專利名稱：：一種體外化合物安全性評價方法及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及藥理毒理檢測領域，具體涉及一種體外化合物安全性評價方法及其應用。
背景技術(shù)：
：長期以來，藥物臨床前安全性評價是依賴于動物實驗。但是，從經(jīng)濟角度考慮，動物實驗耗時，費用高。動物保護主義也對大量使用實驗動物提出了質(zhì)疑。2007年6月，歐盟委員會關(guān)于化合物審批注冊的立法正式生效，約30000種化合物有待檢測，若全部使用動物實驗，估計約需3900000只動物，所以，歐盟倡導使用體外方法替代動物實驗，在化妝品和對皮膚剌激性試驗中已經(jīng)率先采用3R實驗(Refinement,Reduction,R印lacement)，即優(yōu)化、減少、替代動物實驗。3R原則涉及到化學品、化妝品、藥品、生物制品和環(huán)保等幾乎所有涉及到動物實驗的安全性評價領域。自2009年3月起，歐盟禁止使用動物進行化妝品急性毒性、眼剌激和過敏試驗，同時規(guī)定禁止在歐盟范圍內(nèi)銷售使用動物實驗的化妝品。為與國際接軌，避免基于法律的貿(mào)易壁壘，我國也亟待探索可靠的動物實驗替代方法用于藥物及化合物安全性評價。利用體外培的細胞進行實驗研究，具有周期短、高通量、價格低廉、重復性好等優(yōu)點。美國國立職業(yè)安全與衛(wèi)生研究所及歐盟動物替代方法研究機構(gòu)等機構(gòu)多使用3T3，NHK等細胞株進行藥物的毒性安全性評價。但未有應用原代神經(jīng)元、心肌細胞毒理藥理實驗數(shù)據(jù)建立的LD50急性毒性預測模型，而應用原代細胞在藥物體外安全性評價中具有很大的優(yōu)勢。原代細胞培養(yǎng)是指從活體中獲得細胞，在體外條件下進行第一次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞不分裂、增殖，相對于細胞株具有細胞不變異、更接近正常人體內(nèi)狀況的優(yōu)點。神經(jīng)元體外培養(yǎng)是研究神經(jīng)細胞形態(tài)及病理變化的常用方法，同時也是研究各種腦損傷和腦缺血等病理變化的重要手段，所以神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)已逐漸成為研究中樞病變的重要技術(shù)。利用原代培養(yǎng)神經(jīng)元模型用于評價化合物、藥物毒性已經(jīng)成為判斷化合物急性毒性，神經(jīng)系統(tǒng)選擇性毒性、神經(jīng)系統(tǒng)慢性毒性的平臺。因此，應用神經(jīng)元作為藥物或化合物神經(jīng)毒性檢測與篩選相較于細胞株(如PC12、HEK293等細胞株)更具說服力。同樣，利用原代心肌細胞用于評價藥物或化合物的心臟毒性也具有不可替代的優(yōu)勢，原代培養(yǎng)成功的心肌細胞具有自律性，在顯微鏡下可以看到明顯的心肌細胞的搏動，作用于心血管系統(tǒng)的藥物可以直接接觸心肌細胞可以用于心臟毒性評價等。綜合上述，在藥物及化合物安全性評價領域，應用原代培養(yǎng)的細胞建立的藥物急性毒性預測模型將會是可靠的動物實驗替代方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡單易行，周期短，花費低廉的體外化合物安全性評價方法。本發(fā)明的另一目的在于提供上述體外化合物安全性評價方法的應用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)—種體外化合物安全性評價方法，包括如下步驟(1)原代細胞分離培養(yǎng)；(2)將待檢化合物與原代細胞共同孵育；(3)檢測細胞活力。其中，所述原代細胞優(yōu)選大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞或大鼠心肌細胞。因為神經(jīng)元細胞不分裂、增殖，相對于細胞株具有不易變異、更接近正常人體細胞的優(yōu)點；心肌細胞具有自律性，可用于心血管系統(tǒng)藥物的心臟毒性評價。所述大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)步驟如下無菌分離大鼠大腦皮質(zhì)，移入離心管中，靜置去上清，加入胰酶消化310min后，終止消化；將細胞液離心，去上清后重懸，接種于96孔板進行常規(guī)培養(yǎng)。