專利名稱::一種小麥矮腥黑粉菌的特異基因序列、特異性scar標(biāo)記及pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域:
,涉及一種小麥矮腥黑粉菌的特異性基因片段、特異性SCAR標(biāo)記及PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù):
:小麥矮腥黑粉菌(77//幼'flcw7的ver^KUhn,簡(jiǎn)稱TCK)引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要的國際檢疫性病害,對(duì)小麥生產(chǎn)具有毀滅性危害,也是我國外來生物入侵研究的主要物種之一(王圓.小麥矮腥黑穗病菌[M].中國進(jìn)境植物檢疫有害生物選編,中華人民共和國動(dòng)植物檢疫局和農(nóng)業(yè)部植物檢疫實(shí)驗(yàn)所編,北京中國農(nóng)業(yè)出版社,1997,9598)。在小麥矮腥黑穗病流行年份引起的產(chǎn)量損失一般為2050°/。,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)7590%,甚至絕產(chǎn)。病菌抗逆性極強(qiáng),其冬孢子在土中可存活37年,包裹在菌癭中的冬孢子甚至可保持活力長達(dá)IO年以上。此病害一旦發(fā)生,很難防治或根除,所以國際上有15個(gè)國家將其列為檢疫對(duì)象加以防范。我國從20世紀(jì)60年代開始一直將此病害列為一類對(duì)外檢疫對(duì)象。在腥黑粉菌中,TCK與其近緣種小麥網(wǎng)腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌等在形態(tài)學(xué)上極為相似,難于區(qū)別。傳統(tǒng)的病害診斷、檢測(cè)方法主要是依據(jù)病原形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)的特性,不但過程繁瑣、時(shí)間周期長,而且準(zhǔn)確性差、精度不高。因此,利用分子生物學(xué)手段快速、準(zhǔn)確地鑒別小麥矮腥黑粉菌具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。1996年Ferreira等(FerreiraM.A.,TooleyP.W.,HatziloukasE.etc.IsolationofaspeciesspecificmitochondrialDNAsequenceforidentificationof7//WazW/co,theKarnalbuntofwheatfungus[J].ApplicationEnvironmentMicrobiology,1996,62:8793)首次將PCR技術(shù)引進(jìn)到印度腥黑穗病(7)7/eria/w//raMitra)的鑒定中來,他們選擇了印度腥黑粉菌線粒體DNA的一個(gè)2.3kb的EcoRI片段進(jìn)行了克隆和測(cè)序,設(shè)計(jì)的特異性引物Til/Ti4從25種腥黑穗病菌菌株中鑒定出了印腥。另外,Sm他等(SmithO.P.,PetersonG.L.BeckR.J.etc.DevelopmentofaPCR-basedmethodforidentificationofr/〃erta化fifica,causalagentofkarnalbuntofwheat[J].Phytopathology,1996,86:115122)通過克隆印度腥黑粉菌線粒體DNA的DraI片段,進(jìn)行了序列分析,設(shè)計(jì)了兩套寡核苷酸引物對(duì)Til7/Ml和Til7/M2,能分別從印度腥黑粉菌中擴(kuò)增出大小為825bp和118bp特異性片段,也實(shí)現(xiàn)了對(duì)印度腥黑穗病的檢測(cè)鑒定工作。2000年Frederic等(FrederickR.D.,SnyderK.E.,TooleyP.W.IdentificationandDifferentiationof77〃e".a/"&'caandZvra/fehusingthePolymeraseChainReaction[J].Phytopathology,2000,90:951-960.)根據(jù)線粒體的差異設(shè)計(jì)了5對(duì)針對(duì)印度腥黑粉菌的特異性引物和3對(duì)針對(duì)黑麥草腥黑粉菌的特異性引物,分別能將印度腥黑粉菌菌株和黑麥草腥粉菌病菌株從其近緣屬種中鑒別出來。張競(jìng)宇等(張競(jìng)宇,張正光,鄭小波,等.小麥印度腥黑穗病菌的分子檢測(cè)[J].高技術(shù)通訊,2004,1:3136)利用核糖體ITS序列上的差異在乃7/幼'"屬20個(gè)種中設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物Tl/T2,能將7:和7:m汰m'從其它種中區(qū)分開來,而后又根據(jù)73/W/c"和7!wa汰en'線粒體之間的差異設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物Ml/M2,可以將二者區(qū)分開來,為了使反應(yīng)更為靈敏,建立了套式PCR技術(shù),以便于提供更簡(jiǎn)單的鑒定方法。梁宏等(梁宏,彭友良,張國珍,等.腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌rDNA2IGS區(qū)的擴(kuò)增及其序列分析[J].植物病理學(xué)報(bào),2006,36(5):407-412)依據(jù)核糖體的IGS1區(qū)特性,設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,可以將小麥光腥黑粉菌菌株從其近緣屬種中鑒別出來。