的RAPD分子標(biāo)記(張開(kāi)春等，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1999年第7卷第2期Vol. 7No. 21999)； 半矮稈春小麥莖粗基因Rhtl和Rht2的相關(guān)研究，小麥RhtS莖粗基因的遺傳(向平，國(guó)外 作物育種1996)等。從這些背景資料可以看出，植株莖粗相關(guān)功能基因在作物生產(chǎn)中的重 要性顯而易見(jiàn)，具有控制這一性狀的功能基因在生產(chǎn)上的用途是廣闊的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是尋找調(diào)控維管組織發(fā)育的因子，進(jìn)而提供一種控制植株徑粗細(xì)的 方法，特別是提供一種使植物莖桿變粗的方法。通過(guò)對(duì)擬南芥插入激活突變體庫(kù)進(jìn)行篩選，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)AT5g62940基因?qū)S管組 織的發(fā)育起到非常重要的作用，其編碼一個(gè)定位在核內(nèi)并且具有反式激活活性的轉(zhuǎn)錄因 子，具有Dof結(jié)構(gòu)域，屬于Dof轉(zhuǎn)錄因子家族，命名為HCA2/AtDof5. 6。AT5g62940基因的 cDNA序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，其開(kāi)放閱讀框架為自5，端第178-1296位堿基，編 碼的蛋白質(zhì)序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。研究表明，HCA2/AtDof5. 6基因在擬南芥花序莖發(fā)育的早期即開(kāi)始發(fā)揮作用，它可 以促進(jìn)擬南芥花序莖頂端的維管組織即發(fā)育早期的維管組織中束間薄壁組織細(xì)胞的平周 分裂，進(jìn)而在這些維管組織中促進(jìn)束間形成層的形成。HCA2/AtDof5. 6可能參與調(diào)控?cái)M南芥 束間形成層的形成和維管組織的發(fā)育，這是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)調(diào)控束間形成層形成 的轉(zhuǎn)錄因子。過(guò)量表達(dá)At5g62940基因的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出矮小、莖桿變粗的表型，而且其 花序莖基部的橫切顯示其維管形成層基本上連接在一起，表現(xiàn)出較高的形成層活性；而利 用嵌合抑制子沉默技術(shù)構(gòu)建的HCA2/AtDof5. 6嵌合抑制子導(dǎo)致植物維管組織的發(fā)育發(fā)生 缺陷，抑制束間形成層的發(fā)生，這和在過(guò)量表達(dá)At5g62940基因的轉(zhuǎn)基因植株中觀察到的 表型幾乎完全相反。在上述研究成果的基礎(chǔ)上，又鑒于擬南芥是國(guó)際公認(rèn)的分子生物學(xué)研究的模式植物，序列表中SEQ ID No. 2氨基酸序列的編碼基因可以應(yīng)用于控制植物莖桿的粗細(xì)。例如， 將AT4g31670基因在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)量表達(dá)，使得植株莖桿變粗。使植株莖桿變粗的方法一般是，將序列表中SEQ ID No. 2氨基酸序列的編碼基因 導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官中，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，使所述基 因在植株內(nèi)過(guò)量表達(dá)，獲得莖桿變粗的轉(zhuǎn)基因植株。在上述是植株莖桿變粗的方法中，所述SEQ ID No. 2氨基酸序列的編碼基因可以 是該基因的cDNA序列(SEQ ID No. 1)，也可以是該基因的基因組基因序列，還可以是與所述 cDNA序列或基因組基因序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列，是將 所述基因的cDNA序列或基因組基因序列利用已知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì) 得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能 會(huì)導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分 序列經(jīng)常會(huì)和全長(zhǎng)序列同樣有效地發(fā)揮作用?；蛐蛄凶兓蚩s短的方法，以及測(cè)試這些 發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。編碼本發(fā)明HCA2/AtDof5. 6的基因或其同源序列可通過(guò)植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物 組織、細(xì)胞或器官。用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn) 化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA系列載體、Gateway 系列 載體或其它衍生植物表達(dá)載體，所述出發(fā)載體還可以是可在原核生物中復(fù)制的載體，如PUC 系列載體或pBluescript系列載體等。使用編碼本發(fā)明HCA2/AtDof5. 6的基因或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其 轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。這些啟 動(dòng)子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá) 載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以包含ATG起 始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的 正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成 的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性 的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。但從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，也可不加任 何選擇性標(biāo)記基因，直接以表型篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southern、 PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測(cè)手段對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。植物表達(dá)載體可通過(guò)使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植 物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué) 方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組 織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種丁寸。維管形成層的活動(dòng)對(duì)于木本植物的發(fā)育異常重要，是木本植物增粗以及木材形成 的基礎(chǔ)，因此，研究維管形成層的調(diào)控機(jī)制具有重大的經(jīng)濟(jì)意義。本發(fā)明的成果可應(yīng)用于次 生生長(zhǎng)強(qiáng)的木本植物的研究和品質(zhì)改良，應(yīng)用前景廣闊。


