專利名稱：一種改造的鞭毛素蛋白及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種優(yōu)化改造的鞭毛素蛋白及其制備方法和應用。
背景技術：
現(xiàn)在已知致病菌來源的鞭毛素蛋白具有免疫佐劑效果，它是通過鞭毛素蛋白與 Toll樣受體(Toll-like rec印tors，TLRs) 5相結合，引發(fā)NF-κ B途徑引發(fā)先天性免疫，進 而引發(fā)特異性免疫。通過鞭毛素蛋白與目的蛋白混合或融合后免疫，可以顯著提高對目的 抗原的免疫應答，并且可達到抵抗帶有目的抗原的病原微生物的效果。但是因其來源于致 病菌，可能具有潛在的危險性，并且它還可以引起炎癥反應，產(chǎn)生大量針對鞭毛素自身的免 疫反應，導致可能的耐受性以及其它可能的免疫副反應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化改造的鞭毛素蛋白，并將其作為佐劑，使得在保證 其佐劑活性的前提下降低它的抗原性、免疫原性以及由其引發(fā)的炎癥反應。本發(fā)明的第一個目的是提供一種改造的鞭毛素蛋白，該改造的鞭毛素蛋白為缺失 高變區(qū)的蛋白，所述高變區(qū)為鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸區(qū)域。優(yōu)化的，所述改造的鞭毛素蛋白包括FliCA 190-278、FliC Δ 220-320或 FliCA 180-400 ο本發(fā)明的目的之二在于提供一種改造鞭毛素蛋白的制備方法，將鞭毛素蛋白高變 區(qū)進行缺失，所述高變區(qū)為鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸區(qū)域。具體來說，其制備方法包括如下步驟(1)構建鞭毛素蛋白重組質粒；(2)以所述步驟(1)得到的鞭毛素蛋白重組質粒為模板，構建鞭毛素缺失克隆，并 表達純化。優(yōu)選的，上述步驟(1)構建鞭毛素蛋白重組質粒中的模板為人腸道沙門氏菌J341 基因組，引物為如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的序列，連接載體為ρΕΤ28。優(yōu)選的，上述步驟(2)構建鞭毛素缺失克隆的引物為如SEQ ID NO :3至SEQ ID NO 6所示的序列，以得到改造鞭毛素蛋白FliCA 190-278 ；或所用引物如SEQ ID NO 7至 SEQ ID NO :10所示的序列，以得到改造鞭毛素蛋白FliCA 220-320 ；或所用引物如SEQ ID Ν0:11至SEQ ID NO :14所示的序列，以得到改造鞭毛素蛋白FliCA 180-400。具體見實施 例。本發(fā)明還提供了將上述改造的鞭毛素蛋白應用為佐劑。因為該佐劑是通過對鞭毛 素蛋白改造而得到的，因而，可以在保證其佐劑活性的前提下降低它的抗原性、免疫原性以 及由其引發(fā)的炎癥反應。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
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通過改造鞭毛素蛋白，去除其主要的免疫原性區(qū)及抗原活性區(qū)，降低它的抗原性、 免疫原性以及由其引發(fā)的炎癥反應。


圖1是純化的蛋白分別經(jīng)過SDS-PAGE和Western Blot的驗證結果圖；圖2是FliC刺激后誘導Caco-2細胞釋放IL-8和MCP-I的水平檢測圖，其中，圖A 是FliC刺激后誘導Caco-2細胞釋放IL-8的水平檢測圖，圖B是FliC刺激后誘導Caco-2 細胞釋放MCP-I的水平檢測圖；圖3是FliC的佐劑活性檢測實驗相關結果，其中，圖A是血清中p24-特異性 IgG的滴度比較結果，圖B是血清中p24-特異性IgA的滴度比較結果，圖C是唾液樣品中 P24-特異性IgA的滴度比較結果，圖D是陰道樣品中IgA滴度比較結果，圖E是血清中IgG 的滴度比較結果；圖4是鞭毛素高變區(qū)部分缺失蛋白的穩(wěn)定性的相關實驗的圖片，其中，圖A是 構建的三種缺失蛋白的結構示意圖，圖B是構建的三種缺失蛋白的三維結構，圖C是 FliCA 190-278的電泳圖片，圖D是FliC Δ 220-320的電泳圖片，圖E是FliC Δ 180-400的 電泳圖片；圖5是ELISA檢測血清中FliC-特異的和FliC-改造克隆-特異的IgG滴度的實 驗結果圖，其中，圖A是ELISA檢測血清中FliC特異的IgG滴度比較圖。