專利名稱：同時表達抗原特異性受體和外源基因的重組逆轉錄病毒載體、用其修飾的b-淋巴細胞及 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及同時表達抗原特異性受體和報告基因或具有治療作用基因的重組逆 轉錄病毒載體、利用該載體體外修飾B-淋巴細胞的方法、該載體修飾的B-淋巴細胞、該載 體的制藥用途及利用該載體進行基因治療的方法。
背景技術：
基因治療是指應用基因工程和細胞生物學技術，將一些具有治療價值的外源基因 導入體內(nèi)，通過修復或補充失去正常功能的某些基因來達到治療疾病的目的。盡管有關基 因治療的基礎研究已經(jīng)歷時多年并廣泛展開，少數(shù)基因治療藥物還獲準在臨床使用，但是 因為安全性和有效性的問題，當前基因治療研究的進展緩慢。因此安全和有效是當今基因 治療中共同關注的兩大主題。必須在保證安全性的基礎上盡可能的提高基因治療的效率。 影響基因治療安全和效率的兩個主要因素是基因轉移系統(tǒng)和靶細胞。目前應用于基因治療 的基因轉移系統(tǒng)主要有病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體具有高效的優(yōu)點，因此 基因治療研究廣為采用。但是由于安全性問題，目前其應用已受到了很大限制。非病毒載 體盡管安全性較高，但其效率較低，離實際應用的要求相差甚遠。目前研究提高非病毒載體 的效率來提高基因治療的效率進展緩慢。提高基因治療效率的另一個可能途徑是擴增用于 基因治療的靶細胞，使表達外源治療基因的細胞數(shù)量增加，從而使外源治療基因表達水平 提高，最終提高基因治療的效率。對于基因治療的靶細胞來說，造血干細胞(HSC)因為能夠 自我更新和具有無限制分裂的能力，可以實現(xiàn)導入的外源治療基因在體內(nèi)的長期表達，因 而成為目前基因治療中常用的靶細胞。盡管體外培養(yǎng)與擴增可以增加造血干細胞的數(shù)量， 但是有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過體外長期的培養(yǎng)導致造血干細胞的端粒酶活性降低甚至不能檢測到 端粒酶的活性，而端粒酶活性降低或者消失會嚴重影響干細胞的分裂能力，從而影響外源 治療基因在體內(nèi)的長期表達。除了造血干細胞以外，臍帶血干細胞也是基因治療使用的一 種靶細胞，但臍帶血細胞也存在一定的問題，如臍帶血中造血干細胞相對數(shù)量少。淋巴細胞 是另一種常用的基因治療的靶細胞，與造血干細胞一樣，淋巴細胞分化成記憶細胞后也是 長壽命的細胞，具有自我更新的能力(Fearon and Manders et al.，2001)，有記憶干細胞之 稱(Lanzavecchia and Sallusto，2002)。并且勿需骨髓動員，外周血中即有大量的淋巴細 胞，可以很方便地從外周血中分離，并且技術成熟，因此與造血干細胞相比具有取材簡單的 優(yōu)點。同造血干細胞一樣，體外長時間培養(yǎng)與擴增淋巴細胞也非常困難，并且長時間的體外 培養(yǎng)往往導致其不能正常歸巢(Kishimotoand Jutila et al.，1990 ；Tedder and Penta et al.，1990)，從而影響淋巴細胞的功能和壽命。但是B淋巴細胞在體內(nèi)遇到相應的抗原后能 夠發(fā)生克隆增生與擴增，而且激活的B淋巴細胞每秒鐘可以合成高達8X IO4個免疫球蛋白 分子(Langman and Cohn，1987)，幾天內(nèi)體內(nèi)就會有大量針對某種抗原的抗體，因此B淋巴 細胞可以看成是能夠大量合成蛋白的“加工廠”。這一過程是由抗原與B細胞表面的B細胞 受體(BCR，B cell receptor)結合后激活B淋巴細胞(B淋巴細胞激活的詳細過程見Fig
41)，并在輔助性T淋巴細胞的作用下引起特異性B淋巴細胞克隆的擴增(Thomas，2006)。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的第一方面提供了一種同時表達抗原特異性受體和報告基因或同時表 達抗原特異性受體和具有治療作用的基因的重組逆轉錄病毒載體，特別地，所述抗原特異 性受體為人漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl或人乙肝病毒表面抗原特異性mlgGl， 所述報告基因為EGFP基因，所述具有治療作用的基因為人EPO基因，所述逆轉錄病毒載體 為 pMSCV、pLXSN、pLXIN。在本發(fā)明的第二方面提供了一種用同時表達抗原特異性受體和報告基因或同時 表達抗原特異性受體和具有治療作用的基因的重組逆轉錄病毒載體在體外修飾B-淋巴細 胞的方法，其包含下述步驟a)分離培養(yǎng)B-淋巴細胞，b)以每IX IO8個細胞用包裝好的所述重組逆轉錄病毒載體體外感染步驟a)中培 養(yǎng)的細胞24小時，其中，所述B-淋巴細胞來源于脾臟切除術切除的脾臟并利用脂多糖刺激獲得或 采自外周血，利用血細胞分離機獲得。特別地，所述抗原特異性受體為人漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl或人乙 肝病毒表面抗原特異性mlgGl，所述報告基因為EGFP基因，所述具有治療作用的基因為人 EPO基因，所述逆轉錄病毒載體為pMSCV、pLXSN、pLXIN。在本發(fā)明的第三方面提供了一種根據(jù)第二方面所述方法獲得的B-淋巴細胞，特 別地，所述抗原特異性受體為人漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl或人乙肝病毒表面 抗原特異性mlgGl，所述報告基因為EGFP基因，所述具有治療作用的基因為人EPO基因，所 述逆轉錄病毒載體為pMSCV、pLXSN、pLXIN。在本發(fā)明的第四方面提供了一種同時表達抗原特異性受體和具有治療作用的基 因的重組逆轉錄病毒載體在制備治療B淋巴細胞相關疾病、遺傳性疾病、腫瘤或病毒感染 性疾病的藥物中的用途。特別地，所述抗原特異性受體為人漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異 性mlgGl或人乙肝病毒表面抗原特異性mlgGl，所述報告基因為EGFP基因，所述具有治療作 用的基因為人EPO基因，所述逆轉錄病毒載體為pMSCV、pLXSN、pLXIN，所述B淋巴細胞相關 疾病為腺苷脫氨酶缺乏癥，所述遺傳性疾病為凝血因子VIII或IX缺乏引起的血友病或脂 蛋白脂肪酶缺乏癥。在本發(fā)明的第五方面提供了一種使用同時表達抗原特異性受體和具有治療作用 的基因的重組逆轉錄病毒載體治療B淋巴細胞相關疾病、遺傳性疾病、腫瘤或病毒感染性 疾病患者的方法，所述方法包括下述步驟a)利用血細胞分離機從患者血液中采集至少IXlO4個B-淋巴細胞并進行常規(guī)培 養(yǎng)以擴增細胞數(shù)目，b)以每IX IO8個細胞用包裝好的所述重組逆轉錄病毒載體體外感染步驟a)中培 養(yǎng)的細胞2-24小時，c)將步驟b)中獲得的細胞用無菌PBS重懸，以0.1 100 X IO6個細胞/kg/天的 劑量經(jīng)靜脈注射入患者體內(nèi)。
特別地，所述抗原特異性受體為人漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl或人乙 肝病毒表面抗原特異性mlgGl，所述報告基因為EGFP基因，所述具有治療作用的基因為人 EPO基因，所述逆轉錄病毒載體為pMSCV、pLXSN、pLXIN,所述B淋巴細胞相關疾病為腺苷脫 氨酶缺乏癥，所述遺傳性疾病為凝血因子VIII或IX缺乏引起的血友病或脂蛋白脂肪酶缺 乏癥。本發(fā)明利用B淋巴細胞受到特異性抗原刺激后能夠被激活和擴增的特性成功地 在體內(nèi)擴增了基因修飾的B淋巴細胞。本發(fā)明采用了能夠表達特異性BCR的載體修飾B 淋巴細胞，載體同時攜帶有外源治療基因，將這些細胞輸入受體鼠體內(nèi)，在抗原免疫后有明 顯的擴增。在以EGFP為檢測指標的SCID小鼠體內(nèi)的實驗中，漢灘型漢坦病毒核心蛋白抗 原免疫后，檢測到了表達EGFP的B淋巴細胞的擴增；在以hEPO的表達水平為檢測指標的 免疫力正常小鼠BALB/c小鼠的體內(nèi)實驗中，乙肝表面抗原免疫后檢測到了 hEPO表達水平 的增高，并且其表達水平的增高基本與機體受到抗原初次免疫后的抗體水平的增加時相吻 合(Sedgwick and Holt，1983)。在免疫力正常小鼠BALB/c小鼠的體內(nèi)實驗中，本發(fā)明使 用了載體pMhE5C31基因修飾供體鼠B淋巴細胞，載體中用于調(diào)控hEPO表達的啟動子是病 毒載體LTR區(qū)的調(diào)控序列，與淋巴細胞特異性調(diào)控序列不同，其活性不受淋巴細胞的激活 狀態(tài)影響，而淋巴細胞特異性調(diào)控序列的活性會在淋巴細胞激活后增強(Takacs andDu et al.，2004)。因此，乙肝表面抗原免疫后外源治療基因hEPO表達水平的增高僅與基因修飾 的B淋巴細胞的體內(nèi)擴增相關，而與調(diào)控hEPO表達的調(diào)控序列無關。以上這些結果說明， 采用既能表達抗原特異性BCR同時又能表達外源治療基因的載體基因修飾B淋巴細胞，經(jīng) 相應的特異性抗原免疫后能夠在體內(nèi)擴增基因修飾的B淋巴細胞，從而獲得相對較高水平 的外源治療基因的表達(Fig 14，F(xiàn)igl5)。通過抗原特異性體內(nèi)擴增基因修飾的B淋巴細 胞可以很好的解決體外培養(yǎng)B淋巴細胞困難的難題，從而達到有較多的基因修飾的B淋巴 細胞表達外源治療基因，最終提高基因治療的效率。在記憶B細胞的形成過程中通常伴隨著免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的不可逆重排，最 常見的是由mlgM、mlgD型BCR轉變?yōu)閙lgGl型BCR，但仍然保留其抗原特異性，這一過程 被稱之為Ig類別轉換。mlgM和mlgD型其胞內(nèi)區(qū)僅有三個氨基酸，其信號轉導由與之共價 結合的Iga/β介導(Reth，1992)。而mlgGl盡管也與Ig α / β共價結合，但是其高度保 守的胞內(nèi)區(qū)較長，在細胞信號傳導中起重要作用(Reth，1992)，當突變掉mlgG的胞內(nèi)區(qū)后 引起初次和二次免疫應答IgG和IgE抗體水平降低10到20倍(Kaisho and Schwenk et al.，1997)。mlgGl型胞內(nèi)區(qū)BCR的轉基因鼠初次免疫應答的抗體滴度高于mlgM型胞內(nèi)區(qū) BCR的轉基因鼠，而且其初次免疫應答中漿細胞的形成是mlgM型BCR轉基因鼠的10到50 倍(Martin andGoodnow，2002)，盡管引起這種巨大差異的確切機制目前還不太清楚，但是 比較明確的是mlgGl型的BCR會減少此種類型漿細胞的凋亡，從而有較多的漿細胞分泌抗 體(Martin and Goodnow，2002)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，mlgGl型BCR相對mlgM型BCR能引 起較強的細胞內(nèi)鈣信號，并且不受抑制性輔助受體⑶22的影響(Wakabayashi and Adachi et al. ,2002 ；Horikawa and Martin et al. ,2007) 因此采用 mlgGl 型 BCR 相對 mlgM 型 BCR的細胞信號傳導會有更有效的增加外源治療基因的表達。另外采用mlgGl型胞內(nèi)區(qū)的 BCR相對mlgM型胞內(nèi)區(qū)的BCR在小鼠脾的MZ區(qū)有較多的細胞存在(Martin and Goodnow, 2002)，而此區(qū)域主要是記憶B細胞存在的區(qū)域，因此采用mlgGl型BCR相對mlgM型BCR的
