專利名稱：一種產(chǎn)油微生物培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)油微生物培養(yǎng)的方法，更具體地講，是在碳源濃度大于40g/L 的培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)基中碳源和磷源的比率(C/P比)，使產(chǎn)油微生物經(jīng)通氣培養(yǎng)后得到 的菌體含有超過細(xì)胞干重40 %的油脂。本發(fā)明技術(shù)簡單，可減少磷源用量，提高微生物利用 天然原料發(fā)酵生產(chǎn)油脂的能力，提高菌體油脂含量和生產(chǎn)效率，降低成本，改善微生物油脂 發(fā)酵的技術(shù)經(jīng)濟(jì)性。
背景技術(shù)：
許多微生物，如酵母、霉菌和藻類等在一定條件下，能以碳水化合物、碳?xì)浠?物等為碳源，在體內(nèi)合成并貯存大量油脂。凡是可以在胞內(nèi)油脂積累超過細(xì)胞干重20% 的微生物稱為產(chǎn)油微生物(Ratledge C，Wynn JP. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms. Advances in Applied Microbiology，2002，51，1-5 。部分產(chǎn)油微生物能在菌體內(nèi)積累含量超過細(xì)胞干重60%以 上的油脂。以產(chǎn)油微生物菌體為原料分離得到的油脂稱為微生物油脂。微生物油脂，尤其 是酵母產(chǎn)生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸組成與商品化的動植物油脂相似，仍以 C16和Cw系脂肪酸為主。相對于動植物油脂，微生物油脂生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)與氣候限制， 原料來源廣，基本不占用額外耕地資源，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，被認(rèn)為很有潛力的新型油脂資 源。因此，微生物油脂不僅可能作為食用油或其它功能性油脂的替代品，還可能在可再生液 體燃料生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮重要作用(趙宗保.加快微生物油脂研究為生物柴油產(chǎn)業(yè) 提供廉價原料.中國生物工程雜志，2005，25 (2)，8-11)。目前微生物油脂發(fā)酵主要建立在氮源限制的調(diào)控機(jī)制上。培養(yǎng)基中可同化氮源耗 盡，細(xì)胞生長受到限制，代謝活動主要將過量的碳源轉(zhuǎn)化為脂類分子。許多文獻(xiàn)研究也表 明控制培養(yǎng)基碳源和氮源的比率(C/N比)能顯著改善微生物油脂積累，如Papanikolaou S.等報道多限制因素對刺孢小克銀漢霉和深黃被孢霉的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基的C/N比 從83. 5增加到133. 5時，刺孢小克銀漢霉的油脂含量從36%增加到47% ；深黃被孢霉 的油脂含量由 50% 提高到 56% (Papanikolaou S, Sarantou S, Komaitis Μ, Aggelis G.. Repression of reserve lipid turnover in Cunninghamella echinulata and Mortierella isabellina cultivated in multiple-limited media. Journal of Applied Microbiology，2004，97，867-875)。Angerbauer C.等研究斯達(dá)氏油脂酵母轉(zhuǎn)化城市淤泥為 油脂時也發(fā)現(xiàn)C/N比為15時，干菌體油脂含量僅為34% ；C/N比為60時，干菌體油脂含量 為40% ；C/N比為150時，干菌體油脂含量為68% ；表現(xiàn)為隨著C/N比升高，干菌體油脂含 量增加，發(fā)酵液中油脂量也增加。進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)果表明C/N比為100時，盡管干菌體油脂含 量為 56%，但油脂量達(dá)到 7. 5g/L (Angerbauer C, Siebenhofer Μ, Mittelbach Μ, Guebitz GM. Conversion of sewage sludge into lipids by Lipomyces starkeyi for biodiesel production. Bioresources Technology,2008,99,3051-3056)。磷也是微生物生長的必需元素，它參與核酸、磷脂、ATP、輔酶等重要分子的組
3裝。通常微生物培養(yǎng)基中含有豐富的磷源，例如培養(yǎng)酵母菌的YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20g/ L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH 5. 5-6.0)，其碳源和磷源的比率(C/P比)為50g/g， C/N比為3. lg/g。在這樣的條件下，產(chǎn)油微生物正常增殖，不在胞內(nèi)過量積累油脂。通過 控制培養(yǎng)基的C/P比，可以抑制產(chǎn)油微生物菌體生長，而有機(jī)碳源能轉(zhuǎn)化為油脂貯存在細(xì) 胞內(nèi)。Granger等研究不同營養(yǎng)限制下Iihodotorula glutinis油脂積累發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和 (NH4)2SO4 濃度分別為濃度為 20g/L 和 4. 0g/L、KH2PO4 濃度為 2. 4g/L、Na2HPO4 · 12H20 為 2. 3g/L時，即C/N比為9. 4g/g、C/P比為10. 7g/g的條件下連續(xù)發(fā)酵，菌體內(nèi)油脂積累量 僅為菌體干重5. 4% ；其他條件不變，減少培養(yǎng)基中含磷鹽濃度使C/P比率提高至208g/g， 細(xì)胞能將過量的碳源轉(zhuǎn)化為占生物量干重18%的油脂(Granger LM, Perlot P，Goma G， Pareilleux A. Effect of various nutrient limitations on fatty acid production by Rhodotorula glutinis. Applied Microbiology and Biotechnology,1993,38,784-789)。 