圖1是實(shí)施例中長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)六周的擬南芥野生型和hca2突變體植株的照片和高度比較圖，其中A是植株照片，B是植株最終高度的柱形比較圖。圖2是實(shí)施例中實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)的At5g62940和At5g62950在野生型和hca2 突變體中的表達(dá)量柱狀示意圖。圖3是實(shí)施例中At5g62940基因過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株和At5g62950降低表達(dá) 的SALK突變體植株的表型比較，其中A是各轉(zhuǎn)基因植株的照片4EnhancerS-HCA2-20和 4Enhancers-HCA2-26代表用4個(gè)35S增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的At5g62940過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株， SALK_117570是At5g62950表達(dá)降低的突變體植株，HCA2RNAi2/hca2代表hca2突變體中轉(zhuǎn) 入HCA2RNAi載體的植株，而At5g629500El/hca2代表hca2突變體中轉(zhuǎn)入At5g62950過(guò)量 表達(dá)載體的植株；B和C是HCA2過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株花序莖基部橫切甲苯胺藍(lán)染色后的結(jié) 果，bar = 100 μ m ；D-F顯示的是SALK_117570以及在hca2背景下降低表達(dá)At5g62940禾口 過(guò)量表達(dá)At5g62950之后花序莖基部的結(jié)構(gòu)，bar = 200 μ m;其中Fc，束中形成層；Ic，束 間形成層；Vb，維管束。圖4是實(shí)施例中At5g62940和At5g62950在各種轉(zhuǎn)基因植株和SALK_117570 中的表達(dá)量柱形示意圖，其中WT代表野生型植株，4Enhancers-HCA2-20和 4Enhancers-HCA2-26代表用4個(gè)35S增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的At5g62940過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株， HCA2RNAi2/hca2 代表 hca2 突變體中轉(zhuǎn)入 HCA2RNAi 載體的植株，SALK_117570 是 At5g62950 表達(dá)降低的突變體植株，而At5g629500El/hca2代表hca2突變體中轉(zhuǎn)入At5g62950過(guò)量表 達(dá)載體的植株。圖5是實(shí)施例中野生型和35S:HCA2SRDX轉(zhuǎn)基因植株中基因表達(dá)量和花序基部切 片的比較圖，其中，A是野生型和35SHCA2SRDX轉(zhuǎn)基因植株中HCA2和HCA2SRDX的表達(dá)情況 比較；B-D分別是野生型和35S:HCA2SRDX轉(zhuǎn)基因植株花序莖基部橫切切片，bar = 100 μ m ； C，皮層；If，束間纖維；Pc，形成層；Ph，韌皮部；Xy，木質(zhì)部；Fe，束中形成層；Ic，束間形成層。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。一、高形成層活性突變體hca2的篩選擬南芥中沒(méi)有內(nèi)源的標(biāo)簽因子，T-DNA整合成為主要的插入誘變方法。擬南芥 已經(jīng)通過(guò)T-DNA標(biāo)簽得到了成千上萬(wàn)的突變體。經(jīng)過(guò)TAIL-PCR(Thermal Asymmetric InterlacedPCR, Yaoguang Liu et al,1998, Plant Molecular Biology Reporter 16: 175-181，熱不對(duì)稱交錯(cuò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)擴(kuò)增并測(cè)定標(biāo)簽插入位點(diǎn)的兩端序列，用 Blast2. 0軟件將測(cè)定序列和擬南芥的全基因組序列比較，找出突變位點(diǎn)，種植突變體，通過(guò) 表型分析以及各種不同的環(huán)境條件的篩選，在大量突變體當(dāng)中篩選出控制擬南芥莖中形成 層發(fā)育，進(jìn)而控制莖粗細(xì)性狀的基因。激活標(biāo)簽載體PSKI015轉(zhuǎn)化擬南芥所生成的T-DNA 插入突變體庫(kù)的構(gòu)建參見(jiàn)文獻(xiàn)Qin et al. ,2003,Plant Sci，165，941-949.和Qin et al.， 2005，Plant Cell,17，2693-2704。(一)、材料
擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型(Col-Ο)；質(zhì)粒pSKI015 ；各種常 用抗生素；根癌土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)為 GV3101。(二)、方法1.植物生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化
擬南芥在溫室中22°C生長(zhǎng)，每天光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí)。我們采用的Ti質(zhì)粒是pSKI015，質(zhì)粒中的T-DNA區(qū)域含有BAR基因，賦予除草劑 抗性。還含有在原核系統(tǒng)中用來(lái)篩選的Amp抗性基因，在T-DNA右邊緣附近有串聯(lián)的4個(gè) 35S增強(qiáng)子，有可能在插入擬南芥基因組后增強(qiáng)側(cè)翼或附近某個(gè)基因的表達(dá)，從而獲得某種 功能，做為插入基因失活的一個(gè)額外的補(bǔ)充。轉(zhuǎn)化擬南芥的方法主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。十多年前科學(xué)家發(fā)明了種 子浸染轉(zhuǎn)化法，后來(lái)采用農(nóng)桿菌培養(yǎng)侵染植物莖尖成整株植物進(jìn)行真空抽濾，這些方法 都代替了以前組織培養(yǎng)和植物再生方法，縮短了組織培養(yǎng)的步驟。我們實(shí)驗(yàn)使用的轉(zhuǎn)化 方法是花浸法(flaral dip)，比真空抽濾更為簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化效率也不會(huì)降低，野生的擬南芥 (Columbia)長(zhǎng)到一定階段，有一些未成熟的花苞，將已開(kāi)的花剪掉，做為待轉(zhuǎn)化植物。帶有 PSKI015的農(nóng)桿菌經(jīng)鑒定后28°C搖到穩(wěn)定期(0D· ^ 2. 0)離心后重新懸浮在浸染培養(yǎng)基 中。浸染培養(yǎng)基中必不可少的提高轉(zhuǎn)化效率的是蔗糖和Surfactant兩種物質(zhì)。將含有大 量未開(kāi)花苞的擬南芥倒置在農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基的浸泡液中十五分鐘，然后暗培養(yǎng)一定時(shí) 間后繼續(xù)開(kāi)花，結(jié)籽，將種子收集，其中就有轉(zhuǎn)基因株系。2.轉(zhuǎn)基因植物的篩選和PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化植物的子代用抗生素等標(biāo)記篩選出來(lái)。我們使用的是除草劑PPT，采用一定 濃度的PPT (100mg/ml)加入培養(yǎng)基中，使不含有T-DNA插入的種子不萌發(fā)或不生長(zhǎng)，而含有 T-DNA插入的種子因?yàn)楹型暾腂AR基因而正常生長(zhǎng)起來(lái)。在這些植物中，T-DNA插入一 般為單倍體，是隱性突變，所以表型一般不易發(fā)現(xiàn)。