專利名稱：：對核苷類似物具有改變的敏感性的病毒變體及其應用的制作方法對核苷類似物具有改變的敏感性的病毒變體及其應用本申請是申請日為2003年2月5日、發(fā)明名稱為"對核苷類似物具有改變的敏感性的病毒變體及其應用"、申請?zhí)枮?03805162.1"的分案申請。
背景技術：
：發(fā)明領域本發(fā)明通常涉及病毒變體，該病毒變體對特定的藥物表現(xiàn)下降的敏感性和/或與免疫劑具有降低的相互作用。更具體地，本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒(HBV)變體，該乙型肝炎病毒變體對核苷性類似物表現(xiàn)全部或部分抗性和/或與病毒表面組分的抗體具有降低的相互作用，包括對這些抗體的下降的敏感性。本發(fā)明進一步包含用于檢測這種病毒變體的測定，這種測定在監(jiān)控抗病毒治療方案上以及在開發(fā)針對病毒尤其是HBV變體的新的或改進的疫苗是有價值的。本發(fā)明也包含利用病毒變體篩選能夠抑制病毒感染、復制和/或釋放的藥物?，F(xiàn)有技術詳述術在任何國家構成了常識的組成部分的承認或任何形式的暗示。在氨基酸序列中的特異突變此處表示為'XaainXaa2，，Xaa!是突變前的原始的氨基酸殘基，n是殘基號以及Xaa2是突變的氨基酸。縮寫'Xaa，可以是三字母或單字母(即，'X，)編碼。乙型肝炎病毒DNA聚合酶的氨基酸殘基這樣編號，在TyrMetAspAsp(YMDD)基序中的甲硫氨酸殘基是204號殘基(Stuyver等，H印tf^/o^;":751-757，2001)。乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸殘基根據(jù)Norder等(/Gefi.K/o/.74:341-1348,1993)編號。術語核苦類似物已經被用于既指核苷酸又指核苷類似物。乙型肝炎病毒(HBV)會引起衰弱性疾病癥狀并且導致急性肝衰竭。HBV是DNA病毒，通過RNA中間產物復制并且在復制策略中采用逆轉錄(Summers和Mason,W29:403-415,1982)。含有部分雙鏈DNA結構的HBV基因組性質復雜，部分雙鏈DNA結構中含有編碼表面、核心、聚合酶和X基因的重疊的開放閱讀框。HBV基因組的復雜性質在圖1中表現(xiàn)。聚合酶由四個功能區(qū)組成，末端蛋白(TP)、間隔區(qū)、逆轉錄酶(rt)和核酶(RNAse)。HBV聚合酶基因和包膜基因重疊，在聚合酶催化結構域的突變會影響包膜蛋白的氨基酸序列，并且反之亦然。尤其是，在HBsAg內發(fā)現(xiàn)的并且位于氨基酸99和169之間的稱為'a，決定簇的HBV中和結構域的基因序列，實際上和病毒聚合酶蛋白的主要催化區(qū)尤其是A和B結構域重疊。HBVDNA聚合酶的存在導致了核苷類似物能夠作為有效的抗病毒藥物的前題。目前正在試驗的核苷類似物的實例是噴昔洛韋(penciclovir)和它的口月艮形式(FAM)[VereHodge,爿w"v/m/C^e/wC7re挑tf^^r4:67-84,1993;Boyd等,JriviV*fl/C^e附C^e附o^Aer.32:358-363,1987;Kruger等，i^/m^/ogv22:219A,1994;Main等,丄Wra;fT印fl"船3:211-215，1996]拉米夫定(Lamivudine)[(畫)國/3-2，-脫氧-3，誦硫代胞脊；(3TC或LMV)Severini等，^wri附/cro6i"/4gewteCTie/wW/i"M:1430-1435，1995;Dienstag等，iVew/B3:1657-1661，1995。已經進入臨床試驗的新的核苷類似物包括pyriamidines恩曲他濱(Emtricitabine)，(-)-/5丄-2，-3，-雙脫氧-5-氟-3，國硫代胞苷(FTC)，3TC的5-氟衍生物，和克力夫定(Clevudine)(1-(2-氟-5-甲基-i(J-L-阿拉伯呋喃糖基)尿苷；L-FMAU)，胸腺嘧啶類似物。正如3TC，這些是具有非天然"L"構型的嘧啶衍生物。一些嘌呤衍生物也進入了臨床試驗；他們包括恩替卡韋(Entecavir)(BMS-200，475;ETV)，環(huán)脫氧鳥苷類似物、二氨基噤呤二氧戊環(huán)(DAPD)、二氧戊環(huán)鳥嘌呤((-)-j3-D-2-二氨基嘌呤二氧戊環(huán)；DXG)的口服前藥，以及阿德福韋酯(Adefovirdipivoxil)，無環(huán)脫氧腺苷一磷酸核苷類似物阿德福韋(Adifovir)(9-磷酸-甲氧基乙基I腺噪呤;PMEA)的口服前藥。這些藥物對抑制HBVDNA合成非常有效，但在長期抗病毒的化12學治療中有了HBV抗性突變體出現(xiàn)的趨勢。在長期的LMV治療的患者的聚合酶內的rt結構域中篩選關鍵的抗性突變rtM204I/V+/-rtL180M。用于聚合酶突變的命名是依據(jù)Stuyver等，2001，swp所提出的。只有LMV被批準用于抗慢性HBV感染。拉米夫定(Lamivudine)是HBV復制的特別有效的抑制劑，并且通過抑制病毒DNA合成降低原位肝移植(OLT)后的慢性感染患者血清的HBVDNA滴度。LMV單一治療似乎不可能在較長期控制HBV復制。這是因為HBV的抗LMV林的出現(xiàn)在單一治療期間幾乎是不可避免的，并且就其本身而論單一治療通常不足以導致病毒清除。ETV也是HBV復制的有效的抑制劑。ETV是可口服的具有抗嗜肝DNA病毒和皰療病毒活力的環(huán)戊基脫氧鳥苷類似物。在基于酶和細胞測定的臨床前研究表明ETV是非常有效的HBV抑制劑(Innaimo等，爿w"挑/cn^^//^eWC7^附"1441-1448，1997;Siefer等，顛/附/m嵐々ewfCA柳2;3200-3208,1998;Yamanaka等，爿rtri附/c^Wo/v4ge/^C7^附43:1卯畫193，1999)。ETV也證明了在慢性感染土撥鼠肝炎中抗WHV的功效(Colonno等，JID184:1236-452001;Genovesi等，爿wrt附ic6,W^ge",C7iew":3209-3217，1998)。一個四個星期的劑量逐步上升的試驗表明ETV是高度耐受的，并且在試驗的最高劑量(1mg/天)導致病毒血癥平均降低2.5log10。據(jù)報道LMV抗性突變在體外具有ETV交叉抗性，盡管恩替卡韋仍然能夠在更高劑量時抑制病毒復制；鑒于ETV不是L型核苷，這些數(shù)據(jù)有些令人吃驚的。ETV已經被成功用于治療抗LMV的HBV突變的患者。沒有特異的ETV抗性突變體被描述。核苷類似物治療可以作為單一治療或聯(lián)合治療實施，聯(lián)合治療是指給予兩種或更多種類似物。核苷類似物也可以和其它抗病毒試劑(如干擾素或乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG))聯(lián)合給予。這里有鑒定抗核苷和/或抗體的HBV變體的必要。快速鑒定可以導致正在使用的治療方案的改變。發(fā)明概述表l定義的縮寫被用于本說明書。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>整個說明書中，除非上下文另外要求，單詞"包含"，或其變化形式應被理解為意味著所述元素或其整體或元素組或其整體的包括，而不是排除任何其它元素或其整體或元素組或其整體。核苷酸和氨基酸序列是通過序列標識符號(SEQIDNO:)表示。SEQIDNO:在數(shù)字上相當于序列標識符<400>1，<400>2等。序列列表將在權利要求書后提供。核苷酸和氨基酸突變的位置使用來自B、C或F基因型的命名法確定，此處在DNA聚合酶的YMDD基序中甲硫氨酸位置指定為550(參見澳大利亞專利第734831號)。本說明書中給出的核苷酸和氨基酸位置基于新的的命名法，此處YMDD中的甲硫氨酸的位置是204并且稱為rtM204，此處rt是逆轉錄酶的縮寫。根據(jù)本發(fā)明，HBV抗性變體在下面的患者中鑒定，一個既用LMV又用ETV治療的慢性乙型肝炎的患者(患者A)和一個用ETV治療的肝臟移植患者(患者B)，該患者以前用過包括LMV在內的許多核苷藥物治療。在聯(lián)合治療中，根據(jù)本發(fā)明，在LMV和ETV治療后鑒定了具有在HBVDNA聚合酶基因內突變的HBV抗性變體，突變降低了HBV對這些核苷類似物的敏感性。在表面抗原內也發(fā)生相應的突變。這些HBV變體的鑒定對于開發(fā)用來監(jiān)控LMV和/或ETV抗性和/或其它核苷類似物治療方案抗性的檢驗方法和篩選作為替代治療藥物的有價值的藥物是重要的。從患者A分離的HBV的關鍵功能結構域中檢測到的突變，即rtl69T+rtV173L+rtL180M+rtM204V，在功能分析中證明對ETV具有下降的敏感性。這種HBV變體的檢測在治療方案的管理上尤其重要，包括治療HBV感染的合適的藥物的選擇。本發(fā)明這個方面的方法部分地依據(jù)監(jiān)控在核苷類似物存在下具有升高的HBV載量的受試者的發(fā)展。臨床醫(yī)生于是能夠對現(xiàn)行的治療方案進行修改或相應地選擇合適的治療方案。因而本發(fā)明的一個方面是涉及分離的HBV變體，該變體在編碼DNA聚合酶的基因中包含核苷酸突變，導致DNA聚合酶的至少一個氨基酸添加、置換和/或缺失，并且對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性。優(yōu)選地，DNA聚合酶對ETV或和ETV表現(xiàn)下降的敏感性。變異的HBV在基因組內重疊的開放閱讀框中在由HBVDNA聚合酶的一個或多個F和A-E結構域定義的區(qū)域內包含突變。本發(fā)明進一步涉及用于確定HBV對ETV和/或LMV或可選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性的潛力的方法，通過從HBV分離DNA或相應的mRNA并且在編碼HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中篩選突變，該突變導致在所述DNA聚合酶的任何一個或多個F和A-E的結構域中或最接近那里的區(qū)域中至少一個氨基酸置換、缺失和/或添加，并且該突變和對ETV和/或LMV抗性或下降的敏感性相關。這種突變的存在是對所述的恩替卡韋和/或LMV可能存在抗性的指示。優(yōu)選地，HBV變體對ETV、或ETV和LMV二者表現(xiàn)下降的敏感性。本發(fā)明也提供一種組合物，該組合物包括抗ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物的變異的HBV或來自變異的HBV的HBV表面抗原或它的重組或衍生形式或它的化學等價物和一種或多種藥物可接受載體和/或稀釋劑。本發(fā)明的另外一個方面提供前述組合物或在編碼DNA聚合酶的基因中包含核苷酸突變的變異的HBV在生產用于治療和/或預防乙型肝炎病毒感染的藥物中的應用，該突變導致DNA聚合酶的至少一個氨基酸添加、置換和/或缺失，并且對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物的下降的敏感性。本發(fā)明也涉及用于確定HBV林是否對核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性的方法，通過從HBV中分離DNA或相應的mRNA，并且在編碼DNA聚合酶的拔蕃隨到.電篩選交復，其中在間隔區(qū)和r寬E下齊的突變間隔區(qū)L971、間隔區(qū)K115R、間隔區(qū)H116L、間隔區(qū)L128F、間隔區(qū)S137G、間隔區(qū)R139G、間隔區(qū)F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其組合或等同的一個或多個其它突變的存在是對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物具有下降的敏感性的變體的指示。本方法也可以通過在編碼DNA聚合酶的核苷酸序列中篩選突變而實施，其中下面的在rt區(qū)的B或C結構域中的突變rtll69T，rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021、r総04V或其組合或等同的一個或多個其它突變的存在是對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物具有下降的敏感性的變體的指示。應該注意突變體rtV173L、rtL180M和rtM204V分別相應于澳大利亞專利第734831號(釆用初期的命名體系)的突變體V519L、L526M和M550V。深入的方法包括在編碼包膜基因的核苷酸序列中篩選突變，其中在PreSl、PreS2和S基因中的下面的突變(括號內表明在重疊的逆轉錄酶區(qū)的變化)PreSlN114D、PreSlT115S、PreS2F22L、PreS2V39A、PreS2P52L、sL89V、sT118A、sF161L(=rtI169T)、sE164D(=rtV173L)、sI195M(=rtM204V)、sI208T、PreSlE86Q、PreSlN91K、PreS2P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F或其組合或等同的一個或多個其它突變的存在是對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物具有下降的敏感性的變體的指示。優(yōu)選地，變體是以分離的形式存在，以致它們從天然存在的體液分離后經過了至少一個純化步驟。或者，變體可以在分離的體液中或以DNA形式維持。本發(fā)明也涉及包含來自變異的HBV的基因組或其部分基因組的有感染力的分子克隆。在細胞、細胞裂解物、培養(yǎng)上清液和體液中的HBV或它的組分的檢測可以通過任何〗更利的方法，包括任何基于核酸的檢測方法，例如，通過核酸雜交技術或通過一個或多個聚合酶鏈式反應(PCRs)。術語"體液"包括得自血液、淋巴、組織或器官系統(tǒng)的任何流體，包括血清，全血、活檢組織和活檢組織液、器官移植體和器官懸液，如肝懸液。本發(fā)明進一步包括基于核酸的檢測方法的不同檢測形式的使用，包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、單鏈構像多態(tài)性(SSCP)、擴增和錯配檢測(AMD)、散布重復序列聚合酶鏈式反應(IRS-PCR)、反向聚合酶鏈式反應(iPCR)和逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)等。在鑒定特異的核苷酸或核苷酸序列上反向雜交是尤其有用的技術。其它檢測形式包括Northern印跡、Southern印跡、PCR測序、抗體方法，如酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)、Western印跡和免疫組織化學。一個尤其有用的分析包括固定化寡核苷酸或寡肽介導的檢測系統(tǒng)所要求的試劑和組分。本發(fā)明的另外一個方面涉及包含具有下列特征的表面抗原的HBV變體，該表面抗原和來自參照或野生型HBV的表面抗原相比具有含單一或多個氨基酸置換、添加和/或缺失或截短的氨基酸序列，并且其中相對于所述的HBV變體，參照或野生型表面抗原產生的抗體表現(xiàn)了改變的免疫學性質。一個改變的免疫學性質包括降低的中和HBV的能力。更具體地，和治療前的HBV相比，變異的HBV的表面抗原表現(xiàn)改變的免疫學性質，此處變異的HBV通過HBVDNA聚合酶的核苷類似物選擇。本發(fā)明的這個方面的變異的HBV也可以包含這樣的核苷酸序列，和治療前的HBV相比，該核苷酸序列包括一個或多個核苷酸置換、添加和/或缺失。本發(fā)明擴展到相應于變異的HBV的分離的HBsAg或它的重組形式或它的衍生物或化學的等價物。通常，HBsAg或它的重組或衍生形式或它的化學等價物包括這樣的氨基酸序列，和來自參照HBV的HBsAg相比，含有單一或多個氨基酸置換、添加和/或缺失或截短的氨基酸序列，并且其中相對于帶有所述的變異的HBsAg的HBV，針對參照HBV的抗體表現(xiàn)改變的免疫學性質。在一個實施方案中，改變的免疫學性質包括降低的中和變異的HBV的能力。本發(fā)明部分地依據(jù)HBV變體的鑒定和分離，該HBV變體具有多個突變并且表現(xiàn)選自下面的兩個或多個性質相對于野生型HBV，對一種或多種核苷類似物減少的或下降的敏感性；乙型肝炎e抗原的下降的水平和/或功能活力；或下降的、取消的或受損的免疫相互作用。因此，具有這些突變模式的HBV變體的鑒定是重要的，尤其對于開發(fā)用于檢測HBV變體的檢驗和用于篩選對治療和/或預防由那些變體或/和其它HBV分離林引起的感染的有用藥物的檢驗，以及開發(fā)控制HBV感染的替代治療方案。