6細胞信號傳導有可能會增加記憶B細胞的形成。在本發(fā)明中采用mlgGl的cDNA構建載體， 經(jīng)此載體基因修飾的B淋巴細胞輸入體內(nèi)后，經(jīng)抗原免疫可能就會獲得持續(xù)高水平的外源 治療基因的表達。本發(fā)明構建的載體除了有治療基因hEPO的表達之外同時還有特異性mlgGl的表 達，因此經(jīng)此載體修飾的脾B淋巴細胞除了表達hEPO外還有抗原特異性的BCR的表達，這 些細胞受到特異性抗原刺激會在體內(nèi)被擴增，從而有大量的B淋巴細胞表達外源治療基因 hEPO，并且在本發(fā)明的實施例中也檢測到了抗原免疫后hEPO表達水平的增高。本發(fā)明采用 了效率高、能整合到基因組的逆轉錄病毒載體，而不是非病毒載體作為研究工具，證明能夠 通過采用特異性抗原來體內(nèi)擴增基因修飾的靶細胞從而獲得較高的外源治療基因的表達。隨著人類功能基因組學的不斷發(fā)展，特別是對人類基因組中非編碼DNA功能的不 斷研究，將為基因治療技術中的載體設計帶來新的思路。結合安全有效的載體，采用B淋巴 細胞作為基因治療的靶細胞有較為廣泛的應用前景，有可能應用于B細胞相關疾病，例如 腺苷脫氨酶缺乏癥的治療(Anderson，1992 ；Miller, 1992)。因為B淋巴細胞表達的治療蛋 白能夠直接分泌入血，從而治療相關的遺傳性疾病，例如凝血因子VIII或IX缺乏引起的血 友病(Miller 1992)和脂蛋白脂肪酶缺乏癥的治療。由于B淋巴細胞是抗原提呈細胞，可 以用來表達腫瘤或病毒相關抗原，能夠激活機體的抗腫瘤抗病毒免疫反應，從而在腫瘤和 病毒感染性疾病的治療中發(fā)揮作用。換言之，本發(fā)明充分利用了 B淋巴細胞受到特異性抗原刺激后能夠被激活和擴增 的特性，通過在體外用同時表達抗原特異性受體和具有治療作用的基因的重組逆轉錄病毒 載體轉染分離的脾細胞或血液B-淋巴細胞并將轉染所述重組逆轉錄病毒載體的B-淋巴細 胞輸回體內(nèi)，成功地在體內(nèi)擴增了基因修飾的B淋巴細胞，由于基因修飾的B淋巴細胞的數(shù) 目的大幅增加，即使單個基因修飾的B淋巴細胞中外源基因表達的水平未提高，總的外源 基因的表達量也大幅增加，因此為克服基因治療過程中經(jīng)常遇到的表達外源治療性基因的 載體效率低下的問題提供了一種有益的解決方式。特別地，本發(fā)明構建了表達漢灘型漢坦 病毒核心蛋白特異性mlgGl的逆轉錄病毒表達載體和表達乙肝病毒表面抗原特異性mlgGl 的逆轉錄病毒表達載體，分別攜帶EGFP報告基因和EPO治療基因，在體外用上述逆轉錄病 毒表達載體轉染B-淋巴細胞后，進行體外實驗和體內(nèi)實驗，結果表明，經(jīng)漢灘型漢坦病毒 核心蛋白特異性mlgGl逆轉錄病毒表達載體基因修飾的B淋巴細胞同時表達EGFP，輸入 SCID小鼠體內(nèi)經(jīng)抗原免疫后流式細胞儀檢測確定其能夠在SCID鼠體內(nèi)擴增，經(jīng)乙肝病毒 表面抗原特異性mlgGl逆轉錄病毒表達載體基因修飾的B淋巴細胞攜帶和表達外源治療基 因hEPO，輸入BALB/c小鼠體內(nèi)在抗原免疫后檢測到體內(nèi)外源治療基因hEPO表達水平的增 高。因此，通過將能刺激B-淋巴細胞增殖的抗原特異性受體與具有治療作用的外源表達基 因共同重組于逆轉錄病毒表達載體中并利用該載體體外修飾B-淋巴細胞，該基因修飾的 B-淋巴細胞回輸體內(nèi)后，由于其表達的抗原特異性受體的刺激，B-淋巴細胞大量增殖，從 而大幅度提高了具有治療作用的外源表達基因的表達量，為需要該外源表達基因的基因治 療提供了更多的治療劑。


圖1 顯示了載體pMEGFP的載體圖。
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圖2 顯示了載體pMELHCPl的載體圖。圖3 顯示了載體pME5C3LHl的載體圖。圖4 顯示了載體pMhE5C31的載體圖。圖5 顯示了漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性膜型免疫球蛋白IgGl能與其抗原相 結合，用載體pMELHCPl (表達EGFP以及漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl)轉染293A 細胞，轉染后48小時用紅色熒光標記的漢灘型漢坦病毒核心蛋白檢測該蛋白是否能夠與 細胞特異性結合，圖中為同一視野，分別用綠色熒光和紅色熒光激發(fā)，從圖中可以看出被轉 染了的293A細胞表達綠色熒光蛋白(左圖)，并且此細胞能與紅色熒光標記的漢灘型漢坦 病毒核心蛋白特異性結合(右圖)。圖6 顯示了漢灘型漢坦病毒核心蛋白引起表達漢灘型漢坦病毒核心蛋白抗原特 異性BCR細胞的體外擴增。用逆轉錄病毒載體pMELHCPl (表達EGFP以及漢灘型漢坦病毒 核心蛋白特異性mlgGl)感染小鼠原代脾B淋巴細胞，然后在第二活化信號⑶40Ligand的 存在下加入能與載體表達的mlg特異性結合的漢灘型漢坦病毒核心蛋白，培養(yǎng)48小時后流 式細胞儀檢測EGFP陽性細胞比例。如圖所示，在CD40Lignad提供第二活化信號的作用下， 給予漢灘型漢坦病毒核心蛋白組綠色熒光細胞比例明顯增高(A)，接近不給于抗原組的兩 倍，而僅給予PBS組綠色熒光細胞比例未見增高(B)，等于未處理組(C)。圖7 顯示了沒有特異性膜型免疫球蛋白的表達不能引起淋巴細胞的體外擴增。 用逆轉錄病毒載體PMEGFP (與上述實驗中所用載體不同，此載體僅有EGFP的表達而沒有特 異性mlgGl的表達)感染小鼠脾B淋巴細胞，在第二活化信號⑶40Ligand的存在下加入漢 灘型漢坦病毒核心蛋白，培養(yǎng)48小時后流式細胞儀檢測EGFP陽性細胞比例。從圖中可以 看出在CD40Ligand提供第二活化信號的作用下，給予漢灘型漢坦病毒核心蛋白抗原組(A) 和僅給予PBS組(B)的EGFP陽性細胞比例沒有明顯差異，都等于未處理組(C)。圖8 顯示了 pMELHCPl載體基因修飾的脾B淋巴細胞在SCID受體鼠體內(nèi)能夠被 抗原漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性擴增。逆轉錄病毒載體pMELHCPl (表達EGFP以及漢 灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl)體外感染小鼠脾細胞。感染24小時后，將感染后的 脾細胞與新鮮分離的C57BL/6小鼠脾細胞按3 1比例混合后尾靜脈注射至實驗動物SCID 鼠體內(nèi)，每只鼠注射1. 31 X 107個感染后的脾細胞及0. 44 X 107個新鮮分離的脾細胞，注射 的細胞中EGFP陽性細胞比列為0. 4%。共注射4只，并把這4只SCID鼠分為兩組，每組2 只，第一組( )于細胞注射后24小時腹腔注射漢灘型漢坦病毒核心蛋白50ug/只，第二組 (■)腹腔注射PBS作為實驗對照組(注其中第一組中的一只SCID鼠注射了兩次抗原，分 別于細胞注射后第1天和第26天注射，抗原用量分別為50ug和15ug ；另一只SCID鼠僅在 細胞注射后第1天注射抗原50ug)。分別于細胞注射后18天和28天取鼠脾細胞，流式細胞 儀檢測EGFP陽性細胞比例。流式細胞儀檢測時每只小鼠計數(shù)50000個脾細胞。圖9 顯示了外源治療基因人促紅細胞生成素(hEPO)體內(nèi)表達水平的抗原反應性 增高。逆轉錄病毒載體pMhE5C31 (此載體即表達hEPO又表達乙型肝炎病毒表面抗原特異 性mlgGl)感染BALB/c小鼠脾B細胞，感染24小時后把感染后的脾細胞輸入受體鼠BALB/c 小鼠體內(nèi)。細胞受體鼠分為三組，第一組共2只小鼠，為抗原預免疫組(■)，于細胞注射前 6天腹腔注射乙肝疫苗安在時5ug/只，并于細胞注射后24小時腹腔注射乙肝疫苗安在時 IOug/只；第二組共3只小鼠，為抗原非預免疫組()，于細胞注射后24小時腹腔注射乙肝疫苗安在時IOug/只；第三組共4只小鼠，為實驗對照組(□)，于細胞注射后24小時腹腔 注射等體積的PBS。分別于細胞注射后第5、7、9天取不同的小鼠割尾取血200微升，ELISA 法檢測hEPO的表達水平。
具體實施例方式下面本發(fā)明將參考下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明的技術方案。實施例實施例1 實驗材料及方法菌株大腸桿菌DH5a (遺傳型 supE44 Δ lacU169 ( <pS0 IacZ Δ M15) hsdR17recA lendAlgyrA96thi-lrelAl), JM109(遺傳型 recAlsupE44endAlhsdR17gyrA96relAl thi Δ (lac-proAB)F' [traD36proAB+lacIqlacZ ΔM15]購自鼎國生物。細胞系293Τ細胞、ΡΤ67細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。限制性內(nèi)切酶及其它酶類限制性內(nèi)切酶分別購自TaKaRa公司、New England Biolabs公司；熱啟動高保真 DNA 聚合酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)購自 TaKaRa 公司。載體逆轉錄病毒載體pMSCVneo由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所免疫學系曹偉博士 惠贈，質(zhì)粒pEGFP-Cl、病毒包裝輔助MD質(zhì)粒及PV質(zhì)粒購自CL0NTECH，。pGEM T easy載體 購自Promega公司。 特異性抗體序列及抗原漢灘型漢坦病毒核心蛋白抗體L13F3可變區(qū)DNA序列及其抗原蛋白由中國疾病控 制中心病毒病預防控制所梁米芳教授惠贈。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)單克隆抗體 5C3 可變區(qū)序列查自 The international ImMunoGeneTics informationsystem http // imRt. cines. fr/(Affinity constant :4X IO10M-1) (zu and Skerra et al. , 1999) ,^ifiJ^ 乙型病毒性肝炎疫苗購自北京市東城區(qū)疾病控制中心，為上海葛蘭素史克生物制品有限公 司產(chǎn)品。