2004年高強(qiáng)(高強(qiáng).小麥矮腥黑穗病的分子檢測(cè)[D].長沙,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2004)利用RAPD技術(shù)找到了一條可以將小麥網(wǎng)腥黑粉菌菌株和小麥矮腥黑粉菌菌株區(qū)別于其它黑粉菌株的條帶,但是很遺憾在矮腥黑粉菌和網(wǎng)腥黑粉菌之間沒有找到有差異的條帶,沒能將二者分開。2006年周業(yè)琴,劉素萍等(周業(yè)琴,劉素萍,周國梁,等.水稻腥黑粉病菌的單孢檢測(cè)[J]。植物檢疫,2006,20:3841)應(yīng)用核糖體ITS序列的通用引物Till/Ti14和兩對(duì)特異性引物(Hor2/Hor9;Hml/Hm5)結(jié)合建立了套式PCR技術(shù),可以將水稻腥黑粉菌標(biāo)定出來。本實(shí)驗(yàn)室陳萬權(quán)、劉太國、劉建華利用AFLP技術(shù),找到了小麥矮腥黑粉菌的特異性片段,能將小麥矮腥黑粉菌從其近緣屬種中區(qū)分開來,該技術(shù)已經(jīng)獲得國家發(fā)明專利,專利號(hào)為200510080073.7,但未報(bào)道其檢測(cè)的靈敏度,尚未在海關(guān)檢疫中應(yīng)用。ISSR是指利用基于SSR而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物來檢測(cè)2個(gè)SSR之間的一段短DNA序列差異,其優(yōu)點(diǎn)是可在沒有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的情況下,進(jìn)行基因組指紋圖構(gòu)建;可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)SSR座位;DNA用量少;顯性或共顯性。ISSR標(biāo)記可以用來填充遺傳圖譜中一些RFLP標(biāo)記稀少間斷或空白區(qū),因此,在QTL定位中也逐漸得到較多的應(yīng)用。目前國內(nèi)外尚未見基于ISSR方法獲得特異性引物檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明根據(jù)目前分子生物學(xué)方法檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的方法單一、靈敏度不高、檢測(cè)樣本范圍較窄的現(xiàn)狀,提供一種小麥矮腥黑粉菌的特異性SCAR標(biāo)記及其引物,用于檢測(cè)小麥腥黑粉菌,具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)。一種小麥矮腥黑粉菌的特異基因序列,其特征是具有SeqNo.l、SeqNo.2或SeqNo.3所示的核苷酸序列。一種小麥矮腥黑粉菌的特異性SCAR標(biāo)記,其核苷酸序列是根據(jù)SeqNo.l、SeqNo.2或SeqNo.3所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增而來。所述的SCAR標(biāo)記,具有如SeqNo.4、SeqNo.5或SeqNo.6所示的核苷酸序列。一種檢測(cè)小麥矮腥黑穗病的PCR方法,其特征在于根據(jù)SeqNo.4、SeqNo.5或SeqNo.6所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增待測(cè)模板。所述引物為正向引物TCKSF1:5'-TGGTGGTCGGGAAAGATTAGA-3,,反向引物TCKSRI:5,-GGGACGAAGGCATCAAGAAG-3,;正向引物TCKSF2:5,-TTGCTGGCTCTTCGCCCTGA-3,反向弓I物TCKSR2:5'-TTGCCCGTCTTGCGGTTGAT-3,;或者,正向引物TCKSF3:5'國CACACACACACAGGAAGCA-3',反向引物TCKSR3:5,-CGAGGAAGCAGACAAGGCAT隱3'。本發(fā)明基于ISSR獲得的小麥矮腥黑粉菌的特異性基因序列,所采用的黑粉菌樣本來源廣泛,共計(jì)51個(gè)菌株14個(gè)小麥矮腥黑粉菌(7:co^ravenraKiihn,TCK)菌株;6個(gè)小麥光腥黑粉菌(Z/oWW"Liro,TFL)菌株,其中l(wèi)個(gè)來自于捷克(TFL6),其余5個(gè)來源國內(nèi)不同地區(qū);24個(gè)小麥網(wǎng)腥黑粉菌(7:aOT&Tul.,TCT)菌株,大部分來自于美國,1個(gè)來自于捷克(TCT24),以及另外5種不同種的真菌菌株。這51個(gè)樣本來源基本涵蓋了目前黑粉菌盛行的地域,用加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100個(gè)ISSR引物對(duì)這些菌株進(jìn)行特異性引物篩選,其中引物ISSR859能在小麥矮腥黑粉菌中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出670bp的片段,ISSR818能在小麥矮腥黑粉菌中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出952bp以及867bp的片段,而在其余兩種近緣的腥黑粉菌的37個(gè)菌株和其它對(duì)照的病原真菌中中沒有發(fā)現(xiàn)該條帶。因此,確定其為小麥矮腥黑粉菌特有的核苷酸序列。通過回收測(cè)序上述3個(gè)特異性DNA片段,獲得這些片段的核苷酸序列信息,如SeqNo.l,No.2,No.3所示。由于本發(fā)明獲得的S叫No.l,No.2,No.3所示的核苷酸序列是小麥矮腥黑粉菌所特有的基因片段,因此,根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的特異性引物,能將小麥矮腥黑粉菌從其近緣種中區(qū)別開來。