相應地，本發(fā)明的一個方面涉及包含和至少兩個選自下面的性質相關的多種核苷酸突變的分離的HBV變體(a)對一種或多種核苷類似物的抗性，(b)乙型肝炎e抗原下降的水平和/或功能活力，或(c)下降的、取消的或受損的免疫相互作用。本發(fā)明的另外一個方面涉及包含多個核苷酸突變的分離的HBV18變體，這些核苷酸的突變和下面的性質相關(a)對一種或多種核苷類似物的抗性，(b)乙型肝炎e抗原下降的水平和/或功能活力，或(c)下降的、取消的或受損的免疫相互作用相關。本發(fā)明的另外一個方面提供了包含多種選自下面的兩個或多個核苷酸突變的分離的HBV變體(a)在編碼DNA聚合酶的基因中的核苷酸突變，導致對所述的DNA聚合酶的至少一個氨基酸添加、置換和/或缺失，其中所述的變體對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性，(b)編碼乙型肝炎e抗原的基因或所述基因的轉錄控制元件中的核苷酸突變，其中所述的突變導致所述的乙型肝炎e抗原的下降的水平和/或功能活力，或(c)編碼乙型肝炎多肽的基因中的核普酸突變，導致對所述的多肽的至少一個氨基酸的添加、置換和/或缺失，降低、取消或損害了它的免疫相互作用。本發(fā)明的另外一個涉及設想用于檢測對HBV表現(xiàn)抑制活性的藥物的方法，通過產生一個基因構建體，該構建體包括來自包含于質粒載體中的HBV的復制有效量的基因組，然后用所述的構建體轉染所述的細胞，在轉染前、期間和/或之后，用待檢測的藥物接觸細胞，在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所述條件為如果對所述的藥物有抗性，則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；并且對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或裝配和/或釋放。在優(yōu)選的實施方案中，質粒載體是桿狀病毒栽體并且方法包括產生基因構建體，該構建體包括來自HBV的復制有效量的基因組，其包含在或融合于對感染細胞有效量的桿狀病毒基因組，并且用所述的構建體感染所述的細胞，在感染前、期間和/或之后，用待檢測的藥物接觸細胞，在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所迷條件為如果對所述的藥物有抗性，則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒然后對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或裝配和/或釋放。在可供選擇的實施方案中，該方法包括產生連續(xù)細胞系，包含復制有效量的HBV基因組的有感染力的拷貝，以致所述的有感染力的HBV基因組穩(wěn)定整合到所述的連續(xù)細胞系中，比如但不局限于2.2.15或AD,用待檢測的藥物接觸細胞，在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所述條件為如果對所述的藥物有抗性，則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒然后對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或裝配和/或釋放。在可供選擇的實施方案中，本發(fā)明也涉及在體外聚合酶檢驗中用于檢測對HBV聚合酶表現(xiàn)抑制活性的藥物的方法。使用已被確認的檢驗方法可以測定HBV聚合酶活性(Gaillard等，^rari附,cw6爿^wtoC&歸紐.W六1005-1013，2002;Xiong等，i/一o一.2W":1669-73，1998)。HBV聚合酶可以是野生型或參照HBV聚合酶或突變的HBV聚合酶。和這些方法相結合，質粒栽體可以包括編碼部分或全部的其它病毒載體的基因，例如桿狀病毒載體或腺病毒載體(參見Ren和Nassal，/.75〔":1104-1116，2001)。病毒變體的鑒定使得能夠產生包括特定的重組病毒組分(例如聚合酶或編碼L、M、S蛋白的包膜基因PreSl、PreS2、S)的疫苗以及包括缺陷的HBV變體的治療疫苗?？梢圆捎煤侠淼乃幬镌O計來鑒定或產生治療分子，該治療分子能夠和聚合酶或編碼L、M、S蛋白的包膜基因PreSl、PreS2、S或HBV的其它組分相互作用。這樣的藥物也可能具有診斷潛力。貫穿本說明書使用的序列標識符的總結在表2中提供。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>附圖簡介圖1是顯示部分雙鏈DNA的HBV基因組的圖示，表明編碼表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X基因的重疊的開放閱讀框。圖2患者A的臨床病歷的圖示，包括治療方案、HBVDNA病毒載量和丙氨酸轉氨酶(ALT)水平。圖3是恩替卡韋的化學結構的圖示。圖4是在LMV單一治療或LMV/恩替卡韋聯(lián)合治療期間來自患者A序貫樣本中編碼聚合酶基因催化區(qū)的HBV核苷酸序列比較示意圖。圖5是在LMV單一治療或LMV/恩替卡韋聯(lián)合治療期間來自患者A序貫樣本中聚合酶基因催化區(qū)的推導的氨基酸序列比較示意圖。圖6是在LMV單一治療或LMV/恩替卡韋聯(lián)合治療期間來自患者A序貫樣本中包膜基因的推導的氨基酸序列比較示意圖。圖7是確定HBV變體潛能值(PA)的計算機系統(tǒng)的圖示。圖8是在LMV單一治療(ETV前)期間和ETV治療時來自患者B序貫樣本中編碼聚合酶基因催化區(qū)的HBV核苷酸序列比較示意圖。圖9是在LMV單一治療(ETV前)期間和ETV治療時來自患者B序貫樣本中聚合酶基因催化區(qū)的推導的氨基酸序列比較示意圖。圖10是在LMV單一治療(ETV前)期間和ETV治療時來自患者B序貫樣本中包膜基因的推導的氨基酸序列比較示意圖。圖11與沒有藥物對照的野生型和編碼rtll69T+rtV173L+rtL180M+rtM204M突變的HBV相應的由定量PCR檢測的HBVDNA復制中間產物圖示。優(yōu)選實施方案詳述本發(fā)明部分地依據(jù)在用ETV或LMV或ETV和LMV和可選的其它核苷類似物對患者治療后對核苷類似物具有抗性的HBV變體的鑒定和分離。尤其是，ETV、ETV和LMV治療的患者產生對ETV和/或LMV表現(xiàn)減少的或下降的敏感性的HBV變體。此處關于ETV和/或LMV的敏感性相關的"減少"或"下降"包括對核苷類似物的完全的或相當大的抗性以及部分抗性，并且包括在核苷類似物存在下比野生型更高的復制速率或復制效率(產生表型)。在一方面，這可以通過22病毒栽量升高到和治療前相似或更高的水平便捷地測定。相應地，本發(fā)明的一個方面是針對分離的HBV變體，其中所述的變體在編碼DNA聚合酶的基因中包括核苷酸突變，導致所述的DNA聚合酶的至少一個氨基酸的添加、置換和/或缺失，并且其中所述的變體對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性。優(yōu)選地，降低的敏感性關于ETV、或ETV和LMV。除了編碼DNA聚合酶的基因中的突變，由于HBV基因組的重疊性質(圖1)，相應的突變也會發(fā)生在編碼表面抗原(HBsAg)的基因中，導致和免疫試劑(例如針對HBsAg的抗體和免疫細胞)降低的相互作用。病毒表面組分的免疫試劑相互作用的降低通常包括識別或基本上識別病毒表面組分的免疫記憶的缺失。本發(fā)明因此擴展到對ETV和/或LMV表現(xiàn)下降的敏感性和針對HBsAg的免疫試劑表現(xiàn)降低的相互作用的HBV變體，其中變體在ETV和/或LMV聯(lián)合或序貫治療后凈皮篩選。在這方面術語"序貫"意思是ETV后是LMV或LMV后是ETV或每次的ETV和LMV或LMV和ETV的多次序貫給予。病毒變體因而可以只在DNA聚合酶或DNA聚合酶和HBsAg二者中帶有突變。術語"突變"應該在最廣背景下理解并且包括多個突變。本發(fā)明擴展到HBVDNA聚合酶的任一結構域并且尤其是F和A-E區(qū)域的突變，只要所述的突變導致對LMV和/或ETV下降的敏感性。HBVDNA聚合酶的F區(qū)由下式I[SEQIDNO:lj中所示的氨基酸序列確定。式IL，BhB2，D,W，G，P,C,B3，B4,H，G,B5，H，B6，I,R，B7,P,R,T，P,B8,KV，B9,G,G,V，F(xiàn),L,V，D，&N,P，H,N,T，B10，E，S，B"，L，B12，V，D，F(xiàn)，S，Q，F(xiàn)，S，R,G,B13,B14，B15，V,S,W，P，KF，V,P,N,L,B16，S，L，T，N,L,L,S*其中是L或R或IB2是E或DB3是T或D或A或N或YB4是E或DB5是E或K或QB6是H或R或NB7是I或TB8是A或SB9是T或RBio是A或T或SBu是R或TB12是V或GB13是S或I或T或N或VBl4是T或S或H或YB15是R或H或K或QBi6是Q或P并且其中S4皮指定為氨基酸74。在本說明書中，由A-E結構域確定的DNA聚合酶的保守區(qū)是尤其相關的。區(qū)域A到E由下式II[SEQIDNO:2j所示的氨基酸序列確定(并且在澳大利亞專利第734831號中式IISZ,LSWLSLDVSAAFYHZ2PLHPAAMPHLLZ3GSSGLZ4RYVARLSSZ5SZ6Z7XNZ8QZ9Z10XXXZuLHZ12Z13CSRZ14LYVSLZl5LLYZi6TZnGZ18KLHLZi9Z20HPIZ2iLGFRKZ22PMGZ23GLSPFLLAQFTSAIZ24Z25Z26Z27Z28RAFZ29HCZ30Z3iFZ32YM*DDZ33VLGAZ34Z35Z36Z37HZ38EZ39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z461:LZ47Z48GIHLNPZ49KTKRWGYSLNFMGYZ50IG其中X是任意氨基酸；Zi是N或D;Zz是I或P;Zs是I或V;Z4是S或D;Zs是T或N;Z6是R或N;Z7是N或I;Zs是N或Y或H;Z9是H或Y;Zk)是G或R;Zu是D或N;Zu是D或N;Zu是S或Y;Z"是N或Q;Z^是L或M;Zw是K或Q;Zn是Y或F;Z^是R或W;Zw是Y或L;Z2。是S或A;Z21是I或V;Zn是I或L;Z23是V或G;Z24是C或L.，乙25是A或S;Zm是V或M;Z27是V或T;Z28是R或C;Zm是L或V;Zm是A或V;Z32是S或A;Z33是V或L或M;Zw是K或R;Zm是S或T;Z36是V或G;Zw是Q或E;Z38是L或S或R;Z39是S或F;Zm是F或Y;Z"是T或A;Zm是A或S;Z"是V或I;Z44是T或C;Z45是N或S;Z"是F或V;Z"是L或V;Z"是N或Q;Zso是V或I;和]VP是氨基酸204;并且其中第一個S指定為氨基酸75。優(yōu)選地，突變導致HBVDNA聚合酶的《壬何一個或多個F和A-E結構域或最接近那里的區(qū)域內氨基酸序列改變。本發(fā)明的另外一個方面提供在基因組的重疊開放閱讀框內包含突變的HBV變體，其中所述的突變在由HBVDNA聚合酶的一個或多個F和A-E結構域確定的區(qū)域內，并且所述的變體對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性。在相關的實施方案中，提供了在編碼DNA聚合酶的核苷酸序列內包含突變的HBV變體，該突變導致了在所述的DNA聚合酶中式I[SEQIDNO:l和/或HSEQIDNO:2所示的一個或多個氨基酸的氨基酸的添加、置換和/或缺失式IL,BhB2，D,W,G,P，C'B3,B4，H,G,B5,H,B6,I，B7,P,R,T,P,B8,R，V,B9,G,G,V，F(xiàn)，L，V，D,K,N，P,H，N，T,B0，E，S，Bn，L,B12,V，D，F(xiàn)，S,Q，F(xiàn)，S，G,B13,B14,B15，V，S，W，P，K,F，A,V，P,N，L，B16,S'L,T，N,L,L，S*其中Bi是L或R或IB2是E或DB3是T或D或A或N或YB4是E或DB5是E或K或QB6是H或R或NB7是I或TB8是A或SB9是T或RBio是A或T或SBu是R或TB12是V或GB13是S或I或T或N或V是T或S或H或YB15是R或H或K或QBi6是Q或P以及式IISZtLSWLSLDVSAAFYHZ2PLHPAAMPHLLZ3GSSGLZ4RYVARLSSZ5SZ6Z7XNZ8QZ9Z10XXXZULHZ12Z13CSRZ14LYVSLZ15LLYZ16TZ17GZ18KLHLZ19Z20HPIZ21LGFRKZ22PMGZ23GLSPFLLAQFTSAIZ24Z25Z26Z27Z28RAFZ29HCZ30Z31FZ32YM*DDZ33VLGAZ34Z35Z36Z37HZ38EZ39LZ4oZ4iZ42Z43Z44Z45Z46LLZ47Z48GIHLNPZ49KTKRWGYSLNFMGYZ50IG其中X是任意氨基酸；Z！是N或D;Z2是I或P;Z3是I或V;Z4是S或D;Zs是T或N;Z6是R或N;Z7是N或I;Zs是N或Y或H;Z9是H或Y;Z^是G或R;Zn是D或N;Z^是D或N;Zu是S或Y;Z"是N或Q;Z^是L或M;Zw是K或Q;Zn是Y或F;Zw是R或W;乙19是Y或L;Z2。是S或A;Z21是I或V;Z23是V或G;Zm是C或L;Zm是A或S;Z26是V或M;Zn是V或T;Z^是R或C;Zm是F或P;Z3。是L或V;Z31是A或V;Zh是S或A;Z33是V或L或M;Z34是K或R;Z^是S或T;Z^是V或G;Z;7是Q或E;Z^是L或S或R;Z39是S或F;Zm是F或Y;Z41是T或A;Z"是A或S;Z43是V或I;Z"是T或C;Z"是N或S;Zm是F或V;Z化是L或V;Z"是N或Q;Zso是V或I;和1VP是氨基酸204;并且其中在式I中的S4皮指定為氨基酸74，在式II中的第一個S被指定為氨基酸75;并且其中所述的變體對ETV和/或LTV和可選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性。優(yōu)選地，下降的敏感性是針對ETV或LMV和/或ETV二者。本發(fā)明的另外優(yōu)選方面涉及在編碼HBsAg的核苷酸序列內包含突變的HBV變體，該突變導致在所述的HBsAg中相應于式I和II所示的氨基酸序列的區(qū)域內氨基酸的添加、置換和/或缺失，其中所述的變體對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性。更具體地，本發(fā)明提供包含這樣表面抗原的HBV變體，該表面抗原和來自參照或野生型HBV的表面抗原相比具有含單一或多個氨基酸置換、添加和/或缺失或截短的氨基酸序列，并且其中針對參照或野生型表面抗原的抗體表現(xiàn)了下降的中和所述HBV變體的能力，所述的變體是在聯(lián)合或序貫治療中通過使受試者接觸ETV和/或LMV而篩選。術語"聯(lián)合治療"是指ETV和LMV二者在同一組合物中共同給予或在不同組合物中同時給予。術語"序貫治療，，意思是指兩種藥物在幾秒、幾分鐘、幾小時、幾天或幾周內以任一順序或交替給予。序貫治療也包括用或者ETV或者LMV完成治療過程，然后用另外的ETV或LMV完成另一治療過禾呈。相應地，本發(fā)明的另外一方面涉及包含這樣的表面抗原的HBV變體，該表面抗原和治療前的HBV相比具有含單一或多個氨基酸置換、添加和/或缺失或截短的氨基酸序列，并且其中和治療前的HBV相比，變異的HBV的表面抗原表現(xiàn)了改變的免疫學性質，此處所述的變異的HBV通過HBVDNA聚合酶的核苷類似物選擇，所述的變體是在聯(lián)合或序貫治療中通過使受試者接觸ETV和/或LMV而篩選。在相關的實施方案中，本發(fā)明提供包含這樣的核苷酸序列的HBV變體，該核苷酸序列和治療前的HBV相比，包含一個或多個核苷酸置換、添加和/或缺失，并且和治療前HBV相比，HBV變體含有表現(xiàn)改變的免疫學性質的表面抗原，所述的變體是在聯(lián)合或序貫治療中通過使受試者接觸ETV和/或LMV而篩選。優(yōu)選地，變體是以分離的形式存在，以致它們從天然存在的體液分離后經過了至少一個純化步驟?；蛘撸凅w可以在分離的體液中或以DNA形式維持。本發(fā)明也涉及了包含來自變異的HBV的基因組或其部分基因組的有感染力的分子克隆。而且，本發(fā)明提供了來自變異的HBV的分離組分，比如但不局限于分離的HBsAg。相應地，本發(fā)明提供分離的HBsAg或它的重組形式或它的衍生物或化學的等價物，來自變異的HBV的所述的HBsAg是在聯(lián)合或序貫治療中通過使受試者接觸ETV和/或LMV而篩選。更具體地，本發(fā)明的另外一個方面涉及分離的變異的HBsAg或它的重組的或衍生的形式或它的化學等價物，其中和來自參照HBV的HBsAg相比，所述的HBsAg或它的重組的或^f生的形式或它的化學等價物表現(xiàn)改變的免疫學性質，來自變異的HBV的所述的HBsAg是在聯(lián)合或序貫治療中通過使受試者接觸ETV和/或LMV而篩選。