專(zhuān)利名稱(chēng)：一種小麥矮腥黑粉菌的快速檢測(cè)方法及其特異性scar標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種小麥矮腥黑粉菌的快速檢測(cè)方法及其特異性 SCAR標(biāo)記。
背景技術(shù)：
小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kilhn，簡(jiǎn)稱(chēng)TCK)引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要的國(guó)際檢疫性病害，對(duì)小麥生產(chǎn)具有毀滅性危害，也是我國(guó)外來(lái)生物入侵研究的主要物種之一(王圓.小麥矮腥黑穗病菌[M].中國(guó)進(jìn)境植物檢疫有害生物選編，中華人民共和國(guó)動(dòng)植物檢疫局和農(nóng)業(yè)部植物檢疫實(shí)驗(yàn)所編，北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997，95 98)。在小麥矮腥黑穗病流行年份引起的產(chǎn)量損失一般為20 50%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)75 90%，甚至絕產(chǎn)。病菌抗逆性極強(qiáng)，其冬孢子在土中可存活3 7年，包裹在菌癭中的冬孢子甚至可保持活力長(zhǎng)達(dá)10年以上。此病害一旦發(fā)生，很難防治或根除，所以國(guó)際上有15個(gè)國(guó)家將其列為檢疫對(duì)象加以防范。我國(guó)從20世紀(jì)60年代開(kāi)始一直將此病害列為一類(lèi)對(duì)外檢疫對(duì)象。在腥黑粉菌中，TCK與其近緣種小麥網(wǎng)腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌等在形態(tài)學(xué)上極為相似，難于區(qū)別。傳統(tǒng)的病害診斷、檢測(cè)方法主要是依據(jù)病原形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)的特性， 不但過(guò)程繁瑣、時(shí)間周期長(zhǎng)，而且準(zhǔn)確性差、精度不高。因此，利用分子生物學(xué)手段快速、準(zhǔn)確地鑒別小麥矮腥黑粉菌具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。1996年i^erreira等 (Ferreira Μ. A.，Tooley P. W.，Hatziloukas E.etc.Isolation of a species specific mitochondrial DNA sequence for identification of Tilletia indica， the Karnal bunt of wheat fungus[J]. Application Environment Microbiology，1996，62 :87 93) 首次將PCR技術(shù)引進(jìn)到印度腥黑穗病(Tilletia indicaMitra)的鑒定中來(lái)，他們選擇了印度腥黑粉菌線(xiàn)粒體DNA的一個(gè)2. 3kb的EcoR I片段進(jìn)行了克隆和測(cè)序，設(shè)計(jì)的特異性引物Til/Ti4從25種腥黑穗病菌菌株中鑒定出了印腥。另夕卜，Smith等(Snith 0. P.， Peterson G. L. Beck R. J. etc. Development of a PCR-based method for identification of Tilletia indica, causal agent of karnal bunt of wheat[J]. Phytopathology, 1996,86 115 122)通過(guò)克隆印度腥黑粉菌線(xiàn)粒體DNA的Dra I片段，進(jìn)行了序列分析， 設(shè)計(jì)了兩套寡核苷酸引物對(duì)Til7/Ml和Til7/M2，能分別從印度腥黑粉菌中擴(kuò)增出大小為 825bp和118bp特異性片段，也實(shí)現(xiàn)了對(duì)印度腥黑穗病的檢測(cè)鑒定工作。2000年Frederic 等(Frederick R. D. , Snyder K. Ε. , Tooley P. W. Identification and Differentiation of Tilletia indica and T. walkeri using the Polymerase Chain Reaction [J].Phytopathology, 2000,90 :951-960.)根據(jù)線(xiàn)粒體的差異設(shè)計(jì)了 5對(duì)針對(duì)印度腥黑粉菌的特異性引物和3對(duì)針對(duì)黑麥草腥黑粉菌的特異性引物，分別能將印度腥黑粉菌菌株和黑麥草腥粉菌病菌株從其近緣屬種中鑒別出來(lái)。