專利名稱：一種抗中華鱉免疫球蛋白單克隆抗體及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于抗水產(chǎn)生物免疫球蛋白單克隆抗體及其應用，特別是抗甲魚免疫球蛋 白單克隆抗體及應用。
背景技術(shù)：
近年來，隨著中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，中華鱉病害也日益猖獗。暴發(fā)性疾病的發(fā)生與 流行阻礙了中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。要解決這些問題，除了加強管理、提高養(yǎng)殖技術(shù)外， 還必須重視其病原學、免疫學等領域的研究，將免疫預防手段引入到中華鱉養(yǎng)殖業(yè)，通過免 疫手段有效增強中華鱉主動防御能力，減少疾病發(fā)生機率?；谶@種認識和生產(chǎn)上的需求， 本發(fā)明者開展了針對中華鱉免疫球蛋白(IgM)單克隆抗體的研究。雜交瘤_單克隆抗體技 術(shù)由KoTtler和Milstein發(fā)明于1975年。80年代初在世界各國興起單克隆抗體研究熱 潮，現(xiàn)在每年都有近萬篇有關(guān)單克隆抗體的研究報道，單克隆抗體已從初期的探索性研究 進入大量開發(fā)、應用階段。此外，單克隆抗體技術(shù)與現(xiàn)代分子生物學技術(shù)相結(jié)合還可以用于 基因定位、表達文庫的篩選、基因表達產(chǎn)物的檢測與提純。盡管單克隆抗體已廣泛應用于生 命科學的方方面面，但應用單克隆抗體研究水產(chǎn)類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)與功能，用于水產(chǎn)類病 原微生物研究、檢測與快速診斷方面的報道卻為數(shù)不多，AK Siwicki制備了抗金魚免疫球 蛋白單克隆抗體并用于抗體分泌細胞和免疫水平監(jiān)測，Lin和Harry應用單克隆抗體分析 小瓜蟲保護性抗原并進行了被動免疫實驗，Austin建立以單克隆抗體為核心的水產(chǎn)病原快 速檢測方法。本發(fā)明是發(fā)明者開展中華鱉免疫球蛋白(IgM)單克隆抗體的研究，包括將單 克隆抗體運用于中華鱉體液免疫應答規(guī)律的研究、病原診斷、流行病學、血清學調(diào)查和中華 鱉IgM結(jié)構(gòu)與功能的分析研究的構(gòu)成部分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決當今應用單克隆抗體研究水產(chǎn)類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)與功能，單克隆體 用于水產(chǎn)類病原微生物研究、檢測與快速診斷方面的工作甚少，以至于對水產(chǎn)類生物特別 是甲魚的疾病診斷與防治困難的問題，為此提供本發(fā)明的一種抗中華鱉免疫球蛋白單克隆 抗體及其應用。為解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案包括一種抗中華鱉免疫球蛋白單克隆抗體及 這種單克隆抗體的應用。本發(fā)明的一種抗中華鱉免疫球蛋白單克隆抗體，其特殊之處是該單克隆抗體是按 以下步驟制備的抗體(1)制備中華鱉特異性抗原中華鱉頸部切斷，采其血置于玻瓶，于室溫下凝固， 用無菌棒沿玻瓶內(nèi)壁括撥將血塊與瓶壁的粘連分離后，先于35 38°C放置1. 5 3h，再于 3 6°C放置8 12h，血清充分析出，離心沉淀，取其上清，制SephadexG-200層析柱，中華 鱉血清經(jīng)硫酸銨水溶液粗提并透析濃縮后，用PBS (pH7. 