顯然，控制培養(yǎng)基C/P比可能調(diào)控微生物油脂發(fā)酵，提高微生物油脂生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。為降低微生物油脂的生產(chǎn)成本，許多天然原料如玉米、甘薯、木薯、菊芋、麥稈、玉 米秸稈、稻草等都可作為微生物油脂發(fā)酵的底物。然而，由于氮和磷是植物生長的必須元 素，它們也貯存在植物的種子、塊莖、根和秸稈中。分析表明玉米顆粒總C/N比和C/P比 分別為21g/g和69g/g ；甘薯塊莖中總C/N比和C/P比分別為28g/g和61g/g ；木薯塊莖 中總C/N比和C/P比分別為33g/g和68g/g ；菊芋塊莖中總C/N比和C/P比分別為17g/g 和78g/g ；麥稈總C/N比和C/P比分別為42g/g和66g/g ；玉米秸稈總C/N比和C/P比分別 為41g/g和70g/g ；稻草總C/N比和C/P比分別為39g/g和63g/g(高云·黑甜玉米的營 養(yǎng)成分分析及開發(fā)利用.食品科學(xué)，2000，21(12)，59-61。張立明，王慶美，王蔭墀.甘薯 的主要營養(yǎng)成分和保健作用.中國食物與營養(yǎng)，2003，07。Lee J. Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol. Journal of Biotechnology,1997,56,1-24)。 顯然，這些原料均含有豐富的氮源和磷源，直接用于油脂發(fā)酵時效率低。由于氮元素主 要整合到蛋白質(zhì)中，磷元素整合到核酸、磷脂、ATP、輔酶等不穩(wěn)定活性分子中，天然底物 在預(yù)處理過程中磷源較易釋放出來，而氮源不容易釋放。因此，通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)處理可 以從原料中有效移去磷源，提高原料的C/P比，使其有利于微生物油脂發(fā)酵(Szogi AA, Vanotti MB. Prospects for phosphorus recovery from poultry litter.Bioresource Technology, 2009,100, 5461-5465.趙芯，朱義年，廖雷，等.微生物蛋白硫酸水解提取 復(fù)合氨基酸的研究.中國資源綜合利用，2006，M(10)，10-13.Morgm GB，Lackey JB， Gilcreas FW. Quantitative determination of organic nitrogen in water,sewage,and industrial wastes. Anal. Chem.，1957，29，833-835.)。本發(fā)明通過控制培養(yǎng)基組成，使碳源濃度大于40g/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)基C/P比大 于80g/g，產(chǎn)油微生物經(jīng)通氣培養(yǎng)后得到的菌體含有超過細(xì)胞干重40%的油脂。本發(fā)明提 供的產(chǎn)油微生物培養(yǎng)的方法，技術(shù)簡單，可減少磷源用量，提高微生物利用天然原料發(fā)酵生 產(chǎn)油脂的能力，提高菌體油脂含量和生產(chǎn)效率，降低成本，顯著改善微生物油脂發(fā)酵的技術(shù) 經(jīng)濟(jì)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過調(diào)整培養(yǎng)基初始碳源和磷源的用量、清除培養(yǎng)基中富余磷源、在微生物培養(yǎng)過程中增加碳源投料或添加磷清除劑的策略，在碳源濃度大于40g/L的培養(yǎng)基中得 到C/P比大于80g/g的培養(yǎng)基。產(chǎn)油微生物在上述培養(yǎng)基中通氣培養(yǎng)，得到的菌體含有超 過細(xì)胞干重40%的油脂。本發(fā)明技術(shù)簡單，可減少磷源用量，菌體油脂含量高，提高利用天 然原料發(fā)酵生產(chǎn)油脂的能力，降低成本，改善微生物油脂發(fā)酵的技術(shù)經(jīng)濟(jì)性。本發(fā)明切實(shí)有 效，簡單易行，為高效培養(yǎng)產(chǎn)油微生物，獲取微生物油脂提供了一種新方法。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)1、通過下述方法的一種或它們的必要組合方法，獲得C/P比大于80g/g的培養(yǎng)基 (碳源濃度>40g/L)A.控制磷源使用量，獲得C/P比率大于80g/g的培養(yǎng)基(碳源濃度彡40g/L)，此 方法適用于碳源中不含磷源的情況；或，B.使用磷源清除劑，降低磷源含量，獲得C/P比率大于80g/g的培養(yǎng)基(碳源濃度 ^ 40g/L)，此方法適用于發(fā)酵原料同時含有碳源和磷源的情況；或，C.在培養(yǎng)過程中增加碳源投料，獲得總C/P比率大于80g/g的培養(yǎng)基(碳源濃度 ^ 40g/L)，此方法適用于培養(yǎng)基初始C/P比小于80g/g的情況；或，D.在培養(yǎng)過程中添加磷源清除劑，除去部分磷源，獲得總C/P比率大于80g/g的培 養(yǎng)基(碳源濃度> 40g/L)，此方法適用于培養(yǎng)基初始C/P比小于80g/g的情況。2、產(chǎn)油微生物培養(yǎng)。按照上述方法A或B制備的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH2. 5-8. 0，直接滅 菌或補(bǔ)充微生物生長所需的常規(guī)營養(yǎng)成份后滅菌，接種產(chǎn)油微生物種子液，于20°C -40°C 通氣培養(yǎng)，待發(fā)酵液中總還原糖濃度降至10g/L以下時停止培養(yǎng)，收集菌體。除非另外說明，本發(fā)明使用液體培養(yǎng)基(葡萄糖或相應(yīng)碳源20g/L，酵母粉10g/L， 蛋白胨10g/L，pH 5.5-6.0)制備產(chǎn)油微生物種子液。種子液培養(yǎng)條件為溫度25_37°C，通 風(fēng)培養(yǎng)20-48小時，細(xì)胞密度達(dá)到IO5-IO8個細(xì)胞/mL。其中酵母粉N和P的質(zhì)量含量分別 為9.0%和1.31% ；蛋白胨N和P的質(zhì)量含量分別為14. 5%和0. 14%。本發(fā)明參考文獻(xiàn)(LiYH, Zhao ZB, Bai Fff. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture. Enzyme Microbial Technology, 2007，41，312-317)的方法，在發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)離心、洗滌，收集菌體 沉淀。菌體在105°C干燥至恒重，即得干菌體。