用CATB法提取植物葉片的總DNA，利用pSKI015載體上BAR基因的引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)5，引物5，-TCGACTCTAGCGAATTCCTC-3，，3，引物5，-ATAGGCGTCTCGCATATCTC-3，；并用擬南芥中COPl的引物同時(shí)進(jìn)行PCR作為正對(duì)照5，引物5，-TGACTATGCTCTGTTTCAGCT-3，，3，引物5，-TTAGTAAACCAAGGAAACACCA-3，反應(yīng)條件為94°C 50s, 60°C 60s,72°C 90s, 35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠 進(jìn)行電泳檢測(cè)。3. T-DNA插入側(cè)翼序列的擴(kuò)增和測(cè)序我們采用TAIL-PCR 方法，即熱不對(duì)稱性交錯(cuò) PCR(Thermal Asymmetry Interlace PCR)，TAIL-PCR包含三輪連續(xù)的半嵌套式插入序列特異引物和一個(gè)小的可退火在附近側(cè)翼 序列上的隨機(jī)引物，很容易擴(kuò)增出插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，這種方法不需要在PCR之前進(jìn)行很 多復(fù)雜的操作，而且產(chǎn)生高純度的特異產(chǎn)物，可以直接用作雜交探針和測(cè)序模板，即具有高 效、靈敏、簡(jiǎn)便、特異的優(yōu)點(diǎn)。將確定含有BAR基因的植株用TAIL-PCR擴(kuò)增T-DNA插入側(cè)翼序列(Liu，1995)，所用的三個(gè)特異引物是根據(jù)T-DNA的左邊緣附近的序列設(shè)計(jì)的，分別為DLl :5，-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGG-3，；DL2 :5， -TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3，；DL3 :5， -GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3，。所用的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物有兩個(gè)
AD2 5，-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3，；AD2-2 5，-NGTGCA(G/C)(A/T)GTNT(A/T)GAA-3，。大量擴(kuò)增第三輪PCR產(chǎn)物，用低熔點(diǎn)瓊脂糖將每條條帶進(jìn)行回收，加兩倍體積的 水在65°C溫浴使膠塊熔化，用酚、氯仿各抽提一遍。再用2-2. 5倍體積乙醇和1/10體積醋 酸鈉(NaAc)沉淀。12，000轉(zhuǎn)，離心20分鐘后沉淀，用70%、100%乙醇各洗一遍，抽干。溶 于水中，定量后可用來(lái)測(cè)序。還可將第三輪PCR產(chǎn)物直接與pBS產(chǎn)生的T-vector用T4-DNA連接酶連接，篩選 出有插入的陽(yáng)性克隆。提質(zhì)粒測(cè)序。4.序列的比對(duì)和分析得到大量的插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，就需要進(jìn)行序列分析，首先用BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，到EMBL或Gene bank中比對(duì) 出匹配的序列，從而確定T-DNA插入位點(diǎn)究竟在哪條染色體的什么部位，附近的開(kāi)放讀碼 框架0RF，已經(jīng)翻譯出蛋白質(zhì)的可能功能，與已知蛋白的同源比較等等。5.表型分析種植突變體，同時(shí)種植野生型擬南芥為對(duì)照。我們篩選到一例維管組織發(fā)育發(fā)生 改變的突變體，在其花序莖中缺乏維管束和束間纖維交替出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，各個(gè)維管束中的束 中形成層已經(jīng)和束間新形成的束間形成層連接而呈現(xiàn)出連續(xù)的環(huán)狀的維管形成層結(jié)構(gòu)，相 應(yīng)的在維管形成層的內(nèi)外分別形成連續(xù)的韌皮部和木質(zhì)部。這樣的結(jié)構(gòu)表明在突變體的 花序莖中存在一種非典型性的形成層結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)了高活動(dòng)性的形成層結(jié)構(gòu)，這與之前曾經(jīng) 報(bào)道的hca突變體(Pineau et al. ,2005, Plant J，44，271-289.)的表型類似，因此將其 命名為hca2 Oiigh^tmbial activity 2) 0如圖1所示，圖IA為擬南芥植株在開(kāi)花期和結(jié) 莢期的形態(tài)照片，其中從左到右依次是野生擬南芥WT、雜合突變體hca2+/_和純合突變體 hca2-/-植株的形態(tài)照片。野生型植株花序莖的長(zhǎng)度是27. 86 士 2. 33cm，而純合突變體花序 莖的長(zhǎng)度只有9. 23士0. 86cm,純合突變體花序莖的長(zhǎng)度大概是野生型的30%左右(見(jiàn)圖 1B)。由圖中可以看出，突變體植株在開(kāi)花期和結(jié)莢期與野生型比較，表現(xiàn)出明顯的矮化和 莖桿變粗的表型特征。序列分析和比較顯示，在hca2突變體中，T-DNA插入了擬南芥第五染色體的第 25262703堿基處，插入了基因AT5g62950的第四個(gè)外顯子中。二、造成突變體表型的基因的確定為了確定是哪一個(gè)基因的改變導(dǎo)致了上述的hca2突變體表型，我們檢測(cè)了 T-DNA 插入位點(diǎn)附近基因的表達(dá)水平。在插入位點(diǎn)上下游各IOkb的范圍內(nèi)一共有六個(gè)基因(At5g62920，At5g62930， At5g62940, At5g62950, At5g62960和At5g62970)，根據(jù)這六個(gè)基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中的編碼序列 設(shè)計(jì)了 6對(duì)引物，然后提取野生型和hca2突變體植株的RNA，用TRIzol Kit(Invitrogen)法(1)將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入Iml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。 樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積的10% ；(2)將勻漿樣品在15 30°C放置5min，使得核 酸蛋白復(fù)合物完全分離；(3) 4°C 12000rpm離心lOmin，取上清；(4)每使用Iml TRIzol加 0. 2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15sec，室溫放置3min ； (5) 4°C 12000rpm離心15min，樣品 會(huì)分成三層黃色的有機(jī)相、中間層和無(wú)色的水相，RNA主要在水相中，水相的體積約為所 用TRIzol試劑的60%。把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白，可保留有機(jī)相，進(jìn)行進(jìn) 一步操作；(6)每使用Iml TRIzol加入0. 5ml異丙醇，混勻，室溫放置IOmin ； (7)4°C不超 過(guò)12000 Xg離心lOmin，去上清。離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見(jiàn)的，離心后在管側(cè)和管底 形成膠狀沉淀；(8)加Iml 75%乙醇(配乙醇溶液用DEPC處理過(guò)的水)洗滌沉淀。每使用 Iml TRIzol至少加Iml乙醇；(9) 4°C不超過(guò)7500 X g離心5min，棄上清；(10)室溫放置晾 干或真空抽干(不要晾的過(guò)干，RNA完全干燥后會(huì)很難溶解，大約晾干5-lOmin左右。)