專利名稱：：加快花生轉(zhuǎn)化率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)花生外源基因遺傳轉(zhuǎn)化效率的技術(shù)方法，通過在花生遺傳轉(zhuǎn)化所用的農(nóng)桿菌工程菌液中添加一定量的煙草提取液，并將煙草提取液與工程菌液在合適的時機加入和混勻，通過提高農(nóng)桿菌毒性來提高花生外源基因遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。
背景技術(shù)：
：組培條件下以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)進行花生遺傳轉(zhuǎn)化已有較多的成功先例，多以嫩葉為外植體進行轉(zhuǎn)化，印度Eapen和GeorgeI994年首次報道以9~10d苗齡嫩葉為外植體通過含雙元質(zhì)粒pBI121的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因花生。美國ChengMing等人于1996和1997年報道以花生10d齡苗嫩葉為外植體通過含PBI121雙元質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植抹，得到l、T2代種子，證實外源基因已整合進花生基因組并在后代穩(wěn)定表達。同一實驗室的LiZhijian等通過對技術(shù)的改進獲得轉(zhuǎn)番茄班萎病毒殼蛋白(TSWV-CP)基因花生植林，并通過抗病性鑒定。國內(nèi)方小平等以花生品種鄂花4號4d齡苗嫩葉作外植體，與AGL1菌株共培，經(jīng)卡那霉素篩選獲得獲得國內(nèi)首例轉(zhuǎn)基因花生。Mckently、Baker、Lacorte等則分別以花生胚軸、胚狀體和節(jié)瘤為外植體實現(xiàn)了外源基因?qū)ㄉ霓D(zhuǎn)化。另外，國際半干旱熱帶地區(qū)作物所Sharma等用含雙元質(zhì)粒載體(pBI121;pROKII:IPCVcp)的農(nóng)桿菌C58菌抹轉(zhuǎn)化成熟種子子葉外植體，轉(zhuǎn)化率達55%以上。本試驗以花生叢生芽為外植體通過LBA4404菌株介導(dǎo)將含雙價表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入花生體內(nèi)，并經(jīng)過了初步分子鑒定，說明通過花生叢生芽再生體系進行外源基因轉(zhuǎn)化是可行性的。這與Sharma的研究基礎(chǔ)相似，都是以叢生芽為外植體，但Sharma等的研究是以子葉為外植體獲得的叢生芽，本研究則是以帶子葉胚為外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化試驗，轉(zhuǎn)化效率遠低于Sharma等的研究結(jié)果，分析與叢生芽的再生數(shù)量有關(guān)。同時試驗發(fā)現(xiàn)，花生叢生芽再生體系具有再生周期短、再生率高、叢生芽再生數(shù)量較多等優(yōu)點，可作為花生外源基因轉(zhuǎn)化比較好的受體體系，如對該再生體系繼續(xù)優(yōu)化，進一步提高初期莖枝誘導(dǎo)數(shù)量，則提高轉(zhuǎn)化效率有利。
發(fā)明內(nèi)容為解決農(nóng)桿菌介導(dǎo)花生外源基因芽誘導(dǎo)率低、轉(zhuǎn)化效率不高等缺點，本發(fā)明通過在花生遺傳轉(zhuǎn)化所用的農(nóng)桿菌工程菌液中添加一定量的煙草提取液，并將煙草提取液與工程菌液在合適的時機力口入和混勻，通過提高農(nóng)桿菌毒性來提高花生外源基因遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種提高花生轉(zhuǎn)化率的方法；其包^r如下步驟從煙草無菌苗取葉片搗碎離心獲得新鮮汁液；制備花生轉(zhuǎn)基因用農(nóng)桿菌工程菌液，4。C冰箱低溫放置1.5-2hr,取出后震蕩混勻，每100mL工程菌液加入2-2.5mL新鮮煙草提取液，混勻后用于花生外源基因遺傳轉(zhuǎn)化。在花生遺傳轉(zhuǎn)化研究中，常規(guī)技術(shù)多以在農(nóng)桿菌工程菌液中添加乙酰丁香酮為主，但該物質(zhì)對操作人員存在不良影響，成本高，并對后期芽誘導(dǎo)不利。本技術(shù)研究了利用煙草提取液提高轉(zhuǎn)化效率的方法，效果顯著。與常規(guī)技術(shù)相比，煙草提取液僅依靠其中的酚類物質(zhì)作用于農(nóng)桿菌毒性區(qū)，以提高農(nóng)桿菌侵染花生的毒性，區(qū)別于常規(guī)技術(shù)中加入乙酰丁香酮化學物質(zhì)，對操作人員沒有任何附加的傷害，并且提高轉(zhuǎn)化率效果更顯著。圖1是雙價表達載體pBI121的載體圖譜，該載體含35SCaMV啟動子連接的人源輪狀病毒抗原蛋白G1VP4基因(2350bp)或G2VP4基因(2350bp)，和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NPTII基因，即以卡那霉素(Kan)抗性基因作為抗性篩選基因。