參照文獻(xiàn)(李植峰，張玲，沈曉京，等.四種 真菌油脂提取方法的比較研究.微生物學(xué)通報，2001，觀(6)，72-75.)使用酸熱-有機(jī)溶劑 法抽提獲得油脂，計算菌體油脂含量。本發(fā)明使用的磷源清除劑包括鎂鹽、鐵鹽、鋁鹽及鈣鹽，或它們的混合物，按照文 獻(xiàn)的方法(湯琪.磷酸銨鎂技術(shù)中不同沉淀劑脫氮除磷效果比較.重慶交通大學(xué)學(xué)報， 2008，27(1)，148-151。黃自力，肖晶晶，李密.化學(xué)沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武 漢科技大學(xué)學(xué)報，2009，32(1)，102-105。徐建宇，宮宇周，潘明富.幾種混凝劑深度除磷性 能的對比研究.廣西輕工業(yè)，2009，(1)，89-91)從溶液中脫除磷源。本發(fā)明所述的碳源為戊糖、己糖、氨基糖及經(jīng)水解可釋放出戊糖、己糖、氨基糖的 材料，包括化學(xué)組成明確的有機(jī)物，如葡萄糖、木糖、蔗糖、N-乙酰葡糖胺等，天然有機(jī)質(zhì)或 工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，如玉米、小麥、水稻、甘薯、木薯、菊芋、土豆、麥稈、玉米秸稈、稻草、蔗渣、糖 蜜、乳清、淀粉廢水、發(fā)酵廢水、廢甘油以及它們的組合。
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本發(fā)明所述的磷源為磷酸鹽及經(jīng)水解可釋放出磷酸根的物質(zhì)。本發(fā)明所述的其它微生物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)包括氮源、硫源、金屬離子、維生物 素及其它具有顯著作用的物質(zhì)或它們的組合。本發(fā)明使用的產(chǎn)油微生物為經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后菌體油脂含量可超過細(xì)胞干重 20% (w/w)的真菌、細(xì)菌或微藻。它們包括但不限于，產(chǎn)油真菌，如Miodosporidium toruloides、Cryptococcus curvatus、Cryptococcus albidus、Yarrowia lipolytica、 Rhodotorula glutinis、 Rhizopus arrhizus、 Lipomyces starkeyi、 Trichosporon cutaneum、Mortierella isabellina、Mucor circinelloides 禾口 Cunninghamella ；產(chǎn)油 細(xì)菌，如 Croynebacterium、Nocardia、Mycobacterium 禾口 Rhodococcus opacus ；產(chǎn)油微 藻，如 Botryococcus braunii、Crypthecodinium cohnii、Chlorella protothecoides、 Nannochloropsis sp.禾口 Schizochytrium limacinum。本發(fā)明的有益效果是1)與現(xiàn)有使用高C/N比培養(yǎng)基進(jìn)行油脂發(fā)酵相比，本發(fā)明 使用高C/P比培養(yǎng)基，減少了磷源用量，降低了油脂發(fā)酵輔料成本；幻當(dāng)使用天然材料作為 油脂發(fā)酵原料時，采用本發(fā)明的策略去除磷源簡單易行，效果好，原料處理工藝簡化，降低 了油脂發(fā)酵原料成本；；3)采用本發(fā)明的方法，低C/N比的原料不經(jīng)過非常復(fù)雜的氮源脫除 處理，也可以用于微生物油脂生產(chǎn)，擴(kuò)展了油脂發(fā)酵的原料范圍；4)本發(fā)明的方法培養(yǎng)產(chǎn) 油微生物效率高，所獲得的菌體材料油脂含量占細(xì)胞干重40%以上，有效提高了油脂發(fā)酵 的產(chǎn)物得率，降低了生產(chǎn)成本?？傊?，本發(fā)明技術(shù)簡單有效，投資少，有利于大規(guī)模工業(yè)化生 產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面是提高微生物油脂生產(chǎn)效率的具體實(shí)施例。通過實(shí)施例可進(jìn)一步了解控制培 養(yǎng)基中C/P比率大于80g/g對微生物油脂生產(chǎn)的影響。對比例1 培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖70，ΚΗ2Ρ043· 6，(NH4) 2S045. OjMgSO4 ·7Η201· 5, EDTA 0. 1， 蛋白胨2.0，調(diào)節(jié)ρΗ 6.0，C/N比率為21g/g，C/P比率為!Mg/g。121°C滅菌15min后，以 10% (v/v)接種量接入Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (購自中國普通微生物菌 種保藏管理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)138小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘 離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體23. 7g/L，油脂量5. 5g/L，菌體油脂含量23. 2%。實(shí)施例1 培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖70，KH2PO4 0. 1，(NH4)2SO4 5. 0，MgSO4 · 7Η201· 5，EDTA 0. 1，蛋白胨 2.0，調(diào)節(jié) ρΗ 6. 0，C/N 比率為 21g/g，C/P 比率為 1093g/g。121°C滅菌 15min 后，以10% (v/v)接種量接入Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (購自中國普通微生 物菌種保藏管理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)138小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體20. 7g/L，油脂量10. Og/L,菌體油脂含量48. 2%。 與對比例1比較，油脂量和油脂含量增率分別為81%和108%。實(shí)施例2 培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖70，KH2PO4 0. 04，(NH4)2SO4 5. 0，MgSO4 · 7H20 1. 5， EDTA0. 1，蛋白胨 2. 