專利名稱：一種通過重組藻類生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙醇生產(chǎn)的新生物方法。具體來說，本發(fā)明涉及了使用重 組藻類來生產(chǎn)乙醇的方法，是一種低投入高乙醇產(chǎn)率的方法。該方法使用了一種含有能表達(dá)丙酮酸脫羧酶(以下稱之為PDC)活性的基因和一種含有能表達(dá) 乙醇脫氫酶(以下稱之為ADH)活性的基因，即乙醇生物合成酶基因群，通過基 因工程技術(shù)分別導(dǎo)入到藻類基因組中，在體內(nèi)表達(dá)生產(chǎn)乙醇。
背景技術(shù)：
目前，乙醇的生產(chǎn)還停留在發(fā)酵和合成兩種方法上。發(fā)酵法就是利用生物 資源例如植物的糖類用一種微生物如酵母菌的發(fā)酵來制備乙醇，合成法是通過 化石資源例如煤和石油的乙烯化學(xué)合成來制備乙醇。通過傳統(tǒng)大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵 生產(chǎn)乙醇方法的缺點(diǎn)是乙醇生產(chǎn)速率低，成本高，盡管發(fā)酵是在厭氧條件下進(jìn) 行，但是發(fā)酵過程中條件難以控制。而通過合成方法生產(chǎn)乙醇的方法是利用不 可再生資源為原料化學(xué)合成的方法，該方法缺點(diǎn)是資源匱乏，污染大。從能源 或環(huán)境問題的觀點(diǎn)來看，使用一種可再生生物資源并通過生物工程方法生產(chǎn)乙 醇的方法是未來乙醇生產(chǎn)發(fā)展的趨勢(shì)。本發(fā)明是利用重組藻類生產(chǎn)乙醇的方法，與使用酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法 相比，乙醇生產(chǎn)速度顯著提高。此外藻類分布的范圍極廣，對(duì)環(huán)境條件要求 不嚴(yán)格，適應(yīng)性較強(qiáng)，在只有極低的營(yíng)養(yǎng)濃度、極微弱的光照強(qiáng)度和相當(dāng) 低的溫度下也能生活。不僅能生長(zhǎng)在江河、溪流、湖泊和海洋，在短暫積 水或潮濕的地方也能生長(zhǎng)。從熱帶到兩極，從積雪的高山到溫?zé)岬娜?從潮濕的地面到不很深的土壤內(nèi)，幾乎到處都有藻類分布。例如，以小球藻為例，小球藻是一種單細(xì)胞真核綠藻，作為生物反應(yīng)器可對(duì)復(fù)雜蛋白進(jìn)行正 確的翻譯后加工，形成有活性的分子。同時(shí)還具備微生物的特點(diǎn)，生長(zhǎng)繁殖迅 速，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本相對(duì)低廉，易于大規(guī)模培養(yǎng)?，F(xiàn)在對(duì)其基因組結(jié) 構(gòu)與功能的研究日益深入，因而小球藻是進(jìn)行基因工程研究的較理想材料。本發(fā)明是把兩個(gè)基因~~^乙醇生物合成酶基因群，即一個(gè)為PDC活性編碼的基因 (能催化糖酵解途徑中的丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醛)和另一個(gè)為ADH活性編碼的基因 (能催化乙醛轉(zhuǎn)化成乙醇)，在允許其表達(dá)的調(diào)節(jié)序列下插入宿主(藻類基因組)，使用這樣的轉(zhuǎn)化體實(shí)現(xiàn)高生產(chǎn)率的乙醇生產(chǎn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在提供一種高效率生產(chǎn)乙醇的方法，利用乙醇生物合成酶基因群，包含PDC和ADH的活性基因的DNA在允許該表達(dá)的調(diào)節(jié) 序列下轉(zhuǎn)型的藻類，例如小球藻。在其一定的培養(yǎng)條件下，這種小球藻沒 有實(shí)質(zhì)性增殖的條件下，體內(nèi)生產(chǎn)乙醇，定期收集含有乙醇的培養(yǎng)液，經(jīng) 加工而生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明將公開一種利用基因工程技術(shù)在藻類中轉(zhuǎn)入PDC和ADH基因(乙 醇生物合成酶基因群)，從而產(chǎn)生一種體內(nèi)生產(chǎn)乙醇的生物辦法。藻類植物是植物界中沒有真正根、莖、葉分化，以光能自養(yǎng)生活，生 殖器官由單細(xì)胞構(gòu)成和無胚胎發(fā)育的一大類種群。以小球藻為例，小球藻 是單細(xì)胞浮游種類，細(xì)胞微小，圓形或略橢圓形，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞內(nèi)有l(wèi) 個(gè)杯形或曲帶形載色體，細(xì)胞老熟時(shí)載色體分裂成數(shù)塊，無蛋白核，只有 蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa Chick.)有蛋白核。