具體實施例方式本發(fā)明提供一種提高花生轉(zhuǎn)化率的方法，其包括如下步驟1.從煙草無菌苗取葉片搗碎離心獲得新鮮汁液；2.制備花生轉(zhuǎn)基因用農(nóng)桿菌工程菌液(1)從保存的平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種到加有50mg/LKan和25mg/LRif的5mL農(nóng)桿菌培養(yǎng)基(YEB)中，振蕩培養(yǎng)過夜；(2)耳又lmL菌液接種到50mL加有50mg/LKan和50mg/LRifYEB液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩培養(yǎng)至OD6oo-1.0-1.2，5000rpm離心lOmin,菌體用1/2MS(含有3%蔗糖)培養(yǎng)基重懸一次，5000rpm離心lOmin;(3)用1/2MS(含有3%蔗糖)培養(yǎng)基重懸，OD6(K)=0.5-0.7，4。C下儲藏1-2小時用于共培養(yǎng)。3.4。C水箱低溫放置1.5-2hr,取出后震蕩混勻，每lOOmL工程菌液加入2-2.5mL新鮮煙草^是取液，混勻后用于花生外源基因遺傳轉(zhuǎn)化。1.1實驗材料1.1.1植物材料花生(Jrac/z^/y;pogaeaL.)品種花生栽培品種魯花14號、花育19號、花育22號、花育23號由山東省花生研究所提供，同時也是市售的花生品種；煙草(Mcoto加ta&cwwcvJa"A/)品種翠碧1號本實驗室保存品系(二倍體)，該品種也是市售的花生煙草品種。1.1.2質(zhì)粒及菌種本試馬全所用農(nóng)桿菌(JgroZ>a"en-wmwme/acz'e"s)菌才朱為LBA4404,可從生物技術(shù)公司購得。該質(zhì)粒為雙價表達載體pBI121,含35SCaMV啟動子連接的人源輪狀病毒抗原蛋白G1VP4基因(2350bp)或G2VP4基因(2350bp),和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NPTII基因，即以卡那霉素(Kan)抗性基因作為抗性篩選基因，由中國農(nóng)業(yè)科學院提供(載體圖譜見附錄)。1.1.3培養(yǎng)基(一)農(nóng)桿菌培養(yǎng)基(YEB):<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>用5MNaOH調(diào)pH7.0-7.2，固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂粉，定容，々裝，高溫高壓滅菌15-20min。(二)MS培養(yǎng)基母液的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(4)母液IV的酉己制<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.1.4引物(所用引物均由上海生工生物公司合成)(1)根據(jù)G1VP4和G2VP4的序列(序列見附錄)，設(shè)計通用引物引物1:5'-ACAATGGCTTCACTCATTTATA-3'引物2:5'畫CACATCCTCAATAGCGTTCTCAC-3'(2)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因("prtl)擴增引物引物1':5'-TAGTCGGCTATGACTGGGCA-3'引物2':5'-GCCAACGCTATGTCCTGAT-3'1.1.5化學試劑(1)質(zhì)粒提取液溶液I:50mM葡萄糖，25mMTris.Cl(PH8.0),10mMEDTA(PH8.0)。溶液II:0,2MNaOH,1%SDS。溶液III:60.0mL5MKac，11.5rnL冰乙酸，28.5mLH20。溶液I15磅高壓滅菌15min。溶液II(2MNaOH和10%SDS貯存液)，現(xiàn)用現(xiàn)配。溶液I和溶液III保存于4°C。(2)lOxTE溶液O.lMTris(pH8'0)，0.01MEDTA(pH8.0)。(3)STE溶液0.1MNaCl,10mMTris(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0)。(4)RNaseA(DNasefree)溶液10mg/mL脂aseA,10mMTris(pH7.5)，15mMNaCl，100°C煮沸15min,分裝后貯于-20。C備用。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其它化學試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。1.2農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化(1)保存的農(nóng)桿菌LBA4404活化后，劃板，28。C培養(yǎng)2天后長出單克??