加 25-200 μ 1 DEPC水或0.5% SDS溶液，55-60°C放置IOmin溶解RNA (如果后面需進(jìn)行酶反 應(yīng)，請(qǐng)勿使用SDS溶液)；(11) TRIzol法提取的RNA可用于芯片雜交，或經(jīng)DNase I處理后 用作反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄生成cDNA:DNase I處理RNA樣品200 μ 1反應(yīng)體系RNA10 μ g 20 μ g10X反應(yīng)緩沖液20 μ 1DNase I2 μ 1RNase 抑制劑1 μ 1DEPC水補(bǔ)足體積至200 μ 1，混勻。(1)37°C水浴反應(yīng)30min ;(2)向反應(yīng)體系中加入200μ 1 DEPC水，用400 μ 1的 酚氯仿異戊醇(25 24 1)抽提，4°C 12000rpm離心IOmin ； (3)取上清，加入等體積 的氯仿異戊醇(24 1)抽提，4°C 12000rpm離心IOmin ； (6)取上清，加入40 μ 1 3Μ醋酸 鈉(ρΗ5· 2)，Iml無(wú)水乙醇，_20°C沉降過(guò)夜；(7) 4°C 12000rpm離心30min ； (8)倒去上清，保 留沉淀，分別用70%和100%的乙醇洗一次，4°C 12000rpm離心IOmin ； (9)吹干沉淀，用適 量體積的DEPC水溶解。待用。RT-PCR前的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用20 μ 1反應(yīng)體系Oligo (dT) (600ng/ μ 1) 1 μ 1RNA5 μ gdNTP (IOmM)1 μ 1用DEPC水補(bǔ)足體積至13 μ 1，混勻。(1) 65°C水浴使RNA變性，5min后迅速置于冰上冷卻，防止復(fù)性；(2)接著加入5X第一鏈合成緩沖液 4μ10. IM DTT1 μ 1RNase 抑制劑1 μ 1SuperScript III 型反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μ 1) 1 μ 1(3)混勻，50°C水浴保溫Ihr ； (4) 70°C水浴15min使酶失活；(5)加入2 μ 1 RNase H 37°C保溫30min，離心，_20°C保存；獲得cDNA，然后，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR和實(shí)時(shí)定 量RT-PCR反應(yīng)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR采用20 μ 1反應(yīng)體系
2 X SYBR Green MIX5 μ 1Primer-I (2. 5 μ Μ)1 μ 1Primer-2 (2. 5 μ Μ)1 μ 1cDNA2 μ 1ddH20補(bǔ)足體積至10 μ 1。每個(gè)基因做三個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)程序95 "C 3min94 °C 20sec58 °C 20sec72 °C 20secPlate read78°C 86°C IsecPlate readGo to step 2 44 cycles72 °C 5minMelting curve from 58°C to 95°C, read every 0.2°Co反應(yīng)結(jié)束后，用2_ΔΔεω的方法分析基因表達(dá)的差異。RT-PCR結(jié)果顯示和野生型 相比，突變體中除了 At5g62940和At5g62950外其他基因的表達(dá)量都沒(méi)有發(fā)生明顯的變化， 更進(jìn)一步利用反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，對(duì)At5g62940和At5g62950基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)在hca2突變體中At5g62940基因的表達(dá)量顯著升高，而At5g62950基因沒(méi)有表 達(dá)，見(jiàn)圖2。說(shuō)明T-DNA的插入導(dǎo)致AT5g62950基因的表達(dá)受到破壞，同時(shí)引起其上游基因 At5g62940的過(guò)量表達(dá)。AT5g62940基因的cDNA序列見(jiàn)序列表SEQ ID No. 1，AT5g62940基 因編碼的蛋白質(zhì)序列見(jiàn)序列表SEQ ID No. 2。為了確定到底是過(guò)量表達(dá)At5g62940基因或者是At5g62950的敲除導(dǎo)致了突變體 的表型，我們根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的At5g62940和At5g62940基因的cDNA序列在其編碼區(qū)兩 端分別設(shè)計(jì)引物，以野生型植株葉片的cDNA為模板，擴(kuò)增這兩個(gè)基因的cDNA序列。然后將 擴(kuò)增的到的片段連入PBS載體，測(cè)序并與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列相比對(duì)以確定其正確性。接下來(lái) 用擴(kuò)增得到的cDNA序列分別構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體和RNAi載體。HCA2/AtDof5. 6的4Enhancers_HCA2過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建的方法用Pst I和Kpn I 雙酶切 pQGllO 得 pQGllO ；Pst I 和 Sal I 雙酶切 pBS_4Enh(+)得 pB4Enh ；Sal I 和 BamH I 雙酶切 pBS-ProHCA2 (-)得 pAProHCA2 ；BamH I 和 KpnI 雙酶切 pBS_HCA2 (+)得 pBHCA2 ；回 收各片斷，用T4連接酶進(jìn)行連接后即得pQ4EnhProHCA2，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選 陽(yáng)性克隆之后，培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒并用酶切鑒定其正確性。過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建好后，按 前述方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，然后用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥野生型和hca2突變體。由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的At5g62940基因的RNAi載體HCA2 RNAi的構(gòu)建方法為了構(gòu)建HCA2基因的RNAi載體，根據(jù)HCA2的cDNA序列，然后在3’端 的部分設(shè)計(jì)了一對(duì)引物HCA2-3 5' -GGG AGT GAA CAA TGA CAA CCT G—3'HCA2-4 5' -ATT CCA CGA CGA ACC TAA ACC-3‘