甚至更具體地，本發(fā)明提供了分離的變體HBsAg或它的重組的或衍生的形式或它的化學等價物，和來自參照HBV的HBsAg相比，其中所述的HBsAg或它的重組的或衍生的形式或它的化學等價物包括具有單一或多個氨基酸置換、添加和/或缺失或截短的氨基酸序列，并且其中針對參照HBV的中和抗體對帶有所述的變異的HBsAg的HBV具有降低的或不具有中和活力，來自變異的HBV的所述的HBsAg是在聯(lián)合或序貫治療中通過使受試者接觸ETV和/或LMV而篩選。在HBVDNA聚合酶中的優(yōu)選的突變包括選自在ETV和/或LMV治療后HBV復發(fā)的患者的變體。優(yōu)選地，治療包括在聯(lián)合或序貫治療中ETV或ETV和/或LMV二者。核苷類似物的治療是針對移植過程(例如骨髓移植(BMT)或OLT)或在診斷為肝炎的患者的治療后進行。在變體篩選后，高于治療前的水平的病毒載量是可以獲得的。在HBVDNA聚合酶中的優(yōu)選的突變包括一個或多個的間隔區(qū)L97I、間隔區(qū)K115R、間隔區(qū)H116L、間隔區(qū)L128F、間隔區(qū)S137G、間隔區(qū)R139G、間隔區(qū)F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其組合或等同的一個或多個其它突變，這是對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物具有降低的敏感性的變體的指示。應該注意氨基酸位置的命名系統(tǒng)基于在YMDD基序中甲硫氨酸殘基被指定為編碼rtM204。這個編號體系和澳大利亞專利第734831號中的不同，在澳大利亞專利第734831號中聚合酶基因內的YMDD基序中的甲硫氨酸殘基被指定為編碼550。在這點上，rtV173L、rtL180M和rtM204V分別相應于澳大利亞專利第734831號的V519L、L526M和M550V。術語"間隔區(qū)"的意思是被指定在末端蛋白和逆轉錄酶這兩個功能區(qū)之間的區(qū)域。它為功能區(qū)提供了正確折疊并且沒有其它特定功能賦予這個區(qū)域。相應的突變也可能發(fā)生在包膜基因中，例如在一個或多個的PreSl，PreS2和HBsAg中。具體的突變如下PreSlN114D、PreSlT115S、PreS2F22L、PreS2V39A、PreS2P52L、sL89V、sT118A、sl61L、sE164D、sI195M、sI208TPreSlE86Q、PreSlN91K、PreS2P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F或其組合或等同的一個或多個突變，這是對ETV和/或LMV和可選的其它核普類似物具有降低的敏感性的變體的指示。在編碼HBsAg的基因中sF161L、sE164D或sI195M突變也分別導致在聚合酶基因rtll69T、rtV173L或rtM204V的突變。其它相應的突變可能在rt內發(fā)生，如間隔區(qū)L971、間隔區(qū)K115R、間隔區(qū)H116L、間隔區(qū)L128F、間隔區(qū)S137G、間隔區(qū)R139G、間隔區(qū)F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、r鏡04V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其組合或等同的一個或多個其它突變，這是對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物具有下降的敏感性的變體的指示。本發(fā)明的變體的鑒定允許產生一系列的檢驗來檢測這樣的變體。這種變體的檢測在鑒定抗性變體是重要的，以確定合適的化學治療形式和/或監(jiān)控疫苗方案或開發(fā)新的或改良的疫苗制劑。的其它核苷類似物表現(xiàn)降低的敏感性的潛力的方法，;述的方il括從所述的HBV分離DNA或相應的mRNA，并且在編碼HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中篩選突變，該突變導致在所述DNA聚合酶的任何一個或多個F和A-E的結構域中或最接近那里的區(qū)域中至少一個氨基酸置換、缺失和/或添加，并且該突變和對ETV和/或LMV抗性或下降的敏感性相關。這種突變的存在是對所述的ETV和/或LMV可能存在抗性的指示。優(yōu)選地，該檢驗在間隔區(qū)和/或rt區(qū)可以檢測到一個或多個下面的突變間隔區(qū)L97I、間隔區(qū)K115R、間隔區(qū)H116L、間隔區(qū)L128F、間隔區(qū)S137G、間隔區(qū)R139G、間隔區(qū)F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其組合或等同的一個或多個其它突變，這是對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物具有下降的敏感性的變體的指示。相應地，本發(fā)明的另外一個方面產生用以確定HBV林是否對核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性的方法，所述的方法包括從所述的HBV分離DNA或相應的mRNA，并且在編碼HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中篩選突變，其中在間隔區(qū)和rt區(qū)下面的突變間隔區(qū)L971、間隔區(qū)K115R、間隔區(qū)H116L、間隔區(qū)L128F、間隔區(qū)S137G、間隔區(qū)R139G、間隔區(qū)F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其組合或等同的一個或多個其它突變的存在，是對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物具有降低的敏感性的變體的指示。逆轉錄酶中優(yōu)選的突變是rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或其組合或等同的一個或多個其它突變，這是對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物具有降低的敏感性的變體的指示。相應地，本發(fā)明的另外一個方面涉及用以確定HBV抹是否對核苷類似物表現(xiàn)降低的敏感性的方法，所述的方法包括從所述HBV分離DNA或相應的mRNA,并且在編碼HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中篩選突變，其中在rt區(qū)的B或C結構域中下面的突變rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或其組合或等同的一個或多個其它突變的存在，是對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物具有降低的敏感性的變體的指示。在細胞、細胞裂解物、培養(yǎng)上清液或體液中的HBV或它的組分的檢測可以通過任何便利的方法，包括任何基于核酸的檢測方法，例如，通過核酸雜交技術或通過一個或多個聚合酶鏈式反應(PCRs)。術語"體液，，包括任何得自血液、淋巴、組織或器官系統(tǒng)的液體，包括血清，全血、活檢組織和活檢組織液、器官移植體和器官懸液，如肝懸液。本發(fā)明進一步包括所述基于核酸檢測方法的不同檢驗形式的使用，包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、擴增片段多態(tài)性(AFLP)、單鏈構像多態(tài)性(SSCP)、擴增和錯配檢測(AMD)、interspersedrepetitivesequence聚合酶鏈式反應(IRS-PCR)、反向聚合酶鏈式反應(iPCR)和逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)等。其它檢測形式包括Northern印跡、Southern印跡、PCR測序、抗體方法，如酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)、Western印跡和免疫組織化學。一個尤其有用的分析包括固定化寡核苷酸或寡肽介導的檢測系統(tǒng)所要求的試劑和組分。一個尤其有用的核酸檢測系統(tǒng)是反向雜交技術。在這個技術中，使用生物素或其它配基標記引物來擴增來自HBV樣品的DNA以產生標記的擴增子。然后通過雜交用固定在固相支持物(例如硝酸纖維素薄膜)上的寡核苷酸捕獲擴增的DNA。通過生物素或配基來鑒定特異的核酸片段。通常，標記引物對待檢測的特定的核苷酸變異是特異的。擴增只在待檢測的變異存在下發(fā)生。有許多種形式的反向雜交分析形式并且所有都包括在本發(fā)明中。在細胞培養(yǎng)液中檢測HBV復制是尤其有用的。本發(fā)明的另外一個方面涉及用于檢測對HBV表現(xiàn)抑制活性的藥物的方法，通過產生一個基因構建體，該構建體包括包含于質粒載體中的來自HBV的復制有效量的基因組，然后用所述的構建體轉染所述的細胞；在轉染前、期間和/或之后，用待檢測的藥物接觸細胞；在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所述條件為如果對所述的藥物有抗性則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；并且對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或裝配和/或釋放。在優(yōu)選的實施方案中，質粒載體可以包括編碼部分或全部其它病毒載體的基因，例如桿狀病毒或腺病毒(Ren和Nassal，2001并且方法包括產生一個基因構建體，該構建體包括來自所述HBV的復制有效量的基因組，其包含于或融合于感染細胞有效量的桿狀病毒基因組或腺病毒基因組中，然后用所述的構建體感染所述的細胞；在感染前、期間和/或之后，用待檢測的藥物接觸細胞；在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所述條件為如果對所述的藥物有抗性則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；并且對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或裝配和/或釋放。在可供選擇的實施方案中，該方法包括產生連續(xù)細胞系，該連續(xù)細胞系包含復制有效量的HBV基因組的有感染力的拷貝，以致所述的有感染力的HBV基因組穩(wěn)定整合到所述的連續(xù)細胞系中，比如但不局限于2.2.15或AD;用待檢測的藥物接觸細胞；在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所述條件為如果對所述的藥物有抗性則足以使HBV復制j表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；并且對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或裝配和/或釋放。正如上面所示，變體也可以針對HBsAg(s基因)和PreSl、PreS2包膜基因檢測。在這點上優(yōu)選的突變包括一個或多個PreSlN114D、PreSlT115S、PreS2F22L、PreS2V39A、PreS2P52L、sL拼、sT118A、sF161L、sE164D、sI195M、sI208TPreSlE86Q、PreSlN91K、PreS2P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F。相應地，本發(fā)明的另外一個方面涉及用以確定HBV抹是否對核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性的方法，所述的方法包括從所述的HBV分離DNA或相應的mRNA，并且在編碼包膜基因的核苦酸序列中篩選突變，其中在PreSl、PreS2和HBsAg中下面的突變PreSlN114D、PreSlT115S、PreS2F22L、PreS2V39A、PreS2P52L、sL89V、sT118A、sF161L、sE164D、sI195M、sI208TPreSlE86Q、PreSl顧K、PreS2P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F或其組合或等同的一個或多個其它突變的存在，是對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物具有降低的敏感性的變體的指示。本發(fā)明部分地根據(jù)HBV變異體的鑒定和分離，HBV變異體具有多個突變并且表現(xiàn)選自下面的兩個或多個性質和野生型HBV相比，對一種或多種核苷類似物減少的或降低的敏感性；乙型肝炎e抗原的下降的水平和/或功能活力；或降低的、廢除的或受損的免疫相互作用。因此，具有這些突變模式的HBV變體的鑒定是重要的，尤其對于開發(fā)用于檢測HBV變體的檢驗法和用于篩選對治療和/或預防由那些變體或/和其它HBV分離株引起的感染的有用藥物的檢驗法，以及開發(fā)控制HBV感染的替代治療方案。相應地，本發(fā)明的一個方面是針對包含和至少兩個選自下面的性質相關的多種核苷酸突變的分離的HBV變體(a)對一種或多種核苷類似物的抗性，(b)乙型肝炎e抗原下降的水平和/或功能活力，或(c)下降的、取消的或受損的免疫相互作用。本發(fā)明的另外一個方面涉及包含多個核苷酸突變的分離的HBV變體，這些核苷酸的突變和下面的性質相關(a)對一種或多種核苷類似物的抗性，(b)乙型肝炎e抗原下降的水平和/或功能活力，或(c)下降的、取消的或受損的免疫相互作用。本發(fā)明的另外一個方面提供了包含多種選自下面的兩個或多個核苷酸突變的分離的HBV變體(a)在編碼DNA聚合酶的基因中的核苷酸突變，導致對所述的DNA聚合酶的至少一個氨基酸添加、置換和/或缺失，其中所述的變體對ETV和/或LMV和可選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性，(b)編碼乙型肝炎e抗原的基因或所述基因的轉錄控制元件中的核苷酸突變，其中所述的突變導致所述的乙型肝炎e抗原的下降的水平和/或功能活力，或(c)編碼乙型肝炎多肽的基因中的核苷酸突變，導致對所述的多肽的至少一個氨基酸的添加、置換和/或缺失，降低、取消或損害了它的免疫相互作用。DNA聚合酶的氨基酸變體的檢測可以通過參照式I和II所示的氨基酸序列完成。所示的多態(tài)性代表在用于活性病原的HBV林的多種數(shù)據(jù)庫中所示的變異。當HBV變體包含不同于所表示的氨基酸時，這種分離抹被認為是具有改變的DNA聚合酶活性的推定的HBV變體。本發(fā)明進一步包括抑制ETV和/或LMV抗性的HBV變體的藥物。如果臨床醫(yī)生采用ETV和/或LMV和/或可選的其它核苷類似物長期治療，這種藥物是尤其有用的。藥物可以是DNA或RNA或蛋白質的或非蛋白質的化學分子。從自然產物(例如植物、珊瑚和微生物)中篩選也被預期作為一種遮蔽劑的有價值的潛在來源。藥物可以是分離的形式或藥物組合物的形式并且可以和核苷類似物序貫或同時給予。相應地，本發(fā)明的另外一個方面涉及用于檢測對于HBV表現(xiàn)抑制活性的藥物的方法，所述HBV對于ETV和/或LMV表現(xiàn)抗性或下降的敏感性，所述的方法包括產生一個基因構建體，該構建體包括包含于質粒載體中的來自HBV的復制有效量的基因組，然后用所述的構建體轉染所述的細胞；在轉染前、期間和/或之后，用待檢測的藥物接觸細胞；在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所述條件為如果對所述的藥物有抗性則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；并且對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或裝配和/或釋放。本發(fā)明的另外一個方面提供用于檢測對于HBV表現(xiàn)抑制活性的藥物的方法，所述HBV對于ETV和/或LMV表現(xiàn)抗性或下降的敏感性，所述的方法包括產生一個基因構建體，該構建體包括來自所述HBV的復制有效量的基因組，其包含于或融合于感染細胞有效量的桿狀病毒基因組中，然后用所述的構建體感染所迷的細胞；在感染前、期間和/或之后，用待檢測的藥物接觸細胞；在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所述條件為如果對所述的藥物有抗性則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；并且對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或裝配和/或釋放。