專利名稱：團頭魴微衛(wèi)星家系鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚育種和分子標(biāo)記技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定團頭魴混養(yǎng)家系子代親本的方法。
背景技術(shù)：
團頭鮮(Megalobrama amblycephala Yih, 1955),又名武昌魚，隸屬于硬骨魚綱，鯉形目，鯉科，魴屬，其自然分布僅局限于長江中下游少數(shù)幾個湖泊中。團頭魴是我國重要的草食性經(jīng)濟魚類之一，由于其食性廣、成本低、生長快、成活率高、易捕撈，能在池塘中產(chǎn) 卵繁殖，凡具有味美、頭小、含肉率高、體形好、規(guī)格適中等優(yōu)點，因而被作為優(yōu)良的草食性魚類品種在全國普遍推廣。近年來，團頭魴成為市場暢銷品種，養(yǎng)殖經(jīng)濟效益較好。因而市場對團頭魴優(yōu)良苗種的需求十分迫切，亟待規(guī)范團頭魴的苗種繁育生產(chǎn)，加快團頭魴的種質(zhì)資源保護和良種選育進程。由于團頭魴苗種生產(chǎn)中普遍存在近親繁殖的現(xiàn)象，導(dǎo)致種質(zhì)退化加劇，常規(guī)苗種的生長速度較慢，不僅影響了團頭魴的生長性能，而且在一定程度上制約了團頭魴在更大范圍的推廣。雖然我國已經(jīng)選育出生長較快的浦江一號，但苗種仍不能滿足市場需求。還有待進一步加強團頭魴種質(zhì)資源監(jiān)測、評估與保護，挖掘和創(chuàng)新種質(zhì)資源，選育出生長快、抗逆性好的團頭魴優(yōu)良品種。在魚類遺傳育種中，準(zhǔn)確的系譜記錄對于育種計劃的制定具有關(guān)鍵性作用。由于魚類所處的環(huán)境特點以及繁育過程中自然交配、混合受精等原因，常常造成個體系譜不明確。對于魚類來說，為了保持家系信息，對不同的家系實施分池養(yǎng)殖存在所需水體大、管理強度大的缺陷，同時，大大限制了家系的數(shù)目，不利于得出正確的估計值，更重要的是，不同的環(huán)境因素影響了不同家系的性狀，使育種相關(guān)的遺傳參數(shù)估計產(chǎn)生偏差，不利于育種計劃的制定(Gjederm 2005);在混合養(yǎng)殖群體中保持家系信息，在魚類上應(yīng)用的傳統(tǒng)的物理標(biāo)記方法有剪鰭、烙印、體外標(biāo)、編碼金屬標(biāo)、被動整合雷達標(biāo)、熒光染料、電子芯片等。其中一些標(biāo)記在家畜上應(yīng)用較廣泛也有良好的效果，如烙印法。但是對水產(chǎn)動物尤其是魚類來說，由于其所處的水體環(huán)境及魚體自身的特點，使用物理標(biāo)記存在操作繁瑣、易損傷魚體、對生長造成一定影響、標(biāo)記保存時間不長等缺陷。而且，物理標(biāo)記不適用于仔魚或幼魚，因此，在育種時首先需要對各家系分池養(yǎng)殖，待到可以進行物理標(biāo)記時才能實施混養(yǎng)。這樣不僅增加了養(yǎng)殖成本，更重要的是引入了環(huán)境誤差。因此，對于魚類個體標(biāo)識、家系鑒定一直是難以解決的問題，這在很大程度上限制了良種選育工作的開展。微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強、特異性高、共顯性遺傳等優(yōu)點，為水產(chǎn)動物選育中保持家系信息、確認(rèn)親緣關(guān)系、追蹤系譜提供了有用的工具。如果已知父母的基因型，微衛(wèi)星標(biāo)記能在沒有外部物理標(biāo)記且不需要分開養(yǎng)殖的情況下區(qū)分出混養(yǎng)群體中個體所屬的家系。有關(guān)研究(Vandeputte et al. 2004 ；Jerry et al. 2006 ;董世瑞等 2008 ；ffanget al. 2009)證實了微衛(wèi)星在水產(chǎn)動物研究中確認(rèn)父母本和分析家系關(guān)系中的應(yīng)用價值。目前尚未見將微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于團頭魴家系鑒定的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性鑒定團頭魴家系，為團頭魴遺傳育種提供必要的分子分子標(biāo)記。