4)倍比稀釋，經(jīng)濾膜過濾后上樣， 用PBS洗脫，自動采樣器收集洗脫液，并用紫外分光光度計跟蹤測定洗脫液的蛋白濃度，最先洗脫的蛋白IgM即為中華鱉特異性抗原；該抗原蛋白H鏈分子量為63kD，L鏈分子量均為 22kD ；(2)制備多克隆抗體以所述中華鱉特異性抗原免疫動物，取血，分離出抗血清， 純化制得所述多克隆抗體，并以所述中華鱉特異性抗原的包被抗原檢測所述抗血清，證明 為含抗所述中華鱉特異性抗原的多克隆抗體；(3)制備一種雜交瘤細胞株以骨髓瘤細胞與產(chǎn)生抗中華鱉血清蛋白IgM抗體的 脾細胞融合得該雜交瘤細胞株(生物材料保藏日期2009年6月2日，保藏單位中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC No.3113)，所述的脾細胞取自以 所述中華鱉血清蛋白IgM免疫的動物；(4)制備一種抗中華鱉免疫球蛋白的單克隆抗體以所述的雜交瘤細胞株產(chǎn)生該 單克隆抗體，該單克隆抗體對所述的中華鱉免疫球蛋白IgM具有特異性。步驟(1)中，所述血塊與瓶壁的粘連分離后，宜先于37°C放置2h，再于4°C放置 10h，血清充分析出后，2000r/mim離心沉淀；所述層析柱，以柱長70cm，直徑1. 6cm為合適。
所述硫酸銨水溶液可以是50 % (W/W)水溶液。所述濾膜為厚度0. 45 μ m濾膜，該濾膜為業(yè)內(nèi)常用濾膜。本發(fā)明所述單克隆抗體的應用，是指一種檢測中華鱉免疫血清抗體效價的方法， 其特殊之處是用所述抗中華鱉免疫球蛋白的單克隆抗體檢測中華鱉免疫血清抗體效價。所述效價檢測可以用間接ELISA或間接競爭ELISA檢測。本發(fā)明所述的一種多克隆抗體，是以所述的免疫抗原(如中華鱉免疫球蛋白)免 疫動物取血制得的抗血清，以所述的包被抗原(如中華鱉免疫球蛋白)檢測該抗血清，可以 證明含抗中華鱉免疫球蛋白的多克隆抗體。例如，抗中華鱉免疫球蛋白多抗是由Balb/c小 鼠全血中分離獲得的，是由上述免疫抗原刺激Balb/c小鼠機體而產(chǎn)生的針對中華鱉免疫 球蛋白的特異性抗體。本發(fā)明所述的一種抗中華鱉免疫球蛋白的單克隆抗體，是由所述的雜交瘤細胞株 所產(chǎn)生的、對中華鱉免疫球蛋白具有特異性的并含均一物質(zhì)的抗體。該細胞分泌的免疫球 蛋白能夠有效特異的結(jié)合中華鱉免疫球蛋白，最高效價達到5. 12X105，同時具有很好的特 異性。例如，所述的細胞株來自于SP2/0細胞與Balb/C小鼠(經(jīng)本發(fā)明所述免疫抗原免 疫)脾細胞融合細胞，所述的免疫球蛋白來自于Balb/c小鼠，由雜交瘤細胞系免疫其機體 后產(chǎn)生腹水而純化獲得。本發(fā)明所述的一種檢測中華鱉免疫血清抗體效價的方法，是用所述的單克隆抗體 檢測，優(yōu)選的是用間接競爭ELISA進行測定。綜合上述，本發(fā)明是將純化的中華鱉血清免疫球蛋白免疫動物，取其血，分離出抗 血清，純化制得所述多克隆抗體，通過產(chǎn)生抗中華鱉血清蛋白IgM抗體的脾細胞(取自以所 述中華鱉血清蛋白IgM免疫的動物)與骨髓瘤細胞的融合獲得能夠分泌特異性抗體的雜交 瘤細胞株，該細胞株能夠分泌中華鱉免疫球蛋白的單克隆抗體。用此抗體可用于中華鱉免 疫血清效價的測定。該抗體具有高度特異、高度靈敏等特點，可用于中華鱉免疫球蛋白的結(jié) 構(gòu)分析、免疫應答水平監(jiān)測和病原診斷、具有廣闊的應用前景。本發(fā)明所述雜交瘤細胞株生物材料保藏日期2009年6月2日，保藏編號CGMCC No. 3113，分類命名雜交瘤細胞，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物
4中心，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所。