本發(fā)明的另外一個方面提供用于檢測對于HBV表現(xiàn)抑制活性的藥物的方法，所述HBV對于ETV和/或LMV表現(xiàn)抗性或降低的敏感性，所述的方法包括產生一個基因構建體，該構建體包括來自所述HBV的復制有效量的基因組，其包含于或融合于感染細胞有效量的桿狀病毒基因組中，然后用所述的構建體感染所述的細胞；在感染前、期間和/或之后，用待檢測的藥物接觸細胞；在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所述條件為如果對所述的藥物有抗性則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；并且對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或裝配和/或釋放。優(yōu)選地，HBV基因組穩(wěn)定整合入細胞基因組中。雖然桿狀病毒載體在實施本發(fā)明中尤其有用，本發(fā)明擴展到一系列的其它載體，例如但不局限于腺病毒。本發(fā)明進一步擴展到帶有基因構建體的細胞系，該構建體包括全部或部分的HBV基因組或基因或基因的一部分。本發(fā)明也提供本發(fā)明的HBV變體來篩選抗病毒藥物的用途。這些抗病毒藥物抑制病毒。術語"抑制，，包括拮抗或防止感染、復制、裝配和/或釋放或任何中間步驟。優(yōu)選的抗病毒藥物包括核苷類似物，然而，本發(fā)明擴展到非核苷分子。另外，合理的藥物設計也可被用來鑒定或產生化學分子，這些化學分子或者模擬核苷或者和特定的核苷酸序列或特定的核苷酸相互作用。組合化學和雙雜交篩選是用來鑒定潛在的治療或診斷藥物的若干技術之一。在一個實例中，聚合酶或表面抗原的晶體結構用來合理地設計小的化學分子，這些化學分子可能和功能和/或抗原性所要求的分子的關鍵區(qū)相互作用。這種藥物作為聚合酶的活性抑制劑是有用的和/或改變表面抗原的表位。由于和來自HIV逆轉錄酶的相似性，HBV聚合酶的幾個模型已經制備(Das等，丄Wo/.75(7^:4771-4779,2001;Bartholomeusz等，^簡油W437-3421997;Allen等，i^/m油gj;27廣":1670-1677，1998)。HBV聚合酶的模型可以用來進行針對編碼抗性突變的HBV以及野生型病毒有效的新藥物的合理藥物設計。被設計的合理的藥物可以基于對現(xiàn)存的抗病毒藥物的改良，例如用于篩選編碼和抗性相關的突變的HBV的藥物。表達編碼突變的HBV基因組物質的病毒或克隆也可以用來篩選新的抗病毒藥物。上面的方法在鑒定抗ETV和/或LMV的HBV的抑制劑中尤其有用。本發(fā)明因而擴展到抑制劑的組合物。抑制劑也可以是抗體或遺傳分子的形式，例如核酶、用于RNAi共抑制或誘導的反義分子和/或有義分子。提到RNAi包括涉及siRNA。術語"組合物"包括"藥物組合物"。抑制劑在下面被稱為"活性成份，，或"活性化合物"，并且可以選自上面給出的抑制劑名單。組合物可以包括HBV的抗原性組分、缺陷型的HBV變體或通過自然產物篩選或合理藥物設計(包括組合化學)鑒定的藥物。藥物可接受的載體和/或稀釋劑包括任何和全部的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。這種針對藥物活性物質的介質或試劑的使用為本領域眾所周知。除了任何和活性成份不相容的常規(guī)的介質或試劑，也包括其在治療組合物中的應用。補充的活性成份也可以被引用到組合物中。藥物組合物也可以包含遺傳分子，例如能夠轉染目的細胞的載體，該栽體帶有能夠編碼天冬氨酰蛋白酶抑制劑的核酸分子。例如載體可以是病毒載體。適合注射使用的藥物形式包括無菌水溶液(此處是水可溶的)和用于臨用前制備無菌可注射溶液的無菌粉末。它在生產和貯藏條件下必須穩(wěn)定并且必須在抗微生物(例如細菌和真菌)污染作用下保存。載體可以是溶劑或稀釋介質，例如包括，水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、液體聚乙二醇等)、它們合適的混合物和植物油。適當?shù)牧鲃有钥梢员槐３郑热?，通過使用superfactant。微生物作用的抑制可以通過多種抗細菌和抗真菌試劑實現(xiàn)，例如，羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal等。在許多例子中，優(yōu)選地是包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。注射組合物的延長吸收可以通過在藥物的組合物中使用延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠。無菌可注射溶液通過使所需量的在合適溶劑中的活性化合物和所要求的活性組分和可選的其它活性組分混合，然后通過過濾滅菌或其它合適的滅菌方法而制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，合適的制備方法包括真空干燥和冷凍干燥技術，可以產生具有活性組分加上任何補充的所需組分的粉末。當活性組分被適當?shù)乇Ｗo，它可以口服給藥，例如，使用惰性稀釋劑或使用可吸收的適食載體，或裝入硬的或軟的殼的明膠膠嚢，或可以壓縮成藥片。用于口服治療給藥，活性成份可以和賦形劑混合，并且以可消化的藥片、頰片、錠劑、膠嚢、酏劑、懸浮劑、糖漿、干糊片等形式使用。這種組合物和制劑應該包含至少重量為1%的活性化合物。組合物和制劑的百分含量當然是可以是不同的并且可以方便地在大約單位重量的5%-80%。在這種治療有效的組合物中的活性化合物的量是使得可以獲得合適的劑量。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的組合物或制劑是這樣制備，以致口服劑量單位形式包含大約0.1/ig-200mg的活性化合物?？梢赃x擇的劑量包括大約l/tg-約1000mg和約lOjng-約500mg。這些劑量是根據(jù)每個個體或每千克體重。給藥可以是每小時、天、周、月或年。藥片、頰片、藥丸或膠嚢等也可以包含此后列出的組分。黏合劑，如樹膠、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，如磷酸二鉀；崩解劑，如玉米淀粉、土豆淀粉、褐藻酸等；潤滑劑，如硬脂酸鎂；以及甜味劑，如蔗糖、乳糖或糖精或調味劑，如薄荷油、冬青油或櫻桃香料。當藥劑單位形式是膠嚢，除了上面類型的原料外，它可以包含液體載體。多種其它原料可以作為包衣或來改變藥劑單位的物理形式而出現(xiàn)。例如，藥片、藥丸或膠嚢可以用蟲膠、糖或二者包被。糖漿或酏劑可以包含活性化合物、蔗糖作為甜味劑、甲基和丙基苯甲酸酯作為防腐劑、染料和調味劑。當然，在制備任何藥劑單位形式時所用的任何原料應該是藥物純的并且基本上在所用量內無毒性。另外，活性化合物可以摻入到持續(xù)釋放的制品和制劑中正如上面所述，本發(fā)明進一步擴展到來自此處描述的HBV變體的分離的HBsAg。更具體地，本發(fā)明提供了HBsAg或它的重組形式或它的衍生的或化學的等價物。分離的表面組分和，更具體地，分離的表面抗原或它的重組的、衍生的或化學的等價物在生物組合物(例如疫苗制劑)的開發(fā)中有用。本發(fā)明的另外一個方面提供了組合物，該組合物包含抗ETV和/或LMV和可選的其它苷類似物的變異的HBV或來自所述的變異的HBV的HBV表面抗原或它的重組的或衍生的形式或它的化學等價物以及一種或多種藥物可接受載體和/或稀釋劑。正如上面所示，針對突變的HBV可以產生抗體，并且用來針對由這些病毒引起的感染的被動或直接的免疫。抗體可以產生于人類或非人類的動物。在后者的情況下，非人類抗體需要在使用前去免疫或更特異地人源化。去免疫可以包括，例如，移植來自鼠或非人類動物的抗HBV抗體的可變區(qū)的互補決定區(qū)(CDRs)到人的共有抗體片段結合(Fab)多肽上?；蛘?，在抗體可變區(qū)內定義表位的氨基酸可以被突變以使表位不再被人的MHCII復合物識別。在核酶的范圍內，考慮到反義或共抑制(RNAi)，這很便利地針對轉錄后的基因沉默?？梢允┘覦NA或RNA或使用包含對HBVmRNA特異的RNAi的復合物或其化學類似物。所有這種分子可以包括進藥物組合物中。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供生物組合物，該組合物包括HBV變體或來自所述的變異HBV的HBsAg或L、M或S蛋白或它的重組的或衍生的形式或它的化學等價物。通常，如果HBV被使用，它首先要被減毒。根據(jù)本發(fā)明的這方面的生物組合物通常進一步包括一種或多種藥物可接受的載體和/或稀釋劑。生物組合物可以包括來自一種HBV變體的HBsAg或相似的分子或者組合物可以是來自一系列的抗ETV和/或LMVHBV變體的HBsAg或L、M或S蛋白或相似的分子的混合物。相似的內含同樣適用于包含HBV的組合物。本發(fā)明進一步針對缺陷型的HBV變體在治療疫苗的生產中的使用，用來給個體接種疫苗以防止具有特定核苷酸序列或編碼特定的聚合酶或表面抗原或L、M或S蛋白的HBV變體的感染。在一個實施方案中，例如，HBV變體被鑒定為在它的聚合酶中具有特定的突變，該突變賦予對核苷類似物的抗性或下降的敏感性。然后這種變體可以被突變以使它成為缺陷型的，即，減毒或不能引起感染。這樣的缺陷型的抗核苷類似物的病毒然后可以用做針對在聚合酶中具有相同突變的劇毒的病毒的治療疫苗。本發(fā)明擴展到用于抗ETV和/或LMV的變異的HBV的檢驗試劑盒。這種試劑盒可以，例如，包含來自PCR或其它的核酸雜交技術的試劑或基于免疫學檢測技術的試劑。一個尤其有用的檢驗包括用于固定的寡核苷酸或寡肽介導的檢測系統(tǒng)所需的試劑和組分。本發(fā)明的另外一個方面涉及用以確定HBV對ETV和/或LMV或可選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性的潛力的方法，通過從HBV分離DNA或相應的mRNA并且在編碼HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中篩選突變，該突變導致在所述DNA聚合酶的任何一個或多個F和A-E的結構域中或最接近那里的區(qū)域中至少一個氨基酸置換、缺失和/或添加，并且該突變和對ETV和/或LMV抗性或下降的敏感性相關，其中這種突變的存在是對所述的ETV和/或LMV可能存在抗性的指示。潛在的病毒變體的評估對篩選合適的治療方案是重要的。這種評估在用軟件編程的計算機的幫助下得到了適當?shù)拇龠M，其計算用于至少兩個和病毒變體相關的特性的指標(Ivs)以提供相應于病毒變體對特定化學化合物或免疫試劑的抗性或敏感性的潛能值(Pj。Ivs可以選自(a)對特定化合物或免疫試劑表現(xiàn)抗性或下降的敏感性的能力；(b)與野生型不同的HBV聚合酶；(c)與野生型HBV不同的表面抗原；(d)患者的發(fā)病和復原的潛力。因而，根據(jù)本發(fā)明，這種特性的IvS保存在機器可讀的存儲介質中，其能夠處理數(shù)據(jù)以給特定的病毒變體或包含該病毒變體的生物樣本提供PA。因此，在另外一方面，本發(fā)明涉及計算機程序產品，用于評估病毒變體或包含病毒變體的生物樣本的可能的有效性以確定在一個受試者中合適的治療方案，所述的產品包括(1)編碼，作為輸入Ivs接受至少兩種和所述的病毒試劑或包含病毒試劑的生物樣本相關的特性，其中所述的特性選自(a)對特定的化合物或免疫試劑表現(xiàn)抗性或下降的敏感性的能力；(b)與野生型HBV不同的DNA聚合酶(c)與野生型HBV不同的表面抗原；或(d)患者的發(fā)病和復原的潛力；(e)改變的復制能力(升高的或下降的)；(2)計算所述Ivs的和以提供相應于所述的病毒變體或生物樣本的Pv的總和的編碼；和(3)儲存編碼的計算機可讀介質。在相關方面，本發(fā)明擴展到用于評估病毒變體或包含病毒變體的生物樣本的可能的有效性的計算機，其中所述的計算機包括(1)機器可讀數(shù)據(jù)存儲介質，包括用機器可讀數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲材料，其中所述的機器可讀數(shù)據(jù)包括用于和所述病毒變體或生物樣本的至少兩種特性相關的Ivs，其中所述的特性選自(a)對特定的化合物或免疫試劑表現(xiàn)抗性或降低的敏感性的能力；(b)與野生型HBV不同的DNA聚合酶；(c)與野生型HBV不同的表面抗原；或(d)患者的發(fā)病和復原的潛力；(e)改變的復制能力(升高的或下降的)；(2)用于存儲指令的工作存儲器，該指令用于處理所述的機器可讀的數(shù)據(jù)；(3)結合到所述的工作存儲器和所述的機器可讀數(shù)據(jù)存儲介質的中心處理單元，用于處理所述的機器可讀數(shù)據(jù)以提供相應于所述化合物Pv的所述IvS的總和；并且(4)結合到所述的中心處理單元的輸出硬件，用于接收所述的Pv。本發(fā)明采用任何一般或特殊用途的計算機系統(tǒng)并且包括和內存以及至少一個輸入/輸出設備(例如終端)電子通訊的處理器。這種系統(tǒng)可以包括但不局限于個人電腦、工作站或大型機。處理器可以是一般用途處理器或微處理器或執(zhí)行位于RAM內存的程序的專門化處理器。程序可以從存儲設備(例如，磁盤或預編程ROM內存)放置于RAM。在一個實施方案中RAM內存既用于數(shù)據(jù)儲存也用于程序執(zhí)行。計算機系統(tǒng)也包括位于不同物理實體中但是通過網絡電子通訊的處理器和內存的系統(tǒng)。例如，具有圖7闡述的全部特點的計算機系統(tǒng)在實施本發(fā)明中是有用的。更特異地，圖7是典型的計算機工作站的示意圖，該工作站通過，例如，內部總線或外部網絡使處理器(101)、RAM(102)、ROM(103)、終端(104)以及可選的外部存儲器(例如磁盤、CDROM或磁帶(105)具有互相的電子通訊(100)。本發(fā)明進一步通過下面的非限制性實施例描述。實施例1HBV的重疊的基因組在圖1中表示。編碼DNA聚合酶(P)的基因，和病毒包膜基因，Pre-Sl和Pre-S2重疊，并且和X和核心(C)基因部分重疊。HBV包膜包括小的、中等的和大的HBV表面抗原。大的蛋白質組分被稱為HBV表面抗原(HBsAg)并且被S基因序列圍繞。Pre-Sl和Pre-S2基因序列編碼另外一個包膜組分。實施例2,悉者和浴^患者A是一位患有慢性乙型肝炎的44歲的男性，在0天(1999年7月9日)表現(xiàn)升高的HBVDNA水平(〉2000pg/ml),并且被建議立即進行LMV治療(圖2)。患者A的HBsAg陽性以及抗-HBe陽性。在LMV治療開始后54天的療程中HBVDNA水平下降到8pg/ml。HBVDNA保持低水平直到199天時，出現(xiàn)了復制復發(fā)以致HBVDNA水平達到1826pg/ml。到第241天時，血清ALT達到最高點為741IU/1。對HBVDNA測序，檢測到抗LMV病毒?；颊呷缓笤诘?82天(2000年7月24日)加入了雙盲ETV加上LMV臨床試驗。到第784天，HBVDNA水平只下降到33pg/m并且ALT降低到167IU/L。對患者開始開放標記ETV加上LMV。然而，HBVDNA水平以及ALT繼續(xù)升高并且在第894天對HBVDNA測序(圖2)?；颊連是一位肝移植患者。該患者已經使用了許多種核苷類似物治療，包括更昔洛韋(ganciclovir),泛昔洛韋(famciclovir)LMV和ETV。對患者在ETV前使用LMV治療。患者目前在用ETV治療中。在ETV治療期間，HBVDNA水平減少到低于5pg/ml。在ETV治療的第532天，相當于移植后的第3857天，出現(xiàn)HBVDNA水平的升高到993pg/ml。來自這個樣本的HBVDNA進一步通過測序進行性質測定。實施例3使用市售的免疫分析測定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、抗-HBe和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)特異的IgG和IgM(Abbott實驗室，NorthChicago,IL，美國)。根據(jù)生產商的指南(DigeneHybridCaptureII，DigeneDiagnosticsInc.,Beltsville，MD)使用捕獲雜交分析測定乙型肝炎病毒DNA水平。生產商聲明用于檢測臨床樣本中HBV病毒血癥的臨界值是0.7xl(^拷貝/ml或2.5pg/ml,[HendricksDA等，爿//C7/wPa^o/JM:537-46，19951。