；(2)挑根癌農(nóng)桿菌單克隆接種于50mLYEB液體培養(yǎng)基中，28°C,220rpm振蕩培養(yǎng)至OD6qo=0.5;(3)5000rpm離心5min,棄上清；(4)菌體用10mL預(yù)冷的0.15M的NaCl重懸；(5)5000rpm離心5min，棄上清；(6)沉淀用1mL預(yù)冷的20mMCaCl2重懸；(7)在200jiL感受態(tài)細胞中加入1重組質(zhì)粒，冰浴30min;(8)液氮中冷凍1min;(9)37。C水浴，融化細胞2~3min;(10)力口1mLYEB,28。C輕輕振蕩24h;(11)輕輕離心1min,用0.1mLYEB懸浮沉淀，將細胞懸液涂布于含50pg/mLKan,40pg/mLRif的YEB平板上，28。C培養(yǎng)23天；(12)篩出的克隆接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提質(zhì)粒，用特異引物進行PCR檢測。1.3子葉組織培養(yǎng)系統(tǒng)(l)挑選成熟花生種子，去掉外殼，在自來水沖洗干凈后，先用70%酒精處理lmin進4亍表面滅菌，再用0.1%升汞(w/v)處理10min,然后用無菌水沖洗46遍，每次間隔5min，最后在無菌水中浸泡2h。在超凈工作臺上小心剝?nèi)シN皮，延縱向分開，用解剖刀小心切去胚及與子葉相連的胚軸處，切成"V"型，每粒種子可產(chǎn)生兩個子葉外植體。(2)花生子葉接種在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(MSC1)上，在25°C±1°C、30004000Lux光強，16h光照條件下培養(yǎng)，每14d更換新鮮培養(yǎng)基。當有綠色芽點形成后，接種到芽伸長培養(yǎng)基(MSC2)上促進芽分化及伸長。待有4-6片葉時，切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(MSC3)誘導(dǎo)生根。約2周后根開始形成，再過一周時間將根系健壯的小植株移栽到經(jīng)高溫滅菌過的蛭石中，置于室內(nèi)光照條件下培養(yǎng)23周后，然后移至溫室，土壤為滅菌的大田土。每個月用Hoagland營養(yǎng)液澆一次，定期用自來水澆灌。(3)子葉組織培養(yǎng)系統(tǒng)的主要培養(yǎng)基i秀導(dǎo)分化培養(yǎng)基(MSC1):MS+5.00mg/L6-BA+1.50mg/L2,4-D，pH5.7-5.8;芽伸長培養(yǎng)基(MSC2):MS+0.50mg/L6-BA,pH5.7-5.8;生根培養(yǎng)基(MSC3):MS+2.00mg/LNAA,pH5.7畫5.8。1.3.3煙草提取物的獲得煙草種子滅菌種于MS培養(yǎng)基中，2-3周后取小苗幼嫩莖葉2g，放入無菌的50mL離心管中搗爛取汁液，然后加入2mL無菌水，振蕩混合均勻靜置3-5min,獲得煙草提取物。取煙草提取物加到50mL1/2MS液體培養(yǎng)基重懸的菌液(OD6。。=0.5-0.7)中。1.4煙草提取物對轉(zhuǎn)化的影響設(shè)置每50mLl/2MS培養(yǎng)基重懸的菌液中加入煙草提取物0.5、1.0、1.5、2.0mL,以魯花14號和花育23號的子葉為外植體，4曼染10min,共培養(yǎng)3天后，移入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-4周，期間觀察外植體的芽分化率。1.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生子葉遺傳轉(zhuǎn)化1.5.1活化農(nóng)桿菌(1)從保存的平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種到加有50mg/LKan和25mg/LRif的5mLYEB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜；(2)取lmL菌液接種到50mL加有50mg/LKan和50mg/LRifYEB液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩培養(yǎng)至006()()=0.8-1.0，5000rpm離心lOmin,菌體用1/2MS(含有3%蔗糖)培養(yǎng)基重懸一次，5000rpm離心10min;(3)用1/2MS(含有3%蔗糖)培養(yǎng)基重懸，OD6Q。=0.5-0.7,4。C下儲藏1-2小時用于共培養(yǎng)。1.5.2侵染及共培養(yǎng)農(nóng)桿菌侵染制備好的子葉外植體10min,然后用滅菌的濾紙洗干多余的菌液。隨后將外植體置入鋪有一層無菌濾紙的MSC1固體培養(yǎng)基中，25。C士rC暗培養(yǎng)3天。