具體實施例方式一、中華鱉IgM單克隆抗體的制備(1)制備中華鱉特異性抗原中華鱉頸部切斷，采其血置于玻瓶，于室溫下凝固， 用無菌棒沿玻瓶內(nèi)壁括撥將血塊與瓶壁的粘連分離后，先于37°C放置2h，再于4°C放置 IOh,血清充分析出，2000r/min離心沉淀，取其上清，制S印hadexG_200層析柱，柱長70cm， 直徑1. 6cm,中華鱉血清經(jīng)50% (W/W)硫酸銨水溶液粗提并透析濃縮后，用PBS(pH7. 4)倍 比稀釋，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾后上樣，用PBS洗脫，自動采樣器收集洗脫液，并用紫外分光光 度計跟蹤測定洗脫液的蛋白濃度，最先洗脫的蛋白IgM即為中華鱉特異性抗原；該抗原蛋 白H鏈分子量為63kD，L鏈分子量均為22kD。(2)制備多克隆抗體以中華鱉特異性抗原免疫小鼠或兔，取血，分離出抗血清， 純化制得多克隆抗體。(3)制備一種雜交瘤細胞株制備以SP2/0骨髓瘤細胞與產(chǎn)生抗中華鱉血清蛋白 IgM抗體的Balb/C小鼠脾細胞融合得雜交瘤細胞株。(4)制備一種抗中華鱉免疫球蛋白的單克隆抗體以所述的雜交瘤細胞株產(chǎn)生該 單克隆抗體，該單克隆抗體對所述的中華鱉免疫球蛋白IgM具有特異性。步驟(2)中小鼠免疫及步驟(3)產(chǎn)生所述抗體的小鼠免疫具體為以所述中華鱉特異性抗原免疫5只雌性Balb/C小鼠，另取5只做陰性對照。每次 免疫以IOOyg/只的中華鱉免疫球蛋白劑量免疫小鼠。免疫程序采用兩次基礎免疫及二次加強免疫，基礎免疫時間分別為0d，15d，加強 免疫21d，融合前3天腹腔及尾靜脈途徑再加強免疫一次。將免疫抗原用生理鹽水稀釋，第 一次基礎免疫用弗氏完全佐劑乳化的抗原注射于小鼠的頸背部皮下(多點)或腹腔內(nèi)，第 二次基礎免疫取用弗氏不完全佐劑乳化好的抗原注射于小鼠的頸背部皮下(多點)或腹腔 內(nèi)，以后加強免疫同上述第二次基礎免疫。步驟(3)制備雜交瘤細胞株具體為細胞融合提前制備小鼠飼養(yǎng)細胞層，步驟為頸椎脫臼法將Balb/C小鼠處死，用 眼科剪刀剪開腹部皮膚，利用一次性注射器將不完全1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔內(nèi)，反復抽 吸幾次，最后將注入的液體全部吸出，放入50ml離心管中，3000rpm離心IOmin用HAT培養(yǎng) 液懸浮沉淀，混勻后以100 μ 1/孔鋪入96孔細胞培養(yǎng)板中。將SP2/0骨髓瘤細胞與前述 免疫Balb/C小鼠脾細胞以1 5的細胞個數(shù)比例，在50ml離心管中混勻，lOOOrpm，離心 lOmin，棄上清(可用滅菌的濾紙吸干)；將裝有細胞混合物的離心管放于37°C水浴中，然后 在Imin內(nèi)慢慢滴入Iml預溫至37°C的50% PEG，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌，完全加完后繼 續(xù)攪拌30s，靜置lmin，然后慢慢加入37°C預溫的1640基礎培養(yǎng)液10ml。具體加入的方法 第Imin逐滴滴入lml，第2min力口 lml，第3_4min加3ml，第5min加其余的5ml，每次加時需 緩慢加入，并不斷輕輕攪拌。最后緩慢加入30ml 1640基礎培養(yǎng)液，IOOOrpm離心7min，去 上清，于37°C放置5min，用HAT完全培養(yǎng)基懸浮，得融合細胞；同時也用HAT培養(yǎng)基懸浮上 述制備的飼養(yǎng)脾細胞，與上述融合后的細胞混合，根據(jù)需要補加適量的HAT，接種于96孔細 胞培養(yǎng)板中，約200 μ 1/孔，然后置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。建立雜交瘤細胞系提前制備飼養(yǎng)脾細胞(方法同上)，將雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內(nèi)