通過(guò)PCR擴(kuò)增得到HCA2基因3 ’端的一段400bp左右的片段，將其命名為 HCA2Frag。將上面所得PCR產(chǎn)物連接到用EcoRV單酶切的pBS平末端載體中，PCR篩選得 到正向和反向插入的各種克隆載體，分別命名為(+)和(_)。然后通過(guò)測(cè)序跟NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) 中的序列進(jìn)行比對(duì)以確定克隆片段的正確性。再用BamH I和Kpn I雙酶切本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建 的用于構(gòu)建植物RNAi載體的模板載體pQGl 10得到pQGllO ；用BamH I和Hind III雙酶切 pBS-HCA2Frag反向插入質(zhì)粒得pAHCA2Frag ；用Hind III和EcoR I雙酶切pBS-⑶S正向插 入質(zhì)粒得PB⑶S ；用EcoR I和Kpn I雙酶切pBS_HCA2Frag正向插入質(zhì)粒得pBHCA2Frag ；回 收各片斷，連接后即得pQHCA2RNAi載體。轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選陽(yáng)性克隆之后， 培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒并用酶切鑒定其正確性。將正確的質(zhì)粒按前述方法轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌 GV3101，然后按前述方法用含有At5g62940基因的RNAi載體HCA2RNAi的農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn) 化hca2突變體。At5g62950的過(guò)量表達(dá)載體At5g629500El的構(gòu)建方法用BamH I和Kpn I分別酶 切前段敘述的本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的過(guò)量表達(dá)載體模板載體PQGllO和PBS-At5g62950，回收各 片斷，連接后得到pQ35SAt5g62950。轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選陽(yáng)性克隆之后，培養(yǎng)陽(yáng) 性克隆，提質(zhì)粒并用酶切鑒定其正確性。將正確的質(zhì)粒按前述方法轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌GV3101， 然后按前述方法用含有At5g62950基因的過(guò)量表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化野生型擬南 芥。首先，我們既檢測(cè)了用4個(gè)35S增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的At5g62940基因過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因 植株，又檢測(cè)了使得At5g62950降低表達(dá)的SALK突變體(SALK_117570)。結(jié)果如圖3A-D所 示，4個(gè)35S增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的At5g62940基因過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出矮小的表型(重現(xiàn) 了 hca2突變體的表型)，而且其花序莖基部的橫切也顯示其維管形成層也基本上連接在一 起，表現(xiàn)出較高的形成層活性(切片方法見(jiàn)后)；而插入到At5g62950基因第一個(gè)內(nèi)含子上 的SALK突變體SALK_117570卻仍然表現(xiàn)出野生型的表型。同時(shí)，實(shí)時(shí)定量RT-PCR的分析 顯示在4X35S增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的At5g62940基因過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中At5g62940基因確 實(shí)是過(guò)量表達(dá)了的，而在SALK_117570突變體中At5g62950基因的表達(dá)量顯著降低(見(jiàn)圖 4)。這樣的結(jié)果就表明只有通過(guò)過(guò)量表達(dá)At5g62940基因而不是通過(guò)降低表達(dá)At5g62950 基因才能夠重現(xiàn)高形成層活性和矮化的表型。為了更進(jìn)一步的確定是At5g62940基因的過(guò)量表達(dá)而不是At5g62950基因的敲除 所引起的hca2突變體的表型，我們?cè)趆ca2突變體中轉(zhuǎn)入了由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S 啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的At5g62940基因的RNAi載體和At5g62950的過(guò)量表達(dá)載體。在hca2突變體背景下轉(zhuǎn)入RNAi載體的大部分轉(zhuǎn)基因植株不僅在整體上而且在 維管組織的排列形式上都恢復(fù)到了野生型的結(jié)構(gòu)(圖3A，E和F)，實(shí)時(shí)定量RT-PCR的結(jié)果 也表明在轉(zhuǎn)基因植株中At5g62940基因基本上恢復(fù)到野生型的水平(圖4)，而轉(zhuǎn)入了過(guò)量 表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株仍然具有突變體的表型，也就是說(shuō)，hca2突變體中轉(zhuǎn)入HAC2RNAi載 體(即由CaMV35S啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的At5g62940基因的RNAi載體)可以恢復(fù)表型，而轉(zhuǎn)入 At5g62950過(guò)量表達(dá)載體不能恢復(fù)表型。以上的這些證據(jù)充分的說(shuō)明hca2突變體的表型是 由于過(guò)量表達(dá)At5g62940基因所引起的。進(jìn)一步的研究表明，At5g62940基因編碼一個(gè)核定位的Dof轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄激 活活性，將其命名為HCA2/AtDof5. 6，其可能通過(guò)改變細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的響應(yīng)來(lái)調(diào)控束間形成層的形成和維管組織的發(fā)育，這是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)參與調(diào)控束間形成層形成的轉(zhuǎn)錄因子。三、HCA2/AtDof5. 6嵌合抑制子導(dǎo)致植物維管組織的發(fā)育發(fā)生缺陷為了更進(jìn)一步的研究HCA2/AtDof5.6的功能，我們利用嵌合抑制子沉默技術(shù) 將HCA2/AtDof5. 6和SRDX基序抑制結(jié)構(gòu)域融合形成顯性的抑制子。該基序是從擬南芥 SUPERMAN基因中分離得到的，含有12個(gè)氨基酸殘基LDLDLELRLGFA，將該基序融合在轉(zhuǎn)錄 因子的C末端時(shí)，就可以在轉(zhuǎn)基因擬南芥中作為顯性的抑制子起作用，這樣即便是有冗余 的轉(zhuǎn)錄因子存在的情況下也可以抑制其下游目標(biāo)基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生顯性的類似于缺 失突變體的表型(Hiratsu et al. ,2003, Plant J，34，733—739. ；Hiratsu et al. ,2004, BiochemBiophys Res Comm,321,172-178.)。35S:HCA2SRDX載體是將不含有終止密碼子的HCA2/AtDof5. 6編碼序列和編碼 SRDX基序的序列融合后構(gòu)建到花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的載體中。35S:HCA2SRDX載體 的構(gòu)建方法是根據(jù)EAR基序抑制結(jié)構(gòu)域SRDX的序列，分別合成了它的正義鏈和反義鏈SRDX-I 5' GAT CTG GAT CTA GAA CTC CGT TTG GGT TTC GCT TAA3'SRDX-2 5' TTA AGC GAA ACC CAA ACG GAG TTC TAG ATC CAG ATC3'將兩條鏈退火之后配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，然后將其連入到PCAMBIA1390載體中就得 到pCAMBIA1390SRDX載體，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證其正確性。