這些引物所擴(kuò)增出來的基因片段可用作小麥矮腥黑粉菌的SCAR標(biāo)記。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的特異性引物TCKSF(l-3)/TCKSR(l-3),其核苷酸序列如SeqNo.(7-12)所示,能高靈敏度、高特異性地將小麥矮腥黑粉菌鑒別出來,該對(duì)引物所擴(kuò)增出來的基因片段具有SeqNo.4,No.5,No.6所示的核苷酸序列,其大小分別為372bp、496bp和419bp,可作為小麥矮腥黑粉菌的優(yōu)選SCAR標(biāo)記。本發(fā)明檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的PCR方法中,由于檢測(cè)潛伏期的種子或者幼苗時(shí),其攜帶5的菌量非常少,與種子或者幼苗共同提取的DNA中,病菌的DNA比例極低,對(duì)引物的特異性、靈敏性要求非常高。因此,PCR反應(yīng)體系采用高特異性SCAR標(biāo)記如SeqNo.4,No.5,No.6所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)高特異性、高靈敏度識(shí)別的引物,這些引物擴(kuò)增出來的基因片段只要方便于瓊脂糖凝膠檢測(cè)即可。本發(fā)明優(yōu)選TCKSF(l-2)/TCKSR(l-2)作為檢測(cè)引物,其檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到lng/25nl。本發(fā)明提供的小麥矮腥黑粉菌特異性DNA片段SeqNo.l,No.2,No.3以及根據(jù)這些特異性片段的核苷酸序列獲得的高特異性和高靈敏度的SCAR標(biāo)記如SeqNo.4,No.5,No.6所示的核苷酸序列,可為PCR技術(shù)檢測(cè)小麥矮腥黑穗病提供多種引物選擇。根據(jù)SCAR標(biāo)記序列設(shè)計(jì)的一對(duì)高特異性引物TCKSF(l-2)/TCKSR(l-2)的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1ng/25nl。因此,本發(fā)明提供的PCR方法用于檢測(cè)小麥腥黑粉菌具有省時(shí)、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn),相對(duì)于本實(shí)驗(yàn)室以前利用AFLP技術(shù)研發(fā)的"一種小麥矮腥黑粉菌檢測(cè)的PCR方法"(專利號(hào)200510080073.7;發(fā)明人陳萬權(quán)等,2007),具有更高的檢測(cè)靈敏度和可靠性。該方法可應(yīng)用于對(duì)小麥矮腥黑粉菌帶菌麥種樣品的檢測(cè)以及小麥矮腥黑穗病的診斷,具有更高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。圖1:ISSR859引物篩選其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL2000);1-8分別為小麥矮腥黑粉菌(編碼為TCK1,TCK2,TCK3,TCK4,TCK5,TCK6,TCK7,TCK8),9-12分別為小麥光腥黑粉菌(編碼為TFL1,TFL2,TFL3,TFL4),13-16分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌(編碼為TCT1,TCT2,TCT3,TCT4)。圖2:特異性SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL2000);1-14分別為小麥矮腥黑粉菌14個(gè)菌株(編碼為TCK1,TCK2,TCK3,TCK4,TCK5,TCK6,TCK7,TCK8,TCK9,TCK10,TCKll,TCK12,TCK13,TCK14),15-38分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌24個(gè)菌株(編碼為TCT1,TCT2,TCT3,TCT4,TCT5,TCT6,TCT7,TCT8,TCT9,TCT10,TCTll,TCT12,TCT13,TCT14,TCT15,TCT16,TCT17,TCT18,TCT19,TCT20,TCT21,TCT22,TCT23,TCT24),39-44別為小麥光腥黑粉菌(編碼為TFL1,TFL2,TFL3,TFL4,TFL5,TFL6),45為小麥散黑黑粉菌,46為稻粒黑粉菌,47為甘蔗黑粉菌,48為高粱黑粉菌,49,50為玉米絲黑穗病菌,51為小麥條銹菌,52為雙蒸水。圖3:特異性引物TCKSF1/TCKSR1的靈敏度檢測(cè)其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL2,000);1-10分別為小麥矮腥黑粉菌(TCK9)不同濃度梯度,分別為100ng、50ng、20ng、10ng、5ng、lng、100pg、10pg、lpg、0.1pg(25jal)。圖4:ISSR818引物篩選其中1為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL2000);2-5分別為小麥矮腥黑粉菌(編碼為TCK2,TCK6,TCK7,TCKIO),6-9分別為小麥光腥黑粉菌(編碼為TFL1,TFL2,TFL3,TFL4),10-12分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌(編碼為TCT1,TCT2,TCT3)。