實施例4朋KZ)AC4時辦如以前在Aye等，JHe/m"U6:1148-53,1997中所描述的，在6個不同的時間點收集的100jd血清中提取HBVDNA(圖2)。寡核苷酸由Geneworks，Adelaide,澳大利亞合成。HBV聚合酶基因的擴增已經由Aye等，1997，訓/mz描述。使用購自MOBIOLaboratoriesInc(LaJolla,CA)的PCR純化層析柱純化特異的擴增產物，并且使用BigDyeterminatorCyclesequencingReadyReactionKit(PerkinElmer，CetusNorwalk,CT)直接測序。PCR引物用來作為測序引物，OS15，-GCCTCATTTTGTGGGTCACCATA-3，(nt1408-1430)[SEQIDNO:3J，TTA35'畫AAATTCGCAGTCCCCAAA-3，(nt2128-2145)SEQIDNO:4，JM5，-TTGGGGTGGAGCCCTCAGGCT-3，(ntl676畫1696)SEQIDNO:5，TTA45，-GAAAATTGGTAACAGCGG誦3，(nt2615-2632)[SEQIDNO:6，OS25，-TCTCTGACATACTTTCCAAT3'(nt2798-2817)SEQIDNO:7，測定PCR產物的內部區(qū)域的序列。實施例5朋F"A^4、#患者A:到第199天通過測序檢測到抗LMV的rtL180M和rtM204V突變(表3)。在恩替卡韋和LMV治療的雙盲階段，rtV173L突變也被檢測到。在B結構域一個獨特突變rtll69T與其它兩個在B結構域的rtL180M和rtM173L突變以及C結構域的rtM204突變一起被檢測到。許多其它獨特的變化也在聚合酶中和重疊的包膜基因中被檢測到(表4，圖4，5和6)。這些獨特的改變和來自七個基因型A-G的每一個參照序列以及來自治療前樣本的共有序列比較以確定獨特的改變。患者B:在ETV治療的第532天樣本被測序并且和ETV治療前的樣本比較(圖8，9和10)。在該樣本中檢測到幾個聚合酶突變，包括rtA21S、rtA38E、rtY54H、rtN76D、rtL911、rtF122L、rtY124H、rtT128N、rtQ130P、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtH248N、rtY252L。在ETV治療的開始，患者已經在使用LMV治療并且已經檢測到rtL80M和M204V突變(圖8，9和10)。LMV突變(rtL180M和rtM204V)甚至在沒有LMV選擇壓力下在ETV治療期間被檢測到，并且這些突變也可以起到抗ETV的作用。在ETV的病毒爆發(fā)時期，LMV選擇A-G的突變以及上面列出的突變仍然存在。所有列出的突變和來自七個基因型的每一個參照序列以及來自治療前的樣本的共有序列比較以確定獨特的改變。患者B是HBeAg陰性并且從這個患者分離的HBV在前核心基因編碼G1896A突變，導致在前核心蛋白precoreW28Stop中的終止密碼子。包括前核心的G1896A突變在內的基因組中其它區(qū)域的突變和聚合酶基因內的突變一起影響HBV復制適合性和對抗病毒藥物的敏感性。實施例6,感參古一戎^^滲,/^^f使用重組HBV/桿狀病毒對HBV突變體的恩替卡韋的敏感性/抗性性質進行檢測。分析抗性性質的方法在下面實施例7-14中概述。實施例7Sf21昆蟲細胞在進一步添加10%v/v熱失活胎牛血清(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)的補充Grace，s昆蟲培養(yǎng)基中在28。C的濕潤的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HepG2細胞在補充10%熱失活胎牛血清的最低必需培養(yǎng)基(MEM-FBS)中培養(yǎng)。HepG2細胞在濕潤的37。C的5%V/VC02的培養(yǎng)箱中生長。實施例8^才掙7f爽義#兄8F/并W病辜脊移我琳^斧/務用于抗病毒檢驗的重組HBV/桿狀病毒系統(tǒng)以前已經被描述(Delaney等，/4w"OTto6C^附C/t"^5W:1705-1013,2001)。簡要地，通過切下包含1.3xHBV基因組構建體的片段并且克隆到桿狀病毒載體pBlueBac4.5(Invitrogen，Carlsbad，CA)的多克隆區(qū)以產生重組轉移載體。根據(jù)生產商的說明書(QuikChange,Stratagene)使用商品試劑盒通過定點突變法產生點突變。編碼逆轉錄酶突變rtll69T+rtV173L+rtL180M+rtM204V的HBV重組體。根據(jù)生產商的說明書(PerkinElmer,CetusNorwalk，CT)使用ABIPrismBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit通過效，J序對質凈立的核苷酸序列和由定點突變法產生的點突變進行確證。實施例9逸含7.ja丑F種建#炎病毒^y4^使用購自Invitrogen(Cadsbad，CA)的BacNBlue轉染試劑盒將純化的重組轉移載體和線性的AcMNPV桿狀病毒DNA共轉染到Sf21細胞中；根據(jù)生產商的指南通過噬斑試驗分離重組病毒。通過感染100-mm培養(yǎng)亞中的Sf21細胞，一系列的重組病毒從分離的噬菌斑中得到擴增。使用標準方法，從擴增的病毒中提取病毒DNA。用限制性酶消化純化的病毒DNA，然后通過1%v/v瓊脂糖凝膠電泳分離。進行Souhtern印跡以確定含有完整的1.3HBV構建體的病毒分離林。用BoehringerMannheinRandomPrimeDNALabeling試劑盒(Indianapolis,IN)來產生[P"I放射性同位素標記的探針。全長的雙鏈HBV基因組被用來作為所有的放射性同位素標記探針的模板。使用有義引物5，-GCCTCATTTTGTGGGTCACCATA-3，SEQIDNO:3，(核苷酸1408-1430，根據(jù)HBVGenebank檢索號M38454)和反義引物5，誦TCTCTGACATACTTTCCAAT隱3，SEQIDNO:6(核苷酸2817-2798,根據(jù)HBVGenebank檢索號M38454)對聚合酶的催化區(qū)進行PCR擴增以確證病毒DNA序列。下面的引物用來測定內部區(qū)的序列5，-TGCACGATTCCTGCTCAA-3，[SEQIDNO:8](核苷酸2345-2362，根據(jù)HBVGenebank檢索號M38454)和5，-TTTCTCAAAGGTGGAGACAG-3，SEQIDNO:9j(核苷酸1790-1810，根據(jù)HBVGenebank檢索號M38454)。實施例10辨務型^f炎^善W^，和趟必以0.5pfu/細胞感染強度(moi)感染對數(shù)期的Sf21細胞懸浮培養(yǎng)物來擴增桿狀病毒。使感染進行到培養(yǎng)瓶中大多數(shù)細胞細胞表現(xiàn)可見的感染特征(4-5天)。通過在80，000xg離心使病毒顆粒從感染的Sf21培養(yǎng)基中沉淀下來，并且通過20-60%w/v蔗糖梯度純化。純化的病毒通過終點稀釋在Sf21細胞中以四重形式滴定。每個高滴度儲液的一份用于DNA提取。聚合酶基因被擴增和測序來確證實施例9中的定點突變的存在。實施例11^^t這許次病毒的,iff好B「感染好印02勿應HepG2細胞在大約20-40%的匯合度時接種，并且在感染前生長16-24小時。在感染的當天，三個平板中細胞被胰酶消化，使用臺盼藍排除用血球計確定活細胞數(shù)。計算平均細胞計數(shù)并且用來確定在所示的moi下感染細胞所必須的高滴度病毒儲液的體積。使用無血清MEM洗滌HepG2細胞一次以除去孩t量血清。4吏用體積為1.0，0.5，和0.25ml分別感染100-mm，60-mm和35-mm培養(yǎng)皿，桿狀病毒被稀釋到無血清MEM中以獲得適當?shù)膍oi。桿狀病毒在37。C被吸附到HepG2細胞1小時，每15分鐘溫和搖動以保證接種物均勻地分布。然后吸出接種物并且用磷酸鹽緩沖液洗滌HepG2細胞兩次，重新給予具有或不具有不同濃度藥物的MEM-FBS。實施例12為V義的if5F拔j辨為、浙使用購自Abbott實驗室(AbbottPark,IL，USA)的試劑盒通過放射免疫分析和微粒酶免疫分析進行乙型肝炎e抗原(HbeAg)的檢測。收集H印G2細胞培養(yǎng)液，在6,000g下離心以除去細胞碎片，轉移到干凈的試管中，并且儲存在20。C直到分析。HBeAg值表示為陽性對照的倍數(shù)。培養(yǎng)基樣品適當稀釋使得放射免疫分析結果低于HBeAg陽性對照值。實施例13勿^^復浙*辨Z參種發(fā)辦從在0.5%w/vNP-40中裂解的HepG2細胞的細胞質組分中分離HBV核心顆粒。細胞質提取物調整到10mmo1/1McC12，通過和500g/ml蛋白酶K37。C孵育1.5小時除去未保護DNA。然后使用商品DNA提取試劑盒(例如Qiagen(DNAextraction))或依次4吏用苯酚和氯仿抽提的自制方法提取樣品中的HBVDNA,并且通過乙醇沉淀回收核酸。核酸重懸于50TE(10mmo1/1Tris，1mmo1/1乙二胺四乙酸)，通過OD260標準化，用100g/mlRNA酶(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)37。C消化1小時，然后使用實時PCR或電泳和Southern印跡分析。在Southern印跡分析后，使用BioRadGS-670光密度計和分子分析專家軟件(BioRad,HeculesCalifornia)來分析Southern印跡合適的膝光。使用來自JandelScientific的TableCurve2D軟件包使光密度測定數(shù)據(jù)擬合對數(shù)劑量反應曲線。對數(shù)劑量反應方程式用來計算變異的ICs。和IC9。值和變異的相關系數(shù)。實施例14對于基于實時PCR的HBV檢驗，根據(jù)生產商的指南(QIAGENGmbH，Hildens，德國)使用QIAampDNA微量試劑盒從200/il血清中提取HBVDNA。引物和分子標志i殳計在HBV基因組的前核心區(qū)內的保守核酸序列以擴增和檢測216核苷酸產物(圖1)。擴增在50-^1的反應混合物中進行，反應混合物包含1.0Taqman緩沖液A(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)，3.0mM氯化鎂，0.4pmol/pl的每種引物，正向引物，PC1(5，GGGAGGAGATTAGGTTAA3，SEQIDNO:10和反向引物，PC2(5，GGCAAAAACGAGAGTAACTC3，SEQIDNO:11I，0.4pmol//tl的HBV特異的分子標志，C5,FAM誦CGCGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGACGCG-DABCYL-3，[SEQIDNO:12;此處FAM代表熒光團6-羧基熒光素和DABCYL，4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸，一種淬滅熒光團)和1.25U的AmpliTaqGoldDNA聚合酶(Perkin-Elmer)。應用ABIPRISM7700熒光分光光度熱循環(huán)儀(AppliedBiosysterms)進行PCR。PCR程序由起始循環(huán)(95t:，10分鐘)和隨后的45個擴增循環(huán)(94。C，15秒，50°C，30秒，72°C，30秒)組成的。機器檢測并且記錄下在退火階段每個反應管中的熒光光鐠。通過連接1.3kB的野生型HBV質粒(基因型D)到pBlueBac質粒栽體(HersheyMedicalCenter,Hershey，PA)建立外部標準。質粒的DNA濃度的定量通過分光光度測定法確定。從108拷貝/1111-100拷貝/ml的連續(xù)10倍稀釋兩份相同的質粒包括在每一輪中以建立標準曲線。每個實驗反應的拷貝數(shù)通過獲得的閾循環(huán)數(shù)(CT)內推確定。實施例15五7T浴#ETV重懸在無菌水中，分裝并且在-20。C冷凍以避免藥物的反復凍溶。包含ETV的培養(yǎng)基每天使用新鮮的3TC分裝按照需要制備。在病毒感染后ETV治療起始的實驗中，用HBV桿狀病毒感染后立即使HepG2細胞接觸所示濃度的ETV。在使用ETV預治療的實驗中，在HBV桿狀病毒感染前，給予細胞包含有ETV的培養(yǎng)基16小時，HBV桿狀病毒感染也在包含ETV的培養(yǎng)基中進行，并且在感染和洗滌過程完成后立即重新給予細胞包含ETV的培養(yǎng)基。實施例16炎y^野^型^弄薦4W/L6Pr+Wv/ZZ+WZ7(^M+WMWF#好5K/并炎^毒迷存^抗應用相對于生長在無ETV(OETV)的野生型病毒定量實時PCR結果，ETV對野生型和四重突變的HBV的劑量效應的圖形分析在圖1中表示。正如在所有的ETV檢測濃度的定量.PCR檢測的HBV復制的中間產物的降低所證明的，ETV對野生型HBV復制具有最明顯的效應。相反地，編碼四重突變(rtlL69T+rtV173L+rtL180M+rtM204V)重組HBV尤其在ETV濃度達到0.5pM時對ETV具有降低的靈敏度。實施例17ETV(以前是BMS-200475或SQ-34676)是HBV復制的有力的抑制劑。ETV是具有生物可口服特性的具有抗嗜肝DNA病毒和皰滲病毒活性的環(huán)戊基脫鹽鳥苷類似物。ETV的結構在圖3中所示并且它的合成由Bisacchi等(所^/^.CAe附.丄&.7:127畫132，1997)描述。臨床前研究表明在基于酶和細胞的檢驗中(Innaimo等，1997,s"/;m;Siefer等，1998，Yamanaka等,1999，)恩替卡韋是非常有力的HBV的抑制劑。ETV以前描述為BMS-200475和SQ-34676,對于本領域技術人員可以理解此處描述的發(fā)明適于除了對特異描述的那些以外的變異或改變。應該理解本發(fā)明包括所有這種變異或改變。本發(fā)明也包括所有在本說明書中提及的或所示的步驟、特性、組合物和化合物，單獨地或共同地，以及任何兩個或多個所述的步驟或特性的任何或所有的組合。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>1.ND-未檢測到2.研究的雙盲階段3.研究的開放標記階段4.根據(jù)Stuyver等，2001，s"/wa命名表4使用ETV和LMV治療的患者A的HBV突變的總結<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>參考文獻:Alleni/印ato/ogy27「<5人1670-1677，1998;Ayee/a/.，/〃，to/.11148-53，1997;BartholomeuszeM/.,/wterv/油gy僻5母337-3421997;Bisacchie"/.(2/oo^.Ma/.Oem.7,127-132,1997;BoydWa/"顛/Wra/C7ie;nCAemo紐.32.358-363，1987;Colo皿oeM/"JZD1236-452001;Das&a/.,乂75(76>人4771-4779，2001;DelaneyWa/"Aft'"!/cTO6CAe"滅e"柳；1705-1013，2001;Dienstage"/"AW五"gWJ編m'1657-1661,1995;Gaillarde《《CAewofAer.1005-1013,2002;GenovesiJn">n/cra6/o/々e,"C/!em3209-3217，1998;HendricksDA，"a/.,爿m/C"n尸w/w/537-46,1995;InnaimoWa/.,v4M">m'cro6/o/々e71rCAe/H1441-1448，1997;Kruger&219A,1994;Maina/.,乂F!>a/i7e;w"r!;y3:211-215,1996;Nordera/.,J!G饑PW.7*341-1348，1993;RenandNassal，F(xiàn)liro/.75(3,'1104-1116,2001;Severini"a/"4Mri,m'cra6!'a/々e&C/iemofW39.'1430-1435，1995;Siefer"a/.,乂rari附!cro&'o/爿gen/C/zem2<5:3200-3208,1998;Stuyver"a/.,//"epa油gyJJ:751-757，2001;SummersandMason,Ce//403-415,1982;VereHodge，顛/v/ra/C/聽C7zewo紐《.67-84,1993;Xiong"aZ"2卿1669-73，1998;Yamanakaa/.,j,"z>m'CTO&'o/CAem43:190-193，1999.