專利名稱：：花生種皮抗黃曲霉基因aw569086及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種花生種皮抗黃曲霉基因AW569086及其編碼蛋白，所述基因及其編碼蛋白能夠顯著提高花生種皮黃曲霉抗性，本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)所述基因表達(dá)量的熒光定量PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：我國(guó)的花生產(chǎn)業(yè)在世界上占有非常重要的地位，總產(chǎn)、單產(chǎn)、出口量均居世界首位。黃曲霉毒素是黃曲霉菌侵染花生等作物后產(chǎn)生的對(duì)人體有極強(qiáng)致癌作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素污染嚴(yán)重影響花生原料及制品的出口，降低了花生國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，是近年來(lái)制約我國(guó)花生出口增長(zhǎng)的重要因素，但目前還沒(méi)有克隆獲得特異的抗黃曲霉菌的有效基因，而分離抗性基因并篩選和改良花生品種是防治污染的有效途徑。關(guān)于花生品種抗黃曲霉侵染機(jī)理的研究均強(qiáng)調(diào)莢殼和種衣的重要性?；ㄉN子抗黃曲霉侵染首先要求具有完整無(wú)缺的莢殼和種皮，其次是種皮具有滲透性低，韌性強(qiáng)，耐破損性較強(qiáng)等特征。顯微和超顯微觀察顯示，抗感品種間種皮的結(jié)構(gòu)存在較大的差異，即抗性品種的種皮具較厚細(xì)胞壁，表皮細(xì)胞間結(jié)合緊密，柵欄細(xì)胞層較密和厚，裂縫和孔較少等，而感病品種的種皮細(xì)胞壁相對(duì)較薄，細(xì)胞間結(jié)合較疏松，裂縫和氣孔較大。種皮蠟質(zhì)層的厚薄，滲透性的強(qiáng)弱也是一個(gè)重要因素。此外，品種的抗性與種臍的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，通?？剐云贩N的種臍較小且關(guān)閉，而感病品種種臍較長(zhǎng)且開(kāi)放。研究表明，花生種皮是抵抗黃曲霉侵染的天然屏障，種皮完整性對(duì)提高抗性極為有利，花生的種皮成分與黃曲霉抗性密切相關(guān)，能夠降低黃曲霉菌對(duì)花生的侵染。有研究發(fā)現(xiàn)，外原病原菌侵染植物后能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生一類低分子的病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-relatedprotein,pRp或pR蛋白)。Cuero等(1992)發(fā)現(xiàn)會(huì)g產(chǎn)毒的黃曲霉菌可誘導(dǎo)萌芽狀態(tài)的花生種子產(chǎn)生分子量為36-45kDa的幾丁質(zhì)酶，而水處理對(duì)照幾乎檢測(cè)不到幾丁質(zhì)酶。Szerszen和Pettit采用SDS-RAGE和雙向電泳檢測(cè)黃曲霉菌感染子葉后蛋白多肽的變化，發(fā)現(xiàn)未感染黃曲霉的子葉含有35組SDS相關(guān)蛋白(13.5218.7kDa)，包括257種組成成分(PI=3.08.7)，接種黃曲霉1824h后，出現(xiàn)了分子量分別為16.4、18.1、23.0和30.6kDa的4條新肽，接種2430h后又出現(xiàn)分子量分別為19.9和22.0kDa的2條新肽，PI=8.15和8.OO，這些新肽被認(rèn)為參與了黃曲霉抗性，有可能會(huì)作為品種的抗性標(biāo)記。然而，目前關(guān)于黃曲霉侵染誘導(dǎo)花生產(chǎn)生抗菌酶或肽的研究報(bào)道很少?；ㄉ裹S曲霉基因的分離克隆將有助于揭示花生與病原菌相互作用的機(jī)理，了解花生抗病性，為控制和防治花生黃曲霉污染提供新的理論與途徑，有利于花生種質(zhì)利用和分子育種。在花生抗黃曲霉基因分離的基礎(chǔ)上，利用植物基因工程技術(shù)可以有效地增強(qiáng)黃曲霉抗性、改善花生品質(zhì)。目前鑒定花生黃曲霉抗性的方法只能通過(guò)對(duì)接種后黃曲霉毒素的含量來(lái)間接獲得，而且所采用的方法，例如薄層色譜法和高壓液相色譜法，都具有操作復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用高并且對(duì)設(shè)備的要求較高等特點(diǎn)，不能有效地用于花生抗性育種研究。在花生黃曲霉抗性基因分離鑒定的基礎(chǔ)上，可以實(shí)現(xiàn)在分子水平對(duì)花生抗黃曲霉基因的檢測(cè)，到目前為止，對(duì)花生種皮抗黃曲霉基因的檢測(cè)方法還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。熒光定量PCR技術(shù)優(yōu)勢(shì)具有靈敏度和特異性高等特點(diǎn)，因此對(duì)花生種皮抗黃曲霉基因的熒光定量檢測(cè)方法的建立，將有助于優(yōu)質(zhì)抗黃曲霉花生新品系的快速鑒定和篩選。