圖5:特異性SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證其中1、25、26、50為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL2000);2-9分別為小麥矮腥黑粉菌8個(gè)菌株(編碼為TCK1,TCK2,TCK5,TCK6,TCK7,TCK8,TCK9,TCKIO),10-17分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌8個(gè)菌株(編碼為TCT1,TCT2,TCT3,TCT4,TCT5,TCT6,TCT7,TCT8),18-23別為小麥光腥黑粉菌6個(gè)菌株(編碼為TFL1,TFL2,TFL3,TFL4,TFL5,TFL6),24,27-28為小麥散黑粉菌,29-33為甘蔗黑粉菌,34-36為高粱黑粉菌,37-40為玉米絲黑穗病菌,41-42為小麥條銹菌,43-44為小麥葉銹菌,45-46為小麥稈銹菌,47為小麥白粉菌,48為小麥赤霉菌,49為雙蒸水。圖6:特異性引物TCKSF2/TCKSR2的靈敏度檢測(cè)其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL2,000);2-12分別為小麥矮腥黑粉菌(TCK6)不同濃度的梯度,分別為60ng、50ng、30ng、20ng、10ng、5ng、lng、100pg、10pg、lpg、Opg(25^11)。圖7:特異性SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證其中l(wèi)、25、26、50為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL2000);2-9分別為小麥矮腥黑粉菌8個(gè)菌株(編碼為TCK1,TCK2,TCK5,TCK6,TCK7,TCK8,TCK9,TCKIO),10-17分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌8個(gè)菌株(編碼為TCT1,TCT2,TCT3,TCT4,TCT5,TCT6,TCT7,TCT8),18-23別為小麥光腥黑粉菌6個(gè)菌株(編碼為TFL1,TFL2,TFL3,TFL4,TFL5,TFL6),24,27-28為小麥散黑粉菌,29-33為甘蔗黑粉菌,34-36為高粱黑粉菌,37-40為玉米絲黑穗病菌,41-42為小麥條銹菌,43-44為小麥葉銹菌,45-46為小麥稈銹菌,47為小麥白粉菌,48為小麥赤霉菌,49為雙蒸水。圖8:特異性引物TCKSF3/TCKSR3的靈敏度檢測(cè)其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL2,000);1-10分別為小麥矮腥黑粉菌(TCK7)不同濃度的梯度,分別為100ng、90ng、80ng、70ng、60ng、50ng、40ng、30ng、20ng、10ng、5ng、lng、100pg、10pg(25pl)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)材料小麥矮腥黑粉菌(co"的wmKiihn,TCK)共14個(gè)菌株,其中12個(gè)菌株來源于美國,2個(gè)菌株由重慶大學(xué)王中康教授提供;小麥光腥黑粉菌(7:/o^c/"Liro,TFL)共6個(gè)菌株,其中1個(gè)來源自捷克,其余5個(gè)來源國內(nèi)不同地區(qū),均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥病組收存;小麥網(wǎng)腥黑粉菌(7:c"n&Tul.,TCT)共24個(gè)菌株,除l個(gè)來自捷克外,其余均由重慶大學(xué)王中康教授提供;小麥散黑粉菌(t/勸7flgo化衍c/入稻粒黑粉菌(A^ovom/"/zwr/必入甘蔗黑粉菌("sc/to附z7efl入高粱軸黑粉菌(5^/wce/w/zeca玉米絲黑穗病菌(51rez7/awa入小麥條銹菌(尸wccm'aWn'z/ww"入小麥葉銹菌(P的7/c/"a人小麥稈銹菌CPgra/w/w^、小麥白粉菌(五Ow;p/zegram/m'^、小麥赤霉菌(尸^ar/Mmgra附/"eara附)等由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥病組收存,可向公眾發(fā)放作為非商業(yè)性實(shí)驗(yàn)用(見表1)。表1本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株材料<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>菌株編菌株學(xué)名號(hào)保存單位來源PRPGEGFG尸wc"'"/a的Y/c/waEriks.尸wcc/rt/agraw/m'sPers.gra附Zw/s(DC.)Speer.FMsa"'訓(xùn)grammar,Schw.InstituteofPlantProtection,CAASChinaInstituteofPlantProtection,CAASChinaInstituteofPlantProtection,CAASChinaInstituteofPlantProtection,CAASChina主要試劑TaqDNAPolymerase、dNTP、Mg2+、質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技公司;克隆載體pMD18-T、IPTG、X-Gal購于寶生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠試劑盒購于AXYGEN;ISSR引物根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR序列由上海生物工程公司合成。實(shí)施例1:篩選小麥矮腥黑粉菌特異性的ISSR特異性引物1.1小麥矮腥黑粉菌DNA的提取應(yīng)用改進(jìn)的CTAB/SDS方法提取小麥矮腥黑粉菌的DNA。