專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化甜瓜蔓枯病菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，特別的，屬于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜蔓枯病菌轉(zhuǎn) 化技術(shù)。
背景技術(shù)：
甜瓜是我國重要的經(jīng)濟作物，而瓜類蔓枯病是當前危害瓜類生產(chǎn)的最主要病害， 嚴重影響瓜果的產(chǎn)量和品質(zhì)。蔓枯病菌病原學(xué)研究還非常落后。瓜類蔓枯病是由亞隔孢殼 屬(Didymella spp.)(近年來的公認名稱)引起，是一種嚴重的全球性真菌病害，侵染黃 瓜、西瓜、甜瓜、南瓜和西葫蘆等，對寄主植物造成不同程度的影響。國內(nèi)外已經(jīng)開展了一些 甜瓜蔓枯病菌的研究，主要集中在培養(yǎng)、產(chǎn)孢以及應(yīng)用分子標記技術(shù)簡單分類等，關(guān)于該菌 的功能基因的研究未見任何報道。而建立一種簡單、快速、高效的甜瓜蔓枯病菌轉(zhuǎn)化體系是 研究該菌功能基因以及甜瓜蔓枯病菌互作的必需的工具。根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌轉(zhuǎn)化效率比較高，在報道中，有的106個孢子能產(chǎn)生300-500 個轉(zhuǎn)化子，有的105個孢子能產(chǎn)生53個轉(zhuǎn)化子、而有的則為104個孢子能產(chǎn)生156個轉(zhuǎn) 化子。。T-DNA單拷貝插入的幾率比較高，而且T-DNA插入位置的旁側(cè)序列很容易通過 TAIL-PCR擴增得到，根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的真菌轉(zhuǎn)化子很容易發(fā)生表型以及致病性的突 變，而且表型與T-DNA共分離的幾率比較高，已經(jīng)在多種真菌上使用，被證明是一種非常有 用的研究真菌基因功能以及病菌與寄主互作的工具。而現(xiàn)有技術(shù)中沒有建立起甜瓜蔓枯病 菌轉(zhuǎn)化體系，這就需要特別針對甜瓜蔓枯病菌進行轉(zhuǎn)化體系的建立。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決以上問題，本發(fā)明提供一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化甜瓜蔓枯病菌的方 法，包括(1)將甜瓜蔓枯病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，并在40W紫外燈(12h紫外燈/12h黑 暗)下處理4-6天誘導(dǎo)產(chǎn)孢，用滅菌水洗下孢子，采用血球計數(shù)板測定，配成5X 106個/mL 孢子懸浮液；(2)用活化的根癌農(nóng)桿菌的菌液100 PL與等體積的蔓枯病菌分生孢子懸浮液 (5X106f/mL)混勻，23°C、150rpm 培養(yǎng) 12h ；(3)然后涂布于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上孔徑為0. 45i!m的5mm2的纖維素膜上，23°C培養(yǎng) 48h ；其中，共培養(yǎng)培養(yǎng)基包括200 u g/mL氨芐青霉素、200 u g/mL頭孢噻肟鈉和200 u g/mL 四環(huán)素；(4)最后挑取單個轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至含潮霉素100 u g/mL的液體CMC培養(yǎng)基內(nèi)促進產(chǎn) 孢。在一個優(yōu)選的方式中，在步驟3后進行選擇培養(yǎng)的時，選擇培養(yǎng)基包括100 u g/mL的潮 霉素、200 u g/mL的頭孢噻肟鈉和200 u g/mL的氨芐青霉素有益效果本發(fā)明首次發(fā)明了甜瓜蔓枯病菌分生孢子的轉(zhuǎn)化體系，為了研究該菌功能基因以
3及甜瓜蔓枯病菌互作的提供了基礎(chǔ)。