大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)優(yōu)選為如下步驟無菌分離新生SPF級Wistar大鼠大腦皮質(zhì)，以解剖液洗滌12次，于解剖液中用眼科剪剪碎腦組織至1咖3大小，移入離心管中，靜置，去上清，加入O.25X胰酶，37t:消化5min，吸出上清液至裝有少量小牛血清的離心管中，終止消化，反復數(shù)次至消化完全；匯集全部液體過180目篩后移入離心管，100rpm離心7min后，棄上清，用含5mllOX的胎牛血清和5%馬血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞密度為5X105，以每孔100iU的體積接種于鋪好多聚賴氨酸的97孔板中，于37°C、5%C02、100%濕度的條件下進行細胞培養(yǎng)；24h后以含2%B27的神經(jīng)元細胞培養(yǎng)基換液，48h后加入細胞分裂抑制劑阿糖胞苷，以后每三天換液一次。培養(yǎng)了710d的細胞最適合用于評價化合物的安全性。所述大鼠心肌細胞培養(yǎng)步驟如下無菌分離大鼠心臟，取心尖組織移入離心管中，靜置去上清，加入胰酶消化310min后，終止消化；將細胞液離心，去上清后重懸，接種于96孔板進行常規(guī)培養(yǎng)。大鼠心肌細胞培養(yǎng)優(yōu)選為如下步驟無菌分離新生SPF級Wistar大鼠心臟，以PBS洗滌45次，剪取心尖組織，于PBS中用眼科剪剪碎組織至lmm3大小，移入離心管中，靜置，去上清后，加入O.25X胰酶，37t:消化5min，吸出上清液至裝有少量小牛血清的離心管中，終止消化，反復數(shù)次至消化完全；匯集全部液體過180目篩后移入離心管，100rpm離心7min后，棄上清，用含5ml10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞密度至5X105，以每孔100iil的體積接種于96孔板中，于37°C、5%C02、100%濕度的條件下進行細胞培養(yǎng)；48h后加入細胞分裂抑制劑Brdu，以后每三天換液一次。所述待檢化合物與原代細胞共同孵育的時間優(yōu)選為24h。所述檢測細胞活力的方法皆為本領域內(nèi)常見方法，如SRB法、LDH法等，優(yōu)選為MTT法。本發(fā)明體外化合物安全性評價方法在化妝品、食品、新藥物或未知性質(zhì)化合物的安全性評價中的應用如下(1)化妝品、護膚品的快速、高通量毒理學安全性評價；(2)防治燒傷、皮膚病、性病、外傷等外用藥物的快速安全性評價；(3)藥物致畸形、致突變的評價；4(4)新藥物或新化合物的快速、高通量毒性篩選與確認；(5)未知性質(zhì)化合物快速毒性鑒定；(6)農(nóng)藥對哺乳動物細胞的毒性安全性評價；(7)食品的研發(fā)、檢驗和質(zhì)量控制中的安全性評價。本發(fā)明體外化合物安全性評價方法對于不同性質(zhì)、不同用途的藥物或化合物毒性或敏感性不盡相同，因此，既可獨立評價化合物，亦可與其它檢驗方法相輔相成，綜合評價藥物或化合物的安全性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明體外化合物安全性評價方法通過心肌細胞或神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)，將待檢化合物作用于上述兩種細胞中的一種來評價其安全性，該評價方法簡單易行，周期短，檢測效率高，花費低廉，避免了環(huán)境污染，可以用于化妝品、護膚品、藥物、化合物、未知性質(zhì)化合物、農(nóng)藥、食品等的安全性評價，具有可觀的應用前景。圖1為17種受試化合物作用于原代神經(jīng)元細胞時，用MTT法測得的lg(IC50)與lg(LD50)間的相關(guān)性;圖2為20種受試化合物作用于原代心肌細胞時，用MTT法測得的lg(IC50)與lg(LD50)間的相關(guān)性;圖3為培養(yǎng)5天的心肌細胞；圖4為正常心肌細胞HE染色的形態(tài)學觀察照片；圖5為倒置顯微鏡下與普羅帕酮共孵育24h的心肌細胞照片。具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何限定。