0，調(diào)節(jié)ρΗ 6. 0，C/N 比率為 21g/g，C/P 比率為 2343g/g。121°C滅菌 15min后，以10% (ν/ν)接種量接入Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (購自中國普通微生 物菌種保藏管理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)138小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體19. Og/L，油脂量10. 7g/L，菌體油脂含量56. 5%。 與對比例1比較，油脂量和油脂含量增率分別為95%和143%。實(shí)施例3:培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖70，KH2P04 0 . 00 5，(NH4)2SO4 5. OjMgSO4 ·7Η20 1. 5, EDTA 0. 1，蛋白胨 2.0，調(diào)節(jié) ρΗ 6. 0，C/N 比率為 21g/g，C/P 比率為 9858g/g。121°C滅菌 15min 后， 以10% (ν/ν)接種量接入Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (購自中國普通微生物 菌種保藏管理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)138小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分 鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體16. 3g/L，油脂量8. 8g/L，菌體油脂含量53. 9%。與 對比例1比較，油脂量和油脂含量增率分別為59%和132%。對比例2:培養(yǎng)基組成(g/L)木糖70，KH2P04 3. 6，(NH4)2SO4 4. OjMgSO4 ·7Η201· 5, EDTA 0. 1， 酵母粉0. 75，調(diào)節(jié)ρΗ 6. 0，C/N比率為31g/g，C/P比率為34g/g。121°C滅菌15min后，以 10% (ν/ν)接種量接入Lipomyces starkeyi AS 2. 1608 (購自中國普通微生物菌種保藏管 理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)144小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘，收集菌體，得到干菌體21. 2g/L，油脂量5. 2g/L，菌體油脂含量5%。實(shí)施例4 培養(yǎng)基組成(g/L)木糖70，KH2P04 0. 1，(NH4)2SO4 4. OjMgSO4 ·7Η201· 5, EDTA 0. 1， 酵母粉0.75，調(diào)節(jié)ρΗ 6. 0，C/N比率為31g/g，C/P比率為849g/g。121°C滅菌15min后，以 10% (v/v)接種量接入Lipomyces starkeyiAS 2. 1608 (購自中國普通微生物菌種保藏管 理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)144小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘，收集菌體，得到干菌體20. 2g/L，油脂量9. 7g/L，菌體油脂含量48. 0%。與對比例2比 較，油脂量和油脂含量增率分別為86%和96%。實(shí)施例5 培養(yǎng)基組成(g/L)木糖70，KH2PO4 0. 04，(NH4)2SO4 4. 0，MgSO4 · 7Η201· 5，EDTA 0. 1，酵母粉 0. 75，調(diào)節(jié) ρΗ 6.0，C/N 比率為 31g/g，C/P 比率為 1450g/g。121°C滅菌 15min 后，以10% (v/v)接種量接入Lipomyces starkeyi AS 2. 1608 (購自中國普通微生物菌種 保藏管理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)144小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離 心10分鐘，收集菌體，得到干菌體19. 3g/L，油脂量10. 5g/L，菌體油脂含量4%。與對比 例2比較，油脂量和油脂含量增率分別為102%和122%。對比例3:培養(yǎng)基組成(g/L)=N-乙酰葡糖胺 70,KH2PO4 2. 7,Na2HPO4 0. 95,MgSO4 ·7Η20 0. 2， 酵母粉1. 0，調(diào)節(jié)ρΗ 5. 5，C/N比率為6. 7g/g，C/P比率為36g/g。121°C滅菌15min后，以 10% (v/v)接種量接入 Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自 the American Type Culture Collection)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)120小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體21. 7g/L，油脂量7. 7g/L，菌體油脂含量35. 4%。實(shí)施例6:培養(yǎng)基組成(g/L)=N-乙酰葡糖胺 70，KH2PO4 0. 1，MgSO4 · 7H20 0. 2，酵母粉 1. 0，調(diào)節(jié) pH 5. 5，C/N 比率為 6. 7g/g, C/P 比率為 836g/g。121 V 滅菌 15min 后，以 10 % (ν/ ν)接種量接入 Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自 the American Type Culture Collection)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)120小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心 10分鐘，收集菌體得到干菌體20. lg/L，油脂量11. 4g/L，菌體油脂含量56.9%.與對比例 4比較，油脂量和油脂含量增率分別為48%和46%。對比例4:以新鮮菊芋塊莖為原料，參照文獻(xiàn)方法(華艷艷，趙鑫，趙金，張素芳，趙宗保.圓 紅冬孢酵母發(fā)酵菊芋塊莖產(chǎn)油脂的研究.中國生物工程雜志，2007，27 (10)，59-63)處 理，得到菊芋水解液，調(diào)整總還原糖濃度為70g/L，pH 5. 5，C/N比率為17. 