專利名稱：等電等電荷法提取動物血(豬血)中的sod酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從豬血中提取SOD酶的處理方法。該方法根據(jù)血中主要蛋白質(zhì)間等電點(diǎn)電荷存在較大差異特點(diǎn)而進(jìn)行分離的一種方法。
背景技術(shù)：
從動物血中制取SOD酶的技術(shù)早于1969后由Mccord和Fridovich第一次從動物血中所提取。這一技術(shù)是目前國內(nèi)外從動物血中制取SOD酶的普遍做法。但這一技術(shù)所用試劑氯仿、丙酮具有剌激性強(qiáng)，不宜在較高溫度下操作。本發(fā)明試劑可以在較高溫度下進(jìn)行，所用試劑或價(jià)格低廉，或用量少，或可以回收循環(huán)利用特點(diǎn)。完全可以取代Mccord法得到相應(yīng)效果。 此一技術(shù)，原則上也適用于對各種生物具有已知等電點(diǎn)蛋白的分離。包括各種酶、
蛋白類激素、各種細(xì)胞蛋白包括免疫球蛋白、以及各種特異性蛋白的分離等等。 對于SOD酶的分離，業(yè)界人士一般均認(rèn)為較難提取，原因是分離時(shí)外界因素對其
有一定影響首先是溫度，它在氣候較高時(shí)則損害其活性；但卻耐受較短時(shí)間的高溫；其次
是酸堿度，它的活力適合范圍是ra:6-9。 6以下越呈酸性，對活力影響越大。因而本發(fā)明充
分考慮到這一特點(diǎn)相結(jié)合的一種分離方法。

發(fā)明內(nèi)容
1、分離除去血槳 取新鮮豬血加入3.8%檸檬酸三鈉抗凝劑，新鮮血液與抗凝劑之比為3 : l，攪拌均勻，以4000r/min離心10-15min，初步除去黃色血漿，收集紅細(xì)胞。 紅細(xì)胞中加放3倍體積的生理鹽水，分三次，每次離心15min，繼續(xù)除去黃色血漿及其懸浮物液。 2、紅血球的破裂和血紅細(xì)胞的滲出 加入同體積的去離子水，劇烈攪拌15min，在室溫下迅速放入冰箱30min( > -15°C )取出，在室溫下劇烈攪拌15min，再放置冰箱30min(3。C _5°C )取出。
3、分離除去血紅蛋白類雜質(zhì)
(!)等電點(diǎn)電荷單寧沉淀法 a、 NaH2P04 2H20緩沖液(PH :5. 5)的制備將NaH2S04 2H20_Na2HP04 2H20配成0. 2M濃度的溶液各1000ml ，配成PH :5. 5緩沖液備用。 b、血紅蛋白的分離將處理液用KU十測試(這時(shí)測得的數(shù)值大致為PH:6. 5-6. 9)，按處理液體積緩慢加入緩沖液(PH :5. 5)，邊加邊拌，直到為PH :6± 。攪拌30min，這時(shí)血紅蛋白帶正電荷，將單寧以每100毫升加入0. 8-2g，血紅蛋白被沉淀，以6000r/min離心棄除。 c、離子吸附法測處理液的HI值繼續(xù)保持HI :6，然后加入1/2體積的724弱酸性陽離子交換樹脂，混合均勻，低溫?cái)嚢?-4小時(shí)，使其達(dá)到平衡。停止攪拌，取未被吸附的清液。 4、分離、棄去剩余雜質(zhì) a、丁醇-K2HP04 3H20的制備將以上濾液按體積加入重量為38%的磷酸氫二鉀(磷酸氫二鉀先調(diào)成糊狀)，充分?jǐn)嚢?5min，再加入體積15 %的丁醇，攪拌均勻，置于3°C -5"冰箱內(nèi)，靜置15min到1小時(shí)。 b、取出靜置后，可以觀察到溶液分4層最上層為丁醇液，次上層為懸浮雜質(zhì)層，次下層為磷酸氫二鉀層，最下層為沉淀雜質(zhì)層。將此容器內(nèi)容物用人造沸石過濾，濾除雜質(zhì)以后6000r/min離心分離15min除沉淀物，再將上清液倒入分液漏斗內(nèi)。這時(shí)可以見到內(nèi)容物分上下層，上層為丁醇液(不含SOD)，下層為清液，取下層液于燒杯中。