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是從花生高抗黃曲霉品種Jll中分離克隆得到一種花生種皮抗黃曲霉基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述花生種皮抗黃曲霉基因所編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種針對(duì)上述花生種皮抗黃曲霉基因的熒光定量PCR檢測(cè)方法，它能有效克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。本發(fā)明涉及分離克隆一種花生種皮抗黃曲霉基因，其可以賦予花生種皮抗黃曲霉抗性，其中所述基因序列如序列表中SEGIDNo:l所示，或者基本上相當(dāng)于SEGIDNo:l中所示的基因序列，或者其功能相當(dāng)于所示序列的片段或亞片段。所述DNA片段編碼一種黃曲霉抗性蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEGIDNo:2所示。所述花生種皮抗黃曲霉基因AW569086是根據(jù)基因芯片雜交結(jié)果，采用RT-PCR方法，并結(jié)合RACE技術(shù)獲得的，是通過(guò)以下具體技術(shù)步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)的1、總RNA的提取(1)將-S(TC保存的花生種皮放入研缽中，加液氮研磨至粉末狀；(2)用預(yù)冷的藥匙將樣品轉(zhuǎn)移至事先裝有500iiLTrizol的1.5mL的離心管中，加樣體積不應(yīng)該超過(guò)離心管的1/5;(3)向離心管中加入3MNaAc150yL，將離心管放在漩渦振蕩器上震蕩數(shù)秒鐘，用一次性注射器抽吸數(shù)次，以打斷基因組DNA;(4)向離心管中加入300iiL酚/氯仿/異戊醇(25:24:D，充分混勻，4t:，12000rpm，離心5min;(5)將上清液小心轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入1/2體積的5MNaCl，l/2體積的異丙醇，室溫放置3h;(6)4。C，14000rpm，離心15min，小心棄上清，防止RNA沉淀?yè)p失；(7)加1/10體積的3mol/LNaAc(pH5-5.2)和2倍體積的無(wú)水乙醇，-2(TC放置90min;(8)4°C，14000rpm，離心15min，棄去上清，用70%乙醇洗滌沉淀兩次；(9)盡可能徹底的吸走上清，防止RNA沉淀?yè)p失；(10)打開(kāi)離心管蓋，室溫放置數(shù)分鐘使乙醇揮發(fā)干凈。向離心管中加入30iiL-50iiLRNAse-freeddH20溶解，-80。C保存。提取的RNA利用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)對(duì)其純度及濃度進(jìn)行測(cè)定。2、RACE引物設(shè)計(jì)及合成RACE引物AnchorprimerI:5，—GACCACGCGTATCGATGTCGAC(dT)17_3，Anchorprimer11:5'-GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3'AW569086SP1:5'-GGCATTGTAGTTGGAGTTGAGCG-3，AW569086SP2:5'-TACCTCAACCCACGACCTCAAC-3'AW569086SP3:5'-GACCAGCACAGCCCTTCTAC-3'AW569086SP4:5'-ACTTTTTCGGTGGAGCAATGGGC-3'3、AW569086基因cDNA全序列克隆及序列測(cè)定利用RACE技術(shù)擴(kuò)增目的基因的3'，5'末端全長(zhǎng)，對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，并將PCR產(chǎn)物克隆到載體PEasy-Tl，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，藍(lán)白斑篩選并進(jìn)行菌落PCR，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到AW569086基因全長(zhǎng)序列。4、AW569086基因分析登錄http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov,對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括氨基酸序列、保守結(jié)構(gòu)域、0RF、同源性等。本發(fā)明涉及一種針對(duì)上述花生種皮抗黃曲霉基因的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其中，按照如下步驟進(jìn)行檢測(cè)1)根據(jù)基因序列，應(yīng)用primer5.0軟件，設(shè)計(jì)特異性引物和探針。探針5'端的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是Eclipse。正向引物AW569086-F:5'-TGAGTTCTGTTGGCGTCTGTAG-3反向引物AW569086-R:5'-AATTTCTTTCCTTGGCGAGCAAA-3'AW569086-P:5，-(FAM)TCCCGACACGACCAGCACCATCCT(Eclipse)-3，2)樣品檢測(cè)選擇高抗黃曲霉品種Jll，從花生收獲前30天開(kāi)始，每隔10天對(duì)其進(jìn)行黃曲霉接種并保持土壤干旱。