4g/g，總磷濃 度為0. 356g/L，C/P比率為78. 6g/g。121 °C滅菌15min后，以10 % (ν/ν)接種量接入 Cryptococcus curvatus ATCC20509 (購自 the American Type Culture Collection)禾中子 液，于30°C通氣培養(yǎng)110小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌 體，得到干菌體20. 4g/L，油脂量8. Og/L,菌體油脂含量39. 2 %。實(shí)施例7 同對比例4的方法制備菊芋水解液，參照文獻(xiàn)方法(黃自力，肖晶晶，李密.化學(xué) 沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武漢科技大學(xué)學(xué)報，2009，32 (1),102-10 調(diào)菊芋水 解液總還原糖濃度為70g/L, pH 5. 5，加入i^eCl32. 4g/L，攪拌lh，過夜沉降，過濾，C/N比率 為 17. 4g/g，總磷濃度為 0. 083g/L, C/P 比率為 337g/g。121°C滅菌 15min 后，以 10% (ν/ ν)接種量接入 Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自 the American Type Culture Collection)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)110小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心 10分鐘，收集菌體，得干菌體19. 8g/L，油脂量10. 2g/L，菌體油脂含量51. 5%。與對比例4 比較，油脂量和油脂含量增率分別為27%和31%。實(shí)施例8 同對比例4的方法制備菊芋水解液，參照文獻(xiàn)方法(黃自力，肖晶晶，李密.化學(xué) 沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武漢科技大學(xué)學(xué)報，2009，32(1)，102-105.)調(diào)菊芋水 解液總還原糖濃度為70g/L，pH 5. 5，加入!^Cl3 3. 2g/L，攪拌lh，過夜沉降，過濾，C/N比率 為 17. 4g/g，總磷濃度為 0. 027g/L, C/P 比率為 1037g/g。121°C滅菌 15min 后，以 10% (ν/ ν)接種量接入 Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自 the American Type Culture Collection)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)110小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心 10分鐘，收集菌體，得干菌體18. 9g/L，油脂量12. 5g/L，菌體油脂含量66. 1%.與對比例4 比較，油脂量和油脂含量增率分別為56%和68%。對比例5:參照文獻(xiàn)方法(蔣常德，木薯燃料酒精濃醪發(fā)酵工藝研究，南寧廣西大學(xué))，以 市售木薯粉為原料，粉碎過40目篩，經(jīng)液化(液化工藝料水比為1 2.3，液化酶加入量 為10 μ /g,配料水溫為60°C，預(yù)熱溫度和時間分別為60°C、30min，液化溫度和時間分別為 105°C、2h。)、糖化(糖化工藝即在液化醪降溫到60°C時，調(diào)pH 4. 5，加糖化酶60°C保溫 糖化至多糖完全水解。糖化液調(diào)整總還原糖濃度為70g/L，pH 5.5^^WMgS04*7H20 1. 5g/ L，酵母粉1. 0g/L，總磷濃度為0. 426g/L, C/N比率為28g/g, C/P比率為65g/g。121°C滅菌 15min后，以 10% (v/v)接種量接入Mortierella isabellina AS 3. 3410 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液，于25°C通氣培養(yǎng)150小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn) /分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體22. 7g/L，油脂量7. 9g/L，菌體油脂含量34. 8%。實(shí)施例9:同對比例5的方法制備木薯水解液，調(diào)整總還原糖濃度為70g/L，參照文獻(xiàn)方法 (黃自力，肖晶晶，李密.化學(xué)沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武漢科技大學(xué)學(xué)報， 2009，32 (1)，102-105)，調(diào)整水解液 pH 6. 0，加入 Al2 (SO4) 31. 8g/L，攪拌 Ih,過夜沉降。調(diào) 整pH 5. 5，添加MgSO4 · 7H20 1. 5g/L，酵母粉1. Og/L,總磷濃度為0. 273g/L，C/N比率為 28g/g, C/P 比率為 102g/g。121°C滅菌 15min 后，以 10% (ν/ν)接種量接入 Mortierella isabellina AS 3. 3410 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液，于25°C通氣培 養(yǎng)150小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體得到干菌體22. 2g/ L,油脂量9. lg/L，菌體油脂含量41.0%。與對比例5比較，油脂量和油脂含量增率分別為 15% 禾口 18%。實(shí)施例10 同對比例5方法制備木薯水解液，調(diào)整總還原糖濃度為70g/L，pH 5. 5，添 加 MgS04*7H20 1.5g/L，酵母粉 1.0g/L，121°C 水解 15min。以 10 % (ν/ν)接種量接入 Mortierella isabellina AS 3. 3410 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液，于 30°C通氣培養(yǎng)Mh。參照文獻(xiàn)方法(黃自力，肖晶晶，李密.化學(xué)沉淀-磁絮凝深度快速除 磷的研究·武漢科技大學(xué)學(xué)報，2009，32 (1)，102-105.)，向發(fā)酵液中添加Al2 (SO4) 3至終濃 度達(dá)到4. Og/L,繼續(xù)培養(yǎng)至120小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收 集菌體得到干菌體20. 