1.5.3芽誘導(dǎo)培養(yǎng)(1)共培養(yǎng)三天后，將外植體取出用含Cef為250mg/L、Carb為250-500mg/L的無菌水沖洗4-5遍后，用滅菌濾紙吸干，接到含Cef為250mg/L、Carb為250-500mg/L的i秀導(dǎo)分化培養(yǎng)基(MSC1)上，在25°C±1°C、3000-4000Lux光強，16h光照條件下選擇培養(yǎng)14d;(2)然后轉(zhuǎn)一妾到含有Cef為250mg/L、Carb為250-500mg/L、Kan為125mg/L誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(MSCl),在25。C士1。C、3000-4000Lux光強，16h光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每14d更換新鮮培養(yǎng)基。子葉隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)伸長膨大，逐步將外植體的子葉部分切掉；(3)當有綠色芽點形成后，接種到Cef為250mg/L、Carb為250-500mg/LCarb、Kan為125mg/L的芽伸長培養(yǎng)基(MSC2)上促進芽分化及伸長，隨著芽叢的繼續(xù)生長，逐步將其切分成小塊，繼續(xù)伸長培養(yǎng)。1.5.4生根培養(yǎng)當誘芽長有3~4片小葉時，將誘芽切下，轉(zhuǎn)接到加有Cef為250mg/L、Carb為250-500mg/L、Kan為25mg/LKan的生根培養(yǎng)基(MSC3)誘導(dǎo)生根，約2周后^f艮開始形成。1.5.5移栽溫室將根系健壯的小植株移栽到經(jīng)高溫滅菌過的蛭石中，置于室內(nèi)光照條件下培養(yǎng)2-3周后，然后移至溫室，土壤為滅菌的大田土。每個月用Hoagland營養(yǎng)液澆一次，定期用自來水澆灌。1.6轉(zhuǎn)基因植林的分子檢測1.6.1轉(zhuǎn)基因植抹的PCR檢測1.6.1.1花生DNA的提取(1)取2-4g新鮮花生葉片，在液氮中充分研磨；(2)移至50mL離心管中，加入16mLDNA提取液，充分混勻，65°C水浴j呆溫20min;(3)加入5mL5M的KAc溶液，水浴30min以上(中間輕搖幾次)；(4)加入5mL氯仿苯酚(l:l)混合液，混勻，6000rpm離心15min(冰凍離心才幾)；(5)上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的50mL離心管中，加入5mL氯仿，6000rpm離心10min;(6)上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的50mL離心管中，加入等體積冰凍的異丙醇，-20。C放置兩小時以上;(7)4。C,6000rpm離心5min，用70%乙醇洗;條DNA5冗淀三次；(8)沉淀吹干后用水溶解，用分光光度法測A26o及A，以確定濃度，于-20。C貯存。DNA提取液Tris畫HCl(pH8.0)100mmol/LEDTA(pH8.0)5mmol/LNaCl500mmol/LSDS1.25%1.6.1.2PCR擴增wp/II基因0.5mLEP管中，50(iLPCR反應(yīng)體系Taq酶0.25^L10xbuffer5jiLMgCl23jxLdNTP(2.5mM)4pLTemplate1jjL"/fiiPrimer1'1jjLiiPrimer2'1jjLDDW34.75(iL反應(yīng)條件94°C5min,94°C50s,55°C45s，72°Clmin,30循環(huán)后，72°C延伸10min,4。C保存。1.0%瓊脂糖;10交電泳檢測。1.6.1.3PCR擴增VP4基因0.5mLEP管中，50(xLPCR反應(yīng)體系Taq酶0.25jaL10x緩沖液5}iLMgCl23|oLdNTP(2.5mM)4jiL模板IjiLVP4引物1lpLVP4引物2lpLDDW34.75)iL反應(yīng)條件94。C5分鐘，94。C55秒，57°C45秒，72。Cl分鐘，30循環(huán)后，72。C延伸10分鐘，4。C保存。1.0%瓊脂糖凝膠電泳4企測。1.6.2轉(zhuǎn)基因植林的PCR-Southern雜交和Southern雜交檢測提取轉(zhuǎn)基因花生植抹的基因組DNA,DNA用Saw//1酶切，電泳，轉(zhuǎn)膜，用標記VP4部分片段的序列進行雜交。PCR-Southem雜交，PCR擴增目的基因后，轉(zhuǎn)膜雜交過程同Southern雜交。實施例煙草提取物中含有較多的酚類物質(zhì)，在花生外植體侵染過程中加入煙草提^f又物，提高酚類物質(zhì)的含量，由表l可以看出，當50mL1/2MS培養(yǎng)基重懸的菌液中加入煙草提取物為1.0-1.25mL時，魯花14號和花育23號的轉(zhuǎn)化率提高最大。實驗證明煙草提取物能提高花生外植體的轉(zhuǎn)化率，但加入過量又會導(dǎo)致外植體的褐化引起轉(zhuǎn)化率降低。表l煙草提取物對子葉外植體轉(zhuǎn)化率的影響(2Q04年)煙草提耳又物的濃度(mL/50ml)0.00.51.01.251.5魯花14號轉(zhuǎn)化率(％)10172928.0021花育23號轉(zhuǎn)化率(％)_1216272412由表2中看出，添加煙草換:耳又液后，泉花10號與金花1012的雙^介表達載體基因遺傳轉(zhuǎn)化率顯著提高，分別提高了4.4和5倍。