張競(jìng)宇等(張競(jìng)宇，張正光，鄭小波，等.小麥印度腥黑穗病菌的分子檢測(cè)[J].高技術(shù)通訊，2004，1 31 36)利用核糖體ITS序列上的差異在Tilletia屬20個(gè)種中設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物T1/T2,能將T. indica和T. walkeri 從其它種中區(qū)分開(kāi)來(lái)，而后又根據(jù)T. indica和T. walkeri線(xiàn)粒體之間的差異設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物M1/M2，可以將二者區(qū)分開(kāi)來(lái)，為了使反應(yīng)更為靈敏，建立了套式PCR技術(shù)，以便于提供更簡(jiǎn)單的鑒定方法。梁宏等(梁宏，彭友良，張國(guó)珍，等.腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌 rDNA 2IGS區(qū)的擴(kuò)增及其序列分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2006，36 (5) =407-412)依據(jù)核糖體的IGSl區(qū)特性，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，可以將小麥光腥黑粉菌菌株從其近緣屬種中鑒別出來(lái)。2004年高強(qiáng)(高強(qiáng).小麥矮腥黑穗病的分子檢測(cè)[D].長(zhǎng)沙，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004) 利用RAPD技術(shù)找到了一條可以將小麥網(wǎng)腥黑粉菌菌株和小麥矮腥黑粉菌菌株區(qū)別于其它黑粉菌株的條帶，但是很遺憾在矮腥黑粉菌和網(wǎng)腥黑粉菌之間沒(méi)有找到有差異的條帶，沒(méi)能將二者分開(kāi)。2006年周業(yè)琴，劉素萍等(周業(yè)琴，劉素萍，周?chē)?guó)梁，等.水稻腥黑粉病菌的單孢檢測(cè)[J]。植物檢疫，2006，20 :38 41)應(yīng)用核糖體ITS序列的通用引物Till/Til4 和兩對(duì)特異性引物(Hor2/Hor9 ；Hml/Hm5)結(jié)合建立了套式PCR技術(shù)，可以將水稻腥黑粉菌標(biāo)定出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)室陳萬(wàn)權(quán)、劉太國(guó)、劉建華利用AFLP技術(shù)，找到了小麥矮腥黑粉菌的特異性片段，能將小麥矮腥黑粉菌從其近緣屬種中區(qū)分開(kāi)來(lái)，該技術(shù)已經(jīng)獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)為200510080073. 7，但未報(bào)道其檢測(cè)的靈敏度，尚未在海關(guān)檢疫中應(yīng)用。ISSR是指利用基于SSR而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物來(lái)檢測(cè)2個(gè)SSR之間的一段短DNA 序列差異，其優(yōu)點(diǎn)是可在沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的情況下，進(jìn)行基因組指紋圖構(gòu)建； 可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)SSR座位；DNA用量少；顯性或共顯性。ISSR標(biāo)記可以用來(lái)填充遺傳圖譜中一些RFLP標(biāo)記稀少間斷或空白區(qū)，因此，在QTL定位中也逐漸得到較多的應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)基于ISSR方法獲得特異性引物檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)目前分子生物學(xué)方法檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的方法單一、靈敏度不高、 檢測(cè)樣本范圍較窄的現(xiàn)狀，提供一種小麥矮腥黑粉菌的特異性SCAR標(biāo)記及其引物，用于檢測(cè)小麥腥黑粉菌，具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)。一種小麥矮腥黑粉菌的特異性SCAR標(biāo)記，其核苷酸序列如kq No. 6所示。一種小麥矮腥黑穗病的快速檢測(cè)方法，其特征在于根據(jù)kq No. 6所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物來(lái)PCR擴(kuò)增待測(cè)模板。所述引物為正向引物TCKSF3 5，-CACACACACACAGGAAGCA-3，，反向引物TCKSR3 5，-CGAGGAAGCAGACAAGGCAT-3，。