5g/L，油脂量10. 7g/L，菌體油脂含量52.2%。與對比例5比較，油脂 量和油脂含量增率分別為35%和50%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，按對比例5方法制備的總還原糖濃度 為70g/L的木薯水解液，經(jīng)4. Og/L的Al2(SO4)3處理，C/P可達(dá)到410g/g。這說明為在發(fā)酵 過程中使用磷源清除劑，提高發(fā)酵體系中的C/P比率，可以達(dá)到增加菌體油脂含量的有益 效果。對比例6:參照文獻(xiàn)方法(杜娟，王宏勛，金紅林，顏克亮，張曉昱.甘薯淀粉廢水發(fā)酵生產(chǎn) 微生物油脂的研究.生物加工過程，2007，5，33-36)，以新鮮甘薯為原料，切碎，料水比為 1 2.3勻漿，4層紗布過濾，濾液經(jīng)液化(液化酶加入量為10 μ /g,配料水溫為60°C，預(yù)熱 溫度和時間分別為60°C、30min，液化溫度和時間分別為105°C、2h)、糖化(在液化醪降溫到 60°C時，調(diào)pH 4. 5，加糖化酶60°C保溫糖化至多糖完全水解)。調(diào)整總還原糖濃度為70g/L， pH 5. 5，添加 MgSO4 · 7H20 1. 5g/L，酵母粉 1. Og/L,總磷濃度為 0. 467g/L，C/N 比率為 24g/ g，C/P比率為60g/g。121°C滅菌15min后，以10% (v/v)接種量接入白色隱球酵母ATCC 56四8(購自 the American Type Culture Collection)種子液，于20°C通氣培養(yǎng) 192小時， 停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體23. 5g/L，油脂量 7. lg/L，菌體油脂含量30.2%。實(shí)施例11 同對比例6的方法制備甘薯水解液，調(diào)整總還原糖濃度為70g/L，ρΗΙΟ. 0，參照文 獻(xiàn)方法(黃自力，肖晶晶，李密.化學(xué)沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武漢科技大學(xué) 學(xué)報，2009，32(1)，102-105) JnACaCl2 1. 5g/L，攪拌 lh，過夜沉降。調(diào)整 pH 5. 5，添加
9MgSO4 · 7H20 1. 5g/L，酵母粉 1. Og/L,總磷濃度為 0. 269g/L，C/N 比率為 24g/g, C/P 比率 為 104g/g。121°C滅菌 15min 后，以 10% (ν/ν)接種量接入 Cryptococcus albidus ATCC 56四8(購自 the American Type Culture Collection)種子液，于 20°C通氣培養(yǎng) 192 小 時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體得到干菌體22. lg/L，油脂 量8. 9g/L，菌體油脂含量40.3%。與對比例6比較，油脂量和油脂含量增率分別為25%和 33 % ο實(shí)施例12 同對比例6的方法制備甘薯水解液，調(diào)整總還原糖濃度為70g/L，ρΗΙΟ. 0，參照文 獻(xiàn)方法(黃自力，肖晶晶，李密.化學(xué)沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武漢科技大學(xué) 學(xué)報，2009，32 (1),102-105.) JnACaCl2 3. 5g/L，攪拌 lh，過夜沉降。調(diào)整 pH 5. 5，添加 MgSO4 · 7H20 1. 5g/L，酵母粉 1. Og/L,總磷濃度為 0. 036g/L, C/N 比率為 24g/g, C/P 比率 為 783g/g。121°C滅菌 15min 后，以 10% (ν/ν)接種量接入 Cryptococcus albidus ATCC 56四8(購自 the American Type Culture Collection)種子液，于 20°C通氣培養(yǎng) 192 小 時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體得到干菌體19. 9g/L，油脂 量12. 0g/L，菌體油脂含量60. 3%。與對比例6比較，油脂量和油脂含量增率分別為69%和 99%。對比例7:參照文獻(xiàn)方法(吳素萍.甘薯淀粉廢水發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的研究.生物加工 過程，2007，5，33-36)，以新鮮玉米粉(淀粉含量為65.9%)為原料，過60目篩，料水比為 1 2.3勻漿，4層紗布過濾，濾液經(jīng)液化(液化酶加入量為10 μ /g,配料水溫為60°C，預(yù)熱 溫度和時間分別為60°C、30min，液化溫度和時間分別為105°C、2h)、糖化(在液化醪降溫到 60°C時，調(diào)pH 4. 5，加糖化酶60°C保溫糖化至多糖完全水解)。調(diào)整總還原糖濃度為70g/L， PH 5. 5，添加 MgSO4 ·7Η20 1. 5g/L，酵母粉 1. 0g/L，總磷濃度為 0. 417g/L，C/N 比率為 18g/g， C/P 比率為 67g/g。121°C滅菌 15min 后，以 10% (ν/ν)接種量接入 Rhodotorula glutinis AS 2. 499(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)120小時， 停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體23. lg/L,油脂量 8. 2g/L，菌體油脂含量35.5%。實(shí)施例13 同對比例7的方法制備玉米粉水解液，調(diào)整總還原糖濃度為70g/L，pH9. 0，參照文 獻(xiàn)方法(湯琪.磷酸銨鎂技術(shù)中不同沉淀劑脫氮除磷效果比較.重慶交通大學(xué)學(xué)報，2008， 27(1)，148-151)，加入 MgCl2 ·6Η20 4. 0g/L、NH4C10. 8g/L，攪拌 lh，過夜沉降。調(diào)整 pH 5.5， 添加 MgSO4 · 7H20 1. 0g/L,酵母粉 1. 0g/L,總磷濃度為 0. 023g/L, C/N 比率為 18g/g，C/P 比率為 1242g/g。121°C滅菌 15min 后，以 10% (ν/ν)接種量接入 Rhodotorula glutinis AS2. 499 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)120小時，停 止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，得干菌體19. 