圖1為不同潮霉素B濃度對甜瓜蔓枯病菌分生孢子萌發(fā)的影響實驗結(jié)果圖。其中， 每個平板上的數(shù)字分別代表0、25、50、100、150、200、2501^/11^的潮霉素B的PDA平板。圖2為不同潮霉素B濃度對甜瓜蔓枯病菌菌絲生長的影響。其中每個平板上的數(shù) 字分別代表0、25、50、100、150、200、250118/11^的潮霉素B的PDA平板。圖3為甜瓜蔓枯病菌的轉(zhuǎn)化子以及野生型的潮霉素抗性基因HPT II的PCR擴增 結(jié)果圖。其中M，是DNA marker, WT是野生型的甜瓜蔓枯病菌，1是3甜瓜蔓枯病菌的轉(zhuǎn)化 子。試驗為了進一步說明本發(fā)明的效果，我們進行了試驗。這些試驗僅僅是本發(fā)明的有限 實施方式的列舉，并不構(gòu)成對本發(fā)明權(quán)利要求限制性的解釋。試驗材料供試菌株。甜瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae，DB11)，于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué) 院植物保護與微生物研究所的經(jīng)濟作物病害研究室保存；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaceins)菌株AGL1 (根癌農(nóng)桿菌AGL1由浙江農(nóng)科院植物保護與微生物研究所真菌研 究室王艷麗于2008年9月饋贈)；質(zhì)粒pHG包括pHIG2RHPH2-GFP-GUS —段序列的載體，簡 稱PHG，(包含pHG質(zhì)粒的大腸桿菌由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院宋鳳鳴教授月于2005 年8月饋贈)，按照常規(guī)方法把質(zhì)粒pHG轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌AGL1中，并在YEB培養(yǎng)基(含新 霉素Neo濃度25 u g/mL)上生長48小時備用。培養(yǎng)基YEB培養(yǎng)基Beef extract (牛肉浸膏)5g/L, Yeast extract (酵母膏)lg/L, P印tone (蛋白 胨)5g/L，Sucrose (蔗糖)5g/L，MgS04. 7H20 4g/L，Agar (瓊脂)，15g/L pH 7. 4。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，加水1000mL。AB MM 培養(yǎng)基每升含50mL AB 緩沖液(20XAB Buffer :K2HP04 60g/L, NaH2P04 20g/L)，50mL AB 鹽(20XAB 鹽NH4C1 20g/L,MgS04 7H20 6g/L, KC1 3g/L, CaCl2 0. 2g/L，F(xiàn)eS04 7H2050mg/ L，pH = 0. 7)和0. 5%的葡萄糖。誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)1XAB 緩沖液，2mmol/L NaP04, 50mmol/L MES (pH 5. 6)，0. 5%葡萄糖。共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MM)與IM相同，但是葡萄糖的含量為0.25%。試驗1甜瓜蔓枯病菌的產(chǎn)抱蔓枯病菌孢子懸浮液的準備將甜瓜蔓枯病菌(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物與微生物 研究所經(jīng)濟作物病害研究室分離保存)接種在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200克煮沸10分鐘，過 濾湯汁，棄固體薯塊，取濾液，然后加蔗糖20克，瓊脂17克，純水定容至1升，滅菌后備用)上，并在40W紫外燈(12h紫外燈/12h黑暗)下處理4d誘導(dǎo)產(chǎn)孢。用滅菌水洗下孢子，采 用血球計數(shù)板測定，配成5 X 106個/mL孢子懸浮液備用。試驗2平板法測定不同潮霉素B濃度對甜瓜蔓枯病菌孢子萌發(fā)的抑制效果配制含潮霉素(0、25、50、100、150、200和250ii g/mL)的PDA培養(yǎng)基，倒平板， 5 X 106個/mL孢子懸浮液稀釋1000倍，吸10 y L蔓枯病菌孢子懸浮液的稀釋液均勻涂布到 平板上，每培養(yǎng)皿平均50個分生孢子，28°C培養(yǎng)4d觀察菌落生長情況。每處理重復(fù)三次。試驗結(jié)果表明(圖1)，PDA平板含0-25 u g/mL潮霉素B時對甜瓜蔓枯病菌的分生 孢子萌發(fā)基本沒有抑制作用，含50 y g/mL潮霉素B時對孢子的萌發(fā)抑制作用較強，但是孢 子還是能萌發(fā)，而含100 u g/mL潮霉素B時甜瓜蔓枯病菌的分生孢子就不能萌發(fā)了。 _4] i式I 3 ￥臓■綱朝籠B W應(yīng)甘應(yīng)古碰麟果配制含潮霉素8(0、25、50、100、150、200和250 u g/mL)的PDA培養(yǎng)基，倒平板，打 孔器取同等菌齡和直徑的菌碟放置到平板中心，28°C培養(yǎng)7d觀察菌落生長情況。