本發(fā)明基于ISSR獲得的小麥矮腥黑粉菌的特異性基因序列，所采用的黑粉菌樣本來(lái)源廣泛，共計(jì)51個(gè)菌株14個(gè)小麥矮腥黑粉菌(T. controversa Kuhn, TCK)菌株；6個(gè)小麥光腥黑粉菌(T. foetidaLiro,TFL)菌株，其中1個(gè)來(lái)自于捷克(TFL 6)，其余5個(gè)來(lái)源國(guó)內(nèi)不同地區(qū)；對(duì)個(gè)小麥網(wǎng)腥黑粉菌(T. cariesTul.，TCT)菌株，大部分來(lái)自于美國(guó)，1個(gè)來(lái)自于捷克(TCT24)，以及另外5種不同種的真菌菌株。這51個(gè)樣本來(lái)源基本涵蓋了目前黑粉菌盛行的地域，用加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100個(gè)ISSR引物對(duì)這些菌株進(jìn)行特異性引物篩選，其中引物ISSR859能在小麥矮腥黑粉菌中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出670bp的片段，ISSR818能在小麥矮腥黑粉菌中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出952bp以及867bp的片段，而在其余兩種近緣的腥黑粉菌的37個(gè)菌株和其它對(duì)照的病原真菌中中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該條帶。因此，確定其為小麥矮腥黑粉菌特有的核苷酸序列。通過(guò)回收測(cè)序上述3個(gè)特異性DNA片段，獲得這些片段的核苷酸序列信息，如No. 1，No. 2，No. 3所示。由于本發(fā)明獲得的kq No. 1，No. 2，No. 3所示的核苷酸序列是小麥矮腥黑粉菌所特有的基因片段，因此，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的特異性引物，能將小麥矮腥黑粉菌從其近緣種中區(qū)別開(kāi)來(lái)。這些引物所擴(kuò)增出來(lái)的基因片段可用作小麥矮腥黑粉菌的SCAR標(biāo)記。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的特異性引物TCKSF (1-3) /TCKSR (1-3)，其核苷酸序列如Seq No. (7-12)所示，能高靈敏度、高特異性地將小麥矮腥黑粉菌鑒別出來(lái)，該對(duì)引物所擴(kuò)增出來(lái)的基因片段具有Seq No. 4, No. 5, No. 6所示的核苷酸序列，其大小分別為372bp、496bp和 419bp，可作為小麥矮腥黑粉菌的優(yōu)選SCAR標(biāo)記。本發(fā)明檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的PCR方法中，由于檢測(cè)潛伏期的種子或者幼苗時(shí)， 其攜帶的菌量非常少，與種子或者幼苗共同提取的DNA中，病菌的DNA比例極低，對(duì)引物的特異性、靈敏性要求非常高。因此，PCR反應(yīng)體系采用高特異性SCAR標(biāo)記如kq No. 4, No. 5， No. 6所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)高特異性、高靈敏度識(shí)別的引物，這些引物擴(kuò)增出來(lái)的基因片段只要方便于瓊脂糖凝膠檢測(cè)即可。本發(fā)明優(yōu)選TCKSF(l-2)/TCKSR(l-2)作為檢測(cè)引物， 其檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到lng/25l·! 1。本發(fā)明提供的小麥矮腥黑粉菌特異性DNA片段kq No. 1，No. 2, No. 3以及根據(jù)這些特異性片段的核苷酸序列獲得的高特異性和高靈敏度的SCAR標(biāo)記如kq No. 4， No. 5，No. 6所示的核苷酸序列，可為PCR技術(shù)檢測(cè)小麥矮腥黑穗病提供多種引物選擇。根據(jù)SCAR標(biāo)記序列設(shè)計(jì)的一對(duì)高特異性引物TCKSF(1-2)/TCKSR(1-2)的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到 lng/25uL·因此，本發(fā)明提供的PCR方法用于檢測(cè)小麥腥黑粉菌具有省時(shí)、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于本實(shí)驗(yàn)室以前利用AFLP技術(shù)研發(fā)的“一種小麥矮腥黑粉菌檢測(cè)的PCR方法”(專(zhuān)利號(hào)200510080073. 7 ；發(fā)明人陳萬(wàn)權(quán)等，2007)，具有更高的檢測(cè)靈敏度和可靠性。