6g/L，油脂量12. 9g/L，菌體 油脂含量65.8%。與對比例7比較，油脂量和油脂含量增率分別為57%和85%。對比例8:培養(yǎng)基組成(g/L)蔗糖30, KH2PO4 3. 6，(NH4)2SO4 4. 0，MgSO4 ·7Η200· 5，NaCl 5. 0， 酵母粉 0.75，CaCl2 3xlO-3，F(xiàn)eSOJxlO-3，調(diào)節(jié) pH 7. 8，C/N 比率為 14g/g，C/P 比率為 15g/g。121°C滅菌15min后，以10% (ν/ν)接種量接入Rhodococcus opacus PD630(購自德國生 物材料資源中心)種子液。于37°C通氣培養(yǎng)，4 后向發(fā)酵液中補(bǔ)加蔗糖，至發(fā)酵液中蔗糖 累積用量達(dá)到50g/L;培養(yǎng)后向發(fā)酵液中補(bǔ)加蔗糖，至發(fā)酵液中蔗糖累積用量達(dá)到70g/ L。培養(yǎng)144小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌 體19. 2g/L，油脂量4. 8g/L，菌體油脂含量25.0%。實(shí)施例14 培養(yǎng)基組成(g/L)蔗糖30, KH2PO4 1. 0，(NH4)2SO4 4. OjMgSO4 ·7Η200· 5, NaCl 5. 0， 酵母粉 0. 75，CaCl2 3xl(T3，F(xiàn)eS0Jxl(T3，調(diào)節(jié) pH 7. 8，C/N 比率為 14g/g，C/P 比率為 53g/ go 121°C滅菌 15min 后，以 10% (v/v)接種量接入 Rhodococcus opacus PD630(購自德國 生物材料資源中心)種子液。于37°C通氣培養(yǎng)，4 后向發(fā)酵液中補(bǔ)加蔗糖，至發(fā)酵液中 蔗糖累積用量達(dá)到50g/L ；培養(yǎng)后向發(fā)酵液中補(bǔ)加蔗糖，至發(fā)酵液中蔗糖累積用量達(dá)到 70g/L。培養(yǎng)144小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到 干菌體18.3g/L，油脂量8.7g/L，菌體油脂含量47.5%。與對比例8比較，油脂量和油脂含 量增率分別為81%和90%。這說明在初始C/P比率較低的條件下，通過在培養(yǎng)過程中補(bǔ)加 碳源，提高發(fā)酵體系的總C/P比率，也可以達(dá)到增加菌體油脂含量的有益效果。對比例9:培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖70，KH2PO4 3. 6，K2SO4 1. 5，氨基乙酸 4. 0，MgSO4 · 7H20 0. 3，CaCl23xl(T3，F(xiàn)eS042xl0-3, Vitamin BIO. OlxlO-3,酵母粉 2. 0，調(diào)節(jié) pH 6. 5，C/N 比率 為 30g/g, C/P 比率為 33g/g。115°C滅菌 30min 后，以 10% (v/v)接種量接入 Chlorella protothecoides (購自美國德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校藻種保藏中心)種子液，于通氣 培養(yǎng)120小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體 22. 4g/L，油脂量5. 2g/L，菌體油脂含量23.2%。實(shí)施例15 培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖70，KH2PO4 0. 05，K2SO4 1. 5，氨基乙酸 4. 0，MgSO4 · 7H20 0. 3，CaCl23xlO_3，F(xiàn)eS042xl(T3，Vitamin B1O. OlxlO-3,酵母粉 2. 0，調(diào)節(jié) pH 6. 5，C/N 比率 為 30g/g, C/P 比率為 725g/g。115°C滅菌 30min 后，以 10% (v/v)接種量接入 Chlorella protothecoides (購自美國德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校藻種保藏中心)種子液，于通氣 培養(yǎng)120小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體 19.6g/L，油脂量9. lg/L，菌體油脂含量46.4%。與對比例9比較，油脂量和油脂含量增率 分別為75%和100%。實(shí)施例16 參照文獻(xiàn)方法(Kootstra AMJ,Beeftink HH, Scott EL, Sanders JPM. Comparison of dilute mineral and organic acid pretreatment for enzymatic hydrolysis of wheat straw. Biochemical Engineering Journal，2009，46，126—131)，以新鮮玉米秸稈為 原料，干燥，粉碎過60目篩，和50mM馬來酸溶液混合，料液比為10% (w/w)，浸泡Mh，170°C 消化30min，稀釋至料液比為5% (w/w)，調(diào)pH 4. 8，纖維素酶加入量為50FPU/g固體，60°C、 150rpm反應(yīng)72h，過濾，調(diào)整總還原糖濃度為25g/L，C/N比為33g/g，C/P比為67g/g。在此 糖液中加入葡萄糖 50g/L，(NH4)2SO4 3.(^/1，1%504*7!1201.(^/1，酵母粉1.(^/1，調(diào)？!1 3.5。 此時培養(yǎng)基中C/N比率為四.lg/g，C/P比率為202. 5g/g。115°C滅菌30min后，以10% (ν/