<120><130><140><141><150><151><150><151><160><170><210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>序列表MelbourneHealth(allstatesexceptUS)AustinandRepatriationMedicalCentre(allstatesexceptUS)SouthernHealth(allstatesexceptUS)Bartholomeusz,Angeline(USonly)rjocarnini,Stephen(USonly)Ayres,Anna(USonly)Angus,Peter(USonly)Sievert,William(USonly)對核苷類似物具有改變的敏感性的病毒變體及其應用2609536/EJHNotyetavailable2003-02-07AUPS03702002-02-07AUPS12692002-03-2136Patentlnversion3.176PRTMISC一特征(2).:(2)X=Ij或R或IMISC—特征(3).:(3)X=E或DMISC一特征(9).:(9)X=T或D或A或N或YMISC一特征(10):(10)X=E或D<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><:222><223>MISC一特征(13):.(13)X=E或K或QMISC—特征(15)..(15)X=H或R或NMISC—特征(18):(18)X=I或TMISC—特征(23):.(23)X=A或SMISC—特征(26):.(26)X=T或RMISC一特征(40):.(40)X=A或T或SMISC一特征(43):.(43)X=R或TMISC一特征(45)..(45)X=V或GMISC—特征(55):(55)X=S或I或T或N或V:220::221::222::223:MISC—特征<56):.(56)X=T或S或H或Y<220:<221:<222:<223:MISC—特征(57):.(57)X=R或H或K或Q<220:<221:<222:<223:MISC—特征(69):.(69)X=Q或P<220:<221:<222:<223:變體(76)..(76)S指定為氨基酸74<400>1LeuXaaXaaAspTrpGlyProCysXaaXaaHisGlyXaaHisXaalie151015ArgXaaProArgThrProXaaArgValXaaGlyGlyValPheLeuVal202530AspLysAsnProHisAsnThrXaaGluSerXaaLeuXaaValAspPhe354045SerGinPheSerArgGlyXaaXaaXaaValSerTrpProLysPheAla505560ValProAsnLeuXaaSerLeuThrAsnLeuLeuSer657075<210:<211:<212:<213:2181PRT合成<220><221>變體<222>(1).-(1)<223>S=氨基酸75<220><221>MISC—特征<222>(2)..(2)<223>X=N或D<220><221>misc—特征<222>(17)..(17)<223>x=i或p<220><221>MISC—特征<222>(29):.(29)<223>x=i或v<220><221>misc—特征<222><35)二(35)<223>X=s或d<220><221>misc一特征<222>(44):.(44)<223>X=T或N<220><221>misc—特征<222>(46):.(46)<223>x=R或N<220><221>misc—特征<222>(47):.(47)<223>X=N或I<220><221>MISC一特征<222>(48):.(48)<223>x=任何氨基酸<220><221>misc一特征<222>(50)..(50〉<223>x=N或Y或H60<220<221<222<223<220<221<222<223<220<221<222<223<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>MISC一特征(52):.(52)X=H或YMISC—特征(53):.(53)X=G或RMISC—特征(54):.(56)Xs任何氨基酸MISC—特征(57):(57)X=D或NMISC—特征(60)7.(60)X=D或NMISC—特征(61):.(61)X=S或YMISC—特征(65):.(65)X=N或QMISC一特征(71):.(71)X=Ii或MMISC—特征(75):.(75)X=K或Q<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><:222><223>MISC—特征(77):.(77)X=Y或FMISC一特征(79)..(79)X=R或WM工SC—特征(84廠.(84)X=Y或LMISC—特征(85廠.(85)X=S或AMISC—特征(89):.(89)X=I或VMISC—特征(95):(95)X=I或IiMISC—特征(99):.(99)X=V或GMISC—特征(114丁-.(114)X=C或IjMISC—特征(115)..(115)X=A或S<220><221>misc一特征<222>(116〖..(116)<223:>x=v或m<220><221>misc—特征<222>(117]"..(117)<223>x=V或T<220><221>misc一特征<222>(118)..(118)<223〉x=R或C<220><221>misc一特征<222>(122j"..(122)<223>x=f或p<220><221>misc一特征<222>(125丁.(125)<223>x=:l或v<220><221>,misc一特征<222>(126j".(126)<223>x=a或v<220><221>MISC一特征<222>(128T..(128)<223>x=s或a<220><221>變體<222'>(130).(130)<223>m=氨基酸204<220><221>misc一特征<222>(133j".-(133)<223>X=V或L或M<:220><221>MISC一特征<222>(138"T..(138)<223>x=K或R<220:<221:<222:<223:misc一特征(139丁..(139)X=S或T<220><221><222><223>misc—特征(140)..(140)x=v或g<220:<221:<222:<223:misc—特征(l"T..(141)x=q或e<220><221><222><223>misc—特征(1437.-(143)x=:l或s或r<220><221><222><223>misc—特征(145T-(145)x=s或f<220><221><222>'<223>misc—特征(1477..(147)x=f或y<220><221>misc—特征<222>(148Y…(148)<223>x=t或a<220><221>misc—特征<222>(149)(149)<223>x=a或s<220><221;>misc特征<222>(150).(150)<223>X=V或I<220><221><222><223>MISC—特征(151丁..(151)X=T或C<220:<221:<222:<223:MISC—特征(152]"--(152)X=N或S<220><221><222><223>MISC—特征(153丁--(153)X=F或V<220:<221:<222:<223:MISC—特征(156丁-(156)X=S或D<220><221><222><223>MISC—特征(157T..(157)X=Ii或V<220><221><222><223>MISC—特征(164]"-(164)X=N或Q<220><221><222><223>MISC—特征(179T--(179)X=V或I<400>2SerXaaLeuSerTrpLeuSerLeuAspValSerAlaAlaPheTyrHis1510isXaaProLeuHisProAlaAlaMet.ProHisLeuLeuXaaGlySerSer202530GlyIjeuXaaArgTyrValAlaArgLeuSerSerXaaSerXaaXaaXaa354045AsnXaaGinXaaXaaXaaXaaXaaXaaLeuHisXaaXaaCysSerArg505560XaaLeuTyrValSerLeuXaaLeuLeuTyrXaaThrXaaGlyXaaLys65707580LeuHisLeuXaaXaaHisProlieXaaLeuGlyPheArgLysXaaPro'859095MetGlyXaaGlyLeuSerProPheLeuLeuAlaGinPheThxSerAla100105110工leXaaXaaXaaXaaXaaArgAlaPheXaaHisCysXaaXaaPheXaa115120125TyrMetAspAspXaaValLeuGlyAlaXaaXaaXaaXaaHisXaaGlu130135140XaaLeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaLeuLeuXaaXaaGlylieHis145150155160LeuAsnProXaaLysThrLysArgTrpGlyTyrSerLeuAsnPheMet165170175GlyTyrXaa工leGly180<210>3<211:>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物(OSl)<400>3gcctcattttgtgggtcaccata<210>4<211>1823<212>DNA<213>人工序列<220><223>弓|物(TTA3)<400>4aaattcgcagtccccaaa18<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物(jm)<400>5ttggggtggagccctcaggct21<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>弓I物(TTA4)<400>6gaaaattggtaacagcgg18<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>弓l物(OS2)<400>7tctctgacatactttccaat20<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>弓l物<400>8tgcacgattcctgctcaa18<210><:211><:212><213><220><223>920人工序列引物<400>9tttctcaaaggtggagacag20<210><211><212><213><220><223>1018人工序列正向引物PC1<400>10gggaggagattaggttaa18<210:<211:<212:<213:<220:<223:1120DNA人工序列反向引物PC2<400>11ggcaaaaacgagagtaactc20<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223>1242D肌人工序列HBV特異性分子標志引物misc—特征(42)..(42)<400>12cgcgtcctactgttcaagcctccaagctgtgacgcgdabcyn4268<210>13<211>644<212>DNA<213>TR2<220><221>misc—特征<222>(619T-■(620)<223>N=任何核苷酸<220><221>misc—特征<222>(624T--(624)<223>N=任何核苷酸<220><221>misc—特征<222>(63lJ--(631)<223>N=任何核苷酸<400>13ccctcccgttctccaacttgt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><213><220><221><222><223>26162PRTTR2的HBsAgTransmisc一特征(113匸.(113)X=任何氨基酸<400>26CysProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhe151015lieliePheLeuPhelieLeuLeuLeuCysLeuliePheLeuLeuVal202530LeuLeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeulieProGly354045SerSerThrThrSerAlaGlyProCysArgThrCysThrThxThrAla505560GinGlyThrSerMetTyrProSerCysCysCysThrLysProSerAsp65707580GlyAsnCysThrCys工leProlieProSerSerTrpAlaPheGlyLys859095PheLeuTrpGluTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuLeu100105110XaaProPheValGinTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpLeu115120125SerValMetTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerThr130135140LeuSerProPheLeuProLeuLeuProliePhePheCysLeuTrpVal145150155160Tyrlie<210>27<211>162<212>PRT<213>TR3的HBsAgTrans<220>,<221>misc—特征<222>'(129)<223>X=任何氨基酸<400>27CysProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhe151015lieliePheLeuPhelieLeuL>euLeuCysLeuliePheLeuLeuVal202530LeuLeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeu工leProGly354045SerSerThrThrSerAlaGlyProCysArgThrCysThrThrThrAla505560GinGlyThrSerMetTyxProSerCysCysCysThrLysProSerAsp65707580GlyAsnCysThrCys工leProlieProSerSerTrpAlaPheGlyLys859095PheLeuTrpGluTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuLeu100105110ValProPheValGinTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpLeu115120125XaaValMetTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyxSerThr130135140LeuSerProPheLieuProLeuLeuProliePhePheCysLeuTrpVal14S150155160Tyrlie<210>28<211>161<212>PRT<213>TR4的HBsAgTrans<400>28ProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhe工le151015工lePheLeuPhelieLeuLeuLeuCysLeuliePheLeuLeuValLeu202530LeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeulieProGlySer354045SerThrThrSerAlaGlyProCysArgThrCysThrThrThrAlaGin505560GlyThrSerMetTyrProSerCysCysCysThrLysProSerAspGly65707580AsnCysThrCys工leProlieProSerSerTrpAlaPheGlyLysPhe859095LeuTrpGluTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuLeuVal100105110ProPheValGinTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpLeuSer115120125ValMetTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerThrLeu130135140SerProPheLeuProLeuLeuPro工l.ePhePheCysLeuTrpValTyr145150155160工le<210><211><212><213><220><221><222><223>29161PRTTR5的HBsAgTransmisc—特征(99):.