通用名重組(酵母)乙型肝炎疫苗；商品名安在時；主要成分劑量(1.0ml)含 有20微克重組乙肝病毒表面抗原(S蛋白)。實驗動物C57BI/6、BALB/c、SCID Beige購自北京維通利華實驗動物技術有限公司 (VitalRiver)，雌性或雄性8-10周齡。主要試劑及試劑盒RPMI 1640 培養(yǎng)基、Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品；DMSO為Sigma公司產(chǎn)品；丙酮酸鈉、2巰基乙醇、NEAA、谷胺酰 胺購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心；LPS(055 :B5)購自鼎國昌盛生物技術有 限公司，為Sigma公司產(chǎn)品；TIANpr印Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小提試劑盒、TIANgel Midi Purification Kit凝膠回收試劑盒均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；Trizl抽提 液、SuperScript II RNaseH-Reverse Transcriptase 反轉錄試齊Ll盒為 Gibco 公司產(chǎn)品；PCR片段純化回收試劑盒為天為時代公司產(chǎn)品；DNA分子量Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品； 轉染試劑Vigofect購自威格拉斯生物技術有限公司；抗原熒光標記試劑盒為日本同仁化 學產(chǎn)品；CD40Ligand 為 Perprotech 公司產(chǎn)品；hEPO 檢測試劑盒，Human Epo Immunoassay 為R&DSystems，Inc.產(chǎn)品；EZ-S印TM Mouse IX淋巴細胞分離液以及200目尼龍網(wǎng)(裁成 90mm*90mm正方形)為達科為生物技術有限公司產(chǎn)品。所有試劑及試劑盒均按照廠商說明 書進行使用。主要儀器紫外分光光度計(DU-65)為Beckman產(chǎn)品；超速離心機(L7-65)為Beckman公 司產(chǎn)品；酶標儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；超純水制備器為Milipore公司產(chǎn)品；細胞培養(yǎng)箱 (NAPC05410)為 Precision Scientific 公司產(chǎn)品；PCR 熱循環(huán)儀(DNA ThermalCycler)為 MJ公司及德國Bio-metra公司產(chǎn)品；流式細胞儀(FACSC alibur)為BectonDickinson公 司產(chǎn)品。所有儀器均按廠商說明書進行操作。實驗方法除非另外指明，本發(fā)明實施例中涉及的酶切反應、DNA片段回收、DNA連接反應、感 受態(tài)大腸桿菌細胞制備、細菌質(zhì)粒轉化、小量及大量質(zhì)粒DNA制備、RT-PCR、PCR等操作均按 照“分子克隆實驗指南(第三版)”(科學出版社，2002[美]J.薩姆布魯克D.W拉塞爾著， 黃培堂等譯)及廠商說明書進行，細胞培養(yǎng)、脾細胞分離、細胞傳代、細胞復蘇及凍存、細胞 轉染及病毒載體包裝、免疫熒光測定等操作均按照“動物細胞培養(yǎng)一基本技術指南(第四 版)”(科學出版社，2000，[英]弗雷謝尼(R. I.)著，章靜波等譯)及廠商說明書進行操 作。實施例2:載體構建逆轉錄病毒載體pMEGFP的構建以質(zhì)粒pEGFP-Cl為模板，以引物up :5，GGAATTCGTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3‘(下劃線為 EcoRI 酶切位點，SEQ ID NO :1)，down :5，-GAAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’ (下劃線為 BglII 酶切位點， SEQ ID NO 2),退火溫度為68°C，PCR擴增EGFP cDNA, PCR產(chǎn)物酶切后克隆入pMSCVneo載體的 EcoRI和BglII位點，測序以保證其序列準確。此載體表達EGFP，無抗原特異性膜型免疫球 蛋白的表達(mlg)。其載體圖譜見圖1。逆轉錄病毒載體pMELHCPl的構建小鼠mlgGl重鏈恒定區(qū)cDNA PCR擴增小鼠mlgGl 恒定區(qū) cDNA 序列(SEQ ID NO 3)信息查自 http://imgt. cines. fr/ 及參考文獻(Tyler and Cowman et al.，1982)。RT-PCR法擴增小鼠mlgGl恒定區(qū)5，端缺 失46個堿基的小鼠mlgGl重鏈恒定區(qū)cDNA。在測序正確的基礎上以此為模板，以Pl引物 與P3引物擴增延伸5’端，再以此產(chǎn)物為模板用P2與P8引物繼續(xù)延伸5’端得到完整的 小鼠mlgGl恒定區(qū)cDNA序列，退火溫度為63°C。然后，SOE (Gene splicing by over lap extension)法擴增與拼接漢灘型漢坦病毒單克隆抗體L13F3重鏈V區(qū)cDNA與mlgGl重鏈 恒定區(qū)cDNA，得完整的漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl重鏈cDNA，含有信號肽，序列
10如SEQ ID N0:11所示。所用引物如下Pl:CACCCCCATC TGTCTATCCA CTGGCCCCTG GATCTGCTGCCCAAACTAAC TCCATGGTG(SEQ ID NO 4)P2 :CAAGGCACCA TTCTCACAGT CTCCTCAGCC AAAACGACACCCCCATCTGT CTATCCACT(SEQ ID NO 5)P3 :CTAGGGCGCTTGCCCAATCATG(SEQ ID NO 6)P4 :TAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG~GGAGGCTTAGTG(SEQ ID NO :7(退火溫度為 63°C ))P5 :GGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTAATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGC(SEQ ID NO :8(退火溫度為 65°C ))P6 :CCGCTCGAGATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTC(SEQID N0:9(含 Xho I，退 火溫度為63°C ))P7 TCGTTTTGGCTGAGGAGACTGTGAGAATGGTGC (SEQ ID NO 10 退火溫度為 65°C )
P8 :CCGACGCGTCTAGGGCGCTTGCCCAATCATG (SEQ ID NO : 11 (含 Mlu I，退火溫度為 65 °C ))說明劃橫線部分為引物與模板的結合區(qū)。P4、P5、P6分別依次延伸5’端，P7為 下游引物，P7與恒定區(qū)有部分重合。PCR過程為，先用P4與P7分別作為上下游引物，以漢灘型漢坦病毒單克隆抗體 L13F3重鏈V區(qū)為模板PCR擴增，再以此產(chǎn)物為模板以P5與P7分別為上下游引物擴增，再 以此輪產(chǎn)物為模板用P6與P7分別為上下游引物擴增，最后所得PCR產(chǎn)物再和mlgGl重鏈 恒定區(qū)cDNA進行SOE法拼接，所用引物為P6和P8。最終所得片段克隆入pGEM T easy載 體，經(jīng)測序檢測序列完全正確。漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性輕鏈cDNA U型)PCR擴增最終所得為完整的漢灘型漢坦病毒特異性mlgGl輕鏈cDNA(k型)，含有信號肽。 序列如SEQ ID NO 12所示。所用引物如下Pa :CCTTGTCCTAATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGATGTTGTGATGACCCAGTCTCC ACTCA (SEQ ID NO 13)(退火溫度為63°C )Pb :GCTCTAGAGCCGCCA CCATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTAATTT TAAAAGGTGTC (SEQ ID NO 14)(含 Xba I，Kozak，退火溫度為 63°C )Pc :ATAAGAATGCGGCCGCTTATTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTC(SEQ ID NO :15)(含 NotI，退火溫度為65°C )說明劃橫線為引物與模板結合區(qū)，陰影部分為保護堿基及酶切位點，Pb引物中 斜體部分為Kozak序列。Pa，Pb分別依次延伸5’端，所用下游引物均為Pc，即Pa與Pc分別 為上下游引物以漢灘型漢坦病毒單克隆抗體L13F3輕鏈cDNA為模板PCR擴增，再以此PCR 產(chǎn)物為模板，以Pb與Pc分別為上下游引物擴增得完整的漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性 輕鏈CDNA(K型)。所得DNA片段克隆入pGEM T easy載體，經(jīng)測序完全正確。漢灘型漢坦病毒核心蛋白輕鏈U型)cDNA及膜型重鏈mIgGlCDNA分別與其啟動 子SOE法拼接上述所得漢坦病毒核心蛋白輕鏈cDNA及膜型重鏈mlgGlcDNA分別與CMV(巨細胞病毒)啟動子及PGK(磷酸甘油酸酯激酶，phosphoglycerate kinase)啟動子SOE法拼接。擴增PGK啟動子引物PGKBgl2 :GAAGATCTAATTCTACCGGGTAGGGGAGG (SEQ ID NO :16)(含保護堿基及 BglII位點，退火溫度為61°C)PGKMlu 1 :CGACGCGTTGCAGGTCGA AAGGCCCGGA (SEQ ID NO 17)(含保護堿基及 Mlu I 位點，退火溫度為ere)擴增CMV啟動子引物CMVSall :ACGCGTCGACAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG (SEQ IDNO 18)(含保護堿基 及Sal I位點，退火溫度為61°C )CMVNotl :ATAAGAATGCGGCCGCACCGGTAGCG CTAGCGGATC (SEQID NO 19)(含保護堿基 及Not I位點，退火溫度為61 °C )PGK 啟動子序列見 SEQ ID NO :20。CMV 啟動子(無 Κ0ΖΑΚ)序列見 SEQID NO :21。