專利名稱：D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，涉及一種氨基酸的生物轉(zhuǎn)化方法，尤其涉及一 種利用微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化D，L-丙氨酸外消旋體系中的L-丙氨酸以制備D-丙氨 酸的方法，更具體的涉及一種利用L-丙氨酸脫氨酶的高度專一性，將菌體胞 內(nèi)的L-丙氨酸分解為氨和丙酮酸，并得到D-丙氨酸的方法。
背景技術(shù)：
丙氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸之一，是血中氮的優(yōu)良運輸工 具，又是一種有效的生糖氨基酸。D-丙氨酸是丙氨酸的一種立體構(gòu)型，為非 天然的氨基酸，不是蛋白質(zhì)組成氨基酸和人體正常代謝氨基酸，現(xiàn)代研究表 明，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域有重要用途。
在醫(yī)藥方面，D-丙氨酸是生產(chǎn)維生素B6的原料，有鎮(zhèn)痛作用，它還可 以做成輸液注射、單劑或合劑(氨基酸的應(yīng)用[J]，1996，154)。在法國，D-丙 氨酸被用做防止顏面潮紅的藥物。近年的研究還發(fā)現(xiàn)D-丙氨酸具有其他生理 活性方面的應(yīng)用。D-丙氨酸可使體內(nèi)氨基酸氧化酶(DAAO)在腫瘤細(xì)胞質(zhì) 中異位表達，阻止體內(nèi)脂質(zhì)氧化損傷，清除細(xì)胞毒性(遼寧化工[J],2003, 2,58-60) 。 D-丙氨酸還可以抑制致二甲基亞硝胺(DMNA)的致癌作用，有 效抑制率為72.4%。具有伯胺基的D-丙氨酸能競爭性地替代仲胺與亞硝酸鹽 生成VAN Slyke反應(yīng)，分解為氮氣和有機酸，從而抑制了 DMNA的生成。 因此D-丙氨酸可以應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防。
在食品方面，D-丙氨酸具有丙氨酸的一些共性，即在食品添加劑方面的增加化學(xué)調(diào)味料的調(diào)味效果，改善人工甜
味劑的味感，改善有機酸的酸味。另外，D-丙氨酸本身具有自己的特性，可 以應(yīng)用在功能性食用甜味劑方面。D-丙氨酸甜度高、安全、無熱量，既適合 普通人群消費，更適合肥胖和糖尿病人消費。D-丙氨酸是合成二肽甜味劑L-天冬氨酸-D-丙氨酸的原料之一 (JP5276965)。
在化妝品方面，D-丙氨酸有抑菌作用，而且是自然保濕因子的主要成分， 是角質(zhì)層保持水分的重要角色。
目前D-丙氨酸的制備方法主要有生物法和化學(xué)法。
D-丙氨酸的化學(xué)法制備有兩種， 一種是利用不對稱合成法直接得到D-丙氨酸，另一種是通過化學(xué)合成法得到DL-丙氨酸的混旋體，再利用各種光 學(xué)拆分方法制備D-丙氨酸。
Yanakada在培養(yǎng)基中添加聚乙二醇，在3(TC培養(yǎng)D-環(huán)絲氨酸抗性的短 桿菌(乳酸發(fā)酵短桿菌DCSR-26) 72 h，可得高光學(xué)純度D-丙氨酸 (JP5276965) ; Takeuchi等人報道用5rev/6acten'"/w /ac/o/emewrt^的抗D-環(huán)絲氨酸的突變株來發(fā)酵生成D-丙氨酸的研究，但由于丙氨酸消旋酶的作 用，所得到的D-丙氨酸的光學(xué)純度很低(EP0310949) 。 Yamada等人篩選 出一株氯代D-丙氨酸抗性菌(乳酸發(fā)酵短桿菌HR5-43)，在950mL培養(yǎng)基 中添加葡萄糖、生物素、維生素B、磷酸鹽等，在pH6.0-8.0下發(fā)酵72 h可 得19.1g的D-丙氨酸，其光學(xué)純度可達99% (JP5308981)。
Noriko Ito等禾!j用Cawc/i'c/a、 Oy/ fococcws 、 //itmsewMra禾口 7Wc&os; orow同 化L-丙氨酸而對D-丙氨酸不起作用的特點，開發(fā)了不對稱降解DL-丙氨酸生 物法制備D-丙氨酸的新工藝(US5，422,255)。
通過比較生物法和化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，化學(xué)法生產(chǎn)D-丙氨酸污染大，效率低，光學(xué)純度不高，并且設(shè)備費用昂貴。而發(fā)酵法菌種的篩選工作比較困難，