實驗試劑特級胎牛血清(TBD)，優(yōu)級胎牛血清(TBD)，DMEM(GIBCO)，解剖液(90ml無菌三蒸水+10mllOXKrebsbuffer+0.8ml3.82%MgS04+4.5ml胎牛血清)，胰酶(SIGMA公司，北京鼎國分裝)，PBS(0.Olmol/L，pH7.2)，DMSO(SIGMA公司，用于細胞凍存)，DMSO(天津福晨，分析純，用于MTT法)，多聚賴氨酸(SIGMA公司)，DMSO(SIGMA公司)，B27(PAA)，臺盼藍溶液(0.4%)，MTT(5mg/ml，SIGMA公司)，180目不銹鋼篩網(wǎng)，96孔細胞培養(yǎng)板(COSTAR)，酶標儀(BIORADMODEL450)，371型細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，倒置顯微鏡(德國萊卡)，320型pH計(DELTA)，SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，微量移液器(德國Eppendorf公司)，F(xiàn)A1004型電子分析天平(上海良平儀表有限公司)。實施例1原代細胞分離培養(yǎng)1.大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)無菌分離新生SPF級Wistar大鼠大腦皮質(zhì)，以解剖液洗滌2次，于解剖液中用眼科剪剪碎腦組織至1咖3大小，移入15ml離心管中，靜置，去上清，加入O.25%胰酶，37°〇消化5min，吸出上清液至裝有少量小牛血清的15ml離心管中，終止消化，反復數(shù)次至消化完全。匯集全部液體過180目篩后移入離心管，100rpm，7min。吸去上清，用含5ml10%胎牛血清及5%馬血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞密度5X105，以每孔lOOiU的體積接種于鋪好多聚賴氨酸的96孔板(其中一孔置細胞爬片)中，于371\5%。02、100%濕度的條件下進行常規(guī)培養(yǎng)。24h后以含2%B27的神經(jīng)元培養(yǎng)基換液，48h加入10iimol/L的細胞分裂抑制劑阿糖胞苷，以后每三天換液一次，培養(yǎng)8d后細胞狀態(tài)最佳，用于實驗。2.大鼠心肌細胞培養(yǎng)無菌分離新生SPF級Wistar大鼠心臟，以PBS洗滌5次，剪取心尖組織，于PBS中用眼科剪剪碎組織至1咖3大小，移入15ml離心管中，靜置，去上清，加入0.25%胰酶，37°〇消化5min，吸去上清液，棄去。加入0.25%胰酶，371:消化5min，至裝有少量小牛血清的15ml離心管中，終止消化，反復數(shù)次至消化完全。匯集全部液體過180目篩后移入離心管，100rpm，7min。吸去上清，用含5ml10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞密度5乂105，以每孔lOOiU的體積接種于96孔板(其中一孔置細胞爬片)中，于37°C、5%0)2、100%濕度的條件下進行常規(guī)培養(yǎng)。48h加入lOymol/L的細胞分裂抑制劑Brdu，以后每三天換液一次，培養(yǎng)8d后細胞狀態(tài)最佳，用于實驗。實施例2藥物或化合物的大鼠急性口服LD50及IC50(原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞)17種受試化合物的大鼠一次經(jīng)口的LD50(mg/kg)及本實施例中，用藥物或化合物作用于原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞得到的IC50(mg/ml)值，如表1。表117種藥物或化合物的大鼠急性口服LD50及IC50LD50*acuteoral藥物中文名LD50(rat,mg/kg)原代神經(jīng)元Mean士S.D.IC50(mg/ml)硫酸阿米卡星硫酸慶大霉素乳糖酸阿奇霉素舒必利地兩泮氟哌啶醇乳酸鹽酸普羅帕酮苯巴比妥鈉鹽酸氯丙嗪鹽酸帕羅西丁頭孢噻肟鈉西咪替丁阿糖胞苷4000500043020009800124016537307006916660225250041520000500032006390±0.9465.285±1.8381.264±0.6310.384±0.0751.390±0.3070.124±0.0340.005士0.0013.181±0.6700.041±0.0136.910士1.2500.788±0.1570.019±0.005I.827±0.4600.066±0.02099.93±17.57II.06±4.7239.11士1.977*大鼠急性口服LD50值(mg;kg，來源于化學品安全數(shù)據(jù)庫)。