PCR擴增PGK啟動子，所用的模板為pMSCVneo質(zhì)粒，擴增產(chǎn)物與完整重鏈基因SOE 法拼接。PGK啟動子與重鏈基因間有Mlu I酶切位點，重鏈基因下游酶切位點為Sal I，重 鏈基因下游無polyA。PCR擴增CMV啟動子，所用的模板為pEGFP-Cl質(zhì)粒，擴增產(chǎn)物與完整輕鏈基因SOE 法拼接。CMV啟動子與重鏈基因間有Not I酶切位點，輕鏈基因下游酶切位點有Hind III 酶切位點，輕鏈基因下游無polyA。SOE法最終所得片段為CMV啟動子+輕鏈，這兩者間有酶切位點Not I ；PGK啟動 子+重鏈，這兩者間有酶切位點Mlu I，所得這兩個片段分別克隆入pGEM Teasy載體，經(jīng)測 序檢測所擴增的DNA序列完全正確。逆轉錄病毒載體pMELHCPl構建上述所得CMV啟動子+輕鏈從pGEM T easy載體酶切后克隆入pMEGFP的Sail、 HindIII位點；PGK啟動子+重鏈從pGEM T easy載體酶切后克隆入pMEGFP的BglII、Sal I位點，得到逆轉錄病毒載體pMELHCPl，此載體既表達EGFP又表達漢灘型漢坦病毒核心蛋 白特異性的mlgGl。在CMV啟動子和輕鏈間有Not I酶切位點，PGK啟動子和重鏈間有Mlu I酶切位點，以方便后續(xù)載體輕重鏈的更換。此載體既表達EGFP又表達漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl。漢灘型漢坦 病毒核心蛋白特異性mlgGl可變區(qū)序列由中國疾病控制中心病毒病預防控制所梁米芳老 師惠贈，恒定區(qū)序列由RT-PCR法擴增小鼠脾細胞提取的總RNA而來，可變區(qū)與恒定區(qū)采用 SOE法拼接分別獲得完整漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl重鏈、輕鏈，而后在分別與 啟動子拼接后插入載體，獲得pMELHCPl。逆轉錄病毒載體PME5C3LH1的構建采用引物搭橋的方法合成乙型病毒性肝炎表面抗原單克隆抗體5C3重鏈V區(qū)引 物如下Hl ggtctggagtggctgggagtaatatgggctggtggaatcacaaattataattcggctct(SEQ ID NO 22)H2 agctatggtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggagt(SEQ ID NO 23)H3 ctgtccatcacttgcactgtctctgggttttcattaaccagctatgftgtacactgggt(SEQ ID NO 24)H4 :ctgcatcagtctggggctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacttgcactgt(SEQ IDNO 25)
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HlR :TCTTGMATTGTCTTTCCTGATGCTCAGTCTGGACATGAGAGCOGMTTATMTTTGTG (SEQ ID NO 26)H2R :CATCATTTTGCAGACTGTTCATTTTTMGAMACTTGGCTCTTGMATTGTCTTTCCTG(SEQ ID NO 27)H3R :AGACTCCTCCTCCTCTGGCACAGTAGTACATGGCTGTGTCATCATTTTGCAGACTGTTC(SEQ ID NO 28)H4R :GACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCATAGTTGATACCATAGTAGACTCCTC CTCCTCTGGC(SEQ ID NO 29)先用Hl和HlR分別為上下游引物PCR 10個循環(huán)，再以此PCR產(chǎn)物為模板以H2和 H2R分別為上下游引物PCR 10個循環(huán)，再依次類推，最后的循環(huán)數(shù)為30個循環(huán)，退火溫度設 為50°C。合成的序列見SEQ ID NO 30,該序列信息查自http://imgt. cines. fr/和參考文 獻(zu and Skerra et al.，1999)。所得DNA片段克隆入pGEM T easy載體，經(jīng)測序后確認 基因合成的序列正確。棚弓_荅馳誠☆成船鵬謝牛月干錢耐艦械秘5C3碰V K引物如下Ll aaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaacgtagaacctggggt (SEQ ID NO 31)L2 :gaatattatggcacaagtttaatgcagtggtaccaacagaaaccaggacagccacccaa (SEQ ID NO 32)L3 :gagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatggcacaagtttaa(SEQ ID NO :33)L4 gagctcacccagactccagtctccctggctgtgtctctagggcagagagccaccatctcctgca(SEQ IDNO :34)LlR :GMGTCTGTCCCAGACCCACTGCCACTMACCTGGCAGGGACCCCAGGTTCTAOGTTGG (SEQ ID NO 35)L2R :TGCMTATCATCCTCCTCCACAGGCTGGATGTTGAGGCTGMGTCTGTCCCAGACCCAC (SEQ ID NO 36)L3R :OGTCCMGGMCATTCCTACTTTGCTGACAGMATACATTGCMTATCATCCTCCTCCA (SEQ ID NO 37)L4R:CTCGAGCTTGGTCCCTCCTCCGAACGTCCAAGGAACATTCCTAC(SEQ ID NO 38)合成所得序列如SEQ ID NO :39，其序列信息查自http://imRt. cines. fr/參考文 獻(zu and Skerra et al.，1999)。合成過程同重鏈。設計引物S0E(Gene splicing by over lap extension)法擴增與拼接乙型肝炎 病毒表面抗原單克降抗體5C3重鏈V區(qū)與mlgGl恒定區(qū)得完整的重鏈合成過程同SOE法擴增與拼接漢坦病毒單克隆抗體L13F3重鏈V區(qū)與膜型IgGl 恒定區(qū)。完整重鏈的序列如SEQ ID NO :40所示，其序列信息查自zu and Skerraet al.， 1999，并根據(jù)NCBI網(wǎng)站做了部分堿基的改動。最終所得PCR產(chǎn)物克隆入pGEM T easy載體 經(jīng)測序驗證序列正確。設i十弓丨4勿SOE法擴 曾與拼接乙型病毒肝炎表g抗假單克降抗體5C3fe^ V R^fe 毎車t亙定R (κ ^) nifM.^r.^完整輕鏈的序列如SEQ ID NO :41所示，其序列信息查自zu and Skerra et al.， 1999，并根據(jù)NCBI網(wǎng)站做了部分堿基的改動。最終所得PCR產(chǎn)物克隆入pGEM Teasy載體 經(jīng)測序驗證序列正確。逆轉錄病毒載體PME5C3LH1構建5C3完整輕鏈克隆入pMELHCPl的Not I、HindIII位點，5C3完整重鏈克隆入 pMEGFP、Mlu I和Sal I位點，得到逆轉錄病毒載體pME5C3LHl，在CMV啟動子和輕鏈間有 Not I酶切位點，PGK啟動子和重鏈間有Mlu I酶切位點，以方便后續(xù)載體輕重鏈的更換。此載體既表達EGFP又表達乙型肝炎病毒表面抗原特異性的mlgGl。乙型肝炎病毒 表面抗原特異性的mlgGl可變區(qū)序列查自文獻(zu and Skerra et al.，1999)，表達的乙型肝炎病毒表面抗原特異性mlgGl的親和力為親和力常數(shù)(Affinityconstant) MXIOkT1, 屬于高親和力型mlg。其輕重鏈可變區(qū)采用引物搭橋的方法基因合成，輕重鏈可變區(qū)與逆 轉錄病毒載體PMELHCP1構建中獲得的輕重鏈恒定區(qū)采用SOE法拼接，而后分別克隆入載體 pMELHCPl。逆轉錄病毒載體pMhE5C31的構建提取L02細胞總RNA，反轉錄為人肝細胞總cDNA，以反轉錄產(chǎn)物為模板，設計引物 PCR法擴增人hEP0(人促紅細胞生成素，human Erythropoietin) cDNA。hEP029 :ATGGGGGTGC ACGAATGTCC TGCCTGGCT(SEQ ID NO 42)hEP028 :TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGGCCTCC(SEQ ID NO 43)退火溫度64 °C。所得hEPO cDNA 序列如 SEQ ID NO 44 所示?？寺∪雙GEM-T easy載體測序確認序列正確后，設計下列引物加酶切位點hEPOEcoRl :CGGAATTC ATGGGGGTGC ACGAATGTCC TGCCT (SEQ IDNO :45，含保護堿基 及EcoR I位點，退火溫度為60°C )hEP0Bgl2 :GAAGATCT TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGGC (SEQ ID N0:46，含保護堿基及 BglII位點，退火溫度為60°C )產(chǎn)物克隆入pGEM-T easy載體測序確認序列正確后，再克隆入pME5C3LHl的EcoR I和Bgl II位點，得逆轉錄病毒載體pMhE5C31，此載體既表達hEPO又表達乙型病毒性肝炎 病毒表面抗原特異性mlgGl。在構建此載體時本研究采用hEPO作為載體表達的外源治療基因，小鼠不表達 hEPO。在后續(xù)的ELISA法的檢測過程中，檢測試劑可以區(qū)分hEPO和小鼠的EPO (mEPO)，兩者 沒有交叉反應，因此檢測到的hEPO來自載體的表達。此載體除了表達hEPO外，還表達乙型肝炎病毒表面抗原特異性mlgGl (FigS)。表 達的乙型肝炎病毒表面抗原特異性mlgGl的親和力為Affinity constant MXIOkT1,屬 于高親和力型mlg。(zu and Skerra et al.，1999)。構建過程為，提取L02細胞總RNA， 反轉錄為人肝細胞總cDNA，以反轉錄產(chǎn)物為模板，設計引物PCR法擴增人hEPO (human Erythropoietin) cDNA。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)測序確認正確后克隆入pME5C3LHl的EcoR I和 Bgl II位點，得逆轉錄病毒載體pMhE5C31。實施例3 細胞轉染及病毒載體包裝(1)轉染前一天，293T細胞以合適密度傳代細胞于直徑IOcm培養(yǎng)皿，加入7ml培 養(yǎng)液，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)18-24小時至細胞完全貼壁，使密度為大約90%融合。