(1)樣品的預(yù)處理取黑粉菌菌癭一個(gè)(大約lOmg)壓碎加入到2ml的滅菌螺口離心管中,加入25mg硅藻土、250mg直徑1mm滅菌玻璃珠,渦旋儀震蕩混勻。置于-2(TC過夜。(2)水浴離心管中加入預(yù)熱的660nlSDS/CTAB提取緩沖液和5^1蛋白酶K溶液,渦旋儀混勻,65'C恒溫水浴lh(3)研磨置離心管于快速核酸提取儀MPFastPrep-24中,設(shè)6.5M/s,10s處理l次。(4)抽提取上清液,加入等體積氯仿/異戊醇混合溶液(24:1),4°C,15493xg離心10min。轉(zhuǎn)上清液至新離心管,再重復(fù)抽提操作2次(5)去除RNA:取上清液至新離心管,加入5^dl0mg/mlRNA酶,37。C恒溫水浴l-2h后,按抽提的步驟再抽提一次。(6)沉淀轉(zhuǎn)上清液至新離心管,加入0.6倍體積預(yù)冷異丙醇輕輕混勻,4'C保存1小時(shí)。15493xg離心10min。棄上清液。(7)洗滌為加入200pl預(yù)冷70%乙醇,用移液槍沖洗,洗滌2次。15493xg離心5min,沉淀DNA。(8)溶解真空干燥10min后,將DNA溶于20nlTE溶液,-20°(:保存。1.2小麥矮腥黑粉菌特異性ISSR標(biāo)記引物的(SCAR標(biāo)記)的篩選從加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100個(gè)ISSR引物中挑選其中的40個(gè),按優(yōu)化好的反應(yīng)體10系及各引物的最佳退火溫度對(duì)所有的小麥矮腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌進(jìn)行篩選。篩選到引物UBC859能穩(wěn)定的擴(kuò)增出小麥矮腥黑粉菌的特異片段(圖l)。ISSR-PCR反應(yīng)體系采用25|al的PCR反應(yīng)體系,配比如下10xPCR-buffer2.5pl,Mg2+2pl(25mM),dNTPs0.25pl(10mM),3pl(l(VM)引物(ISSR859:5,-TGTGTGTGTGTGTGTGRC-3,;ISSR818:5,-TGTGTGTGTGTGTGTGRC-3')TaqDNA多聚酶0.4)^1(2.5U/nl),模板DNA1.5pl(20ng/|al),滅菌雙蒸水補(bǔ)足25pl。在MJresearchPCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為94"Clmin;94°C1min,48°C(退火溫度按不同引物的最佳溫度選取)lmin,72°C2min,40個(gè)循環(huán);72"C延伸5min;4°Cforever。PCR擴(kuò)增后,取5pl擴(kuò)增產(chǎn)物加lpl加樣緩沖液在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,用lxTAE作為電泳緩沖液,100V下電泳2小時(shí),用EB染色,在紫外燈下觀測(cè)并照相。如圖l。用引物ISSR859及ISSR818經(jīng)過多次擴(kuò)增確定多態(tài)性較穩(wěn)定,從圖1和圖4中可以看出引物ISSR859,ISSR818擴(kuò)增小麥矮腥黑粉菌群體獲得670bp、952bp和867bp的特異性DNA片段。將該片段從瓊脂糖凝膠上切割下來,使用AXYGEN公司的DNA回收試劑盒對(duì)特異性片段進(jìn)行回收和純化后,純化后的產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上,PCR產(chǎn)物與載體連接后,轉(zhuǎn)化到£.CO//中進(jìn)行克隆,分別用載體上的測(cè)序引物和限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)。將表現(xiàn)為陽性克隆的重組質(zhì)粒交由上海生物工程公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)定的670bp、952bp和867bp小麥矮腥黑粉菌特異性片段的全序列如SeqNo.l、SeqNo.2和SeqNo.3所示.實(shí)施例2小麥矮腥黑粉菌特異性片段序列測(cè)定及獲得特異性SCAR標(biāo)記根據(jù)實(shí)施例1獲得的小麥矮腥黑粉菌特異性片段的序列測(cè)序結(jié)果,用DNAMAN5.2.2軟件對(duì)序列進(jìn)行分析比較,并分別設(shè)計(jì)三對(duì)TCK的專化SCAR引物TCKSF(l-3)/TCKSR(l-3)。這些引物可在所有TCK菌株中分別擴(kuò)增出372bp、496'bp和419bp的條帶,而在小麥光腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌中沒有任何擴(kuò)增產(chǎn)物如圖2、5、7。因此,上述3個(gè)片段是小麥腥黑粉菌的特異性SCAR標(biāo)記。引物TCKSF(1-3)和TCKSR(1-3)序列如下TCKSF1(5,-TGGTGGTCGGGAAAGATTAGA-3,)TCKSR1(5,-GGGACGAAGGCATCAAGAAG-3,)TCKSF2(5'-TTGCTGGCTCTTCGCCCTGA-3,)TCKSR2(5'-TTGCCCGTCTTGCGGTTGAT-3,)TCKSF3(5,陽CACACACACACAGGAAGCA-3,)TCKSR3(5,-CGAGGAAGCAGACAAGGCAT-3,)實(shí)施例3:小麥矮腥黑粉菌特異性SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證本發(fā)明構(gòu)建的小麥矮腥黑粉菌特異性SCAR標(biāo)記引物TCKSF(1-3)/TCKSR(l-3)由上海生物工程公司合成,特異性SCAR標(biāo)記的擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25pl,其中含有10xPCR-buffer2.5jal,Mg2+2pl(25mM),dNTPs0.3jal(10mM),TCKSF(l-3)/TCKSR(l-3)各(10)aM),TaqDNA多聚酶0.3pl(2.5U/|al),模板DNA(小麥矮腥黑粉菌及小麥光腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌提取的DNA)1^1(20ng/nl),滅菌雙蒸水補(bǔ)足25^1。