接種黃曲霉后，取樣并將種皮剝下，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3)熔解曲線的制作繪制PCR產(chǎn)物的熔解曲線，以確定所設(shè)計(jì)引物及PCR擴(kuò)增的特異性。4)結(jié)果判定根據(jù)程序自動(dòng)給出的Ct值和計(jì)算公式表達(dá)量比值=2—A"T進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)量分析。其中，AACT=Ct(target，test)+Ct(ref，cdibrat。r)—Ct(ref，test)—Ct(target，cdibrat。r)，所述Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Target:代表目的基因；ref:代表內(nèi)參基因；test:代表處理樣本calibrator:代表對(duì)照。本發(fā)明公開(kāi)了花生抗黃曲霉基因熒光定量檢測(cè)方法，其優(yōu)點(diǎn)如下(1)特異性好使用了特異性探針對(duì)靶序列進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性，同時(shí)靶序列由特異引物和探針雙重控制，特異性好、假陽(yáng)性低；(2)敏度高綜合了PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、探針的高特異性以及光譜技術(shù)的敏感性而且能夠?qū)崟r(shí)定量，能極大地提高檢測(cè)的靈敏度，通常達(dá)102拷貝/mL，對(duì)數(shù)期分析，線性范圍很寬，為0-10"拷貝/mL;(3)穩(wěn)定性熒光定量PCR結(jié)果相當(dāng)穩(wěn)定，因?yàn)橛蛑翟O(shè)置在指數(shù)擴(kuò)增期。在此階段，各反應(yīng)組分濃度相對(duì)穩(wěn)定，沒(méi)有副作用，Ct與熒光信號(hào)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。與終點(diǎn)法相比Ct值能更穩(wěn)定，更精確地反映起始模板的拷貝數(shù)；圖1為花生種皮抗黃曲霉基因AW569086的開(kāi)放讀碼框分析結(jié)果；從NCBI的ORFFinder發(fā)現(xiàn)在AW86序列位于89-754存在一個(gè)長(zhǎng)666bp的開(kāi)放讀碼框，共編碼222個(gè)蛋白，起始密碼子為ATG。圖2為花生種皮抗黃曲霉基因AW569086編碼蛋白的保守區(qū)域分析結(jié)果；從圖中可發(fā)現(xiàn)AW569086所編碼的氨基酸序列含有一個(gè)植物過(guò)氧化氫酶保守結(jié)構(gòu)域。圖3為花生種皮抗黃曲霉基因AW569086編碼蛋白的同源性分析結(jié)果；由圖可看出該基因與多種高等植物的過(guò)氧化氫酶基因具有很高的同源性。與大豆，鷹嘴豆等豆科植物同源性較高，因此推測(cè)該基因在豆科植物進(jìn)化上高度保守。圖4為花生種皮抗黃曲霉基因AW569086的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果；圖5為花生種皮抗黃曲霉基因AW569086的熒光定量PCR的熔解曲線。分析擴(kuò)增曲線與溶解曲線圖形可知，AW569086基因獲得了清晰的擴(kuò)增曲線與單一峰值的溶解曲線，說(shuō)明該基因經(jīng)定量PCR檢測(cè)所得到的結(jié)果真實(shí)可信，完全可作為目的基因在不同處理樣品中表達(dá)量差異的檢測(cè)手段。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:花生種皮抗黃曲霉基因AW569086的獲得1、總RNA提取(1)將-S(TC保存的花生種皮放入研缽中，加液氮研磨至粉末狀；(2)用預(yù)冷的藥匙將樣品轉(zhuǎn)移至事先裝有500iiLTrizol的1.5mL的離心管中，加樣體積不應(yīng)該超過(guò)離心管的1/5;(3)向離心管中加入3麗aAc150yL，將離心管放在漩渦振蕩器上震蕩數(shù)秒鐘，用一次性注射器抽吸數(shù)次，以打斷基因組DNA;(4)向離心管中加入300iiL酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，充分混勻，4t:，12000rpm，離心5min;(5)將上清液小心轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入1/2體積的5MNaCl，1/2體積的異丙醇，室溫放置3h;(6)4°C，14000rpm，離心15min，小心棄上清，防止RNA沉淀?yè)p失；(7)加1/10體積的3mol/LNaAc(pH5-5.2)和2倍體積的無(wú)水乙醇，-2(TC放置90min;(8)4°C，14000rpm，離心15min，棄去上清，用70%乙醇洗滌沉淀兩次；(9)盡可能徹底的吸走上清，防止RNA沉淀?yè)p失；6(10)打開(kāi)離心管蓋，室溫放置數(shù)分鐘使乙醇揮發(fā)干凈；向離心管中加入30iiL-50iiLRNAse-freeddH20溶解，置-8(TC保存。