發(fā)酵周期長，能耗高，產(chǎn)物濃度低，提取困難。而利用生物法對DL-丙氨酸 外消旋體系中L-丙氨酸的高效轉(zhuǎn)化制備D-丙氨酸，其工藝條件溫和，無需高 溫高壓，環(huán)境友好，且底物轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度都很高，成本較低，有重要的 產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，利用微生物細(xì)胞中 的L-丙氨酸脫氨酶將菌體胞內(nèi)的L-丙氨酸分解為氨和丙酮酸，從而實現(xiàn)制備D-丙氨酸的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種L-丙氨酸的高效轉(zhuǎn)化菌株合適培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所述的用于L-丙氨酸轉(zhuǎn)化的菌株為糞腸球菌(^"tera⑦"^ /^^7/&)、 格氏沙雷氏菌(Serra^igr/wew'/)或其混合。
本發(fā)明所用的糞腸球菌為ATCC29212，僅作為滿足本發(fā)明的充分公開而非限 制，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以使用該種菌的其它菌株，如但不僅限于，ATCC882、 ATCC4083、 ATCC10100、 ATCC11832和ATCC29200等在ATCC列表中可以 査詢到的菌株，以實現(xiàn)本發(fā)明相同的目的。
本發(fā)明所用的格氏沙雷氏菌為ATCC35478，僅作為滿足本發(fā)明的充分公開 而非限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以使用該種菌的其它菌株，如但不僅限于， ATCC14460、 ATCC14461禾n ATCCBAA-1054，以實現(xiàn)本發(fā)明相同的目的。
培養(yǎng)本發(fā)明所述菌種的種子培養(yǎng)基組成為牛肉膏5-10g、蛋白胨10-20g、
6磷酸二氫鉀l-5g、硫酸鎂0.2-1.0g和L-丙氨酸5-50g，用水定容至1000mL， pH 為6.5-7.5。
種子培養(yǎng)時裝液量為50-100mL/250mL三角瓶，接種量為一根長滿的試管斜 面，培養(yǎng)溫度為25-37r，優(yōu)先選擇30-37""C，搖床轉(zhuǎn)速為100-200r/min，優(yōu)先選 擇150-200r/min。
當(dāng)種子培養(yǎng)基當(dāng)中的L-丙氨酸脫氨酶酶活力大于1U/mL時(酶活力定義 lmin轉(zhuǎn)化l^imol的L-丙氨酸的酶量即為1U)，即可保藏作為發(fā)酵用的菌種或 以此作為種子逐級傳代并進行菌種選育或轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基當(dāng)中進行發(fā)酵培養(yǎng)。
本發(fā)明所述發(fā)酵培養(yǎng)為有氧發(fā)酵或厭氧發(fā)酵，其發(fā)酵培養(yǎng)基具體組成為 酵母膏5-20g、葡萄糖10-20g、蛋白胨5-20g、玉米漿5-10g、磷酸二氫鉀1.0-2.0g、 硫酸鎂0.5-1.0g和D，L-丙氨酸5-200g，用水定容至1000mL， pH為7.0-7.5。
發(fā)酵培養(yǎng)時裝液量為50-150mL/250mL三角瓶，接種量為2-10%,v/v,培養(yǎng) 溫度為25-37"C，搖床轉(zhuǎn)速為100-200rpm。
本發(fā)明所述的菌種種子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)方法、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)方 法，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以根據(jù)實際需要按各種組成、用量或體積進行整數(shù)倍 擴大。如當(dāng)接種培養(yǎng)使用500mL燒杯時，裝液量則為100-200mL，接種量則 為二根長滿的試管斜面，搖床轉(zhuǎn)速則根據(jù)實際需要進行調(diào)整。
本發(fā)明所述的D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，其步驟如下
1) 將經(jīng)培養(yǎng)的種子菌種以2-15% (V/V)接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中；
2) 在培養(yǎng)溫度25-37°C，搖床轉(zhuǎn)速100-200rpm，進行有氧發(fā)酵培養(yǎng)12-36h， 培養(yǎng)基的pH值控制在6-8之間；