每處理重 復(fù)三次。試驗結(jié)果表明(圖2)，PDA平板含25 u g/mL潮霉素B就對甜瓜蔓枯病菌的菌絲生 長產(chǎn)生強烈的抑制作用。結(jié)合分生孢子萌發(fā)的抑制效果，所以我們的轉(zhuǎn)化選擇100 y g/mL 潮霉素B來篩選陽性轉(zhuǎn)化子i式I 4柳劍虧#1、氡賴聽禾口卜細敵__吿丨丨 作用配制含200 u g/mL氨芐青霉素+200 u g/mL頭孢噻肟鈉+200 u g/mL四環(huán)素的共培 養(yǎng)培養(yǎng)基(MM)，AGL1 :pHG菌液10 y L均勻涂布到固體平板上，待培養(yǎng)基吸收菌液后，28°C 倒置培養(yǎng)4d觀察菌落生長情況，沒有任何抗生素的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MM)的平板培養(yǎng)根癌農(nóng) 桿菌做對照。每處理重復(fù)三次。實驗結(jié)果表明，AGLl::pHG在不含任何抗生素以及含200i!g/mL氨芐青霉素 +200 u g/mL頭孢噻肟鈉+200 u g/mL四環(huán)素的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MM)上都不能生長，為了抑制 其他雜細菌生長，特選擇200 u g/mL氨芐青霉素+200 u g/mL頭孢噻肟鈉+200 u g/mL四環(huán) 素的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MM)共培養(yǎng)蔓枯病菌孢子和AGLl::pHG根癌農(nóng)桿菌。
_0] i式驗5根癌農(nóng)射舌仆,禾口轉(zhuǎn)仆,用If液準備YEB培養(yǎng)基上培養(yǎng)的C58C1: :pHG菌株上轉(zhuǎn)移至基本培養(yǎng)基(AB匪Neo 25 u g/ mL)上培養(yǎng)48h。然后把50mL菌液在4000rpm下離心lOmin收集菌體，最后用5mL(l/10體 積)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌兩次，收集菌體。5mL(l/10體積)的IM+AS(乙酰丁香酮)100mmol/ L+Neo (25 u g/mL)懸浮根癌農(nóng)桿菌菌體，調(diào)整0D66(1 = 0. 18。試驗6共培養(yǎng)和篩選轉(zhuǎn)化用根癌農(nóng)桿菌的菌液100 PL與等體積的蔓枯病菌分生孢子懸浮液(5X106 個/mL)混勻，23°C、150rpm培養(yǎng)12h，然后涂布于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MM)上孔徑為0. 45 y m的 5mm2的纖維素膜的一面上，纖維素膜的另一面直接與共培養(yǎng)培養(yǎng)基接觸，23°C培養(yǎng)48h，其 中共培養(yǎng)培養(yǎng)基包括200 u g/mL氨芐青霉素+200 u g/mL頭孢噻肟鈉+200 u g/mL四環(huán)素。然后用2mL基本培養(yǎng)基洗上述的纖維素膜，收集真菌和細菌培養(yǎng)物，然后取 200 u L的基本培養(yǎng)基洗滌溶液涂在含100 u g/mL的潮霉素、200 u g/mL的頭孢噻肟鈉和 200 u g/mL的氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，進行選擇培養(yǎng)，同時抑制根癌農(nóng)桿菌的生長。
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試驗7轉(zhuǎn)化子的提取和促講產(chǎn)孢挑取單個轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至含100 μ g/mL的潮霉素的液體CMC培養(yǎng)基內(nèi)促進產(chǎn)孢。培 養(yǎng)后，紫外燈照射4天(12小時光照，12小時黑暗)產(chǎn)孢。試驗8轉(zhuǎn)化子的篩詵鑒定蔓枯病菌基因組DNA提取。真菌基因組DNA提取試劑盒(寶生物工程(大連)有 限公司)提取蔓枯病菌基因組DNA，0. 8%的瓊脂糖電泳檢測DNA的質(zhì)量。潮霉素B抗性基因 的分子檢測。使用潮霉素B抗性基因HPT II的引物PCR擴增該基因，PCR產(chǎn)物469bp，引物 序列Up primer :5，-TCCATACAAGCCAACCAC-3，；Down primer :5，-TGACCTATTGCATCTCCC_3，。 PCR 程序如下:95V 5min ；95°C 30s, 50°C 30s, 72°C 45s，30cycles ；72°C 5min。