通過上表可知，鹽酸普羅帕酮、鹽酸氯丙嗪和氟哌啶醇的LD50分別為鹽酸普羅7帕酮>鹽酸氯丙嗪>氟哌啶醇，上述三種藥物分別作用于原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞后的IC50為鹽酸普羅帕酮>鹽酸氯丙嗪>氟哌啶醇，與LD50順序符合。帕羅西丁和苯巴比妥鈉的LD50為帕羅西丁>苯巴比妥鈉，兩種藥物分別作用于原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞后的IC50為帕羅西丁>苯巴比妥鈉，與LD50順序符合。硫酸阿米卡星、乳酸、阿糖胞苷、氯霉素、乳糖酸阿奇霉素和地西泮的LD50分別為硫酸阿米卡星>乳酸>阿糖胞苷>氯霉素>乳糖酸阿奇霉素>地西泮，上述藥物分別作用于原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞后的IC50為硫酸阿米卡星>阿糖胞苷>乳酸>氯霉素>乳糖酸阿奇霉素>地西泮，與LD50順序基本符合。頭孢噻肟鈉、舒必利、青霉素鈉、硫酸慶大霉素、西咪替丁和硫酸鏈霉素的LD50分別為頭孢噻肟鈉>舒必利>青霉素鈉>硫酸慶大霉素=西咪替丁>硫酸鏈霉素，上述藥物分別作用于原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞后的IC50為頭孢噻肟鈉>西咪替丁>硫酸慶大霉素>青霉素鈉>硫酸鏈霉素>舒必利，與LD50順序基本符合。由上述結(jié)果可知，17種藥物在細胞急性毒性實驗得到的IC50值大小順序與資料顯示的動物實驗數(shù)據(jù)LD50排序基本符合，表明利用原代神經(jīng)元細胞模型所測得的藥物IC50值可用于預測藥物或化合物的急性毒性。用MTT法檢測17種受試化合物對原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元相對細胞活力，IC50(mg/ml)值與其相應的大鼠口服LD50值(mg/kg，來源于化學品安全數(shù)據(jù)庫)間的相關(guān)性，結(jié)果如圖1所示，體外IC50值與體內(nèi)LD50值具有較強相關(guān)性(R2=0.7663)，表明體外神經(jīng)元細胞毒性試驗可以預測體內(nèi)毒性，進而替代動物預測對人類的毒性(包括神經(jīng)毒性)。實施例3藥物或化合物的大鼠急性口服LD50及IC50(原代心肌細胞)20種受試化合物的大鼠一次經(jīng)口的LD50(mg/kg)及本實施例中，用藥物或化合物作用于原代心肌細胞得到的IC50(mg/ml)值，如表2。表220種藥物或化合物的大鼠急性口服LD50及IC50<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>阿糖胞苷320015.13±0.84利巴韋林530017.99±2.66甲磺酸酚妥拉明1250,0.12±0.006鹽酸利多卡因3170.956±0.118鹽酸維拉帕米敗*"1080.057±0.033_硫酸鎂__14.37±3.03_^大鼠急性口服LD50值(mg;kg，來源于化學品安全數(shù)據(jù)庫)。通過上表可知，鹽酸維拉帕米、鹽酸氯丙嗪、鹽酸普羅帕酮、氟哌啶醇、鹽酸帕羅西丁、苯巴比妥鈉和鹽酸利多卡因的LD50分別為鹽酸普羅帕酮>苯巴比妥鈉>鹽酸帕羅西丁>鹽酸利多卡因>鹽酸氯丙嗪>氟哌啶醇>鹽酸維拉帕米，上述藥物分別作用于原代心肌細胞后的IC50為鹽酸利多卡因>苯巴比妥鈉>鹽酸帕羅西丁>鹽酸維拉帕米>鹽酸普羅帕酮>鹽酸氯丙嗪>氟哌啶醇。硫酸阿米卡星、乳酸、阿糖胞苷、氯霉素、乳糖酸阿奇霉素、甲磺酸酚妥拉明和地西泮的LD50分別為硫酸阿米卡星>乳酸>阿糖胞苷>氯霉素>乳糖酸阿奇霉素>甲磺酸酚妥拉明>地西泮，上述藥物分別作用于原代心肌細胞后的IC50為硫酸阿米卡星>阿糖胞苷>乳酸>氯霉素>地西泮>乳糖酸阿奇霉素>甲磺酸酚妥拉明，與LD50順序基本符合。舒必利、青霉素鈉、利巴韋林、硫酸慶大霉素、硫酸鎂和西咪替丁的LD50分別為舒必利>青霉素鈉>利巴韋林>硫酸慶大霉素=硫酸鎂=西咪替丁，上述藥物分別作用于原代心肌細胞后的IC50為硫酸鎂>利巴韋林>硫酸慶大霉素>青霉素鈉>舒必利>西咪替丁，與LD50順序基本符合。