(99)X=任何氨基酸<400>29ProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhe工le151015工lePheLeuPhelieLeuLeuLeuCysLeuliePheLieuLieuValLeu202530LeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeu工leProGlySer354045SerThrThrSerAlaGlyProCysArgThrCysThrThrThrAlaGin505560GlyThrSerMetTyrProSerCysCysCysThrLysProSerAspGly65707580AsnCysThrCyslieProlieProSerSerTrpAlaPheGlyLysPhe859095LeuTrpXaaTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuLeuVal100105110ProPheValGinTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpLeuSer115120125ValMetTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerThrLeu130135140SerProPheI^euProLeuLeuProliePhePheCysLeuTrpValTyr84145lie<210:<211:<212:<213:<220:<221:<222:<223-15015516030305PRTTR6的HBsAgTransmisc—特征(168)-.(168)X=任何氨基酸<400>30SerThrAsnArgGinSerGlyArgGinProThrProLeuSerProPro1510ISLeuArgAspSerHisProGinAlaMetGinTrpAsnSerThrThrPhe202530HisGinThrIjeuGinAspProArgValArgGlylieuTyrLeuProAla354045GlyGlySerSerSerGlyThrValAsnProValProThrThrAlaSer505560Pro工leSerSerliePheSerArglieGlyAspLeuAlaLeuAsnMet65707580GluAsn工leThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLieuValLeuGinAla859095GlyPhePheLeuLeuThrArglieLeuThrlieProGinSerLeuAsp100105110SerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlyThxThrValCysLeu11512012SGlyGinAsnSerGinSerProThrSerAsngisSerProThrSerCys130135140ProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLieuArgArgPhelie145150155160liePheIjeuPhelieIjeuLeuXaaCysLeu工lePheLeuIjeuValLeu165170175LeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeulieProGlySer180185190SerThrThrSerAlaGlyProCysArgThrCysThrThrThrAlaGin195200205GlyThrSerMetTyrProSerCyscysCysThrLysProSerAspGly210215220AsncysThrCys工lePro工leProSerSerTrpAlaPheGlyL.ysL'eu225230235240LeuTrpAspTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerI*euLeuVal245250255ProPheValGinTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpLeuSer260265270ValMetTrpMetMetTrpTy:rTrpGlyProSerLeuTyrSerThrLeu275280285SerProPheLeuProLeuLeuPro工lePhePheCysLeuTrpValTyr290295300lie305<210><211><212><213>31945DNApreETV<400>31gccataaccttccaccaaactctgcaagmtccccctgctggtggctccagttccggaacagtaaaccctgttccgactactgcctctcacatatcgtcaatcttctcgaggattggggac60120cctgcgctgaatatggagaacatcacatcaggattcctaggaccccttctcgtgttacag180gcggggtttttcttgttgacaagaatcctcagagtctagactcgtggtgg2403CttCtctC3attttctagggggaaccaccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccca3003CCtCC33tCctcctgtcctacgacttgacctggttatcgctggatgtgt360ctgcggcgttttatcatattcctcttcstcctgctgctatgcctcatcttcttgttggtt420cttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcCtC33CC3CC480agcacgggaacatgccgaacttgcacgactcctgctcaaggaacctctatgtatccctcc540tgttgctgtaccsaaccttcggacggaaattgcacctgtattcccatcccatcatcctgg600gctttcggaaaattcctatgggagtgggcctcagcccgtttctcatggctcagtttasta"0gtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtttggctttcagttatgtgg720atgatgtggtattgggggccaagtctgtacagcatcttgagtccctttttaccgctgtta780ccaattttcttttgtctctgggtatacatttgaaccctaaagatggggtt8403ctcccta3attttatgggctatgtcattggatgttatgggtccttgcca900tcgtacataaaatcaaagaatgttttagaaaacttcctgt945<210>32<211>1245<212>DNA<213>onETV<400>32tgcctcattttgtgggtcaccatattcttgggaacaagatctacagcatggggcagaatc60tttccaccagcaatcctctgggattctttcccgaccaccsgttggatccagccttcagag120aaatccagattgggacttcaggacacctggccagacgcca180acaaggtaggagctggagcattcgggctgggtttcaccccaccgcacggaggccttttgg240ggtggagccctcaggctcsgggcatactacaaactttgccagcaaagccgcctcctgcct300ccaccastcgccagtcaggacggcagcctaccccgctgtctccacctttgagagacactc360atcctcaggcgcagtggaaaCCC3C33CCttccaccasactgtgcaagctccacctgctg420gtggctccagttccggaa^cagtaaaccctgttccgactactgcctctcacatatcgtcaa480tcttctcgaggattggggaccctgcgctgaatatggagaacatcacatcaggattcctag540gaccccttctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaataccga600agagtctagactggttatcggcctcatcttttccaggatcgaacctctatttcccatccctctcatggcttttggctttcgtccctttttctcgtggtgggcagtccccactggatgtgtcttgttggttCtC33CC3CCgtatccctccatcatcctggcagtttggtaatttatgtggaccgctgttaagatggggttacttctctcascctccaatcctgcggcgttcttctggactagcacgggaatgttgctgtagctttcggaagtgccatttgatgatgtggtccaattttctactccctaaa<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>33290preETVmisc—特征(9).:(9)X=任何氨基酸misc—特征(73):.(73)X=任何氨基酸misc—特征-(219)X=任何氨基酸attttctaggttatcatattatcaaggtatcatgccgaacCCa33CCttCaattcctatgttcagtggttattgggggcctttgtctctgttttatgggggggaaccaccgtgtgtcttg660ctcctgtcctccgacttgtc720cctcttcatcctgctgctat780gttgcccgtttgtcctctaa840ttgcacgactcctgctcaag900ggacggaaattgcacctgta960ggagtgggcctcagcccgtt1020cgtagggctttcccccactg1080aagtctgtacagcatcttga1140ggtatacatttgaaccctaa1200ctatg1245<400>33HisAsnLeuProProAsnSerAlaXaaSerPro1510CysTipTrpIjeuGin15PheArgAsnSerLysProCysSerAspTyrCysLeuSerHis工leVal202530AsnLeuLeuGluAspTrpGlyProCysAlaGluTyrGlyGluHisHis354045lieArglieProArgThrProSerArgValThrGlyGlyValPheLeu505560ValAspLysAsnProHisAsnThrXaaGluSerArgLeuValValAsp65707580PheSerGinPheSerArgGlyAsnHisArgValSerTrpProLysPhe859095AlaValProAsnLeuGinSerLeuThrAsnLeuLeuSerSerAspLeu100105110ThrTrpLeuSerLeuAspValSerAlaAlaPheTyrHislieProLeu115120125H土sProMaAlaMetProHisLeuLeuValGlySerSerGlyLeuSer130135140ArgTyrValAlaArgLeuSerSerAs.nSerArglieLeuAsnHisGin145150155160HisGlyAsnMetProAsnLeuHisAspSerCysSerArgAsnLeuTyr.165170175ValSerLeuLeuLeuLeuTyxGinThrPheGlyArgLysLeuHisLeu180185190TyrSerHisProlielieLeuGlyPheArgLyslieProMetGlyVal195200205GlyLeuSerProPheLeuMetAlaGinPheXaaSerAlalieCysSer210215220ValValArgArgAlaPheProHisCysLeuAlaPheSerTyrValAsp225230235240AspValValLeuGlyAlaLysSerValGinHisLeuGluSerLeuPhe245250255ThrAlaValThrAsnPheLeuLeuSerLeuGlylieHisLeuAsnPro260265270AsnLysThrLysArgTrpGlyTyrSerLeuAsnPheMetGlyTyrVal275280285lieGly290<210>34<211>251<212>PRT<213>onETV<400>34GluAspTrpGlyProCysAlaGluTyrGlyGluHisHis工leArg工le151015ProArgThrProSerArgValThrGlyGlyValPheLeuValAspLys202530AsnProHisAsnThrGluGluSerArgLeuValValAspPheSerGin354045PheSerArgGlyAsnHisArgValSerTrpProLysPheAlaValPro505560AsnLeuGinSerLeuThrAsnLeuLeuSerSerAspLeuSerTrpLeu65707580SerLeuAspValSerAlaAlaPheTyrHis工leProLeuHisProAla859095AlaMetProHisLeuLeuValGlySerSerGlyLeuSerArgTyrVal100105110AlaArgLeuSerSerAsnSerArglieLeuAsnHisGinHisGlyAsn115120125MetProAsnLeuHisAspSerCysSerArgAsnLeuTyrValSerLeu13013514090LeuLeuLeuTyrGinThrPheGlyArgLysLeuHisLeuTyrSerHis145150155160ProlielieLeuGlyPheArgLyslieProMetGlyValGlyL>euSer165170175ProPheLeuMetAlaGinPheGlySerAlalieCysSerValValArg180185190ArgAlaPheProHisCysLeuAlaPhe工leTyrValAspAspValVal135200205LeuGlyAlaLysSerValGinHisLeuGluSerLeuPheThrAlaVal210215220ThrAsnPheLeuLeuSerLeuGlylieHisLeuAsnProAsnLysThr225230235240LysArgTrpGlyTyrSerLeuAsnPheMetGly245250<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223>35110PRTpreETVmisc—特征(8).:(8)X=任何氨基酸misc—特征(72):.