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種利用微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性鑒定團頭魴家系的方法，其步驟包括I)將來自天然群體的團頭魴親本進行人工繁殖，得到至少50個家系，待魚苗孵出10天后，從每個家系中隨機選取200尾魚苗混合放入池塘中，作為用于親子鑒定的家系群體；2)選取步驟I)的團頭魴繁殖親本的鰭條組織，提取基因組DNA，以DNA為模板，選用 12 對微衛(wèi)星引物，對 Τ 01，TTF02, TTF03, TTF04, TTF05, TTF06, TTF08, TTF09, MAC31,MAC46, MAC50, MAC53共12個微衛(wèi)星位點進行巢式PCR擴增；3)步驟2)所述的巢式PCR擴增方法指PCR反應(yīng)體系內(nèi)包含3個引物位點特異性正向引物，其5’末端加有M13通用序列(5’ -CAGTCGGGCGTCATCA-3’ );位點特異性反向引物；FAM、NED、HEX三種熒光標(biāo)記的M13通用引物。PCR反應(yīng)體系為6 μ L :50ng DNA, 3 μ LJumpStart Red Mix(購自Sigma公司)，I. 5pmol反向引物和I. 5pmol的突光標(biāo)記通用引物，O. Ipmol的含加尾序列的正向引物，100 μ M的亞精胺；4)團頭魴繁殖親本在12個微衛(wèi)星位點的PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730型基因分析儀根據(jù)熒光標(biāo)記進行基因型分析，使用P-LOCI軟件模擬分析，篩選出適合鑒定團頭魴混養(yǎng)家系的有效微衛(wèi)星位點 9 個 TTFOI, TTF02, TTF03, TTF04, TTF05, TTF08, MAC31, MAC46, MAC50 ；5)將團頭魴子代混養(yǎng)I年后，隨即選取182尾個體，剪取各個體的鰭條組織，提取個體基因組DNA，選取步驟4)中的9個有效微衛(wèi)星位點，分析子代的基因型；6)根據(jù)親本和子代在9個微衛(wèi)星位點的基因型，采用CERVUS 2. O軟件對不同家系進行區(qū)分，鑒定子代個體的父母本。其中步驟2)所述的12對微衛(wèi)星引物的核苷酸序列如下所示TTFOl-F 5，-CAGTCGGGCGTCATCATGGAGATGAAAGCTGAAGGAA-3’R : 5，-ATGCACGAACTGCCACATAA-3，TTF02-F:5’ -CAGTCGGGCGTCATCAAAACAGCTGCTACCCTTGGA-3’R:5， -TTTGCCAGAAGAGCAAATCA-3’TTF03-F:5’ -CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA-3’R:5， -CTGACCGGATAGCAAAGTGA-3’TTF04-F:5’ -CAGTCGGGCGTCATCAGACTGGAGTCGTCAGGCTTC-3’R:5， -TGCCCCACATTGTTAGACTG-3，TTF05-F:5， -CAGTCGGGCGTCATCACTAGTGGGTAGGTGGCAGGT-3，R:5’ -TGACTGGGAGAGACAGAGGAG-3’TTF06-F:5’ -CAGTCGGGCGTCATCAGGCAGGTCAGGCACATTTAT-3’R:5’ -TCTCTACCTCACATTCTCTCATTCT-3’TTF08-F:5， _CAGTCGGGCGTCATCAGGGGAAATAAAGGGAGAAAGTG_3，
R:5’ -TTTCTCCTGATCCGTTGACC-3’TTF09-F:5’ -CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA-3’R:5， -GAGGTGGGACTGTGTGGAAT-3，MAC31-F : 5，_CAGTCGGGCGTCATCAGCATCGGTAACAGTCAAA_3，R:5’ -CAGGGATAATGTAGGAAGAA-3’MAC46-F:5’ -CAGTCGGGCGTCATCATACAAGAGCAGGTAAGCA-3’R:5，-CAGCCACTGACTGAACAT-3，MAC50-F:5’ -CAGTCGGGCGTCATCAGGTATCGTGCTTGCTTGT-3’ R:5’ -TTCCATTTAGAGCTACGG-3’MAC53-F:5’ -CAGTCGGGCGTCATCAAGCGGGTCTGTGCTAATC-3’R:5， -CGGCCAGTTCCAAAGAGT-3，步驟3)所述通用引物M13的核苷酸序列如下M13 :5， -CAGTCGGGCGTCATCA-3’本發(fā)明具有以下優(yōu)點I.本發(fā)明可將不同家系子代混養(yǎng)在一起，不需要將各家系子代采用水族箱或水泥池分開放養(yǎng)，可極大節(jié)省人力、物力和財力。2.本發(fā)明將不同家系子代在同一池塘混養(yǎng)，可避免家系分開放養(yǎng)引入的環(huán)境誤差，提聞選育效果；3.本發(fā)明不需要對個體使用物理標(biāo)記，避免了物理標(biāo)記存在的操作繁瑣、易損傷魚體、對生長造成一定影響、標(biāo)記保存時間不長等缺陷。4.本發(fā)明采用巢式PCR擴增方法，只需要對通用引物M13進行熒光標(biāo)記，采用微衛(wèi)星位點正向引物5’端加M13序列的方法，不需要對每對微衛(wèi)星引物進行熒光標(biāo)記，極大節(jié)省了引物熒光標(biāo)記的費用。