無性生殖時(shí)，原 生質(zhì)分裂形成2、 4、 8、 16個(gè)似親孢子，母細(xì)胞壁破裂時(shí)，孢子放出成為新的植物體。小球藻在我國(guó)分布甚廣，生活于含有機(jī)質(zhì)的小河、溝渠、池 塘等水中，在潮濕的土壤上也有分布。 本發(fā)明的實(shí)施方案如下本發(fā)明中可以使用來自各種微生物的、能表達(dá)ADH和PDC活性的基因。 通過基因工程技術(shù)，在PDC和ADH已獲得的前提下，進(jìn)行PDC基因擴(kuò)增(PCR 技術(shù))、體外重組、重組體向寄主細(xì)胞導(dǎo)入、再經(jīng)過重組體的克隆篩選與鑒定， 得到能夠表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)型藻類，如小球藻，重復(fù)以上操作，將ADH基因 導(dǎo)入已能表達(dá)外源基因PDC的小球藻中，經(jīng)篩選與鑒定，得到能同時(shí)表達(dá)外源 基因PDC和ADH的轉(zhuǎn)型小球藻。對(duì)于這兩種基因來說，為了表達(dá)其活性，有必要使其處在一種調(diào)節(jié)序列之 下。盡管不一定要求它們處在一種共同的調(diào)節(jié)序列之下，如它們可以處在各自 獨(dú)立的調(diào)節(jié)序列下，在一些情況下處在不同的質(zhì)粒上并且在一條染色體上的不 同部位。本文中使用的"在一種調(diào)節(jié)序列下"是指一個(gè)意向基因可以通過諸如與啟 動(dòng)子、誘導(dǎo)物、操縱基因、核糖體結(jié)合部位、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)等的協(xié)同作用而自動(dòng) 復(fù)制。按照本發(fā)明轉(zhuǎn)型的宿主微生物是藻類生物，該藻類不同于以上提到的先有 技術(shù)中作為宿主的菌類。本發(fā)明的主要特征之一是，選擇原來沒有從丙酮酸生產(chǎn)乙醇功能的藻類作為主要轉(zhuǎn)型宿主，按照本發(fā)明轉(zhuǎn)型藻類的使用，使我們能在藻類上制備乙醇，這與通過按照以上提到的先有技術(shù)轉(zhuǎn)型的菌類例如大腸埃希氏桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的通用方法成鮮明對(duì)照。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施實(shí)例詳細(xì)說明本發(fā)明，但不應(yīng)視為本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例一藻種培養(yǎng)買回的藻種，配制稀釋的LB培養(yǎng)基，按藻液與培養(yǎng)液1:2的比例擴(kuò)種于 1000 mL的三角燒瓶中。將三角瓶放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制其培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度75.3 80.1mmol/m2s，溫度26°C， pH 6~8。每天攪拌三次，每次1分 鐘，待藻體達(dá)到一定密度后按藻液與培養(yǎng)液1: 4的比例擴(kuò)種于3000ml的三角 燒瓶中，放在溫度較低、光線較弱的地方，人工通入經(jīng)過過濾的空氣進(jìn)行培養(yǎng)， 每3個(gè)星期左右擴(kuò)種1次。擴(kuò)大培養(yǎng)的程序?yàn)? OOOmL三角燒瓶—20 L細(xì) 口玻璃瓶—桶中培養(yǎng)—生產(chǎn)池。 實(shí)施例二 ADH基因克隆到pKYL71穿梭載體將克隆的ADH基因與PET28載體連接，以質(zhì)粒形式存在，簡(jiǎn)稱PET-ADH。 以PET-ADH作為模板，進(jìn)行PCR。為了在PCR中克隆ADH基因，合成下列 引物并使用ADH基因擴(kuò)增引物(a-l) 5'-ccgCTCGAGATGGCTTCTTCAACTTTTTATATTCCT-3，(SEQ 1DN0:1) (b-l) 5'-tgcTCTAGATTAGAAAGCGCTCAGGAAGAGTTCT-3，(SEQ 1DN0:2)弓l物(a國(guó)l)含有XhoI限制位點(diǎn)，弓l物(b-l)含有XbaI限制位點(diǎn)。 PCR (Polymerase Chain Reaction)在下列條件用"DNA熱循環(huán)者"和Tag DNA聚合酶(Takara公司)作為反應(yīng)試劑進(jìn)行的。反應(yīng)物PCR緩沖劑、1.25mMdNTP混合物、模板、引物(上游和下游)、Tag酶、無菌水。將以上成分混合，并使該混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)變性過程 94 °C 60s退火過程 52 °C 60s延伸過程 72 °C 120s由以上過程組成的一個(gè)循環(huán)重復(fù)30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，將以上反應(yīng)混合物lOul進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段大小是否符合ADH片段 大小1.2kb。