5輕輕地吹下，用血細胞計數(shù)板對活細胞進行計數(shù)將細胞用1640完全培養(yǎng)基分別稀釋到5， 10,50個細胞/毫升，將上述三個濃度的細胞懸液分別加入已制備好飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng) 板中，100 μ 1/孔，使相應的孔平均分別含有0. 5，1和5個細胞，培養(yǎng)第4天可換液一次，從 第5-6天仔細觀察各孔內(nèi)細胞的生長情況，并記錄。在克隆后第7-9d細胞克隆長滿培養(yǎng)孔 1/3-1/2時，即可用間接競爭法去進行抗體特異性的檢測，如檢出特異性抗體陽性的細胞 孔，可選擇抗體效價高、呈單個克隆生長、生長狀況良好的細胞，繼續(xù)進行再克隆。將陽性孔 的細胞移至24孔培養(yǎng)板，并在相對應的原孔中補加新鮮培養(yǎng)基，以防二者同時污染或細胞 死亡。待24孔板中的細胞生長良好時，可轉(zhuǎn)至IOOml細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并及時凍存。動物體內(nèi)誘生的方法制備腹水在接種雜交瘤細胞前1-2周，先給Balb/C小鼠 腹腔注射0. 5ml液體石蠟或弗氏不完全佐劑；將克隆成功的雜交瘤細胞IOOOrpm離心，棄 上清，細胞用1640基礎培養(yǎng)液懸浮，并將細胞數(shù)調(diào)至IxlO6個/ml，以上每只小鼠腹腔注 射0. 5ml上述制備好的雜交瘤細胞懸液接種雜交瘤細胞后約10d，可見小鼠腹部明顯膨 大，此時用碘酒、酒精棉球?qū)π∈蟾共科つw消毒后，用5ml注射器抽取腹水，將腹水于4°C， IOOOrpm離心lOmin，取上清，分裝后置_20°C保存。腹水的純化取上述制備的腹水3ml，加入0. 06mol/L,pH4. 8的醋酸緩沖液6ml，混 勻后在室溫下邊攪拌邊加入99μ 1辛酸，持續(xù)攪拌30min，然后置于4°C靜止2h以上。將溶 液4°C，IOOOrpm離心30min，取上清，用2mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 4，往上清溶液中邊 攪拌邊加入等體積的飽和硫酸按溶液，30min后，4°C靜止2h以上。IOOOOrpm離心30min， 取沉淀溶于5ml0. 01M, pH7. 4的PBS中，混勻后置入0. OlM的PBS中透析，4°C透析兩日，每 8h換一次液，兩日后取出透析袋中的溶液，收集后經(jīng)紫外分光光度計測定其蛋白含量后，按 5mg/ml分裝凍存于_80°C。二、間接ELISA檢測抗中華鱉免疫球蛋白單克隆抗體的效價取試驗足夠量的本發(fā)明所述的抗原，用包被液CBS進行稀釋，加到ELISA板孔中， IOOuL/孔，然后將酶標板置4°C冰箱過夜。取出過夜的酶標板，用PBST充分洗滌3次后， 每孔加入200 μ L含10%小牛血清的PBS 37°C封閉3h，同上洗滌。每孔加入100 μ L已建立 的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，并從1 100開始倍比稀釋，37°C孵育1.5h，同上洗滌。每孔加入 50 μ L羊抗鼠IgG酶標抗體，37°C孵育1. 5h，同上洗滌。加OPD顯色液，每孔50 μ L，于37°C 水浴避光顯色10 15min。每孔加50 μ L 2mol/L硫酸終止反應。應用酶聯(lián)免疫閱讀儀讀 出OD49tl值。P/N彡2. 1者判為陽性，P/N < 2. 1者判為陰性。三、間接ELISA檢測本發(fā)明所述單克隆抗體的特異性用間接ELISA的方法測所述單克隆抗體與另外種類鱉、魚的IgM之間的交叉反應。 將臺灣甲魚、泰國甲魚、中華鱉、日本甲魚、鯽魚、花魚骨、草魚、鰻魚、青魚、鰱魚、鳊魚的血 清進行1 1000包被，以定株的陽性克隆的單本發(fā)明所述的克隆抗體的細胞上清作為一抗 進行交叉反應的測定。結(jié)果表明本發(fā)明所述雜交瘤細胞3H3產(chǎn)生的本發(fā)明所述單克隆抗體 對臺灣甲魚、泰國甲魚和日本甲魚有交叉反應。(表1)表1單抗的特異性鑒定