上述條件為優(yōu)選條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)其中的條件進(jìn)行適當(dāng)改變。2、RACE引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)大豆基因芯片序列設(shè)計(jì)RACE引物，RACE引物序列為AnchorprimerI:5，-GACCACGCGTATCGATGTCGAC(dT)丄廠3，AnchorprimerII:5'-GACCACGCGTATCGATGTCGAC—3'AW569086SP1:5'-GGCATTGTAGTTGGAGTTGAGCG-3'AW569086SP2:5'-TACCTCAACCCACGACCTCAAC-3'AW569086SP3:5'-GACCAGCACAGCCCTTCTAC-3'AW569086SP4:5'-ACTTTTTCGGTGGAGCAATGGGC-3'3、AW569086基因cDNA全序列克隆及序列測(cè)定利用Roche公司的RACE試劑盒對(duì)AW569086基因的3'和5'末端進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體步驟如下在AW569086基因的3'RACE中，首先以O(shè)ligodT-anchorprimerI為引物對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，所得產(chǎn)物利用PCRanchorprimerI和SP4再進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到cDNA鏈。(l)cDNA第一鏈的合成反應(yīng)體系如表l所示表1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>反應(yīng)條件為55°C60min，85。C5min。(2)PCR擴(kuò)增取cDNA產(chǎn)物luL為模板，利用PCRanchorprimerI和SP4再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如表2所示。表2PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>反應(yīng)條件為(95°C30S，65°C30S，72°Clmin)30cycler，72°C5min在AW569086基因的5'RACE中，首先利用基因特異性引物SP1反轉(zhuǎn)錄總RNA，利用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶和dATP在cDNA末端加上poly(A)尾，隨后以加尾后的cDNA作為模板，用OligodT-anchorprimerI和基因特異性擴(kuò)增引物SP2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用PCRanchorprimerI和特異性擴(kuò)增引物SP3進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。(l)cDNA第一鏈的合成反應(yīng)體系如表3所示。表3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>反應(yīng)條件同3'RACE。(2)cDNA的加尾poly(A)反應(yīng)以合成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行加尾poly(A)反應(yīng)，反應(yīng)體系如表4所示。表4cDNA加尾反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>反應(yīng)條件為94°C3min，冰上冷卻，加入rec(80U/L)luL，37。C20min，70。C10min。(3)第一次PCR擴(kuò)增以加尾后的cDNA作為模板，用OligodT-anchorprimerI和基因特異性擴(kuò)增引物SP2進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如表5所示。表5第一次PCR反應(yīng)體系組分體積(|iU力口尾后的cDNA5OligodT-anchorprimer1primerSP2(12.5M)1dNTP1TaqDNA聚合酶，5U/L0.5ReactionBuffer(10x)5雙蒸水,36.5總體積50反應(yīng)條件為(95。C30S，65。C30S，72。Clmin)30cycler，72°C5min(4)第二次PCR擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物取luL作為模板，再用PCRanchorprimerI和特異性擴(kuò)增引物SP3進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表6所示。表6第二次PCR反應(yīng)體系組分體積(juOPCR產(chǎn)物1PCRanchorprimer1primerSP3(12.5M)1dNTP1TaqDNA聚合酶，5U/L0.5ReactionBuffer(10x)5雙蒸水40.5總體積50反應(yīng)條件為(95。C30S，60。C30S，72。