同時(shí)用HCA2-1和HCA2NS引物擴(kuò)增不含有終止密碼子的HCA2編碼序列HCA2-1 5' -ATG GGT CTC ACT TCT CTT CAA-3‘HCA2NS 5' -AAC CAA GGA GTT TGT TTT AGT G—3'將其插入到EcoRV單酶切的PBS載體中得到pBS_HCA2NS載體，篩選陽(yáng)性克隆并通 過(guò)PCR鑒定方向，測(cè)序驗(yàn)證其正確性。接著用Pst I和Spe I雙酶切pCAMBIA1390SRDX得 PCAMBIA1390SRDX ；Pst I 和 Kpn I 雙酶切 pQGllO 得 35S Promoter ；Kpn I 和 Spe I 雙酶切 PBS-HCA2NS (-)得pA81DzfNS ；回收各片段后連接得35S:HCA2SRDX載體。將其轉(zhuǎn)入DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆PCR鑒定，然后提質(zhì)粒在通過(guò)酶切鑒定其正確性。將正確的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌中。首先是制備農(nóng)桿菌感受態(tài)LB 培養(yǎng)基(IL)胰蛋白胨(Tryptone)IOg酵母提取物(YeastExtract) 5gNaClIOg瓊脂粉15g(固體培養(yǎng)基)(1)將新鮮的農(nóng)桿菌單菌落接種到IOml液體LB培養(yǎng)基中，28°C過(guò)夜振蕩培養(yǎng)； (2)取Iml菌液轉(zhuǎn)移到200ml液體LB培養(yǎng)基中，在11三角瓶中28°C振蕩培養(yǎng)IOhr左右；(3) 室溫5000rpm離心lOmin，倒掉上清，用5ml pH8. O的TE懸?。?4)再離心，去掉上清(沉淀 成粉紅色)；(5)將細(xì)胞懸浮到1/10體積的LB+甘油混合物中(甘油終濃度為25% ) (4ml = 2ml LB+2ml 50%甘油)；(6) 250 μ 1/管分裝感受態(tài)；(7)用液氮速凍，然后保存到_70°C 冰箱。待用。然后將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(1)取出-70°C保存的農(nóng)桿菌感受態(tài) 細(xì)胞，至于冰上，待其融化之后加入6 7 μ 1質(zhì)粒，混勻；⑵冰上放置5min ； (3)置于液氮 中速凍，繼續(xù)用液氮處理5min ； (4) 37°C水浴熱激5min ； (5)加入Iml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，置于28°C搖床中復(fù)蘇4hr左右；(6)室溫5000rpm離心5min，棄去上清；(7)加入 200 μ 1新鮮的LB培養(yǎng)基，混勻后涂板，置于28°C溫箱中溫育。然后用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型擬 南芥植株。轉(zhuǎn)化野生型擬南芥植株，轉(zhuǎn)化方法農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)液IL :MS 混合物2.2g蔗糖50gSilwet L77200 μ 1(1)從平板上挑取篩選為陽(yáng)性的農(nóng)桿菌單菌落接入含有50mg/l慶大霉素、IOmg/ 1利福平和50mg/l相應(yīng)篩選抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)24hr左右；(2)按 1 50的比例轉(zhuǎn)接到250ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)20hr 左右；(3)28°C，5000rpm離心IOmin收集菌體；(4)用IOOml農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)液重懸菌體； (5)將IOOml農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)液倒入適當(dāng)?shù)娜萜?，然后將已剪去已開(kāi)的花(以露白為準(zhǔn)) 和角果的擬南芥植株倒置，使其全部花蕾完全浸入菌液中，保持15min，取出后平放，暗培養(yǎng) 24hr ； (6)將植株正常放置，置于溫室里生長(zhǎng)，待種子成熟后收獲。然后通過(guò)潮霉素篩選轉(zhuǎn) 基因植株，獲得轉(zhuǎn)化HCA2/AtDof5. 6嵌合抑制子的轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)這些植株的表型分析發(fā) 現(xiàn)大部分的轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的表型。和野生型植株相比，光下生長(zhǎng)的35S:HCA2SRDX轉(zhuǎn) 基因植株幼苗的下胚軸比野生型要長(zhǎng)很多，而且子葉向下卷曲。隨著植株的生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植 株的葉柄比野生型要長(zhǎng)，葉片變的細(xì)長(zhǎng)。同時(shí)，提取個(gè)野生型和轉(zhuǎn)基因植株的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA(同前段敘述方 法)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了 35S:HCA2SRDX轉(zhuǎn)基因植株花序莖中HCA2SRDX轉(zhuǎn) 基因的表達(dá)量以及內(nèi)源的HCA2/AtDof5. 6基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，在這些轉(zhuǎn)基因植株中 HCA2SRDX都有不同程度的表達(dá)，而HCA2/AtDof5. 6的表達(dá)量和野生型相比幾乎沒(méi)有很明顯 的變化，而在野生型植株中沒(méi)有HCA2SRDX的表達(dá)；同時(shí)，通過(guò)對(duì)不同株系的轉(zhuǎn)基因植株的 表達(dá)量的分析，也發(fā)現(xiàn)HCA2SRDX的表達(dá)量和其表型的嚴(yán)重程度是相關(guān)的(圖5A)。這就表 明35S:HCA2SRDX轉(zhuǎn)基因植株的表型并不是由于共抑制作用所造成的。特別是，對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因植株的花序莖基部進(jìn)行樹(shù)脂切片，切片的方法和過(guò)程 為首先是實(shí)驗(yàn)材料的包埋(1)取合適樣品在戊二醛固定液中固定；IOOml 4%戊二醛固定液的配置50% 戊二醛8ml0. 2M 磷酸緩沖液 6.25mlddH2085.75ml(2)500mmHg抽真空3 4hr，待材料沉至液面下，30min到Ihr可撥動(dòng)一下材料，固 定后的材料可置于4°C過(guò)夜；(3)用磷酸緩沖液洗兩次，每次30min ；0. 2M 磷酸緩沖液(pH6. 8) 200ml NaH2PO4 · 2H20 3. 12gNa2HPO4 · 12H20 7. 16gddH20 補(bǔ)足 200ml，調(diào) pH 值至 6. 8