圖B是ELISA檢 測血清中FliC改造克隆特異的IgG滴度比較圖；圖 6 為將缺失改造克隆 FliCA 190-278、FliC Δ 220-320 及 FliCA 180-400 以不 同的濃度(0. l、l、10、100、1000、10000ng/ml)分別刺激 Caco-2 細胞后，ELISA 檢測 IL-8 和 MCP-I的結果圖其中，圖A是ELISA檢測IL-8的結果圖，圖B是ELISA檢測MCP-I的結果 圖；圖 7 是以 p24 為抗原，分另丨」與 FliC、FliCA 190-278、FliC Δ 220-320 及 FliCA 180-400混合免疫BALB/c小鼠后，ELISA檢測血、唾液樣及陰道樣p24_特異性和佐 劑_特異性的抗體滴度的結果圖，其中，圖A是ELISA檢測血清中p24-特異性和佐劑_特 異性的IgG抗體滴度的結果圖，圖B是ELISA檢測血清中p24-特異性和佐劑_特異性的 IgA抗體滴度的結果圖，圖C是ELISA檢測唾液樣p24-特異性和佐劑-特異性的IgA抗體 滴度的結果圖，圖D是ELISA檢測陰道樣p24-特異性和佐劑_特異性的IgA抗體滴度的結 果圖；圖8是毒性試驗的預試，將小鼠經(jīng)滴鼻途徑免疫，免疫后常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7天， 記錄小鼠體重的結果圖；圖9是FliCl滴鼻免疫C57BL/6小鼠，分別于免疫后6h、12h、24h、36h、48h及一周 殺小鼠，觀察肝臟病變情況，其中，圖A是解剖的PBS組小鼠肝組織HE染色結果圖，圖Bl是 處理組12h時肝組織HE染色結果圖，圖B2是處理組24h時肝組織HE染色結果圖，圖B3是 處理組1周時肝組織HE染色結果圖；圖10是FliCl處理組肝臟不同時間，觀察肝臟病變情況，其中，圖A是PBS組肝組 織HE染色結果圖，圖Bl是FliCl處理組肝臟12h時肝組織HE染色結果圖，圖B2是FliCl 處理組肝臟24h時肝組織HE染色結果圖，圖B3是FliCl處理組肝臟1周解剖后的小鼠肝組織HE染色結果圖；圖11是取FliCl處理組血清，對反應肝細胞損傷的生化指標進行生化分析的結果 圖，其中，圖 A、B、C、D、E、F、G 和 H 分別是對 ALT 和 AST、TP、ALB、TBiL、DBiL、BUN 和 CREA 的 生化分析的結果圖；圖12為FliC Δ 220-320的安全性的相關實驗結果，其中，圖A為FliC免疫組血清 中ALT和AST濃度的比較圖，圖B為FliC免疫組肝臟解剖學觀察對比圖，圖C為FliC免疫 組肝臟組織病理學觀察對比圖。
具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這 些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克隆實驗手冊中所述的條件。實施例1 克隆構建(I)FliC重組質粒構建以人腸道沙門氏菌J341基因組為模板，以primerl/primerf為引物(引物序列 見表1)進行PCR擴增，引物下劃線部分分別為NcoI和XhoI酶切位點，為方便重組蛋白純 化，在primer2引物設計時缺失掉flic基因的終止密碼子TAA，使其與載體pET28酶切位點 XhoI后的6聚組氨酸標簽形成融合表達。PCR產(chǎn)物經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切后，與經(jīng)同樣雙 酶切線性化的pET28a載體連接。連接產(chǎn)物轉化BL21 (DE3) star ；挑取陽性克隆進行酶切及 測序鑒定，將正確的重組質粒命名為FliC，其表達產(chǎn)物C-端帶有6聚組氨酸標簽。(2)鞭毛素缺失克隆 FliC Δ 180-400、FliC Δ 190-278 及 FliC Δ 220-320 的構建FliCA 180-400 構建以重組質粒 FliCl 為模板，分別以 primer21/primer22、 primer23/primer24為引物(引物序列見表1，表1所示是寡核苷酸引物序列)，分別擴增片 段 FliC(l-180AA)和 FliC(400-560AA)，在 primer21 和 primer225，端分別設計酶切位點 NcoI和EcoRI，在primer23和primer24 5，端分別設計酶切位點EcoRI和XhoI，PCR產(chǎn)物分 別經(jīng)NcoI/EcoRI 及EcoRI/XhoI 酶切后，在FliC(l-180AA)片段的 C-端及FliC(400_560AA) 片段的N-端產(chǎn)生相同的EcoRI粘性末端。