(2)除去各種雜質(zhì)——熱沉淀 將以上溶液放入加熱到68t:的水浴鍋20min，取出在室溫下迅速冷卻，以濾紙過濾，除去沉淀物。 5、除去所用試劑殘余量及彌補(bǔ)銅離子丟失 a、將以上過濾后的溶液加入1. 5倍體積的丁醇，攪拌后置于3°C _5°〇冰箱內(nèi)很快沉淀，經(jīng)抽濾得白色沉淀物，b、沉淀物再用IO倍體積的去離子水溶化，在每100ml中加入8%的氯化銅液1-2毫升。拌勻；c、再在此一溶液中重復(fù)用1. 5倍丁醇沉淀抽濾，得白色稍帶藍(lán)色沉淀物，(丁醇可回收利用)。
6、真空冷凍干燥 取沉淀物進(jìn)行真空冷凍干燥，此即為SOD粉劑。
具體實(shí)施例方式
—、在1000毫升普通清潔水中，加入38克檸檬酸三鈉，配成3.8%的濃度待用。采新鮮豬血1800毫升，加入600毫升上述溶液，攪拌均勻，以4000r/min離心10分鐘，棄去沉淀，收集上層液，在此溶液中加入5000毫升三倍左右的生理鹽水。同樣4000r/min離心10分鐘，收集上清液，繼續(xù)二次，每次以同一方法，分離除去黃色沉淀的血液。得1500毫升血紅溶液。 二、為了使此1500毫升血紅細(xì)胞中含有大部分的血紅蛋白沉淀?xiàng)壢?。已知血紅蛋白的等電點(diǎn)為PH :7. 2，因此用NaH2P04 2H20_Na2HS04 2H20緩沖液配成PH :5. 5的酸性液IOOO毫升，逐次少量加入到1500毫升血紅球溶液中，待溶液加入0. 8X的單寧，攪拌30min，血紅蛋白與單寧結(jié)合成單寧-血紅蛋白沉淀，用6000r/min離心除去沉淀，取上層液。
三、由于豬血soD酶的等電點(diǎn)是ra :4.8有必要將ra :6以上的蛋白進(jìn)一步除去，因
此將以上接近2000毫升的PH :6的溶液加入1000毫升724弱酸性陽離子交換樹脂，混合均勻后，攪拌4小時(shí)，這時(shí)ra :6以上血紅蛋白等雜質(zhì)已被樹脂吸附，而SOD在溶液中呈堿性，故未被吸附倒出。 四、丁醇-磷酸氫二鉀混合液去雜SOD酶極易溶化于磷酸氫二鉀液中，而不溶于15%較低濃度中，但丁醇可以除去脂類物質(zhì)。將以上所得1800毫升處理液加入680克K2HP04 3H20及15% 270毫升丁醇，充分?jǐn)嚢?0分鐘，(K2HP04 3H20事先粉細(xì))，放入冰箱30分鐘后，取出用人造沸石過濾，濾液用6000r/min離心除沉淀物，倒入分液漏斗，取下層
4清液而棄除丁醇液。(所得本醇待后用蒸法回餾收回) 五、為了進(jìn)一步除去其他蛋白殘余雜質(zhì)，將上述下層清液加熱到6『C水浴鍋20分鐘，這時(shí)，有微量雜質(zhì)用濾紙過濾除去。 六、將過濾所得1900毫升清液按體積1. 5倍加入3000毫升丁醇，攪拌后放置
3t:-5t:冰箱半小時(shí)，可見白色的soD酶約io克沉淀，將此酶液抽濾，用io倍去離子水稀釋
后得約10毫升處理液，為了彌補(bǔ)失去的銅離子，以每100毫升中加入8%氯化銅1-2毫升，拌勻溶化后，再加入1/2體積的丁醇，立即見有白色微帶藍(lán)色的沉淀物——Cu-SOD酶，將此酶用真空冷凍干燥，得3. 8克白色微帶藍(lán)色的SOD酶粉劑制品。
權(quán)利要求