潮霉素抗性 基因HPT II的PCR擴增結(jié)果表明T-DNA已經(jīng)插入到甜瓜蔓枯病菌的染色體上(見圖3)本發(fā)明已經(jīng)成功得到甜瓜蔓枯病菌的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子，IO6個分生孢子的轉(zhuǎn)化可 以得到125個左右的轉(zhuǎn)化子。本文中用來描述方法的術(shù)語和表達方式并不是唯一不變的，并且我們沒有任何意 圖使用這些術(shù)語和表達方式來排除描述本方法或者特征的任何相同意義的表達方式，我們 認同在本發(fā)明聲明的范圍內(nèi)的各種不同的表達方式。因此，我們認為盡管在本文中本發(fā)明 已經(jīng)用各種具體方案和任意的特征描述清楚地展示出來，但是改變本文中揭示的設(shè)計的 表達方式還要求助于那些有經(jīng)驗的專業(yè)技術(shù)人士，并且這些改變要與本發(fā)明附帶的聲明一 致。文章、專利、專利應(yīng)用和所有其它文檔的內(nèi)容以及本文中提到的和引證的有用的 電子化信息是結(jié)合在一起的，必須作為一個完整的內(nèi)容來參考，發(fā)表其中任何一個部分都 要特別指明這一點。申請者具有將任何和全部的這些文章、專利、專利應(yīng)用或其它文檔的信 息和材料合并入該申請書作為本專利說明書揭示的一部分的權(quán)利。
權(quán)利要求
一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化甜瓜蔓枯病菌的方法包括(1)將甜瓜蔓枯病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，并在40W紫外燈(12h紫外燈/12h黑暗)下處理4d誘導(dǎo)產(chǎn)孢，用滅菌水洗下孢子，采用血球計數(shù)板測定，配成5×106個/mL孢子懸浮液；(2)用活化的根癌農(nóng)桿菌的菌液100μL與等體積的蔓枯病菌分生孢子懸浮液(5×106個/mL)混勻，23℃、150rpm培養(yǎng)12h；(3)然后涂布于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上孔徑為0.45μm的5mm2的纖維素膜上，23℃培養(yǎng)48h；其中，共培養(yǎng)培養(yǎng)基包括200μg/mL氨芐青霉素、200μg/mL頭孢噻肟鈉和200μg/mL四環(huán)素；(4)最后挑取單個轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至含潮霉素100μg/mL的液體CMC培養(yǎng)基內(nèi)促進產(chǎn)孢。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟3后進行選擇培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)基包括 100 μ g/mL的潮霉素、200 μ g/mL的頭孢噻肟鈉和200 μ g/mL的氨芐青霉素。
全文摘要
本發(fā)明提供一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化甜瓜蔓枯病菌的方法包括(1)將甜瓜蔓枯病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，并在40W紫外燈(12h紫外燈/12h黑暗)下處理4d誘導(dǎo)產(chǎn)孢，用滅菌水洗下孢子，配成5×106個/mL孢子懸浮液；(2)用活化的根癌農(nóng)桿菌的菌液100μL與等體積的蔓枯病菌分生孢子懸浮液混勻，23℃、150rpm培養(yǎng)12h；(3)然后涂布于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上孔徑為0.45μm的5mm2的纖維素膜上，23℃培養(yǎng)48h；其中，共培養(yǎng)基包括200μg/mL氨芐青霉素、200μg/mL頭孢噻肟鈉和200μg/mL四環(huán)素；(4)最后挑取單個轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至含潮霉素100μg/mL的液體CMC培養(yǎng)基內(nèi)促進產(chǎn)孢。
文檔編號C12N15/80GK101824431SQ200910154750
公開日2010年9月8日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者任海英, 方麗, 王漢榮, 茹水江 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院