由上述結(jié)果可知，20種藥物在細胞急性毒性實驗得到的IC50值大小順序與資料顯示的動物實驗數(shù)據(jù)LD50排序基本符合，表明利用原代心肌細胞模型所測得的藥物IC50值可用于預測藥物或化合物的急性毒性。用MTT法檢測20種受試化合物的IC50值(mg/mL)與已知的大鼠口服LD50(mg/kg，來源于化學品安全數(shù)據(jù)庫)值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，以lg(IC50)為自變量X，lg(LD50)為應變量Y，對它們進行相關(guān)分析，經(jīng)線性擬合后得到它們的相關(guān)系數(shù)為R2=0.7615(圖2)。實施例4心肌細胞形態(tài)學觀察1.心肌細胞形態(tài)學觀察(1)正常細胞形態(tài)觀察心肌細胞在分離培養(yǎng)后6h貼壁生長，有偽足交聯(lián)，但不融合。光鏡下可見其由圓形變?yōu)槔庑突蚨嘟切汀?4h后可見單個細胞的搏動，搏動頻率6090beat/min。3d見細胞融合，偽足交織成網(wǎng)，培養(yǎng)至4d，細胞生長融合成簇，同心圓放射狀生長，搏動有力，同步性好，稱為功能性合體細胞，心率在100beat/min左右(圖3)，HE染色觀察細胞形態(tài)良好(圖4)。(2)細胞染毒24h后細胞形態(tài)觀察與普羅帕酮共孵育24h后，可以觀察到細胞形態(tài)隨藥物濃度變化而逐漸變化，濃度達0.02mg/mL時，原代心肌細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，見圖5;由此也可以粗略地了解藥物或化合物的毒性劑量范圍。2.利多卡因與心肌細胞孵育24h后心率變化原代心肌細胞分離培養(yǎng)24h搏動，72h細胞生長融合，搏動同步性好，96h后可用于實驗。如受化合物或藥物影響產(chǎn)生毒性效應，心肌搏動頻率會改變，表現(xiàn)為心率減慢，乃至停搏。利多卡因?qū)π募∮幸欢ㄒ种谱饔茫员侗认♂対舛鹊睦嗫ㄒ蜃饔糜谛募〖毎?，可觀察到細胞隨利多卡因濃度升高，細胞依次搏動減緩，甚至停搏，而在該濃度下細胞形態(tài)未見明顯改變。見表3，大鼠心肌細胞正常心率為100beat/min左右，利多卡因濃度達0.08mg/ml時，心率為96beat/min左右，減緩不明顯，細胞形態(tài)正常；利多卡因濃度達O.31mg/ml時，心率為10beat/min左右，已經(jīng)非常緩慢，但細胞形態(tài)仍正常，及至濃度為0.63mg/ml時，細胞已經(jīng)停止搏動，細胞形態(tài)觀察仍看不出明顯變化。利多卡因濃度達1.25mg/ml時，細胞形態(tài)才發(fā)生明顯變化(表3)。表3不同濃度鹽酸利多卡因作用于原代心肌細胞24h心率變化與細胞形態(tài)觀察(mean±s，n=3)鹽酸利多卡因(mg/ml)細胞搏動次數(shù)(beat/min)細胞形態(tài)2.500非正常0.250非正常0.630正常0.3110.0±5.0正常0.1630.0±5.0正常0.0896.0±16.0正常0.00100.0±20.0正常由上表可知，鹽酸利多卡因濃度為0.63mg/ml時細胞形態(tài)未見明顯變化，但心肌細胞已停止搏動(心肌細胞形態(tài)只分正常與非正常)。10權(quán)利要求一種體外化合物安全性評價方法，其特征在于包括如下步驟(1)原代細胞分離培養(yǎng)；(2)將待檢化合物與原代細胞共同孵育；(3)檢測細胞活力。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外化合物安全性評價方法，其特征在于步驟(1)中，所述原代細胞培養(yǎng)包括大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)或大鼠心肌細胞培養(yǎng)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的體外化合物安全性評價方法，其特征在于所述大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)步驟如下無菌分離大鼠大腦皮質(zhì)，移入離心管中，靜置去上清，加入胰酶消化310min后，終止消化；將細胞液離心，去上清后重懸，