(72)X=任何氨基酸<400>35ThrPheHisGinThrLeuGinXaaProProAlaGlyGlySerSerSer151015GlyThrValAsnProValProThrThrAlaSerHislieSerSerlie202530PheSerArglieGlyAspProAlaLeuAsnMetGluAsn工leThrSer354045GlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuG、lnAlaGlyPhePheLeuLeu505560ThrArglieLeuThrlieProXaaSerLeuAspSerTrpTrpThrSer65707580LeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCysLeuGlyGinAsnSerGin859095SerProThrSerAsnHisSerProThrSerCysProProThr100105110<210>36<211>226<212>PRT<213>postETV<400>36MetGluAsnlieThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuGin151015AlaGlyPhePheLeuLeuThrArglieLeuThr工leProLysSerLeu202530AspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCys354045LeuGlyGinAsnSerGinSerProThrSerAsnHisSerProThrSer505560CysProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhe65707580lie工lePheLeuPhelieLeuLeuLeuCysLeu工lePheLeuLeuVal8S9095LeuLeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeulieProGly10010.511092Sei:SerThrThrSerThrGlyThrCysArgThrCysThrThrProAla115120125GinGlyThrSerMetTyrProSerCysCysCysThrLysProSerAsp130135140GlyAsnCysThrCysliePro工leProSerSerTrpAlaPheGlyLys145150155160PheLeuTrpGluTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuVal165170175ValProPheValGinTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpLeu180185190SerPheMetTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerlie195200205LeuSerProPheLeuProLeuLeuProliePhePheCysLeuTrpVal210215220Tyrlie22權利要求1.一種分離的HBV變體，其中所述的變體在編碼DNA聚合酶的基因內包含核苷突變，導致對所述的DNA聚合酶至少一個氨基酸的添加、置換和/或缺失，并且其中所述的變體對ETV和/或LMV和任選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性。2.權利要求1的分離的HBV變體，其中所述的變體對ETV表現(xiàn)下降的敏感性。3.權利要求1的分離的HBV變體，其中所述的變體對ETV和LMV均表現(xiàn)下降的敏感性。4.權利要求1-3的任一項的分離的HBV變體，其中所述的變體對特異于HBsAg的免疫試劑表現(xiàn)降低的相互作用。5.權利要求1的分離的HBV變體，其中所述的變體在HBVDNA聚合酶的F結構域中包含突變，因而使式I(SEQIDNO:l)所示的序列具有改變的氨基酸序列。式IL，B，B2，D，W,G,P，C，B3，B4,H,G,B5,H，B6,1,R,B7,P,R，T,P，B8,R，V，B9,G,G，V,F，L,V,D,K,N，P,H4N,T，B10,E，S，Bu，L，B12，V,D，F(xiàn)，S,Q,F,S,R,G，B13，B14,B15，V，S,W，P,K,F，A,V，P，N，L，B16,S，L,T，N，L,L,S*其中是L或R或I;B2是E或D;B3是T或D或A或N或Y;B4是E或D;B5是E或K或Q;B6是H或R或N;B7是I或T;B8是A或S;B9是T或R;B1()是A或T或S;Bu是R或T;B12是V或G;B13是S或I或T或N或V;B14是T或S或H或Y;B15是R或H或K或Q;B16是Q或P;并且其中S^旨定為氨基酸74。6.權利要求l的分離的HBV變體，其中所述的變體在A-E的任何一個結構域中包含突變，因而使式II(SEQIDNO:2)中所示的序列具有改變的氨基酸序列。式IISZiLSWLSLDVSAAFYHZzPLHPAAMPHLLZsGSSGLZ-RYVARLSSZ5^Z6Z7XNZ8QZ9Z10XXXZuLHZl2Z13CSRZ14LYVSLZl5LLYZwTZt7GZ18KLHLZ19Z20HPIZ2!LGFRKZ22PMGZ23GLSPFLLAQFTSAIZ24Z25Z26Z27Z28RAFZ29HCZ30Z31FZ32YM*DDZ33VLGAZ34Z35Z36Z37H&8EZ39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z46LLZ47Z48GIHLNPZ49KTKRWGYSLN,GYZ50IG其中X是任意氨基酸；Zt是N或D;Z2是I或P;Z3是I或V;Z4是S或D;Zs是T或N;Ze是R或N;Z7是N或I;Zs是N或Y或H;Z9是H或Y;Zh)是G或R;Zu是D或N;Z^是D或N;Zu是S或Y;Z"是N或Q;Z^是L或M;Z"是K或Q;Zn是Y或F;Zw是R或W;Zw是Y或L;Zm是S或A;Z21是I或V;Zu是I或L;Zm是V或G;Zm是C或L;乙25是A或S;Zm是V或M;Zn是V或T;Z28是R或C;Z29是F或P;Zm是L或V;Z^是A或V;Zm是S或A;^33是Y或L或M;Zw是K或R;Zm是S或T;Z36是V或G;Z"是Q或E;Z38是L或S或R;Zm是S或F;Z4o是F或Y;Z41是T或A;Z42是A或S;Z"是V或I;Z44是T或Zk是N或S;Z"是F或V;Zp是S或D;Z"是L或V;Z49是N或Q;Zso是V或I;和M免是氨基酸204;并且其中第一個S指定為氨基酸75。7.權利要求5或6的分離的HBV變體，其中所述的變體進一步包含改變的HBsAg。8.權利要求5或6或7中的分離的HBV變體，其中所述的變體對特異于HBsAg的免疫試劑表現(xiàn)降低的相互作用。9.在編碼HBsAg的核苷酸序列中包含突變的分離的HBV變體，該突變導致在所述的HBsAg中相應于SEQIDNO:l或SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的區(qū)域內氨基酸的添加、置換和/或缺失，并且其中所述的變體對ETV和/或LMV和任選的其它核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性。10.權利要求9中的分離的HBV變體，其中所述的變體對ETV表現(xiàn)下降的敏感性。11.權利要求9中的分離的HBV變體，其中所述的變體對ETV和LMV均表現(xiàn)下降的敏感性。12.權利要求9中的分離的HBV變體，其中特異于野生型HBsAg的抗體表現(xiàn)降低的中和所述HBV變體的能力，并且所述的HBV變體通過在聯(lián)合或序貫治療中使受試者暴露于ETV和LMV而篩選。13.權利要求1或9中的分離的HBV變體，在HBVDNA聚合酶中包含突變，所述突變選自間隔區(qū)L97I、間隔區(qū)K115R、間隔區(qū)H116L、間隔區(qū)L128F、間隔區(qū)S137G、間隔區(qū)R139G、間隔區(qū)F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、r頻04V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其組合或等同的突變。14.權利要求1或9或13中分離的HBV變異體，包含的突變選自PreSlN114D、PreSlT115S、PreS2F22L、PreS2V39A、PreS2P52L、sL群、sT118A、sF161L、sE164D、sI195M、sI208T、PreSlE86Q、PreSlN91K、PreS2P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F或其組合或等同的突變。15.權利要求1或9或13中的分離的HBV變體，包含的突變選自sF161L、sE164D和sI195M或其組合或等同的突變。16.權利要求1或9或13中的分離的HBV變體，包含的突變選自rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021和rtM204V或其組合或等同的突變。17.用以確定HBV對ETV和/或LMV或4壬選的其它核普類似物表現(xiàn)下降的敏感性的潛力的方法，所述的方法包括從所述的HBV分離DNA或相應的mRNA，并且在編碼HBVDNA聚合酶的核苷酸序列中篩選突變，該突變導致在所述DNA聚合酶的任何一個或多個F和A-E的結構域中或最接近那里的區(qū)域中至少一個氨基酸置換、缺失和/或添加，并且該突變和對ETV和/或LMV抗性或下降的敏感性相關，其中這種突變的存在是對所述的ETV和/或LMV可能存在抗性的指示。18.權利要求17的方法，其中篩選的突變選自間隔區(qū)L97I、間隔區(qū)K115R、間隔區(qū)H116L、間隔區(qū)L128F、間隔區(qū)S137G、間隔區(qū)R139G、間隔區(qū)F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其組合或等同的突變。19.用以確定HBV林是否對核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性的方法，所述的方法包括從所述的HBV分離DNA或相應的itiRNA，并且在編碼DNA聚合酶的核苷酸序列中篩選突變，其中在間隔區(qū)和rt區(qū)下面的突變間隔區(qū)L971、間隔區(qū)K115R、間隔區(qū)H116L、間隔區(qū)L128F、間隔區(qū)S137G、間隔區(qū)R139G、間隔區(qū)F142S、rtY54H、rtL911、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS2021、rtH248N、rtY252L或其組合或等同的一個或多個其它突變的存在對ETV和/或LMV和任選的其它核苷類似物具有下降的敏感性的變體的指示。20.權利要求19的方法，其中篩選的突變選自rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021和rtM204V或其組合或等同的突變。21.用以確定HBV、株是否對核苷類似物表現(xiàn)下降的敏感性的方法，所述的方法包括從所述HBV分離DNA或相應的mRNA，并且在編碼DNA聚合酶的核普酸序列中篩選突變，其中在rt區(qū)的B或C結構域中下面的突變rtll69T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或其組合或等同的一個或多個其它突變的存在對ETV和/或LMV和任選的其它核苷類似物具有下降的敏感性的變體的指示。22.用于檢測對HBV表現(xiàn)抑制活性的藥物的方法，所述HBV對ETV和/或LMV表現(xiàn)抗性或下降的敏感性，所述的方法包括產生一個基因構建體，該構建體包含包含于質粒栽體中的來自HBV的復制有效量的基因組，然后用所述的構建體轉染所述的細胞；在轉染前、期間和/或之后，用待檢測的藥物接觸細胞；在一定條件下培養(yǎng)所述細胞一段時間，所述條件為如果對所述的物質有抗性則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；并且對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在所述藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或組裝和/或釋放。23.用于檢測對HBV表現(xiàn)抑制活性的藥物的方法，所述HBV對ETV和/或LMV表現(xiàn)抗性或下降的敏感性，所述的方法包括產生一個基因構建體，該構建體包含來自所述HBV的復制有效量的基因組，其包含或融合于感染細胞有效量的桿狀病毒基因組中，然后用所述的構建體感染所述的細胞；在感染前、期間和/或之后，用待檢測的藥物接觸細胞；在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所述條件為如果對所述的藥物有抗性則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；并且對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或組裝和/或釋放。24.用于檢測對HBV表現(xiàn)抑制活性的藥物的方法，所述HBV對ETV和/或LMV表現(xiàn)抗性或下降的敏感性，所述的方法包括產生一個基因構建體，該構建體包含來自所述HBV的復制有效量的基因組，其包含于或融合于感染細胞有效量的桿狀病毒基因組中，然后用所述的構建體感染所述的細胞；在感染前、期間和/或之后，用待檢測的藥物接觸細胞；在一定條件下培養(yǎng)細胞一段時間，所述條件為如果對所述的藥物有抗性則足以使HBV復制、表達基因序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；并且對細胞、細胞裂解物或培養(yǎng)上清液應用病毒或病毒組分檢測方法來確定在藥物的存在下，病毒是否已經復制、表達遺傳物質和/或組裝和/或釋放。25.權利要求22或23或24的方法，其中HBV基因組穩(wěn)定整合入細胞的基因組中。26.疫苗，包含權利要求l-16任一項中的HBV變體的抗原組分或其抗體。27.權利要求26的疫苗，其中抗原組分是HBsAg或PreSl或PreS2。28.權利要求26中的疫苗，其中抗原組分是缺陷型的HBV變體。29.權利要求26中的疫苗，包含針對HBsAg或PreSl或PreS2的抗體。30.用于評估病毒變體或包含病毒變體的生物樣本的可能的有效性的計算機產品，以確定在受試者中合適的治療方案，所述的產品包括(1)編碼，作為輸入Ivs接受用于至少兩種和所述的病毒或包含該病毒的生物樣本相關的特性，其中所述的特性選自(f)對特定的化合物或免疫試劑表現(xiàn)抗性或下降的敏感性的能力；(a)改變的來自野生型HBV的DNA聚合酶；(b)改變的來自野生型HBV的表面抗原；或(c)患者的發(fā)病和復原的潛力；(d)改變的復制能力(升高的或下降的)；(2)計算所述Ivs的和以提供相應于所述的病毒變異體或生物樣本的Pv的總和的編碼；和(3)儲存編碼的計算機可讀介質。31.用于評估病毒變體或包含該病毒變體的生物樣本在受試者中的可能的有效性的計算機，其中所述的計算機包括(1)機器可讀數(shù)據(jù)存儲介質，包括機器可讀數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲材料，其中所述的機器可讀數(shù)據(jù)包括用于至少兩種和所述病毒變體或生物樣本相關的特性的Ivs，其中所述的特性選自(a)對特定的化合物或免疫試劑表現(xiàn)抗性或下降的敏感性的能力；(b)改變的來自野生型HBV的DNA聚合酶(c)改變的來自野生型HBV的表面抗原；或(d)患者的發(fā)病和復原的潛力；(e)改變的復制能力(升高的或下降的)；(2)用于存儲指令的工作存儲器，該指令用于處理所述的機器可讀的數(shù)據(jù)；(3)結合到所述的工作存儲器和所述的機器可讀數(shù)據(jù)存儲介質的中心處理單元，用于處理所述的機器可讀數(shù)據(jù)以提供相應于所述化合物Pv的所述Ivs的總和；并且(4)結合到所述的中心處理單元的輸出硬件，用于接收所述的Pv。32.藥物的組合物，包括能夠直接或間接抑制在權利要求1-16的任何一個中定義的HBV變體的藥物，所述的組合物進一步包括一種或多種藥物可接受載體和/或稀釋劑。33.權利要求32的組合物，其中的藥物是來自所述的HBV變體的重組蛋白。34.權利要求33的組合物，其中的重組蛋白是HBsAg或PreSl或PreS2。35.權利要求32的組合物，其中的藥物能夠抑制HBV變體聚合酵。36.權利要求35的組合物，其中的藥物是通過自然產物篩選或合理的藥物設計鑒定的。37.權利要求32的組合物，其中的藥物是缺陷型的HBV變體。38.權利要求32的組合物，其中藥物是針對HBV復合物的抗體。39.權利要求32的組合物，其中藥物是相對于HBV基因的核酶、反義分子或有義分子。全文摘要本發(fā)明涉及對核苷類似物具有改變的敏感性的病毒變體及其應用。更具體地，本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒(HBV)變體，該變體對核苷類似物表現(xiàn)完全或部分的抗性和/或與針對病毒表面組分的抗體降低的相互作用，包括對這些抗體的下降的敏感性。本發(fā)明進一步涉及用于檢測這種病毒變體的測定，該測定在監(jiān)控抗病毒治療方案和開發(fā)新的或改進的針對病毒尤其是HBV變體的疫苗上是有用的。本發(fā)明也涉及應用病毒變體來篩選能夠抑制病毒感染、復制和/或釋放的藥物。文檔編號C12Q1/02GK101555468SQ20091013683公開日2009年10月14日申請日期2003年2月5日優(yōu)先權日2002年2月7日發(fā)明者A·I·巴爾托羅姆斯,A·艾利斯,P·W·安格斯,S·A·落卡里尼,W·西維爾特申請人:墨爾本保健公司;奧斯丁保健公司;南方保健公司