(2)轉染前一小時吸出2ml培養(yǎng)液，剩余培養(yǎng)液5ml。(3)吸取6 μ 1轉染試劑VigOfect至496 μ 1 0ΡΤΙ_ΜΕΜ無血清培養(yǎng)中混勻，室溫靜 置5分鐘。(4)吸取質(zhì)粒DNA共25 μ g(其中逆轉錄病毒載體12. 5 μ g，輔助質(zhì)粒MD9. 375 μ g， PV 3. 125 μ g)，加入OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基中至總量500 μ 1，混勻。(5)把(3)中液體滴入(4)中，混勻，室溫靜置15分鐘。(6)把上步中液體滴入培養(yǎng)皿中，于37°C，5% CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)6小時后補液5ml DMEM完全培養(yǎng)基。轉染后24小時換新鮮DMEM培養(yǎng)基5ml，至轉染后36小時收集上清病毒液，并加新鮮DMEM培養(yǎng)基5ml，如此每12小時收集一次，共收集4次，至轉染后72小時止。 收集的病毒液置于4°C保存，最后一次收集后，4°C 500g離心5分鐘，吸取上清0. 45 μ m濾膜 過濾備用或_70°C凍存。(7)PT67細胞培養(yǎng)于35mm培養(yǎng)皿中，貼壁6小時后細胞密度大約為40%融合，加 Iml上步中制備的病毒液，并加polybrene至終濃度6μ g/ml。感染3小時后棄上清，加入 新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)大于12小時后，加胰酶消化細胞，并鋪于60mm培養(yǎng)皿中， 貼壁6小時后再次感染，反復感染4次后，鋪細胞于IOOmm培養(yǎng)皿，細胞持續(xù)生長，并至細胞 100%融合，加入含有終濃度10 μ g/ml絲裂霉素的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3小時后，用無血清無 絲裂霉素的RPMI1640培養(yǎng)基清洗細胞5遍待用。實施例4 :pMELHCPl載體表達的漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl能夠與抗 原漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性結合構建的膜型IgGl表達載體其IgGl恒定區(qū)后含有穿膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)，因此與分泌型 免疫球蛋白不同，膜型免疫球蛋白分子在穿膜的過程中駐留于細胞表面(Tylerand Cowman et al.，1982 ；Yamawaki-Kataoka and Nakai et al.，1982)，為 了證實構建的載體能表達膜 型IgGl，而且能夠與抗原特性結合設計了免疫熒光實驗來驗證。過程如下(1)在24孔板中放入無菌小圓玻片，將適量的293A細胞接種于24孔板中。(2)轉染細胞，方法如實施例3所述。實驗組轉pMELHCPl，對照組轉pMEGFP，轉染 量均為0. 2ug/孔，每組平行轉2孔，同時兩孔不轉作為空白對照。(3)轉染48h后棄去培養(yǎng)基，綠色熒光下觀察轉染情況后，用冷的PBS漂洗細胞3 次。(4)每孔加200ul 4%的多聚甲醛固定20分鐘。
(5)預冷的PBS漂洗3次，每次5分鐘。(6)每孔加 0. 5% Triton X-100 處理 10 分鐘。(7)預冷PBS漂洗3次，每次5分鐘。(8)每孔加3 % BSA室溫封閉1小時。(9)每孔加200ul 1 1000稀釋的帶TRITC熒光標記的山羊抗小鼠二抗，室溫避
光放置一小時。(10)預冷的PBS漂洗5次，每次5分鐘。(11)每孔加200ul的Hoechst室溫處理5分鐘染核。(12)預冷PBS漂洗3次，每次5分鐘。最后用蒸餾水漂洗一次，5分鐘。(13)在新的潔凈的載玻片上滴一滴防淬滅劑，將小圓玻片從培養(yǎng)板的孔里拿出 來，倒扣在防淬滅劑液滴上封片。(14)熒光顯微鏡下觀察。結果見圖5。圖中為同一視野，分別用綠色熒光和紅色熒光激發(fā)，從圖中可以看出 被轉染了的293A細胞表達綠色熒光蛋白，并且此細胞能與紅色熒光標記的漢灘型漢坦病 毒核心蛋白特異性結合。實施例5 與包裝細胞系PT67共培養(yǎng)法感染原代小鼠脾B淋巴細胞按照EZ-S^ Mouse IX的說明書(即達科為方法)分離小鼠脾細胞，分離的脾細
15胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，每100毫升培養(yǎng)液中加入IOml胎牛血清，1毫升雙抗、ImM丙 酮酸鈉、50 μ M的2巰基乙醇、NEAA、2mM谷胺酰胺，LPS50 μ g/ml。培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2, 及飽和濕度，細胞密度為5 XlO6Ail。培養(yǎng)16至20小時后，細胞懸液加入50ml離心管中，并 加入4倍體積的無血清RPMI1640培養(yǎng)基，4°C，300g離心10分鐘，棄上清，細胞用RPMI1640 培養(yǎng)基(每100毫升培養(yǎng)液中加入IOml胎牛血清，1毫升雙抗、ImM丙酮酸鈉、50 μ M的2巰 基乙醇、NEAA、2mM谷胺酰胺，LPS 50 μ g/ml)重懸，緩慢吹打細胞至無細胞團快，調(diào)整細胞 密度為5 X106/ml-8 XlO6Ail，延培養(yǎng)皿壁緩慢加入絲裂霉素處理過的PT67包裝細胞系培 養(yǎng)皿中，37°C，5% CO2，及飽和濕度培養(yǎng)至24小時。吸取細胞懸液加入新的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng) 3小時，以便脫落的包裝細胞系貼壁。之后吸取細胞懸液加入50ml離心管中，并加入4倍體 積的無血清RPMI1640培養(yǎng)基，4°C，300g離心10分鐘，棄上清，仔細吸棄管壁上的殘留液體 后加入D-Hanks液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1. 5X108/ml-2. 5 X 108/ml，置于冰上待用。實施例6 :pMELHCPl載體基因修飾的B淋巴細胞能夠被抗原漢灘型漢坦病毒核心 蛋白在體外特異性擴增上述實驗證實載體pMELHCPl表達的mlgGl能夠與特異性抗原特異性結合，理論上 抗原結合BCR后會引起B(yǎng)CR在B淋巴細胞表面的交聯(lián)，從而引起細胞信號傳導，引發(fā)一系 列的細胞反應，激活B淋巴細胞(Wang and Clark，2003)。B細胞經(jīng)由BCR識別抗原后，由 Iga/Ig^把抗原結合BCR的第一活化信號傳入細胞內(nèi)(Wang and Clark，2003)，在第二活 化信號CD40Ligand的存在下B細胞發(fā)生增殖與分化。在沒有第二活化信號存在時，僅有第 一信號將會引起B(yǎng)細胞的凋亡(Wang andKarras et al.，1995)。因此基于B淋巴細胞的活 化增殖需要雙信號，設計了體外實驗來驗證BCR是否能夠傳導第一活化信號，并且在第二 活化信號CD40Ligand的存在下引起B(yǎng)細胞的增殖。首先用逆轉錄病毒載體pMELHCPl (表 達EGFP以及漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl)感染小鼠原代脾B淋巴細胞，然后在 第二活化信號⑶40Ligand的存在下加入能與載體表達的mlg特異性結合的漢灘型漢坦病 毒核心蛋白，培養(yǎng)48小時后流式細胞儀檢測EGFP陽性細胞比例。如圖(Figl2)所示，在 CD40Lignad提供第二活化信號的作用下，給予漢灘型漢坦病毒核心蛋白組綠色熒光細胞比 例明顯增高，接近不給于抗原組的兩倍，而僅給予PBS組綠色熒光細胞比例未見增高，等于 未處理組。為了進一步證明上述實驗中EGFP陽性細胞的體外增殖是通過抗原與BCR的特異 性結合所引起，而不是抗原等其它因素引起的增殖，設計了下述實驗來驗證。上述制備之感 染后的脾細胞(用表達EGFP的逆轉錄載體感染)，加入RPMI1640培養(yǎng)基中，每100毫升培 養(yǎng)液中加入IOml胎牛血清，1毫升雙抗、ImM丙酮酸鈉、50 μ M 2巰基乙醇、NEAA、2mM谷胺 酰胺。培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2，及飽和濕度，細胞密度為lX106/ml，加入24孔板中Iml/ 孔，共加九孔，其中三孔加入終濃度為lOOng/ml的⑶40Ligand及15微克漢灘型漢坦病毒 核心蛋白；另三孔加入終濃度為lOOng/ml的⑶40Ligand及等量的PBS，最后三孔不作處 理。培養(yǎng)48小時后流式細胞儀檢測EGFP陽性細胞比例。結果見圖7，從圖中可以看出在 CD40Ligand提供第二活化信號的作用下，給予漢灘型漢坦病毒核心蛋白抗原組和僅給予 PBS組的EGFP陽性細胞比例沒有明顯差異，都等于未處理組。從上述結果中可以得出結論，構建的漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl表達 載體pMELHCPl基因修飾小鼠脾B淋巴細胞后，能夠與漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性結合，并且能夠傳導第一活化信號至細胞內(nèi)，并在第二活化信號的作用下在體外引起小鼠脾B 淋巴細胞增殖。實施例7 :pMELHCPl載體基因修飾的脾B淋巴細胞在SCID受體鼠體內(nèi)能夠被抗原 漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性擴增上述的實驗已證實構建的逆轉錄病毒載體pMELHCPl (表達EGFP以及漢灘型漢坦 病毒核心蛋白特異性mlgGl)感染小鼠脾B淋巴細胞后能夠表達EGFP和漢灘型漢坦病毒核 心蛋白特異性BCR。細胞水平的實驗證實特異性抗原漢灘型漢坦病毒核心蛋白結合BCR后 引發(fā)B淋巴細胞激活與增殖的第1信號后，在第二活化信號CD40L的存在下引起B(yǎng)淋巴細 胞的體外增殖。因為，在體外只能短期培養(yǎng)與擴增B淋巴細胞，本研究的實驗設計的初衷是 要驗證基因修飾的B淋巴細胞能否在體內(nèi)發(fā)生抗原特異性擴增，因此進一步設計了 SCID鼠 的動物實驗。在實驗設計中首先采用SCID鼠作為細胞移植的受體鼠，此品系小鼠的T淋巴 細胞和B淋巴細胞功能均缺如，因此基因修飾的淋巴細胞輸入其體內(nèi)后，僅有輸入的淋巴 細胞能夠與抗原發(fā)生特異性反應，沒有小鼠內(nèi)源淋巴細胞的參與和競爭(下述)；另一方面 EGFP具有較強的抗原性(Stripecke and Carmen et al.，1999)，因此首先采用免疫功能缺 陷的SCID鼠作為細胞移植的受體鼠。細胞移植與受體鼠抗原免疫(1)上述實施例5中制備之感染后的脾細胞懸液，尾靜脈注射入受體鼠，0.2ml/