3) 當(dāng)發(fā)酵液中丙氨酸含量不再減 少時，將發(fā)酵液 心去除菌體；4)將離心所得上清液用活性炭脫色去蛋白后，再經(jīng)離子交換柱分離后，濃 縮至合適濃度，結(jié)晶。
上述制備方法中，可以采用厭氧發(fā)酵，所述的有氧發(fā)酵可以采用通入氧氣， 所述氧氣是純氧氣或是含有氧氣的混合氣體，如空氣；可以采用搖瓶培養(yǎng)或 攪拌式發(fā)酵罐等方式的通風(fēng)培養(yǎng)。此處所列舉的內(nèi)容不作為限定本發(fā)明，本領(lǐng) 域技術(shù)人員能夠根據(jù)本領(lǐng)域教科書或試驗手冊選擇相應(yīng)的實現(xiàn)本發(fā)明目的培養(yǎng) 方式。
上述制備方法中，所述的離子交換可以選擇陽離子交換或陰離子交換，優(yōu) 先選擇陽離子交換，離子交換樹脂的強弱不作為限定本發(fā)明。所得母液可以與 下一次轉(zhuǎn)化液合并濃縮，再結(jié)晶。結(jié)晶所得的粗品也可以通過重結(jié)晶進行精制。 通過離子交換柱制得的D-丙氨酸還可以采用如重結(jié)晶或乙醇沉淀等方法進行 進一步的精制。
本發(fā)明實現(xiàn)的有益效果
本發(fā)明采用微生物菌種細(xì)胞內(nèi)的L-丙氨酸脫氨酶能將L-丙氨酸分解為氨和 丙酮酸的特性，實現(xiàn)了對D，L-丙氨酸為原料進行快速而簡便的生物法制備D-丙 氨酸。該方法能使D-丙氨酸的保留率在90。/。以上，相對于底物D,L-丙氨酸，目 標(biāo)產(chǎn)物的得率在45%以上，提高了該產(chǎn)品的經(jīng)濟效益。
具體實施例方式
以下詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實施例僅供說明具體方法，該 方法的其規(guī)模不受實施例的限制。種子培養(yǎng)基組成如下牛肉膏7.5g，蛋白胨15g，磷酸二氫鉀3.5g，硫 酸鎂0.5g, L-丙氨酸25g，水1000mL， pH7.5， 12rC滅菌20分鐘。
發(fā)酵培養(yǎng)基如下葡萄糖2.0g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.7g，玉米漿0.8g， 磷酸二氫鉀O.lg，硫酸鎂0.06g， D，L-丙氨酸10g，水100mL， pH7.2。
用適量的滅菌過的種子培養(yǎng)基將凍干的格氏沙雷氏菌(ATCC35478)菌 種溶解，然后接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37。C恒 溫培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。 24hrs后取上述種子lOmL接入新鮮的種子培 養(yǎng)基繼續(xù)活化。當(dāng)種子培養(yǎng)基當(dāng)中的L-丙氨酸脫氨酶酶活力大于1U/mL時(酶 活定義lmin轉(zhuǎn)化lpinol的L-丙氨酸的酶量即為1U)后，取4mL上述活化好 的菌種接入100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，200rpm下37。C恒溫培養(yǎng)36h。
將上述發(fā)酵液6000rpm離心20min去除菌體，然后在上述離心所得上清 液中加入2g活性炭，充分?jǐn)嚢?0min，過濾，收集濾液。將濾液上氫型強酸 離子交換樹脂，然后用氨水洗脫，洗出液中再加入5g活性碳脫色后濃縮至 30mL，加入50mL乙醇，結(jié)晶，得干燥固體物4.5g，測樣品旋光，[a￡ = -14.55 (C=5%， 1MHC1)。
實施例2
種子培養(yǎng)基組成如下牛肉膏5.5g，蛋白胨10g，磷酸二氫鉀1.5g，硫 酸鎂1.0g， L-丙氨酸10g,水1000mL， pH7.5， 121。C滅菌20分鐘。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下葡萄糖12g，酵母膏8g，蛋白胨5g，玉米漿8g， 磷酸二氫鉀O.lg，硫酸鎂0.06g， D，L-丙氨酸150g，水1000mL， pH7.2。
用適量的滅菌過的種子培養(yǎng)基將凍干的糞腸球菌(ATCC29212)菌種溶 解，然后接入裝有70mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37。C恒溫培 養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為170r/min。 24hrs后取上述種子10mL接入新鮮的種子培養(yǎng)基 繼續(xù)活化。當(dāng)種子培養(yǎng)基當(dāng)中的L-丙氨酸脫氨酶酶活力lU/mL時(酶活定義 lmin轉(zhuǎn)化lnmol的L-丙氨酸的酶量即 為1U)后，取5mL上述活化好的菌。