(4)用 15%、30%、50%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇逐級(jí)脫水，每次30111土11 左右；(5) 100%乙醇樹(shù)脂=2 1浸3-4hr，浸樹(shù)脂時(shí)每步先潤(rùn)洗IOmin ； (6) 100%乙醇 樹(shù)脂=1 2浸3-4hr ;(7)用100%樹(shù)脂潤(rùn)洗兩次，第二次浸泡過(guò)夜；(8)更換一次新鮮 100%樹(shù)脂，Ihr后即可包埋；(9)55°C聚合24hr以上。樹(shù)脂包埋及切片樹(shù)脂使用前要現(xiàn)配， 將各種物質(zhì)加在一起后振蕩混勻，4°C冰箱中放置。樹(shù)脂的配制VCD (Vinylcyclophene Dioxide(ERL 4206))IOgDER(Diglycidyl Ether of Polypropylene Glycol) 6gNSA(Nonenyl Succinic Anhydride) 26gDAME (Dimethylaminoethanol)0. 4g載玻片的處理新玻片置于洗液中浸泡24hr以上，流水沖洗，ddH20沖洗5次，95% 乙醇浸泡2hr以上。蓋玻片較薄較脆，時(shí)間應(yīng)相應(yīng)縮短。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備好42°C展片臺(tái)。(1)用單面刀片修整包埋好組織的樹(shù)脂塊，要接觸玻璃刀的一面修成矩形；(2)將 載玻片放在水平臺(tái)上，滴一滴明膠，用干凈的手套抹勻(注意留出做標(biāo)記的位置)。稍干后 加400 μ 1 ddH20于載玻片上，水面大小相當(dāng)于蓋玻片；(3)切出0.5 5μπι的組織切片，一 般采用的是2 5μπι，注意玻璃刀上不要有太多劃痕，否則會(huì)影響組織結(jié)構(gòu)的觀察；(4)將 切片飄浮在水面上展平，規(guī)則排列；(5)將此載玻片放在42°C展片臺(tái)上，展片約5min，待多 余水揮發(fā)后即可放置42°C恒溫箱8hr以上(最好24hr以上)，裝入切片盒內(nèi)4°C存放待用； (6)應(yīng)用Spurr樹(shù)脂的切片染色比較困難，需要先將樹(shù)脂脫掉后再染色；(7)配制氫氧化鈉 無(wú)水乙醇飽和溶液，放置2 3d，至溶液變成暗黃棕色為止；(8)將切片浸入上述溶液Ihr ； (9)移至無(wú)水酒精4次，每次5min ； (10)流水洗5min ； (11)染色最好在染缸中進(jìn)行，一次一 片，染5sec (剛從4°C取出的染液上色較慢，15sec為宜)，迅速拿出自來(lái)水沖洗載玻片背面， 水流不要過(guò)大，隨時(shí)鏡檢(自來(lái)水分色效果較好)；(12)42°C恒溫箱烤片8hr以上；(13)及 時(shí)用香柏油或環(huán)氧樹(shù)脂封片，不要加太多，大蓋玻片加40 μ 1即可，小蓋玻片20 μ 1。最好在 封片后立刻照相，因時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)褪色。通過(guò)對(duì)花序莖基部的維管組織分析表明，盡管六周大小的野生型植株沒(méi)有或者幾 乎形成很少量的束間形成層，但是再生長(zhǎng)兩周之后在維管組織的束間區(qū)域已經(jīng)可以看到通 過(guò)平周分裂所形成的束間形成層，這些束間形成層是通過(guò)束中形成層邊沿起始并且延伸之后形成的(圖5Β)。然而，對(duì)于八周大小的35S:HCA2SRDX轉(zhuǎn)基因植株的分析表明，在這類植 株的維管束之間幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)分裂中的束間胞壁組織細(xì)胞(圖5C和D)，這就表明在嵌合抑 制的轉(zhuǎn)基因植株的花序莖中束間形成層并還沒(méi)有開(kāi)始形成。因此，對(duì)HCA2/AtDof5. 6嵌合 抑制轉(zhuǎn)基因植株的分析表明抑制HCA2/AtDof5. 6下游基因的表達(dá)可以抑制束間形成層的 發(fā)生，這和在過(guò)量表達(dá)HCA2/AtDof5. 6的hca2突變體中觀察到的表型幾乎是完全相反的。序列表(SEQUENCELISTING)<110>北京大學(xué)<120>控制擬南芥維管束發(fā)育的特異性基因及其應(yīng)用<130>JSP090367<160>2<170>PatentIn version 3. 1
<210>1〈211>1560<212>DNA〈213〉擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1gaggagaagaagggtcctct tcttgtttcc ttcttattca catcccaacc ccaaactctt60ccttgcctcatcatctctca catttctctc ttctccttct ctctctagat tttgttcagg120aacttgtcttaaaaactctc actctccctc aaactaaaca aacatacaga acacaaaatg180ggtctcacttctcttcaagt ttgcatggat tctgattggc tccaggaatc cgagtcatca240ggaggaagcatgttagactc ttcaacgaat tctccgtcag cagccgacat actagcagct300tgcagcactagaccacaagc ctcggccgtg gctgtagccg ctgcagctct gatggacggt360ggaaggaggctgcgtccacc tcacgaccat cctcaaaagt gtcctcgttg cgagtcaaca420catactaagttctgttacta caataactac agcctctctc agcctcgtta cttctgcaag480acttgtcgccgttactggac aaaaggcgga actctaagga atattccggt tggtggtgga540tgccgtaaaaacaagaaacc atcttcctct aattcctcct cctccacttc ttccggcaaa600aaaccatccaacatcgttac cgccaatacc tctgatctta tggctttagc acattctcat660caaaattaccaacattctcc tctagggttt tcacattttg gtgggatgat ggggtcttac720tcaactccggagcatggtaa cgttggtttc ttggagagca agtatggcgg tttgctttcg780cagagccctagacctattga tttcttggac agtaagtttg atctcatggg agtgaacaat840gacaacctggtcatggttaa tcatggaagt aacggagatc atcatcatca tcataatcat900cacatgggtctgaatcacgg tgtaggtctt acaacaatgg tggatttaat960gggatttctacgggaggcaa tggaaatggt ggtggtctca tggatatatc gacatgccaa1020agacttatgctatctaatta tgatcatcac cattacaatc atcaagaaga tcatcaaagg1080gtagcaacaataatggatgt gaagccaaat ccgaagttgt tatcgcttga ttggcagcaa1140gatcaatgctactccaatgg tggtggtagc ggaggcgcag gaaaatccga cggtggtgga1200tacggcaatggtggttatat caacggttta ggttcgtcgt ggaatggttt gatgaatggc1260tatggaacgtccactaaaac aaactccttg gtttgataag ttaatcagaa cttctttttt1320cttgtcgtcatcaactagta gtagtagtaa tagtagttgg agactagaga agcacttcaa1380attatttatgggtttgtttg ctaagccagt tttactttcg taattggtgg ttatttacga1440gagtaatcttaattagtaat cttgactaga gtattcagag agatatttcg tttgtgtgtg1500ttcgtgtggttgaggtgtaa tgtttcttga tatatataag tagtgcccat ttacttttgg1560<210>2<211>372<212>PRT〈213〉擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2Met Gly Leu Thr Ser Leu Gln Val Cys Met Asp Ser Asp Trp Leu Gln151015
Glu Ser Glu Ser Ser Gly Gly Ser Met Leu Asp Ser Ser Thr Asn Ser