權(quán)利要求
一種抗中華鱉免疫球蛋白單克隆抗體，其特征是所述單克隆抗體是按以下步驟制備的抗體(1)制備中華鱉特異性抗原中華鱉頸部切斷，采其血置于玻瓶，于室溫下凝固，用無菌棒沿玻瓶內(nèi)壁括撥將血塊與瓶壁的粘連分離后，先于35～38℃放置1.5～3h，再于3～6℃放置8～12h，血清充分析出，離心沉淀，取其上清，制SephadexG 200層析柱，中華鱉血清經(jīng)硫酸銨水溶液粗提并透析濃縮后，用PBS(pH7.4)倍比稀釋，經(jīng)濾膜過濾后上樣，用PBS洗脫，自動采樣器收集洗脫液，并用紫外分光光度計跟蹤測定洗脫液的蛋白濃度，最先洗脫的蛋白IgM即為中華鱉特異性抗原；該抗原蛋白H鏈分子量為63kD，L鏈分子量均為22kD；(2)制備多克隆抗體以所述中華鱉特異性抗原免疫動物，取血，分離出抗血清，純化制得所述多克隆抗體，并以所述中華鱉特異性抗原的包被抗原檢測所述抗血清，證明為含抗所述中華鱉特異性抗原的多克隆抗體；(3)制備一種雜交瘤細胞株以骨髓瘤細胞與產(chǎn)生抗中華鱉血清蛋白IgM抗體的脾細胞融合得該雜交瘤細胞株，所述的脾細胞取自以所述中華鱉血清蛋白IgM免疫的動物；(4)制備一種抗中華鱉免疫球蛋白的單克隆抗體以所述的雜交瘤細胞株產(chǎn)生該單克隆抗體，該單克隆抗體對所述的中華鱉免疫球蛋白IgM具有特異性。
2.如權(quán)利要求1所述的一種抗中華鱉免疫球蛋白單克隆抗體，其特征是步驟(1)中，所 述血塊與瓶壁的粘連分離后，先于37°C放置2h，再于4°C放置10h，血清充分析出后，2000r/ mim離心沉淀；所述層析柱，柱長70cm，直徑1. 6cm。
3.如權(quán)利要求1或2所述所述的一種抗中華鱉免疫球蛋白單克隆抗體，其特征是所述 硫酸銨水溶液為50% (W/W)水溶液。
4.如權(quán)利要求3所述的一種抗中華鱉免疫球蛋白單克隆抗體，其特征是所述濾膜為厚 度0. 45 μ m濾膜。
5.一種檢測中華鱉免疫血清抗體效價的方法，其特征是用所述抗中華鱉免疫球蛋白的 單克隆抗體檢測中華鱉免疫血清抗體效價。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特是用間接ELISA或間接競爭ELISA檢測。
全文摘要
一種抗中華鱉免疫球蛋白單克隆抗體，按以下步驟制備(1)中華鱉特異性抗原采中華鱉血置于玻瓶，室溫凝固，35～38℃放置1.5～3h，再3～6℃放置8～12h，離心沉淀，取上清，制層析柱，經(jīng)硫酸銨水溶液粗提并透析濃縮后稀釋，過濾后上樣，洗脫，最先洗脫的蛋白IgM即中華鱉特異性抗原；(2)多克隆抗體以所述抗原免疫動物，取血，分離出抗血清，純化制得所述多克隆抗體；(3)雜交瘤細胞株以骨髓瘤細胞與產(chǎn)生抗中華鱉血清蛋白IgM抗體的脾細胞融合得該雜交瘤細胞株；(4)一種抗中華鱉免疫球蛋白的單克隆抗體以所述的雜交瘤細胞株產(chǎn)生該單克隆抗體。以所述單克隆抗體檢測中華鱉免疫血清效價。本發(fā)明適用于甲魚類病原學、免疫學研究。
文檔編號C12P21/08GK101955534SQ20091010074
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月20日
發(fā)明者姚嘉赟, 尹文林, 徐洋, 沈錦玉, 潘曉藝, 郝貴杰 申請人:浙江省淡水水產(chǎn)研究所