ADH基因與穿梭質(zhì)粒連接用膠回收試劑盒(Invitrogen公司)回收作為PCR產(chǎn)物的ADH目的片段， 詳細(xì)步驟參考試劑盒內(nèi)的說明書?；厥蘸蟮钠闻cpGEM-T載體連接，其連接 體系為反應(yīng)緩沖劑、pGEM-T載體、PCR產(chǎn)物ADH片段、T4連接酶。反應(yīng) 1小時(shí)后轉(zhuǎn)入4。C連接反應(yīng)16小時(shí)。藍(lán)白斑篩選連接產(chǎn)物，酶切獲得目的片段 ADH，構(gòu)建穿梭載體。將以上連接反應(yīng)產(chǎn)物用氯化媽的方法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)狀態(tài)的Escherichia coli JM109細(xì)胞，涂布到含有0.2MIPTG的固體培養(yǎng)基(10g蛋白胨、5g酵母粉、 5gNaCl、和16g瓊脂溶解于1升雙蒸水)。在該培養(yǎng)基挑取白色陽性菌落擴(kuò)增培 養(yǎng)，16小時(shí)后收集細(xì)胞并利用堿裂解法小量制備質(zhì)粒。然后利用Xho I和Xba I 雙酶切質(zhì)粒并回收ADH目的片段。該片段與同樣經(jīng)過Xho I和Xba I雙酶切處 理的pKYL71載體連接，其連接體系為pKYL71、 ADH、 T4連接酶、無菌水。 連接產(chǎn)物為目的基因ADH與載體連接的質(zhì)粒，簡(jiǎn)稱ADH-載體。 實(shí)施例三PDC基因克隆并連接到穿梭載體將克隆的PDC基因與PET32載體連接，以質(zhì)粒形式存在，簡(jiǎn)稱PET-PDC。 以PET-PDC作為模板，進(jìn)行PCR。為了在PCR中克隆PDC基因，合成下列引物并使用PDC基因擴(kuò)增引物(a誦1) 5，- ccgCTCGAGATGAGTTATACTGTCGGTACCTATT-3 ， (SEQ 1D NO: 1) (b-l) 5，- tgcTCTAGACTAGAGGAGCTTGTTAACAGGCTT-3， (SEQ 1D NO:2)弓l物(a國(guó)l)含有XhoI限制位點(diǎn)，弓l物(b-l)含有XbaI限制位點(diǎn)。 PCR在下列條件用"DNA熱循環(huán)者"和TagDNA聚合酶(Takara公司) 作為反應(yīng)試劑進(jìn)行的。反應(yīng)物PCR緩沖劑、1.25mM dNTP混合物、模板、引物(上游和下游)、Tag酶、無菌水。將以上成分混合，并使該混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)變性過程 94 。C 60s退火過程 52 。C 60s延伸過程 72 °C 120s由以上過程組成的一個(gè)循環(huán)重復(fù)30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，將以上反應(yīng)混合 物10ul進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段大小是否符合PDC片段 大小1.8kb。PDC基因與穿梭質(zhì)粒連接用膠回收試劑盒(Invitrogen公司)回收作為PCR產(chǎn)物的PDC目的片段， 詳細(xì)步驟參考試劑盒內(nèi)的說明書。回收后的片段與pGEM-T載體連接，其連接 體系為反應(yīng)緩沖劑、pGEM-T載體、PCR產(chǎn)PDC片段、T4連接酶。反應(yīng)1 小時(shí)后轉(zhuǎn)入4 。C連接反應(yīng)16小時(shí)。藍(lán)白斑篩選連接產(chǎn)物，酶切獲得目的片段PDC，構(gòu)建穿梭載體將以上連接反應(yīng)產(chǎn)物用氯化鈣的方法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)狀態(tài)的Escherichia coli JM109細(xì)胞，涂布到含有0.2MIPTG的固體培養(yǎng)基(10g蛋白胨、5g酵母粉、 5gNaCl、和16g瓊脂溶解于1升雙蒸水)。在該培養(yǎng)基挑取白色陽性菌落擴(kuò)增培 養(yǎng)，16小時(shí)后收集細(xì)胞并利用堿裂解法小量制備質(zhì)粒。然后利用Xho I和Xba I 雙酶切質(zhì)粒并回收PDC目的片段。該片段與同樣經(jīng)過Xho I和Xba I雙酶切處 理的載體連接，其連接體系為載體、PDC、 T4連接酶、無菌水。該片段與同 樣經(jīng)過酶切處理的基因表達(dá)載體。連接產(chǎn)物為目的基因PDC與載體連接的質(zhì) 粒，簡(jiǎn)稱PDC-載體。