202530Pro Ser Ala Ala Asp lie Leu Ala Ala Cys Ser Thr Arg Pro Gln Ala354045Ser Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Leu Met Asp Gly Gly Arg Arg505560Leu Arg Pro Pro His Asp His Pro Gln Lys Cys Pro Arg Cys Glu Ser65707580Thr His Thr Lys Phe Cys Tyr Tyr Asn Asn Tyr Ser Leu Ser Gln Pro859095Arg Tyr Phe Cys Lys Thr Cys Arg Arg Tyr Trp Thr Lys Gly Gly Thr100105110Leu Arg Asn lie Pro Val Gly Gly Gly Cys Arg Lys Asn Lys Lys Pro115120125Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Gly Lys Lys Pro Ser130135140Asn lie Val Thr Ala Asn Thr Ser Asp Leu Met Ala Leu Ala His Ser145150155160His Gln Asn Tyr Gln His Ser Pro Leu Gly Phe Ser His Phe Gly Gly165170175Met Met Gly Ser Tyr Ser Thr Pro Glu His Gly Asn Val Gly Phe Leu180185190Glu Ser Lys Tyr Gly Gly Leu Leu Ser Gln Ser Pro Arg Pro lie Asp195200205Phe Leu Asp Ser Lys Phe Asp Leu Met Gly Val Asn Asn Asp Asn Leu210215220Val Met Val Asn His Gly Ser Asn Gly Asp His His His His His Asn225230235240His His Met Gly Leu Asn His Gly Val Gly Leu Asn Asn Asn Asn Asn245250255Asn Gly Gly Phe Asn Gly lie Ser Thr Gly Gly Asn Gly Asn Gly Gly260265270Gly Leu Met Asp lie Ser Thr Cys Gln Arg Leu Met Leu Ser Asn Tyr275280285Asp His His His Tyr Asn His Gln Glu Asp His Gln Arg Val Ala Thr290295300lie Met Asp Val Lys Pro Asn Pro Lys Leu Leu Ser Leu Asp Trp Gln305310315320Gln Asp Gln Cys Tyr Ser Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Lys
325330335
Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Gly Asn Gly Gly Tyr lie Asn Gly Leu Gly340345350Ser Ser Trp Asn Gly Leu Met Asn Gly Tyr Gly Thr Ser Thr Lys Thr355360365
Asn Ser Leu Val370
權(quán)利要求
一種調(diào)控植株莖桿粗細(xì)的方法，在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)量表達(dá)序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的編碼基因，使植株的莖桿變粗；或者抑制該基因在植物中的表達(dá)，使植物莖桿變細(xì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述調(diào)控植株莖桿粗細(xì)的方法是使植株莖 桿變粗的方法，將序列表中SEQ ID No. 2氨基酸序列的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞、組織或器官 中，再將該植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，并使所述基因在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)過(guò)量表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述序列表中SEQID No. 2氨基酸序列 的編碼基因是其cDNA序列或基因組基因序列。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述cDNA序列是序列表中SEQID No. 1。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述序列表中SEQID No. 2氨基酸序列的編 碼基因通過(guò)植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體是 一種可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體，或者是可在原核生 物中復(fù)制的載體。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在用所述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn) 錄起始核苷酸前加上一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在用所述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)添加翻 譯增強(qiáng)子和/或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在所述植物表達(dá)載體中加入一種或多種選 擇性標(biāo)記基因，所述選擇性標(biāo)記基因包括但不限于可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變 化的酶的基因、發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物和抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種控制擬南芥維管束發(fā)育的特異性基因及其應(yīng)用。所述基因編碼如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其基因組基因是AT5g62940，相應(yīng)的cNDA序列如序列表中SEQ ID No.1所示。研究表明，該基因編碼的是一個(gè)定位在核內(nèi)并且具有反式激活活性的轉(zhuǎn)錄因子，可能參與調(diào)控?cái)M南芥束間形成層的形成和維管組織的發(fā)育，是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)調(diào)控束間形成層形成的轉(zhuǎn)錄因子。在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)量表達(dá)該基因可使植株的莖桿變粗；而抑制該基因在植物中的表達(dá)可抑制束間形成層的發(fā)生。由此，利用該基因可以調(diào)控植株的莖桿粗細(xì)，應(yīng)用于次生生長(zhǎng)強(qiáng)的木本植物的研究和品質(zhì)改良，在林木花草莖桿粗細(xì)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控方面應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101824433SQ20091023676
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月3日
發(fā)明者康定明, 瞿禮嘉, 秦跟基, 郭勇, 顧紅雅 申請(qǐng)人:北京大學(xué)