P(2)細胞注射后24小時，實驗組受體鼠抗原免疫，漢灘型漢坦病毒核心蛋白50μ g 溶于200 μ 1 PBS中腹腔注射；或乙型肝炎病毒疫苗安在時10 μ g/只腹腔注射，對照組僅注 射等量PBS或氫氧化鋁。FACS定量分析表達綠色熒光蛋白細胞的比例(1)確定病毒載體感染效率脾細胞感染后48小時，300g離心10分鐘，棄上清，PBS沖洗細胞，離心管中，吸管 反復吹打分散細胞，離心沉淀細胞，PBS重懸，再離心沉淀，反復洗兩遍，400目鋼網(wǎng)過濾使 細胞呈單細胞懸液，流式細胞儀分析。(2) SCID小鼠脾細胞中綠色熒光蛋白細胞的擴增檢測同前述取小鼠脾細胞，400目鋼網(wǎng)過濾使細胞呈單細胞懸液，流式細胞儀分析。BALB/c小鼠取血檢測hEPO的表達水平分別于適當?shù)臅r間點割尾采血200 μ 1左右檢測hEPO的表達水平，采用ELISA法 檢測，該試劑能特異性檢測人的ΕΡ0，取血200微升后一周再次取血未見有小鼠EPO的交差 反應。詳細過程見R&D公司說明書，簡要過程如下(1)首先從4°C冰箱中取出試劑盒，待恢復到室溫(20-25°C )后使用(2)取走微孔板上多余的孔，放置于袋中保存并封口。(3)每孑L中力口入 100 μ 1 of Epo Assay Diluent(4)每孑L中力口入 100 μ 1 of standard, control, or specimen 并輕拍微孑L板 1 分 鐘至混勻，并用提供的封條封住各孔以防液體蒸發(fā)。室溫靜置2hoUrs士5minUtes。(5)吸凈微孔中的液體，并于濾紙上拍打微孔板，注意不要洗板。(6)每孔加入200 μ 1的Epo Conjugate，并用提供的封條封住各孔以防液體蒸發(fā)。室溫靜置 2hours 士 5minutes(7)吸凈微孔中的液體，加入Wash Buffer (400 μ 1)反復沖洗4遍，確保沖洗完全(8)每孔加入 200L Substrate Solution。注意Substrate Solution 在配置后 15分鐘內(nèi)使用.室溫靜置20-25minutes(9)每孔加入100 μ 1的Stop Solution,并輕拍微孔板。(10)使用酶標儀讀取450nm處的optical density (0. D.)值，校正波長設為570nm(11)繪制標準曲線計算hEPO值。簡而言之，分離培養(yǎng)C57BL/6小鼠脾細胞，脂多糖(LPS)刺激16小時后，逆轉錄病 毒載體pMELHCPl (表達EGFP以及漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl)體外感染。因為 LPS為B細胞絲裂原，僅引起脾細胞中的B淋巴細胞分裂增殖，所以此逆轉錄病毒載體僅能 感染B淋巴細胞而不能感染T淋巴細胞。感染24小時后，將感染后的脾細胞與新鮮分離的 C57BL/6小鼠脾細胞(為了提供新鮮的T細胞，因為T細胞在體外培養(yǎng)時會影響其活力)按 3 1比例混合后尾靜脈注射至實驗動物SCID鼠體內(nèi)，每只鼠注射1.31 X IO7個感染后的 脾細胞及0. 44X IO7個新鮮分離的脾細胞，注射的細胞中EGFP陽性細胞比列為0. 4%。共 注射4只，并把這4只SCID鼠分為兩組，每組2只，第一組于細胞注射后24小時腹腔注射 漢灘型漢坦病毒核心蛋白50ug/只，第二組腹腔注射PBS作為實驗對照組(注其中第一組 中的一只SCID鼠注射了兩次抗原，分別于細胞注射后第1天和第26天注射，抗原用量分別 為50ug和15ug ；另一只SCID鼠僅在細胞注射后第1天注射抗原50ug)。分別于細胞注射 后18天和28天取鼠脾細胞，流式細胞儀檢測EGFP陽性細胞比例。流式細胞儀檢測時每只 小鼠計數(shù)50000個脾細胞，檢測結果見圖8。從圖中可以看出，抗原注射組EGFP陽性細胞所 占脾細胞的比例明顯高于PBS對照組，前者EGFP陽性細胞最高達到0. 07%，而后者最高僅 有0.01%。圖中抗原注射兩次的小鼠其EGFP陽性細胞擴增效果與僅注射一次的小鼠相比 未見增高，可能與二次抗原注射后在較短的時間(兩天)內(nèi)就進行檢測有關。從上述結果 中可以得出結論，經(jīng)表達抗原特異性mlgGl的載體基因修飾的B淋巴細胞能夠在SCID鼠體 內(nèi)發(fā)生抗原特異性擴增。在上述實驗中pMELHCPl (表達EGFP以及漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl) 載體基因修飾的B淋巴細胞在SCID鼠體內(nèi)能夠在抗原的免疫下特異性擴增，因此進一步 考慮在免疫力正常的BALB/c小鼠體內(nèi)是否也能經(jīng)抗原免疫來特異性擴增基因修飾的靶細 胞?？紤]到EGFP有較強的免疫原性(Stripecke and Carmen etal.，1999)，把檢測指標換為 人促紅細胞生成素(hEPO)，檢測其表達水平能否在抗原特異性免疫后增高。又因為漢灘型 漢坦病毒核心蛋白與構建的載體表達的漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl的親和力 不明，考慮到抗原與BCR結合的親和力會影響基因修飾的靶細胞的擴增效果(下述)，把漢 灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl更換為親和力較高的能與乙型肝炎病毒表面抗原特 異性結合的mlgGl (Affinity constant ΜΧΙΟ^Τ1)。首先用逆轉錄病毒載體pMhE5C31 (此 載體即表達hEPO又表達乙型肝炎病毒表面抗原特異性mlgGl)感染BALB/c小鼠脾B細胞， 感染24小時后把感染后的脾細胞輸入受體鼠BALB/c小鼠體內(nèi)。細胞受體鼠分為三組，第一 組共2只小鼠，為抗原預免疫組，于細胞注射前6天腹腔注射乙肝疫苗安在時5ug/只，用于 提前激活與擴增乙肝病毒表面抗原特異性的輔助性T淋巴細胞(Th cell)，此組動物于細 胞注射后24小時腹腔注射乙肝疫苗安在時IOug/只；第二組共3只小鼠，為抗原非預免疫
18組，于細胞注射后24小時腹腔注射乙肝疫苗安在時IOug/只；第三組共4只小鼠，為實驗對 照組，于細胞注射后24小時腹腔注射等體積的PBS。分別于細胞注射后第5、7、9天取不同 的小鼠割尾取血200微升(因為取血量較大不能短時間內(nèi)連續(xù)取血，所以在不同的時間點 取血的小鼠不同)，ELISA法檢測hEPO的表達水平(該檢測試劑盒能特異性檢測人的ΕΡ0， 與小鼠的EPO沒有交叉反應)。如圖9所示，在抗原免疫后第5天抗原預免疫組與抗原非 預免疫組以及實驗對照組hEPO的表達水平均無明顯差異，第7天時抗原預免疫組hEPO的 表達水平是對照組的3倍，抗原非預免疫組是對照組的1. 5倍，第9天時差異最為明顯，抗 原非預免疫免疫組hEPO的表達水平至少是對照組的5倍(因為抗原預免疫組僅有兩只小 鼠并且均已于第5和第7天采血檢測，此時沒有抗原預免疫組的小鼠可供采血檢測)。并且 抗原免疫后第7天和第9天hEPO表達水平的增高基本與機體受到抗原初次免疫后的抗體 水平的增高時相吻合(Sedgwickand Holt，1983)。從上述結果中可以得出結論表達乙肝 表面抗原特異性mlgGl以及同時表達外源治療基因hEPO的載體基因修飾的B淋巴細胞輸 入BALB/c小鼠體內(nèi)后，外源治療基因hEPO的表達水平可經(jīng)乙肝表面抗原的特異性刺激而 增高。
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0206]<400>1
0207]ggaattcgtc gccaccatgg tgagcaagg29
0208]<210>2
0209]<211>33
0210]<212>DNA
0211]<213> 人工
0212]<220>
0213]<223> 引物 down
0214]<400>2
0215]gaagatcttt acttgtacag ctcgtccatg ccg33
0216]<210>3
0217]<211>1182
<212>DNA<213> 人類<220><221> 基因<222>(1). . (1182)<223>mIgGl 恒定區(qū) cDNA<400>3gccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcCCclclclCtclclC60
tccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacc120
tggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgac180
ctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtc240
acctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagg300
gattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttc360
cccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtg420
gtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggag480
gtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtc540
agtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtc600
aacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctCC3.3.3.3.CC3.3.aggcagaccg660
aaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtc720
agtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtgg780
aatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctct840
tacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttc900
acctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccac960
tctcctgggctgcaactggacgagacctgtgctgaggcccaggacggggagctggacggg1020
ctctggacgaccatcaccatcttcatcagcctcttcctgctcagcgtgtgctacagcgct1080
gctgtcacactcttcaaggtaaagtggatcttctcctcggtggtggagctgaagcagaca1140