該方法可應(yīng)用于對(duì)小麥矮腥黑粉菌帶菌麥種樣品的檢測(cè)以及小麥矮腥黑穗病的診斷，具有更高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖1 JSSR859引物篩選其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL2000) ；1_8分別為小麥矮腥黑粉菌 (編碼為 TCK1，TCK2，TCK3，TCK4，TCK5，TCK6，TCK7，TCK8)，9-12 分別為小麥光腥黑粉菌(編碼為T(mén)FLl, TFL2, TFL3, TFL4)，13-16分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌(編碼為T(mén)CT1, TCT2, TCT3, TCT4)。圖2 特異性SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL 2000) ； 1-14分別為小麥矮腥黑粉菌 14 個(gè)菌株(編碼為 TCK1，TCK2, TCK3, TCK4, TCK5, TCK6, TCK7, TCK8, TCK9, TCK10, TCKl 1,TCK12, TCK13, TCK14)，15-38分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌M個(gè)菌株(編碼為T(mén)CT1，TCT2，TCT3, TCT4, TCT5, TCT6, TCT7, TCT8, TCT9, TCT10, TCTl1, TCT12, TCT13, TCT14, TCT15, TCT16, TCT17, TCT18, TCT19, TCT20, TCT21，TCT22，TCT23, TCT24)，39-44 別為小麥光腥黑粉菌(編碼為T(mén)FL1，TFL2，TFL3，TFL4，TFL5，TFL6)，45為小麥散黑黑粉菌，46為稻粒黑粉菌，47為甘蔗黑粉菌，48為高粱黑粉菌，49，50為玉米絲黑穗病菌，51為小麥條銹菌，52為雙蒸水。圖3 特異性引物TCKSF1/TCKSR1的靈敏度檢測(cè)其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL 2，000) ； 1-10分別為小麥矮腥黑粉菌(TCK9)不同濃度梯度，分別為 100ng、50ng、20ng、10ng、5ng、lng、100pg、10pg、lpg、 0. Ipg (25 μ 1)。圖4 :ISSR818引物篩選其中1為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarker DL2000) ；2-5分別為小麥矮腥黑粉菌 (編碼為T(mén)CK2，TCK6，TCK7，TCK10)，6_9分別為小麥光腥黑粉菌(編碼為T(mén)FL1,TFL2, TFL3， TFL4)，10-12分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌(編碼為T(mén)CT1, TCT2，TCT3)。圖5 特異性SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證其中1、25、26、50為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL2000) ；2-9分別為小麥矮腥黑粉菌 8 個(gè)菌株(編碼為 TCK1，TCK2, TCK5, TCK6, TCK7, TCK8, TCK9, TCK10)，10-17 分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌 8 個(gè)菌株(編碼為 TCT1，TCT2, TCT3, TCT4, TCT5, TCT6, TCT7, TCT8)，18-23 別為小麥光腥黑粉菌6個(gè)菌株(編碼為T(mén)FLl，TFL2，TFL3，TFL4，TFL5，TFL6)，24，27-28為小麥散黑粉菌，29-33 為甘蔗黑粉菌，34-36為高粱黑粉菌，37-40為玉米絲黑穗病菌，41-42為小麥條銹菌，43-44為小麥葉銹菌，45-46為小麥稈銹菌，47為小麥白粉菌，48為小麥赤霉菌，49為雙蒸水。圖6 特異性引物TCKSF2/TCKSR2的靈敏度檢測(cè)其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL 2, 000) ；2-12分別為小麥矮腥黑粉菌 (TCK6)不同濃度的梯度，分別為 60ng、50ng、30ng、20ng、10ng、5ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、 Opg (25 μ 1)。