一種從豬血中提取SOD酶的方法，其特征在于a、它是用非刺激性有機(jī)物進(jìn)行沉淀分離的的一種方法，它所用試劑如單寧丁醇等都是一種對SOD酶無損害的、溫和的溶劑。b、試劑價(jià)格低廉，雖丁醇較昂貴，但可回收循環(huán)使用。
2. —種從豬血中提取SOD酶的方法，其特征在于以該酶蛋白的等電點(diǎn)ra :4. 6-4. 8為中心，將其他非該蛋白等電點(diǎn)電荷的蛋白進(jìn)行棄除的方法。a、 由于血中的主要成份是血紅蛋白，其除去方法是用緩沖劑調(diào)正處理劑的ra值為 6士，這時(shí)血紅蛋白呈正離子，將單寧以一定量比例投入拌勻，紅血蛋白以結(jié)合物的形式沉 淀，離心棄去之。b、 為了進(jìn)一步除去^ra:6的雜蛋白及其未被除盡的血紅蛋白，繼續(xù)采用1/2體積的 724弱酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附，二者拌合后繼續(xù)攪拌2-4小時(shí)，使之達(dá)到平衡，吸附 結(jié)束，將未被吸附的含有SOD酶的溶液倒出，進(jìn)行下一步分離。
3. 分離棄去其他剩余物質(zhì)a、 為了除去豬血中含非蛋白的脂類物質(zhì)，用丁醇-磷酸氫二鉀混合液繼續(xù)清除。方法 是在溶液中加入處理量15%的丁醇和38%的磷酸氫二鉀，二者混合，充分?jǐn)嚢?5min，在 冰箱中靜置15分鐘-1小時(shí)，將雜質(zhì)用人造沸石濾除，得過濾液。b、 熱沉淀由于S0D酶的耐熱性在短時(shí)間內(nèi)較強(qiáng)，將上述濾液放入68t:水浴鍋中加熱 20min，并在室溫下迅速冷卻，將其他雜蛋白除去。
4. 除去所用試劑殘余量及彌補(bǔ)銅離子丟失。由于經(jīng)過權(quán)利2中要求的處理，尚存留試劑殘余量，須除去，同時(shí)，為彌補(bǔ)S0D酶中的銅 離子丟失，須補(bǔ)足。故最后按每100ml處理量用1.5倍的丁醇沉淀抽提得白色S0D酶后，將 酶液再用10倍的去離子水溶化，每100ml加入該體積8%的氯化銅液1. 2毫升，攪拌，使溶 液微呈藍(lán)色，然后現(xiàn)加入該體積1.5倍的丁醇再沉淀抽取一次，得到略呈微藍(lán)白色的帶銅 離子的S0D酶(殘留試劑雜質(zhì)擴(kuò)散于處理液中棄除)。用真空冷干燥之，即為含銅離子的微 藍(lán)白色S0D酶粉劑。
5. 此技術(shù)原則上適用于對各種生物具有已知等電點(diǎn)蛋白的分離，包括各種酶、蛋白類 激素、各種細(xì)胞蛋白包括免疫球蛋白、以及各種特異性蛋白的分離等等。
全文摘要
本發(fā)明涉及從豬血中提取SOD酶的方法，該方法根據(jù)豬血中主要蛋白質(zhì)間等電點(diǎn)電荷存在較大差異特點(diǎn)，而進(jìn)行分離的一種方法。本法將除去黃色血漿和血紅蛋白球滲出的血紅蛋白等處理液，用緩沖劑調(diào)正pH值為6±，用單寧使其沉淀析出、棄除。繼續(xù)用保持其該電荷的處理液，用1/2體積的724弱酸性陽離子樹脂進(jìn)行吸附除去殘留血紅蛋白，殘余雜質(zhì)再用丁醇一磷酸二氫鉀混合液處理，并用68℃熱處理20min，然后將SOD沉淀物用去離子水稀釋，丁醇沉淀反復(fù)數(shù)次，以除去試劑殘留量，再用8％的氯化銅液在處理液每100ml容積中加入1-2毫升，以彌補(bǔ)丟失的銅離子，最后用真空冷凍干燥，得白色微藍(lán)色SOD酶制劑。
文檔編號C12N9/08GK101724610SQ20091015669
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:史知行