將上述發(fā)酵液6000rpm離心20min去除菌體，然后在上述離心所得上清 液中加入12g活性炭，充分?jǐn)嚢?0min，過濾，收集濾液。將濾液上氫型強 酸離子交換樹脂，然后用氨水洗脫，洗出液中再加入15g活性碳脫色后濃縮 至300mL，加入600mL乙醇，結(jié)晶，得干燥固體物72.5g，測樣品旋光，[o^5 =-14.25 (C=5%， 1MHC1)。
權(quán)利要求
1.一種D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，其步驟如下1)將經(jīng)培養(yǎng)的種子菌種以2-15％，V/V接種量轉(zhuǎn)接到含D，L-丙氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中；2)在培養(yǎng)溫度25-37℃，搖床轉(zhuǎn)速100-200rpm，進行有氧發(fā)酵培養(yǎng)12-36h，培養(yǎng)基的pH值控制在6-8之間；3)當(dāng)發(fā)酵液中丙氨酸含量不再減少時，將發(fā)酵液離心去除菌體；4)將離心所得上清液用活性炭脫色去蛋白后，再經(jīng)離子交換柱分離后，濃縮至合適濃度，結(jié)晶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，其特征在于所 述的菌種為糞腸球菌和格氏沙雷氏菌之一種或菌種的混合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，其特征在于用 于所述經(jīng)培養(yǎng)的種子菌種的培養(yǎng)基組成為牛肉膏5-10g、蛋白胨10-20g、磷 酸二氫鉀l-5g、硫酸鎂0.2-1.0g和L-丙氨酸5-50g，用水定容至1000mL， pH 為6.5-7.5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，其特征在于用 于所述經(jīng)培養(yǎng)的種子菌種的培養(yǎng)方法為裝液量50-100mL/250mL三角瓶，接 種量為一根長滿的試管斜面，培養(yǎng)溫度為25-37t:，搖床轉(zhuǎn)速為100-200r/min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，其特征在于所 述的培養(yǎng)溫度為30-37°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，其特征在于所 述的搖床轉(zhuǎn)速為150-200r/min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，其特征在于所 述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為酵母膏5-20g、葡萄糖10-20g、蛋白胨5-20g、玉米漿5-10g、 磷酸二氫鉀1.0-2.0g、硫酸鎂0.5-1.0g和D,L-丙氨酸5-200g，用水定容至1000mL， pH為7.0-7.5。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，其特征在于發(fā) 酵培養(yǎng)時裝液量為50-150mL/ 250mL三角瓶，接種量為2-10%,V/V。
全文摘要
一種D-丙氨酸的生物法制備技術(shù)，將經(jīng)培養(yǎng)的種子菌種以2-15％(V/V)接種量轉(zhuǎn)接到pH值6-8且含D，L-丙氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25-37℃，搖床轉(zhuǎn)速100-200rpm，進行有氧發(fā)酵培養(yǎng)12-36h，再依次經(jīng)過離心、脫色、離子交換和濃縮結(jié)晶后得到產(chǎn)品。本發(fā)明技術(shù)方案實現(xiàn)了從D，L-丙氨酸原料中快速而簡便地制備D-丙氨酸。該方法能使D-丙氨酸的保留率在90％以上，相對于底物D，L-丙氨酸，目標(biāo)產(chǎn)物的得率在45％以上，提高了該產(chǎn)品的經(jīng)濟效益。
文檔編號C12P41/00GK101649344SQ20091010079
公開日2010年2月17日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者李加友 申請人:嘉興學(xué)院