接種于96孔板進行常規(guī)培養(yǎng)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的體外化合物安全性評價方法，其特征在于所述大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)步驟如下無菌分離新生SPF級Wistar大鼠大腦皮質(zhì)，以解剖液洗滌12次，于解剖液中用眼科剪剪碎腦組織至1咖3大小，移入離心管中，靜置，去上清，加入0.25X胰酶，37t:消化5min，吸出上清液至裝有少量小牛血清的離心管中，終止消化，反復數(shù)次至消化完全；匯集全部液體過180目篩后移入離心管，100rpm離心7min后，棄上清，用含5ml10%的胎牛血清和5%馬血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞密度為5X105，以每孔100iil的體積接種于鋪好多聚賴氨酸的97孔板中，于37°C、5%C02、100%濕度的條件下進行細胞培養(yǎng)；24h后以含2%B27的神經(jīng)元細胞培養(yǎng)基換液，48h后加入細胞分裂抑制劑阿糖胞苷，以后每三天換液一次。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的體外化合物安全性評價方法，其特征在于所述大鼠心肌細胞培養(yǎng)步驟如下無菌分離大鼠心臟，取心尖組織移入離心管中，靜置去上清，加入胰酶消化310min后，終止消化；將細胞液離心，去上清后重懸，接種于96孔板進行常規(guī)培養(yǎng)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外化合物安全性評價方法，其特征在于所述大鼠心肌細胞培養(yǎng)步驟如下無菌分離新生SPF級Wistar大鼠心臟，以PBS洗滌45次，剪取心尖組織，于PBS中用眼科剪剪碎組織至lmm3大小，移入離心管中，靜置，去上清后，加入0.25%胰酶，37t:消化5min，吸出上清液至裝有少量小牛血清的離心管中，終止消化，反復數(shù)次至消化完全；匯集全部液體過180目篩后移入離心管，100rpm離心7min后，棄上清，用含5ml10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞密度至5X105，以每孔100iil的體積接種于96孔板中，于37°C、5%C02、100%濕度的條件下進行細胞培養(yǎng)；48h后加入細胞分裂抑制劑Brdu，以后每三天換液一次。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外化合物安全性評價方法，其特征在于步驟(2)中，待檢化合物與原代細胞共同孵育時間為24h。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任意一條權(quán)利要求所述的體外化合物安全性評價方法，其特征在于步驟(3)中，所述檢測細胞活力的方法是MTT法。9.權(quán)利要求1至7中任意一條權(quán)利要求所述的體外化合物安全性評價方法的應用，其特征在于所述應用為化妝品、食品、新藥物或未知性質(zhì)化合物的安全性評價。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的體外化合物安全性評價方法的應用，其特征在于所述安全性評價方法中，檢測細胞活力的方法是MTT法。全文摘要本發(fā)明公開了一種體外化合物安全性評價方法，該安全性評價方法是對原代細胞進行分離培養(yǎng)后，將待檢化合物與分離培養(yǎng)好的原代細胞共同孵育，MTT法測原代細胞的相對活力。本發(fā)明還公開了上述體外化合物安全性評價方法在化妝品、食品、新藥物或未知性質(zhì)化合物的體外安全性評價中的應用。本發(fā)明體外化合物安全性評價方法簡單易行，周期短，檢測效率高，花費低廉，結(jié)果穩(wěn)定可靠，避免了環(huán)境污染，具有可觀的應用前景。文檔編號C12N5/077GK101712977SQ20091019327公開日2010年5月26日申請日期2009年10月23日優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日發(fā)明者巫瑋,潘琴,潘雪刁,石磊,臧林泉,郭姣申請人:廣東藥學院