Clmin)30cycler，72°C5min對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，并將PCR產(chǎn)物克隆到PEasy-Tl載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ct，藍(lán)白斑篩選并進(jìn)行菌落PCR，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到AW569086基因全長(zhǎng)序列。4、對(duì)目的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析通過(guò)NCBI的0RFFinder對(duì)目的基因進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示，在AW569086序列位于89-754存在一個(gè)長(zhǎng)666bp的開(kāi)放讀碼框，共編碼222個(gè)蛋白，起始密碼子為ATG。對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行在線保守區(qū)域分析(httD:〃w冊(cè).ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrosb.cgi),保守區(qū)域分析結(jié)果如圖2所示，該序列有一個(gè)棺物付氣化気,酶的保守結(jié)構(gòu)域。并且將拼接后的序列用Blast軟件進(jìn)行同源性測(cè)定，結(jié)果如圖3所示，該基因與大豆，鷹嘴豆，蓮類，毛白楊等過(guò)氧化物酶有著較高的一致性，都在70%以上，其中大豆一致性最高達(dá)到83%。實(shí)施例2:花生種皮抗黃曲霉基因AW569086的熒光定量PCR檢測(cè)方法按照如下步驟進(jìn)行檢測(cè)1、總RNA提取及cDNA合成選擇高抗黃曲霉品種Jll，從花生收獲前30天開(kāi)始，每隔10天對(duì)其進(jìn)行黃曲霉接種并保持土壤干旱。從接種第10天起，每隔5天進(jìn)行取樣，將種皮剝下，提取總RNA(方法同實(shí)施例l)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。10iiL反應(yīng)體系包括liiLdNTPMixture(各lOmM)，1iiLOligodTPrimer(2.5yM)，6yL提取的RNA以及2yL無(wú)RNA酶的雙蒸水，65°C溫浴5min后，然后力口入如下反應(yīng)液10uL5XPrimeScriptBuffer，O.5uLRNaseInhibitor(40U/uL)，0.5iiLPrimeScriptRTase，5iiL無(wú)RNA酶的雙蒸水，42°C30min，95°C5min，將cDNA產(chǎn)物置于-2(TC保存。2、熒光定量PCR檢測(cè)花生種皮抗黃曲霉基因AW569086的表達(dá)量以持家基因Actin為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR對(duì)AW569086基因在抗感品種中的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。Actin基因所使用的引物及探針正向引物Actin-F:5'-GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3'反向引物Actin-R:5'-GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3'Actin-P:5'-(FAM)AGCCAAGACCAGCTCCGCAGTGGA(Eclipse)-3'在Roche熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系如表7所示。表7熒光定量PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>反應(yīng)條件為95。C變性2min后進(jìn)入循環(huán)，95。C10s，55。C10s，72。C20s，共40個(gè)循環(huán)，最后一步為72t:延伸2min。熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖4。3、熔解曲線的制作繪制PCR產(chǎn)物的熔解曲線(結(jié)果見(jiàn)圖5)，以確定所設(shè)計(jì)引物及PCR擴(kuò)增的特異性。在低溫下，PCR產(chǎn)物以雙鏈形式存在，可以和染料結(jié)合并能發(fā)出熒光，當(dāng)溫度升高，DNA解鏈后，染料游離，熒光信號(hào)消失，這時(shí)在熔點(diǎn)曲線上出現(xiàn)一個(gè)峰。若PCR產(chǎn)物單一時(shí)，其解鏈溫度恒定不變，在熔點(diǎn)曲線上將顯示出一個(gè)峰，若出現(xiàn)多個(gè)峰，則說(shuō)明PCR產(chǎn)物不純。4、結(jié)果判斷根據(jù)程序自動(dòng)給出的Ct值和計(jì)算公式進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析。計(jì)算公式如下表達(dá)量比值=2—AACT其中，AACT=Ct(target，test)+Ct(ref，cdibrat。r)—Ct(ref，test)—Ct(target，cdibrat。