表2田間煙草提取液花生外源基因遺傳轉(zhuǎn)化實驗(2004年)添加煙草提取液轉(zhuǎn)化率(°/。)CK轉(zhuǎn)化率(％)提高(倍)泉花10號2.20.54.4金花10121.50.35由表3中看出，添加煙草提取液后，花育19號與花育22號的G1VP4基因遺傳轉(zhuǎn)化率顯著提高，分別提高了2.2倍。表3輪狀病毒G1VP4基因遺傳轉(zhuǎn)化實驗U005年)添加煙草提取液轉(zhuǎn)化率(％)CK轉(zhuǎn)化率(％)提高(倍)花育19號17.25.53.1花育22號15.16.82.權(quán)利要求1.一種提高花生轉(zhuǎn)化率的方法；其包括如下步驟(1)從煙草無菌苗取葉片搗碎離心獲得新鮮汁液；(2)制備花生轉(zhuǎn)基因用農(nóng)桿菌工程菌液，4℃冰箱低溫放置1.5-2小時，取出后震蕩混勻，每100mL工程菌液加入2-2.5mL新鮮煙草提取液，混勻后用于花生外源基因遺傳轉(zhuǎn)化。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，制備花生轉(zhuǎn)基因用農(nóng)桿菌工程菌液的過程包括(1)從保存的平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種到農(nóng)桿菌培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜；(2)取少量菌液接種到加有卡那霉素和利福平的農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩培養(yǎng)至OD60q=1.0-1.2,4000-5000rpm離心10min,菌體用含有3%蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基重懸一次，4000-5000rpm離心10min;(3)用含有3%蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基重懸，OD6oo=0.5-0.7，4。C下儲藏1-2小時用于共培養(yǎng)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述少量菌液為l-2mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化步驟包括(1)保存的農(nóng)桿菌LBA4404活化后，劃板，28。C培養(yǎng)2天后長出單克?。?(2)挑根癌農(nóng)桿菌單克隆接種于50mLYEB液體培養(yǎng)基中，28°C,200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.7;(3)5000rpm離心5min,棄上清；(4)菌體用10mL預(yù)冷的0.15M的NaCl重懸；(5)5000rpm離心5min，棄上清；(6)沉淀用1mL預(yù)冷的20mMCaCl2重懸；(7)在200fiL感受態(tài)細胞中加入1pg重組質(zhì)粒，冰浴30min;(8)液氮中冷凍1min;(9)37。C水浴，融化細月包23min;(10)力o1mLYEB，28。C輕輕振蕩2~4h;(11)輕輕離心1min,用0.1mLYEB懸浮沉淀，將細月包懸液涂布于含50jig/mLKan,40pig/mLRif的YEB平板上，28。C培養(yǎng)2~3天；(12)篩出的克隆接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提質(zhì)粒，用特異引物進行PCR檢測。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，獲得所述煙草提取液的步驟包括煙草種子滅菌種于MS培養(yǎng)基中，2-3周后取小苗幼嫩莖葉2g，》文入無菌的50mL離心管中搗爛耳又汁液，然后加入2mL無菌水，4展蕩混合均勻靜置3-5min,獲得煙草提取物。全文摘要本發(fā)明提供一種提高花生轉(zhuǎn)化率的方法；其包括如下步驟從煙草無菌苗取葉片搗碎離心獲得新鮮汁液；制備花生轉(zhuǎn)基因用農(nóng)桿菌工程菌液，4℃冰箱低溫放置1.5-2小時，取出后震蕩混勻，每100mL工程菌液加入2-2.5mL新鮮煙草提取液，混勻后用于花生外源基因遺傳轉(zhuǎn)化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明對操作人員沒有任何附加的傷害，并且提高轉(zhuǎn)化率效果更顯著。文檔編號C12N15/84GK101586118SQ20091015226公開日2009年11月25日申請日期2009年7月10日優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日發(fā)明者萬書波,單世華,張廷婷,李春娟,閆彩霞申請人:山東省花生研究所