PCR擴(kuò)增條件為94°C5min;94°C30Sec,TCKSF1,3/TCKSR1,355°C30Sec(TCKSF2/TCKSR260°C30Sec),72°Clmin,30個(gè)循環(huán);72。C延伸10min;4°Cforever。PCR擴(kuò)增后,取5^1擴(kuò)增產(chǎn)物加1^1加樣緩沖液在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳,100V下電泳1小時(shí),用EB染色,采用Bio-Rad公司的凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行照相分析。如圖2,用引物TCKSF1/TCKSR1可在所有小麥矮腥黑粉菌中獲得372bp的特異性SCAR標(biāo)記片段,如圖2中1-14泳道,而小麥網(wǎng)腥黑粉菌,圖2中15-38泳道)、小麥光腥黑粉菌,圖2中39-44泳道,小麥散黑穗病菌、稻粒黑粉菌、甘蔗黑粉菌、高粱黑粉菌、玉米絲黑穗、小麥條銹菌的45-51泳道中沒有獲得相應(yīng)的擴(kuò)增片段。如圖5及圖7,小麥矮腥黑粉菌分別可獲得496bp以及419bp的特異性SCAR標(biāo)記片段,如圖5中2-9泳道,圖7中2-8泳道。說明本發(fā)明所構(gòu)建的SCAR標(biāo)記是小麥矮腥黑粉菌的高特異性SCAR標(biāo)記。根據(jù)該SCAR標(biāo)記設(shè)計(jì)的特異性引物可用于檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌。實(shí)施例4:特異性引物的靈敏度檢測(cè)由于特異性SCAR標(biāo)記設(shè)計(jì)的特異性引物具有高特異性和高靈敏度,本發(fā)明直接選用擴(kuò)增該SCAR標(biāo)記的引物作為PCR檢測(cè)小麥腥黑粉菌的特異性引物。通過如下實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其靈敏度。將TCK模板DNA分別稀釋成100ng/(al、50ng/|_d、20ng/pl、10ng/|al、51ng/)al、100pg/(al、10pg/|il、lpg4il、0.1pg/)al,在每個(gè)反應(yīng)體系中加入lpl稀釋好的DNA模板進(jìn)行PCR。PCR體系同實(shí)施例3,PCR后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,TCKSF1/TCKSR1在模板量l-100ng的范圍內(nèi)均可擴(kuò)增出372bp的條帶,如圖3所示;TCKSF2/TCKSR2在模板量l~60ng的范圍內(nèi)均可擴(kuò)增出496bp的條帶,如圖6所示,TCKSF3/TCKSR3在模板量5100ng的范圍內(nèi)均可擴(kuò)增出419bp的條帶,如圖8所示。12本發(fā)明通過ISSR分子標(biāo)記的方法篩選出TCK獨(dú)有的特異片段,并成功的轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的特異性SCAR標(biāo)記,其中TCKSF(l-2)/TCKSR(l-2)在最低模板含量lng時(shí)即可有效的檢測(cè)出TCK,而在小麥光腥黑粉菌、小麥網(wǎng)腥黑粉菌上沒有擴(kuò)增。說明本發(fā)明構(gòu)建的小麥矮腥黑粉菌特異性SCAR標(biāo)記具有較高的準(zhǔn)確性及可靠性,根據(jù)其設(shè)計(jì)的引物可以用于小麥矮腥黑粉菌的快速分子檢測(cè)。附錄序列表<170><210><211〉<212><213><400>Patentlnversion3.31670DNA小麥矮腥黑粉菌特異性序列1tgtgtgtgacattacataagccgtcatcacacatcatccatgtgtccggtgcgacggaga60tatccgatacgagcgccggcgattgtggatcatgtgatgattgccagaaggaagtgggga120acagaaccacatggtggtcgggaaagattagataagataaggagaattatcaccaccacc180accgccgccgctgtcagtctacgcagcagcagagacggatgcagctgttgcgctttgtgc240gctgccctgctgtggtctccgtcgtccattccgctgctacgttgggctgcgcgccccgcc300cgtcgaacggccaccaccaacacctgcaccatcataccaccaccgcgcatcagcccgccc360gtcctctcgcgcgtgctgctctgcctacaagtcgcacgaccgactttccgagagcctgcc420tctccctaccatggaccccggcttcaagaacgacttgcggtccctccacacggatacctc480ggccttcttgatgccttcgtcccacaccacagcccggacaattcgatagtctttcaacac540gattgtccggcataaccacgctcctcggagacacccatcggctaagaaccgacacacctc600ggctaacaaccgaccaceaaggcgtgggcgccctggatcttctactcccgccgccacaca660<210>2<211>952<212〉DNA<213>小麥矮腥黑粉菌特異性片段<400>2cacacacacacacacaggctgccctctccgccgtcacgtccgggtcc朋gtcagcatggg60agctgcccacctcccgtcgtgccactgaccgcctccctccacgcccgccaggccgaagtc120gccgaccaacacatcttcaacacccgcatcccggacgaaggtcggccgtttgctggctct180tcgccctgacgaattgtatccggctggaggtcatgaagaagtctgggttggatctctttg240agctcagttaagcgtatcccctgtcaacgattggaggtcagttccctcgcttcctctcta300tctctcgcttctcatgcctctccctttcttgctcacacctttacctctgcaggaccatgg360ctgacaagctgggccggatcagcaatcatggagggcatcggctacgtcctcgctgccgat420cccgcccagatcctgctcaaccgcggcggacgcgtcgtctttctggtcctctggcccttt480atctgctccgtcgctgcattcgtctgcatcaccgccattcaggcctcgccctcggctgga540ttttcctcgccttcctcgcctttgcttcgtacttgtgagtctctttctgtgttcctgcac600tcgttaaatttctactgatcacgcgttcccggcgcagtgctctccatcaaccgcaagacg660ggcaacgtcgccaccaaggtcaagatggacgtccacctcactgttcggga^cgcaccatg720gaaatctacggtgagtcatgccgccctctcctatttatcttatcatgtaatcatgtctcc780tcactctctctctcctccgagctcgcatcgcttttagtgcaaccagtcacaaactcacac840tactcccatcagttccgatgccccacctcatcagtcaatagtcatcatgcaccctccatc900tgaccatcacccataggtcacatcgctctctctttetgtgtgtgtgtgtgtg952<210>3<211>867<212>DNA<213>小麥矮腥黒粉菌特異序列<400>3670cacacacacacacacaggaagcaaggcgtggggccagctccgggcaaaactagaatcggc60tcggggc肌aac纖gctagggacaaaactccaaagcgccgaggtggtgtggaagatg120ggaaggtggtggtgaaagagttggacgagcagaacacgtcgagctcttttgagcagcaca180ggaaggcagcacatatgagaaaaggatactggataatgcagagattcatgtcatgagaaa240gaaaggtaatgcatacatatgagagttgagaccgaagacaagccgcagcgctcatatgtc300atcataaaagacatgagttgaccttgtgttcgacggacttgcatcggccgcaaggctgtg360gacagcggctgcaattatgcccggcttgcatgcagttgctacaatgccttgtctgcttcc420tcgctttagcctttgccaattctgccgccgtgagaagacggccggttgccttggtggcgg480cagcgaccttgcgctgctccgggtttagagggtccaaaagacgagggaaacggacatcct540ggaggccctcatccgtgcgccactgaggatgtatgctggagagcggaatcggctgactgc600tcgcgcgtagttgacagagggtgtgcgagcaaggaagacccatggtgaccgtgataatgc660aggtgcatgtaatcaccccggt(tcatttgatctccgtgccgcttccacagtctgcpgtc720ccatttcgtcctgcgcctggatgagccgaagcgcatatctggagacggtattggcgacct780cgacgtaaaatcgatcccctagaatattgatggggactttgttgtgatcgtttgcaatgt840cgctttcaatctgtgtgtgtgtgtgtg867<210>4<2U〉372<212>DNA<2B>小麥矮腥黒粉菌特異性SCAR標(biāo)記<400>4:tg跑gtcgggaaagattagataagataaggagaattatcaccaccaccaccgccgccgc60tgtcagtctacgcagcagcagagacggatgcagctgttgcgctttgtgcgctgccctgct120gtggtctccgtcgtccattccgctgctacgttgggctgcgcgccccgcccgtcgaacggc180caccaccaacacctgcaccatcataccaccaccgcgcatcagcccgcccgtcctctcgcg240cgtgctgctctgcctacaagtcgcacgaccgactttccgagagcctgcctctccctacca300tggaccccggcttcaagaacgacttgcggtccctccacacggatacctcggccttcttga360tgccttcgtccc<210>5<211>496<212〉DNA<213>小麥矮腥黒粉菌特異性SCAR標(biāo)記<400>5ttgctggctcttcgccctgacgaattgtatccggctggaggtcatgaagaagtctgggtt60ggatctctttgagctcagttaagcgtatcccctgtcaacgattggaggtcagttccctcg120cttcctctctatctctcgcttctcatgcctctccctttcttgctcacacctttacctctg180caggaccatggctgacaagctgggccggatcagcaatcatggagggcatcggctacgtcc240cgctgccgatcccgcccagatcctgctcaaccgcggcggacgcgtcgtctttctggtcc300tctggccctttatctgctccgtcgctgcattcgtctgcatcaccgccattcaggcctcgc360cctcggctggattttcctcgccttcctcgcctttgcttcgtacttgtgagtctctttctg420tgttcctgcactcgttaaatttctactgatcacgcgttcccggcgcagtgctctccatca480accgcaagacgggcaa372496<210>6<211>419<212>DNA<213>小麥矮腥黒粉菌特異性SCAR標(biāo)記<400>6cacacacacacaggaagcaaggcgtggggccagctccgggcaaaactagaatcggctcgg60ggcaaaactttttgct鄉(xiāng)gacaaaactccaaagcgccgaggtggtgtggaagatgggaa120ggtggtggtgaaagagttggacgagcagaacacgtcgagctcttttgagcagcacaggaa180ggcagcacatatgagaaaaggatactggataatgcagagattcatgtcatgagaaagaaa240ggtaatgcatacatatgagagttgagaccgaagacaagccgcagcgctcatatgtcatca300taaaagacatgagttgaccttgtgttcgacggacttgcatcggccgcaaggctgtggaca360gcggctgcaattatgcccggcttgcatgcagttgctacaatgccttgtctgcttcctcg419<210>7<211>22<212>DNA<213>特異性引物TCKSFl<400>7tggtggtcgggaaagattaga<210>8<211>20<212>DNA<213>特異性引物TCKSRl<400>8gggacgaaggcatcaagaag20<210>9<211>20<212>DNA<213>特異性引物TCKSF2<400>9ttgctggctcttcgccctga20<210>10<211>20<212>DNA<213>特異性引物TCKSR2<400>10ttgcccgtcttgcggttgat20<210>11<211>19<212>DNA<213>特異性引物TCKSF3<400>11cacacacacaC3ggaagc319<210>12<211>20<212>DNA<213>特異性引物TCKSR3<400>12cgaggaagcagacaaggcat20權(quán)利要求1.一種小麥矮腥黑粉菌的特異基因序列,其特征是具有SeqNo.1、SeqNo.2或SeqNo.3所示的核苷酸序列。2.—種小麥矮腥黑粉菌的特異性SCAR標(biāo)記,其核苷酸序列是根據(jù)SeqNo.l、SeqNo.2或SeqNo.3所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增而來。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的SCAR標(biāo)記,其特征在于具有如SeqNo.4、SeqNo.5或SeqNo.6所示的核苷酸序列。4.一種檢測(cè)小麥矮腥黑穗病的PCR方法,其特征在于根據(jù)SeqNo.4、SeqNo.5或SeqNo.6所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增待測(cè)模板。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PCR方法,所述引物為正向引物TCKSF1:5,隱TGGTGGTCGGGAAAGATTAGA-3,,反向引物TCKSR1:5,-GGGACGAAGGCATCAAGAAG隱3,;正向引物TCKSF2:5,-TTGCTGGCTCTTCGCCCTGA-3,反向引物TCKSR2:5,-TTGCCCGTCTTGCGGTTGAT-3,;或者,正向引物TCKSF3:5'-CACACACACACAGGAAG亡A-3,,反向引物TCKSR3:5'-CGAGGAAGCAGACAAGGCAT-3,。全文摘要本發(fā)明涉及“一種小麥矮腥黑粉菌特異基因序列、特異性SCAR標(biāo)記及其應(yīng)用”,小麥矮腥黑粉菌特異性基因序列,如SeqNo.1,SeqNo.2,SeqNo.3所示,根據(jù)這些特異性片段的核苷酸序列獲得的高特異性和高靈敏度的SCAR標(biāo)記如SeqNo.4,SeqNo.5或SeqNo.6所示的核苷酸序列,可為PCR技術(shù)檢測(cè)小麥矮腥黑穗病提供多種引物選擇。根據(jù)SCAR標(biāo)記序列設(shè)計(jì)的高特異性引物TCKSF(1-2)/TCKSR(1-2)的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1ng/25μl,可將小麥矮腥黒粉菌從眾多相似菌株鑒別出來。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101560515SQ20091008515公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2009年6月2日優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日發(fā)明者劉太國,陳萬權(quán),利高申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所