實(shí)施例四根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化利用凍融法把以上構(gòu)建好的ADH-pCY載體、PDC-pCY載體分別轉(zhuǎn)入根癌 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于固體培養(yǎng)基上(LB +40 mg/ L利福平+25 mg/ L鏈 霉素+75 mg/ L慶大霉素)，挑取單菌落，在2 mL農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中，28 °C培 養(yǎng)過夜，取1 mL以上培養(yǎng)物，加入50 mL農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中，28 'C培養(yǎng) 至OD, = 1.0，將50 mL農(nóng)桿菌液經(jīng)3500 4000 r/ min離心8 min收集菌 體，用UM1液體培養(yǎng)基重懸，28t:繼續(xù)培養(yǎng)3 4h，至006()() = 0.5。 實(shí)施例五藻的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化株的篩選(篩選方法需細(xì)化、待定)將以上培養(yǎng)好的藻種放入上述農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，在190 r/ min， 28。C搖床 上共培養(yǎng)10 min后，用離心去除多余菌液，用封口膜封好培養(yǎng)皿，25°C，于 暗處共培養(yǎng)約60 h，之后依次用無菌水、含50mg/L抗生素的無菌水和用含500 mg/L抗生素的UM1將農(nóng)桿菌洗掉，放在UM2培養(yǎng)基上，用封口膜封好培養(yǎng) 皿，暗處培養(yǎng)，待藻種生長(zhǎng)到一定密度時(shí)，轉(zhuǎn)至UM3培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，之 后轉(zhuǎn)至配制稀釋的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到藻種轉(zhuǎn)化株，而非轉(zhuǎn)化株則在含有50 mg/L抗生素的培養(yǎng)基中逐漸死亡。 實(shí)施例六藻轉(zhuǎn)化株的乙醇生產(chǎn)篩選成功的藻轉(zhuǎn)化株在發(fā)酵培養(yǎng)基(稀釋的LB培養(yǎng)基)37'C培養(yǎng)24到48小時(shí) (0.023M (NH4)2S04, 、 0.0005M KH2P04 、 0.0005M K2HP04 、 0.0005M MgSO4.7H20、 0.00002M FeS04.7H20、 0.00002M MnS04'nH20、 0.00002MD-生 物素、0.00001M硫胺素鹽酸鹽、0.00002M碳酸鈉、10%葡萄糖)，將代表性反 應(yīng)物進(jìn)行離心分離。然后，對(duì)每一種分離的上清液進(jìn)行氣相色譜分析，檢測(cè)乙 醇濃度。
權(quán)利要求
1、一種乙醇的生產(chǎn)方法，該方法使用了一種含有能表達(dá)丙酮酸脫羧酶活性的基因和一種含有能表達(dá)醇脫氫酶活性的基因，通過基因工程技術(shù)分別導(dǎo)入到藻類基因組中，在體內(nèi)表達(dá)生產(chǎn)乙醇。其特征在于乙醇是在藻類體內(nèi)制備的。
2、 按權(quán)利要求1所述需要一種使藻基因組轉(zhuǎn)型的表達(dá)載體，該基因組在一種允許該表達(dá)的調(diào)節(jié)序列下插入了一種含有一個(gè)能表達(dá)丙酮酸脫羧酶活性的基因和一個(gè)能表達(dá)醇脫氫酶活性的基因的DNA片段。
3、 按權(quán)利要求2中提出的表達(dá)載體，其中，該表達(dá)載體為PDC+pKYL71和ADH+沐YL71。
4、 用權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)型的藻類基因組，乙醇生物合成酶基因群。該藻類基因組是沐YL71-PDC-ADC。
全文摘要
使用重組藻類進(jìn)行體內(nèi)生產(chǎn)乙醇的方法，是一種低投入高乙醇產(chǎn)率的方法。該方法使用了一種含有能表達(dá)丙酮酸脫羧酶(PDC)活性的基因和一種含有能表達(dá)乙醇脫氫酶(ADH)活性的基因，通過基因工程技術(shù)分別導(dǎo)入到藻類基因組中，在藻類體內(nèi)表達(dá)生產(chǎn)乙醇，定期收集含有乙醇的培養(yǎng)液，經(jīng)加工而生產(chǎn)乙醇。該方法乙醇產(chǎn)率高，成本低，無污染。
文檔編號(hào)C12P7/06GK101603049SQ20091014289
公開日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者波 余, 黃赤夫 申請(qǐng)人:湖北匯特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司