ctggttcctgaatacaagaacatgattgggcaagcgccctag1182<210>4<211>59<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 Pl<400>4cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac tccatggtg 59<210>5<211>59<212>DNA<213> 人工
<220><223> 引物 P2<400>5caaggcacca ttctcacagt ctcctcagcc aaaacgacac ccccatctgt ctatccact 59<210>6
<211>22<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 P3<400>6ctagggcgct tgcccaatca tg22<210>7<211>53<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 P4<400>7taaaaggtgt ccagtgtgaa gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtg53<210>8<211>54<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 P5<400>8ggctcagctt gattttcctt gtcctaattt taaaaggtgt ccagtgtgaa gtgc54<210>9<211>42<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 P6<400>9ccgctcgaga tgaacttcgg gctcagcttg attttccttg tc42<210>10<211>33<212>DNA
21<213>人工 <220>
<223> 引物 P7 <400>10
tcgttttggc tgaggagact gtgagaatgg tgc
<210>11
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 P8 <400>11
ccgacgcgtc tagggcgctt gcccaatcat g
<210>12
<211>1587
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>含信號肽的漢灘型漢坦病毒特異性mlgGl輕鏈cDNA <220>
<221>sig_peptide <222>(1). . (57) <220>
<221>根據(jù)NCBI Ig search添加的序列
<222>(58). . (72)
<220>
<221>漢灘型漢坦病毒單克隆抗體L13F3重鏈V區(qū)
33
31<222>(73).(405)
<220>
<221>mIgGl恒定區(qū)
<222>(406) (1587)
<400>12
atgaacttcgggctcagcttgattttccttgtcctaattttaaaaggtgtccagtgtgaa60
gtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcc120
tgtgcagcctctggattcactttcagtacctatgccatgtCttgggttCgccagactccg180
gagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtgatggtacttacacctcctatcca240
gacagtgtgaagggtcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctg300
caaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagacgaggtaac360
ccccttgactactggggccaaggcaccattctcacagtctcctcagccaaaacgacaccc420
ccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctg480
ggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatcc540
ctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagc600
agctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcc660
cacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggttgtaag720
ccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaag780
gatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaag840
gatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcag900
acgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatc960
atgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttc1020
cctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtg1080
tacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatg1140
ataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcg1200
gagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagc1260
aagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgtta1320
catgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctgggctgcaa1380
ctggacgagacctgtgctgaggcccaggacggggagctggacgggctctggacgaccatc1440
accatcttcatcagcctcttcctgctcagcgtgtgctacagcgctgctgtcacactcttc1500
aaggtaaagtggatcttctcctcggtggtggagctgaagcagacactggttcctgaatac1560
aagaacatgattgggcaagcgccctag1587
<210>13
<211>59
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物:Pa
<400>13
ccttgtcctaattttaaaag■ gtgtccagtg tgatgttgtg atgacccagt ctccactca59
<210>14
<211>68
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 Pb
<400>14
gctctagagccgccaccatg aacttcgggctcagcttgattttccttgtcctaattttaa60
aaggtgtc68
<210>15
<211>44
23
<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 Pc<400>15ataagaatgc ggccgcttat taacactcat tcctgttgaa gctc44<210>16<211>29<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 PGKBgl2<400>16gaagatctaa ttctaccggg taggggagg29<210>17<211>28<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 PGKMIui<400>17cgacgcgttg caggtcgaaa ggcccgga28<210>18<211>36<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 CMVSall<400>18acgcgtcgac agttattaat agtaatcaat tacggg36<210>19<211>36<212>DNA<213> 人工<220><223〉引物 CMVNotl<400>19ataagaatgc ggccgcaccg gtagcgctag cggatc36<210>20
24
<400>31aaaccaggac agccacccaa actcctcatc tatgctgcat ccaacgtaga acctggggt 59<210>32<211>59<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 L2<400>32gaatattatg gcacaagttt aatgcagtgg taccaacaga aaccaggaca gccacccaa 59<210>33<211>59<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 L3<400>33gagagccacc atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa tattatggca caagtttaa 59<210>34<211>64<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 L4<400>34gagctcaccc agactccagt ctccctggct gtgtctctag ggcagagagc caccatctcc 60tgca64<210>35<211>59<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 LlR<400>35gaagtctgtc ccagacccac tgccactaaa cctggcaggg accccaggtt ctacgttgg 59<210>36<211>59<212>DNA
28<213>人工 <220>
<223> 引物 L2R <400>36
tgcaatatca tcctcctcca caggctggat gttgaggctg aagtctgtcc cagacccac 59
<210>37
<211>59
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 L3R <400>37