將酶切后片段按1 1的比例置于4°C鏈接1小 時，連接產(chǎn)物跑膠純化，將純化的酶切產(chǎn)物與經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切線性化的pET28a載體 連接。連接產(chǎn)物分別轉化BL21(DE3) star，挑取陽性克隆進行酶切及測序鑒定，將正確的重 組質粒分別命名為FliCA 180-400。FliCA 190-278-320 及 FliCA220_320 構建，分別以 primerl3/primerl4 和 primerl5/primerl6 及 primerl7/primerl8 禾口 primerl9/primer20 為弓I物(弓I物序列見表 1)進行PCR擴增，構建過程同重組質粒FliC Δ 180-400的構建。表 1
權利要求
1.一種改造的鞭毛素蛋白，其特征在于，所述改造的鞭毛素蛋白為在高變區(qū)有缺失的 蛋白，所述高變區(qū)為鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸區(qū)域。
2.根據(jù)權利要求1所述的改造的鞭毛素蛋白，其特征在于，所述改造的鞭毛素蛋白包 括 FliC Δ 190-278、FliC Δ 220-320 或 FliC Δ 180-400。
3.一種改造鞭毛素蛋白的制備方法，其特征在于，將鞭毛素蛋白高變區(qū)進行缺失，所述 高變區(qū)為鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸區(qū)域。
4.根據(jù)權利要求3所述的改造鞭毛素蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)構建鞭毛素蛋白重組質粒；(2)以所述步驟(1)得到的鞭毛素蛋白重組質粒為模板，構建鞭毛素缺失克隆，并表達純化。
5.根據(jù)權利要求4所述的改造鞭毛素蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)構建 鞭毛素蛋白重組質粒中所用模板為人腸道沙門氏菌J341基因組，所用引物為如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的序列連接載體為pET28。
6.根據(jù)權利要求4所述的改造鞭毛素蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)構建 鞭毛素缺失克隆所用引物為如SEQ ID NO :3至SEQ ID NO :6所示的序列，或如SEQ ID NO: 7至SEQ ID NO 10所示的序列，或如SEQID N0:11至SEQ ID N0:14所示的序列。
7.權利要求1或2所述的改造的鞭毛素蛋白作為佐劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種優(yōu)化改造的鞭毛素蛋白及其制備方法和應用。該蛋白為缺失高變區(qū)的蛋白，高變區(qū)為鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸區(qū)域，該蛋白包括FliCΔ190-278、FliCΔ220-320或FliCΔ180-400。制備該蛋白，將鞭毛素蛋白高變區(qū)進行缺失，使鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸區(qū)域缺失。首先構建鞭毛素蛋白重組質粒；再以之為模板，構建鞭毛素缺失克隆，并表達純化。本發(fā)明還提供了將上述改造的鞭毛素蛋白應用為佐劑。本發(fā)明的改造鞭毛素蛋白降低了其可能具有的潛在的危險性；并且通過去除其主要的免疫原性區(qū)及抗原活性區(qū)，降低它的抗原性、免疫原性以及由其引發(fā)的炎癥反應。
文檔編號C12N15/31GK102002098SQ20091019428
公開日2011年4月6日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權日2009年11月27日
發(fā)明者劉芳, 楊菁毅, 鄢慧民 申請人:中國科學院武漢病毒研究所