圖7 :特異性SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證其中1、25、26、50為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL 2000) ；2-9分別為小麥矮腥黑粉菌 8 個(gè)菌株(編碼為 TCK1，TCK2，TCK5，TCK6，TCK7，TCK8，TCK9，TCK10)，10-17 分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌 8 個(gè)菌株(編碼為 TCT1，TCT2，TCT3, TCT4, TCT5, TCT6, TCT7, TCT8)，18-23 別為小麥光腥黑粉菌6個(gè)菌株(編碼為T(mén)FLl，TFL2，TFL3，TFL4，TFL5，TFL6)，24，27-28為小麥散黑粉菌，29-33為甘蔗黑粉菌，34-36為高粱黑粉菌，37-40為玉米絲黑穗病菌，41-42 為小麥條銹菌，43-44為小麥葉銹菌，45-46為小麥稈銹菌，47為小麥白粉菌，48為小麥赤霉菌，49為雙蒸水。圖8 特異性引物TCKSF3/TCKSR3的靈敏度檢測(cè)其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL 2，000) ；1-10分別為小麥矮腥黑粉菌(TCK7)不同濃度的梯度，分別為 100ng、90ng、80ng、70ng、60ng、50ng、40ng、30ng、20ng、 10ng、5ng、lng、lOOpg、IOpg(25 μ 1)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)材料小麥矮腥黑粉菌(T. controversa Kuhn, TCK)共14個(gè)菌株，其中12個(gè)菌株來(lái)源于美國(guó)，2個(gè)菌株由重慶大學(xué)王中康教授提供；小麥光腥黑粉菌(T.foetida Liro, TFL)共 6個(gè)菌株，其中1個(gè)來(lái)源自捷克，其余5個(gè)來(lái)源國(guó)內(nèi)不同地區(qū)，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥病組收存；小麥網(wǎng)腥黑粉菌(T. caries Tul. , TCT)共M個(gè)菌株，除1個(gè)來(lái)自捷克外，其余均由重慶大學(xué)王中康教授提供；小麥散黑粉菌(Ustilago tritici)、稻粒黑粉菌(Neovossia horrida)、甘蔗黑粉菌(U. scitaminea)、高粱軸黑粉菌(Sphacelotheca crueuta)、玉米絲黑穗病菌(S. reiliana)、小麥條銹菌(Puccnia striiformis)、小麥葉銹菌(P. triticina)、小麥稈銹菌(P. graminis)、小麥白粉菌(Erysiphe graminis)、小麥赤霉菌(Fusarium graminearum)等由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥病組收存，可向公眾發(fā)放作為非商業(yè)性實(shí)驗(yàn)用(見(jiàn)表1)。表1本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株材料
權(quán)利要求
1.一種小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kuhn)的特異性SCAR標(biāo)記，其核苷酸序列如kq No. 6所示。
2.一種小麥矮腥黑穗病的快速檢測(cè)方法，其特征在于根據(jù)Sep No. 6所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物來(lái)PCR擴(kuò)增待測(cè)模板。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)方法，所述引物為 正向引物 TCKSF3 :5，-CACACACACACAGGAAGCA-3，，反向引物 TCKSR3 :5，-CGAGGAAGCAGACAAGGCAT-3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及“一種小麥矮腥黑粉菌的快速檢測(cè)方法及其特異性SCAR標(biāo)記”，該SCAR標(biāo)記如Seq No.6所示，可為PCR技術(shù)檢測(cè)小麥矮腥黑穗病提供多種引物選擇。根據(jù)SCAR標(biāo)記序列設(shè)計(jì)的高特異性引物TCKSF3/TCKSR3的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1ng/25μl，可將小麥矮腥黑粉菌從眾多相似菌株鑒別出來(lái)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154278SQ20111005140
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2009年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日
發(fā)明者劉太國(guó), 陳萬(wàn)權(quán), 高利 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所