11ν)接種量接入1Trichosporon cutaneum AS 2. 571 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中 心)種子液，于35°C通氣培養(yǎng)144小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘， 收集菌體，得到干菌體18. Og/L,油脂量7. 8g/L，菌體油脂含量43. 3 %。實(shí)施例17 培養(yǎng)基組成(g/L)市售蔗糖蜜(含總糖50%，總氮0.4%，總磷0. 145%) 100，葡 萄糖 20，(NH4)2SO4 4.0，MgSO4WH2O 1. 5，酵母粉 1. 0，調(diào)節(jié) pH 2. 5，過濾，C/N 比率為 25g/g， C/P 比率為 491g/g。121°C滅菌 15min 后，以 10% (ν/ν)接種量接入 Cryptococcus albidus ATCC 56298(購自 the AmericanType Culture Collection)種子液，于 24°C通氣培養(yǎng) 144 小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體，得到干菌體19. Og/L,油 脂量12. 7g/L，菌體油脂含量66. 8 %。實(shí)施例18 培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖150，(NH4)3PO4 0. 08，(NH4)2SO4 10. 0，MgSO4 ·7Η20 1. 5， EDTA 0. 1，酵母粉 2.0，調(diào)節(jié) pH 6.0，C/N 比率為 26g/g, C/P 比率為 2033g/g。121°C 滅菌 15min 后，以 10% (v/v)接種量接入 Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(購自中國 普通微生物菌種保藏管理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)168小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集菌體，得到干菌體61. 3g/L，油脂量31. 9g/L，菌體油脂含 量 52. 1%。實(shí)施例19 培養(yǎng)基組成(g/L)蔗糖45，KH2PO4O. 5，(NH4)2SO4IO. 0，MgSO4 · 7Η201· 5，酵母粉 10. 0，蛋白胨 10. 0，調(diào)節(jié) pH 7.0，C/N 比率為 4. 5g/g，C/P 比率為 73g/g。121°C滅菌 15min 后，以10% (v/v)接種量接入Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (購自中國普通微生 物菌種保藏管理中心)種子液。于30°C通氣培養(yǎng)，24h后向發(fā)酵液中補(bǔ)加蔗糖，至發(fā)酵液中 蔗糖累積用量達(dá)到60g/L ；培養(yǎng)4 后向發(fā)酵液中補(bǔ)加蔗糖，至發(fā)酵液中蔗糖累積用量達(dá)到 90g/L ；7 后向發(fā)酵液中補(bǔ)加蔗糖，至發(fā)酵液中蔗糖累積用量達(dá)到120g/L ；后向發(fā)酵液 中補(bǔ)加蔗糖，至發(fā)酵液中蔗糖累積用量達(dá)到150g/L;120h后向發(fā)酵液中補(bǔ)加蔗糖，至發(fā)酵 液中蔗糖累積用量達(dá)到180g/L ；144h后向發(fā)酵液中補(bǔ)加蔗糖，至發(fā)酵液中蔗糖累積用量達(dá) 到210g/L ；培養(yǎng)180小時，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液于10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集菌體， 得到干菌體85. 2g/L，油脂量42. lg/L，菌體油脂含量49.4%。這說明在初始C/P比率較低 的條件下，通過在培養(yǎng)過程中補(bǔ)加碳源，提高發(fā)酵體系的總C/P比率，也可以得到高菌體油 脂含量。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)油微生物培養(yǎng)的方法，其特征是培養(yǎng)基中碳源濃度大于40g/l，并且碳源和 磷源的比率、C/P比大于80g/g。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述培養(yǎng)基C/P比大于80g/g的條件 通過調(diào)整培養(yǎng)基初始碳源或磷源物質(zhì)的用量，或去除培養(yǎng)基中磷源的方法來實(shí)現(xiàn)。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于在微生物培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基C/P比大 于80g/g的條件可以通過增加碳源投料或去除磷源的方法實(shí)現(xiàn)。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于微生物采用液體培養(yǎng)基通空氣培養(yǎng)，培 養(yǎng)溫度為20°C 40°C，pH值2. 5 8. 0。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述的碳源包括戊糖、己糖、氨基糖、或 經(jīng)水解可釋放出戊糖、己糖和/或氨基糖的材料中的一種或多種，所述的磷源為磷酸鹽和 經(jīng)水解可釋放出磷酸根的物質(zhì)中的一種或多種。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述的培養(yǎng)基除含有碳源和磷源外，還 含有微生物生長必需的其它營養(yǎng)物質(zhì)，所述其它營養(yǎng)物質(zhì)為氮源、硫源、金屬離子、維生物 素及其它具有顯著作用的物質(zhì)中的一種或多種。
7.按照權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于所述的產(chǎn)油微生物為 經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后菌體油脂含量可超過細(xì)胞干重20%的真菌、細(xì)菌或微藻。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物培養(yǎng)的方法，通過調(diào)整碳源和磷源相對用量，或清除培養(yǎng)基中磷源，控制培養(yǎng)基碳源和磷源比率(C/P比)大于80g/g，培養(yǎng)基中碳源濃度大于40g/l，在20℃～40℃下通氣培養(yǎng)產(chǎn)油微生物，得到微生物菌體材料的油脂含量可達(dá)到細(xì)胞干重40％以上。本方法切實(shí)有效，簡單易行，可降低生產(chǎn)成本，提高效率，改善微生物油脂發(fā)酵的技術(shù)經(jīng)濟(jì)性，尤其適用于利用復(fù)雜天然原料進(jìn)行油脂發(fā)酵生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/14GK102061262SQ200910219980
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者吳思國, 沈宏偉, 胡翠敏, 趙宗保 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所