cgtccaagga acattcctac tttgctgaca gaaatacatt gcaatatcat cctcctcca 59
<210>38
<211>44
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 L4R <400>38
ctcgagcttg gtccctcctc cgaacgtcca aggaacattc ctac44
<210>39
<211>321
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>抗乙型病毒性肝炎表面抗原單克隆抗體5C3輕鏈V區(qū) <400>39
gagctcacccagactccagtctccctggctgtgtctctagggcagagagccaccatctcc60tgcagagccagtgaaagtgttgaatattatggcacaagtttaatgcagtggtaccaacag120aaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaacgtagaacctggggtc180cctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccagcctgtg240gaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcagcaaagtaggaatgttccttggacgttc300ggaggagggaccaagctcgag321
<210>40 <211>1599 <212>DNA <213>人工 <220>cagaaaccaggacagccacccaaactcctc
gtccctgccaggtttagtggcagtgggtct
gtggaggaggatgatattgcaatgtatttc
ttcggaggagggaccaagctcgagcgggct
ccatccagtgagcagttaacatctggaggt
taccccaaagacatcaatgtcaagtggaag
ctgaacagttggactgatcaggacagcaaa
acgttgaccaaggacgagtatgaacgacat
acatcaacttcacccattgtcaagagcttc
<210>42
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 hEP029
<400>42
atgggggtgcacgaatgtcctgcctggct
<210>43
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 hEP028
<400>43
tcatctgtcccctgtcctgcaggcctcc
<210>44
<211>582
<212>DNA
<213>人類
<220>
<221>基因
<222> ⑴· ·(582)
<223>hEP0cDNA
<400>44
atgggggtgcacgaatgtcctgcctggctg
ctgggcctcccagtcctgggcgccccacca
aggtacctcttggaggccaaggaggccgag
agcttgaatgagaatatcactgtcccagac
atggaggtcgggcagcaggccgtagaagtc
atctatgctgcatccaacgtagaacctggg240gggacagacttcagcctcaacatccagcct300tgtcagcaaagtaggaatgttccttggacg360gatgctgcaccaactgtatccatcttccca420gcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttc480attgatggcagtgaacgacaaaatggcgtc540gacagcacctacagcatgagcagcaccctc600aacagctatacctgtgaggccactcacaag660aacaggaatgagtgttag708
29
28
tggcttctcctgtccctgctgtcgctccct60cgcctcatctgtgacagccgagtcctggag120aatatcacgaCgggCtgtgCtgaacactgc180accaaagttaatttctatgcctggaagagg240tggcagggcctggccctgctgtcggaagct300
31
gtcctgcggggccaggccct gttggtcaac tcttcccagccgtgggagcccctgcagctg360
catgtggataaagccgtcag tggccttcgc agcctcaccactctgcttcgggctctggga420
gcccagaaggaagccatctc ccctccagat gcggcctcagctgctccactccgaacaatc480
actgctgacactttccgcaa actcttccga gtctactccaatttcctccggggaaagctg540
aagctgtacacaggggaggc ctgcaggaca ggggacagatga582
<210>45
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 hEPOEcoRl
<400>45
cggaattcatgggggtgcac gaatgtcctg cct33
<210>46
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 hEP0Bgl2
<400>46
gaagatcttcatctgtcccc tgtcctgcag gc32
3權利要求
一種同時表達抗原特異性受體和報告基因或同時表達抗原特異性受體和具有治療作用的基因的重組逆轉錄病毒載體。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組逆轉錄病毒載體，其特征在于所述抗原特異性受體為人 漢灘型漢坦病毒核心蛋白特異性mlgGl或人乙肝病毒表面抗原特異性mlgGl。
3.根據(jù)權利要求1所述的重組逆轉錄病毒載體，其特征在于所述報告基因為EGFP基 因，所述具有治療作用的基因為人EPO基因。
4.根據(jù)權利要求1所述的重組逆轉錄病毒載體，其特征在于所述逆轉錄病毒載體為 pMSCV、pLXSN、pLXINo
5.一種用同時表達抗原特異性受體和報告基因或同時表達抗原特異性受體和具有治 療作用的基因的重組逆轉錄病毒載體在體外修飾哺乳動物包括人B-淋巴細胞的方法，其 包含下述步驟a)分離、培養(yǎng)所述的B-淋巴細胞16-24小時，b)以每IXIO8個細胞用包裝好的所述重組逆轉錄病毒載體體外感染步驟a)中培養(yǎng)的 細胞24小時，洗滌感染后的細胞并把此細胞輸入小鼠體內(nèi)。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述抗原特異性受體為漢灘型漢坦病毒核 心蛋白特異性mlgGl或乙肝病毒表面抗原特異性mlgGl。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述報告基因為EGFP基因，所述具有治療 作用的基因為人ΕΡ0。
8.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述逆轉錄病毒載體為pMSCV、pLXSN、 pLXIN。
9.一種根據(jù)權利要求5的方法獲得的B-淋巴細胞。
10.根據(jù)權利要求9所述的B-淋巴細胞，其特征在于所述抗原特異性受體為漢灘型漢 坦病毒核心蛋白特異性mlgGl或乙肝病毒表面抗原特異性mlgGl。
11.根據(jù)權利要求9所述的B-淋巴細胞，其特征在于所述報告基因為EGFP基因，所述 具有治療作用的基因為人ΕΡ0。
12.根據(jù)權利要求9所述的B-淋巴細胞，其特征在于所述逆轉錄病毒載體為pMSCV、 pLXSN、pLXIN。
13.—種同時表達抗原特異性受體和具有治療作用的基因的重組逆轉錄病毒載體在制 備治療B淋巴細胞相關疾病、遺傳性疾病、腫瘤或病毒感染性疾病的藥物中的用途。
14.根據(jù)權利要求13所述的用途，其特征在于所述抗原特異性受體為漢灘型漢坦病毒 核心蛋白特異性mlgGl或乙肝病毒表面抗原特異性mlgGl。
15.根據(jù)權利要求13所述的用途，其特征在于所述具有治療作用的基因為人ΕΡ0。
16.根據(jù)權利要求13所述的用途，其特征在于所述逆轉錄病毒載體為pMSCV、pLXSN、 pLXIN。
17.根據(jù)權利要求13所述的用途，其特征在于所述B淋巴細胞相關疾病為腺苷脫氨酶缺乏癥。
18.根據(jù)權利要求13所述的用途，其特征在于所述遺傳性疾病為凝血因子VIII或IX 缺乏引起的血友病或脂蛋白脂肪酶缺乏癥。
19.一種使用同時表達抗原特異性受體和具有治療作用的基因的重組逆轉錄病毒載體治療B淋巴細胞相關疾病、遺傳性疾病、腫瘤或病毒感染性疾病患者的方法，所述方法包括 下述步驟a)利用血細胞分離機從患者血液中采集至少IXlO4個B-淋巴細胞并進行常規(guī)培養(yǎng)以 擴增細胞數(shù)目，b)以每IXIO8個細胞用包裝好的所述重組逆轉錄病毒載體體外感染步驟a)中培養(yǎng)的 細胞2-24小時，c)將步驟b)中獲得的細胞用無菌PBS重懸，以0.1 100 X IO6個細胞/kg/天的劑量 經(jīng)靜脈注射入患者體內(nèi)。
20.根據(jù)權利要求19所述的方法，其特征在于所述抗原特異性受體為漢灘型漢坦病毒 核心蛋白特異性mlgGl或乙肝病毒表面抗原特異性mlgGl。
21.根據(jù)權利要求19所述的方法，其特征在于所述具有治療作用的基因為人ΕΡ0。
22.根據(jù)權利要求19所述的方法，其特征在于所述逆轉錄病毒載體為pMSCV、pLXSN、 pLXIN。
23.根據(jù)權利要求19所述的方法，其特征在于所述B淋巴細胞相關疾病為腺苷脫氨酶缺乏癥。
24.根據(jù)權利要求19所述的方法，其特征在于所述遺傳性疾病為凝血因子VIII或IX 缺乏引起的血友病或脂蛋白脂肪酶缺乏癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同時表達抗原特異性受體和報告基因或具有治療作用的基因的重組逆轉錄病毒載體、所述重組逆轉錄病毒載體在制備治療需要進行基因治療的患者的藥物中的用途、利用所述重組逆轉錄病毒在體外修飾B-淋巴細胞的方法、利用所述方法獲得的修改的B-淋巴細胞及使用所述重組逆轉錄病毒載體治療B淋巴細胞相關疾病、遺傳性疾病、腫瘤或病毒感染性疾病患者的方法。
文檔編號C12N15/867GK101899471SQ20091008546
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權日2009年5月26日
發(fā)明者劉德培, 呂湘, 徐珍, 李家亮, 梁植權, 陳鋒 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所