序列表SEQ ID NO 1是擴增Τ 01微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO 2是擴增Τ 01微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO 3是擴增TTF02微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO 4是擴增TTF02微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO 5是擴增TTF03微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO 6是擴增TTF03微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO 7是擴增TTF04微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO 8是擴增TTF04微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO 9是擴增TTF05微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO 10是擴增TTF05微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO 11是擴增TTF06微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO : 12是擴增TTF06微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO : 13是擴增TTF08微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO 14是擴增TTF08微衛(wèi)星位點的反向引物序列。
序列表SEQ ID NO : 15是擴增TTF09微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO 16是擴增TTF09微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO 17是擴增MAC31微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO 18是擴增MAC31微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO 19是擴增MAC46微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO 20是擴增MAC46微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO 21是擴增MAC50微衛(wèi)星位點的正向引物序列。 序列表SEQ ID NO 22是擴增MAC50微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO 23是擴增MAC53微衛(wèi)星位點的正向引物序列。序列表SEQ ID NO 24是擴增MAC53微衛(wèi)星位點的反向引物序列。序列表SEQ ID NO :25是M13通用引物序列。圖I :巢式一步法PCR擴增圖解。(A，B)陰影框表示微衛(wèi)星位點特異性引物；(C)波浪狀灰色框表不通用引物M13序列，星號為突光標(biāo)記；(D)第一輪PCR循環(huán),含有M13序列的正向引物整合到PCR產(chǎn)物中；(E)這些PCR產(chǎn)物成為了熒光標(biāo)記M13引物的擴增模板，在下一 PCR循環(huán)，退火溫度時整合到PCR產(chǎn)物中；(F)最后的PCR產(chǎn)物帶有了熒光標(biāo)記，可以使用熒光檢測系統(tǒng)檢測。