r)，所述Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Target:代表目的基因；ref:代表內(nèi)參基因；test:代表處理樣本calibrator:代表對(duì)照。實(shí)施例3:花生種皮抗黃曲霉基因AW569086特異性表達(dá)差異的熒光定量PCR檢測(cè)為了檢測(cè)花生種皮抗黃曲霉基因AW569086的特異性表達(dá)差異，對(duì)高抗黃曲霉品種Jl1，從花生收獲前30天開(kāi)始，每隔10天對(duì)其進(jìn)行黃曲霉接種并保持土壤干旱，分別選擇第10天、第20天和第30天取樣的處理樣品(接種黃曲霉)以及同一時(shí)期的對(duì)照樣品(未接種黃曲霉)，提取種皮總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA(方法同實(shí)施例1和2)。采用本發(fā)明中所描述的檢測(cè)方法對(duì)其在不同時(shí)期處理組與對(duì)照組的表達(dá)量進(jìn)行熒光定量PCR分析，以持家基因Actin為內(nèi)參基因，根據(jù)Ct值獲得表達(dá)量差異，結(jié)果如表8所示。從表中可以看出，在黃曲霉處理高抗品種Jll，不同時(shí)期10d、20d、30d時(shí)，AW569086基因的表達(dá)量在處理組與對(duì)照組中發(fā)生了明顯變化，處理組與對(duì)照組相比分別提高了2.64倍、3.53倍、6.06倍，并且隨著處理時(shí)間的增加表達(dá)量差異顯著提高。表8花生種皮抗黃曲霉基因AW569086不同時(shí)間的特異性表達(dá)差異基因處理樣品CT值對(duì)照樣品CT值表達(dá)量比值編號(hào)10d20d30d10d20d30d10d20d30dActin17.6218.2017.99AW56908625.0521.0219.4917.4018.8718.2326.2323.5122.762.643.536.06以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各自更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。0153]序列表0154]SEQUENCELISTING0155]〈211〉8280156]〈212〉DNA0157]〈213〉0158]〈400〉10159]ctcttcttctccttcctaaccccttcaaccC3C3CCC3CC3C3C3gCC3Ccactgccttc600160]gctgccgtgccgccatccatgccgttgcgtC3CC皿C3CC3CC3CC3C3C1200161]tcccaccatctctctgatccatacatttgttcctctgcacaccaggttctgccgaacacc1800162]gattcctcttcttcacataaggcttggtcctcttgtcattggtagttgtgatccactatc2400163]■gagacccttgctgtctaatetgtttctgtagtagttgttgtcagaatcatgggagtgc3000164]cacggtcgtttctcacgtactgcaccgccttagggtctgg■tggcatcagggcacttct3600165]郷gacgtggtcagggttcagagctggatcaatctctggg4200166]gcaccaactt:acacaatgggttcgaccaacactgtgtgctcc朋gcagtgc朋cgacgc0167]caggggtgtcaattcccatggcaccaaacttgtc朋g朋ctgC3g朋3tggactcattgt0168]ggtctggg3g與actgctcaaccacatcagctctgctccttctaccatcccttcttccag0169]tctteagagg與tetggggacctctegcga朋c朋tgcc3tctctggcagagagaacgag0170]gatetcagca:3tga朋c朋ctccagggcattctctttccaaagcttctttctteaatcc0171]aagccttcagataaaacaaaggaacaacccacattcccaa0172]cgct朋teat朋tctcc朋c朋3朋朋朋aaaaaaaaaaaaaaaaaaa0173]〈211>2210174]〈212〉0175]〈400>20176]MetProLeuArgHisGinHisHisHisHisThrProThrlieSerLeu0177]1510150178]lieHisThrPheValProLeuHisThrArgPheCysArgThrProlie0179]2025300180]ProLeuLeuHislieArgLeuGlyProLeuVallieGlySerCysAsp0181]3540450182]ProLeuSerArgAspProCysCysLeulieCysPheCysSerSerCys0183]5055600184]CysGinAsnHisGlySerAlaThrValValSerHisValLeuHisArg0185]657075800186]LeuArgValTrpAsnGlylieArgAlaLeuLeuGinAsnValArgAsp0187]8590950188]ValValArgValGinSerTrplieAsnLeuTrpValGinThrValHis0189]1001051100190]GinLeuHisThrMetGlySerThrAsnThrValCysSerLysGinCys0191]1151201250192]AsnAspAlaArgGlyValAsnSerHisGlyThrLysLeuValLysAsn0193]1301351400194]CysArgAsnGlyLeulieValValTrpGluGluLeuLeuAsnHislie0195]1451501551600196]SerSerAlaProSerThrlieProSerSerSerLeuLysArgAspMet0197]1651701750198]GlyThrSerSerGluThrMetProSerLeuAlaGluArgThrArglie0199]1801851900200]SerAlaHisGluThrThrProGlyHisSerLeuSerLysAlaSerPhe0201]1952002050202]LeuAsnProSerLeuGinValLysProArgLyslielie0203]2102152200204]〈211>2248054060066072078082812CN〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉3tgagttctgttggcgtctgtag<211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4aatttctttccttggcgagcaaa〈211>24〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>5tcccgacacgaccagcaccatcct1權(quán)利要求一個(gè)花生種皮抗黃曲霉AW569086基因，其特征在于1)其具有序列表中SEGIDNo1的核苷酸序列；2)其編碼具有序列表中SEGIDNo2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；2.—種編碼權(quán)利要求1所述花生種皮抗黃曲霉AW569086基因的蛋白質(zhì)；3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于1)其具有序列表中SEGIDNo:2的氨基酸序列；2)在l)中限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的蛋白質(zhì)且與1)的蛋白質(zhì)具有相同的抗黃曲霉功能；4.一種花生種皮抗黃曲霉基因AW569086的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟1)提供抗黃曲霉基因AW569086的熒光定量PCR引物和探針?biāo)鲆餅樘禺悢U(kuò)增抗黃曲霉基因AW569086的引物，其中，正向引物序列5'-TGAGTTCTGTTGGCGTCTGTAG-3'(SEGIDNo:3);反向引物序列5'-AATTTCTTTCCTTGGCGAGCAAA-3'(SEGIDNo:4);所述熒光探針序列為5'_(FAM)TCCCGACACGACCAGCACCATCCT(Eclipse)-3'(SEGIDNo:5);2)花生種皮樣品總RNA的提取及cDNA合成；3)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；4)根據(jù)程序自動(dòng)給出的Ct值和下述計(jì)算公式，判斷樣品的相對(duì)基因表達(dá)量；表達(dá)量比值=2—AACT其中，△ACT—Ct(target，test)+Ct(ref，calibrator)_Ct(ref，test)_Ct(target，calibrator)，所述Ct值是f曰每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為95。C變性2min后進(jìn)入循環(huán)，95。C10s，55。C10s，72。C20s，40個(gè)循環(huán)，最后一步為72°C延伸2min;6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系含有正反向引物均為0.2iimol/L，熒光探針濃度為0.8ymol/L。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)花生種皮抗黃曲霉基因AW569086及其編碼蛋白，所述基因及其編碼蛋白能夠顯著提高花生種皮黃曲霉抗性，本發(fā)明還公開(kāi)了一種所述基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)抗黃曲霉基因AW569086的PCR引物和探針；(2)花生種皮總RNA的提取及cDNA合成；(3)采用熒光定量PCR檢測(cè)抗黃曲霉基因AW569086的表達(dá)量；(4)根據(jù)程序自動(dòng)給出的Ct值和計(jì)算公式，計(jì)算樣品的相對(duì)基因表達(dá)量；本發(fā)明的檢測(cè)方法具有良好的靈敏度和特異性，可以快速有效地鑒定和篩選具有黃曲霉抗性的花生品種，尤其適合花生育種中優(yōu)勢(shì)品種的批量篩選。文檔編號(hào)C12N15/29GK101768592SQ20091015226公開(kāi)日2010年7月7日申請(qǐng)日期2009年7月10日優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日發(fā)明者單世華,孫兵,張廷婷,李春娟,閆彩霞申請(qǐng)人:山東省花生研究所