具體實施例方式以下為本發(fā)明的具體實施方案I)團頭魴家系的繁育及子代混養(yǎng)從團頭魴天然群體(湖北省淤泥湖和梁子湖，江西省鄱陽湖)中挑選了 44尾優(yōu)良母本和34尾父本，通過注射激素的方法進行人工催產(chǎn)，激素注射方法為第一次注射，只注射雌魚，注射促黃體素釋放激素A2 (LRH-A2)，注射劑量為lmg/kg體重；第二次注射約在第一次注射12h后進行，雌雄團頭魴均注射，注射藥物為促黃體素釋放激素A2和地歐酮(DOM),注射劑量分別為4mg/kg體重和5mg/kg體重。在第二次注射完6 8h后,進行人工授精，通過I雄配2雌或I雌配2雄的方法構(gòu)建了團頭魴父系和母系半同胞家系，共繁殖獲得了 54個家系，記錄各雌雄親本交配方式。剪取繁殖親本的臀鰭鰭條一小塊，儲存在95%的酒精內(nèi)，保存于_20°C。將受精卵放入容積為Im3的水缸內(nèi)孵化，待魚苗孵出10天后，從每個家系隨機選取200尾魚苗共同放入面積為4畝的池塘中。待子代在池塘內(nèi)喂養(yǎng)I年后，隨即選取182尾子代，剪取團頭魴小塊臀鰭條組織，儲存在95%的酒精內(nèi)，保存于-20°C。2)團頭魴親本和子代基因組DNA提取取團頭魴每個個體的一小塊鰭條組織放入I. 5mL的Eppendorf離心管中，加入600 μ L 的細胞裂解液(Tris-HCl IOOmM, pH 8. O ；EDTA 50mM, pH 8. 0 ；SDS 1%, pH 8. 0 ；NaCl 125Mm)，用剪刀將鰭條組織剪碎，加入濃度為20mg/mL的蛋白酶K 6111^，放入651水浴鍋中水浴2-4h，每隔半小時搖動下離心管，直到組織充分裂解完。在常溫下靜置離心管直到其溫度降到室溫，加入200 uL 7.5M的醋酸銨，充分搖勻，放入4°C冰箱內(nèi)lOmin，12, OOOrpm 4°C離心lOmin，取上清液，重復(fù)離心一次，取上清液到另一新離心管中。加入與上清液等量的異戍醇，充分混勻，室溫下沉淀2min, 12，OOOrpm 4°C離心lOmin,棄去上清液。用70%的酒精洗滌DNA兩遍，室溫干燥約IOminJPA 100 μ L去離子水溶解DNA。每個DNA樣品加入lOmg/mL RNA酶I μ L。用NanoDrop ND-IOOO紫外分光光度儀檢測DNA濃度和質(zhì)量，將各DNA樣品稀釋成IOOng/ μ L的工作液。3)PCR引物的篩選及擴增反應(yīng)體系優(yōu)化從已發(fā)表的團頭魴微衛(wèi)星引物文獻中(李紹戊等2006 ;Tang等2009)，選取了 12個微衛(wèi)星位點進行PCR擴增，擴增引物及條件如表I所示。引物優(yōu)化時PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含有正、反引物各 O. 2μΜ, dNTP 各 200yM、lXPCR buffer、L 2mM 的 Mg2+、I 個單位的Taq酶，從個體中任意取5個個體的DNA工作液等量混合，再取IOOng DNA作為PCR模板。擴增反應(yīng)在 Bio-Rad DNA Engine peltier Thermal Cycler PCR 系統(tǒng)上完成，PCR 程序為95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，Ta退火30s，72°C延伸45s，反應(yīng)進行30個循環(huán)；最后72°C再延伸5min。Ta值設(shè)置50. O，55. 5，58. 4，61. 8°C四個溫度梯度。各位點最終優(yōu)化的PCR擴增溫度如表I所示。
表I設(shè)計的12個團頭魴微衛(wèi)星位點信息
WI 引物序列(5’-3’)核心重復(fù)序列退火溫度擴增片段大使用的M13
(°C) 小(bp) 焚光標(biāo)記
TTFOl F: CAGTCGGGCGTCATCATGGAGATGAAAGCTGAAGGAA (CA)2158270-314 FAM
R: ATGCACGAACTGCCACATAATTF02 F: CAGrCGGGCGTCJTCJAAACAGCTGCTACCCTTGGA (CA)5 (CT)21 58214-236 HEX
R: TTTGCCAGAAGAGCAAATCATTF03 F: CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA (TC)”58224-268 KED
R: CTGACCGC.ATAGCAAAGTGATTF04 F: CAGTCGGGCGTCATCAGACTGGAGTCGTCAGGCTTC (CA)j462188-220 FAM
R: TGCCCCACATTGTTAGACTGTTF05 F: C4GrCGGGCGrC^rC4CTAGTGGGTAGGTGGCAGGT (CA)1562174-200 HEX
R: TGACTGGGAGAGACAGAGGAGl l'F06 F: CAO/'CGGGCGTCATCAGGCAGGrCAGGCACATTTAT(GA)1362202-234 NED
R: TCTCTACCTCACATTCTCTCATTCTTTF08 F: CAGTCGGGCGTCATCAGGGGAAATAAAGGGAGAAA(CT)1862194-240 FAM
GTG
R: TTTCTCCTGATCCGTTGACCTTF09 F: C^GrCGGGCGrOirCiAAGACGCCACGGAAACTTTA (TC)1958285-335 HEX
R: GAGGTGGGACTGTGTGGAATMAC31 F: CAGTCGGGCGTCATCAGCATCGGTAACAGTCAAA(GT)2655190-258 NED
R: CAGGGATAATGTAGGAAGAAMAC46 K: CAGTCGGGCGTCATCATACAAQAGCAGGTAAGCA(GT)1252192-220 FAM
R: CAGCCACTGACTGAACATMAC50 F: C^GrCGGGCGT1C//VrCMGGTATCGTGCTTGCTTGT(GT)1652192-216 HEX
R: ttccatttagagctacgg
MAC53 F: CAGTCGGGCGTCArCAAGCGGGTCTGTGCTAATC (TG)27 56 195-267 NED_R: CGGCCAGTTCCAAAGAGT_4)微衛(wèi)星位點基因型分析PCR反應(yīng)在每一個反應(yīng)體系中含三個引物，其包括5’末端有尾巴的表I所示的微衛(wèi)星位點的正向引物和反向引物以及帶熒光標(biāo)記(FAM、NED和HEX三種，購自ABI公司)的M13 通用引物。PCR 反應(yīng)體系為 6μ L :50ng DNA, 3 μ L JumpStart Red Mix (Sigma 公司)，
I.5pmol反向引物和I. 5pmol的突光標(biāo)記通用引物,0. Ipmol的含M13序列的正向引物，100 μ M的亞精胺。PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，Ta(視引物而定，見表I)退火45s，72°C延伸45s，反應(yīng)進行35個循環(huán)；最后72°C再延伸5min。各位點擴增時采用的M13突光標(biāo)記見表I。PCR反應(yīng)完后，從每個個體的每個位點的PCR產(chǎn)物中吸出I μ L，根據(jù)片段的大小和熒光標(biāo)記的顏色，將用熒光標(biāo)記為NED、FAM、HEX各I個位點的PCR產(chǎn)物混合在一起，作為上機檢測的樣品。將混合3 μ L的PCR產(chǎn)物樣品加入到ABI 3130基因分析儀配置的96孔板內(nèi)，每個孔內(nèi)加入O. 5yL的GeneScan 350R0X 標(biāo)準(zhǔn)片段(購自ABI公司)，另外在每個孔內(nèi)加入6. 5 μ L的Hi-Di 甲酰胺(ABI公司)，將96孔板放入PCR儀器內(nèi)于95°C變性10分鐘，變形后立即置于冰上，然后上樣到ABI 3730基因分析儀(購自美國ABI公司)分析，或者用鋁箔紙包好后放入_20°C保存待上機分析。待基因分析儀電泳結(jié)束后，用軟件GeneMapper 4. O做基因型分析，讀取各個體在各微衛(wèi)星位點的基因型。
5)有效微衛(wèi)星位點的選取及親子鑒定分析采用步驟4)的方法分析78尾團頭魴繁殖親本在表I所示的12對微衛(wèi)星位點的基因型，通過軟件CERVUS 2. O (Marshall等1998)模擬各繁殖家系子代的基因型，篩選到9個微衛(wèi)星位點(TTR)1，TTF02, TTF03, TTF04, TTF05, TTF08, MAC31，MAC46，MAC50)鑒別子代親本來源的準(zhǔn)確率可以達到100%。選取這9個有效微衛(wèi)星位點的引物在隨即選取的182個個體中擴增，獲得子代個體在這9個微衛(wèi)星位點的基因型。采用軟件CERVUS 2. O計算混養(yǎng)子代群體各微衛(wèi)星座位等位基因頻率、雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及無效等位基因頻率，并據(jù)LOD值鑒定182尾個體的父母本。對于任何一子代，其鑒定的親本來源的可信度低于95%時，人工與其期望的親本的基因型做比較評估。6)結(jié)果在9個微衛(wèi)星位點對78尾團頭魴繁殖親本和182尾混養(yǎng)家系子代個體進行了擴增和基因分型。基因型應(yīng)用CERVUS 2. O軟件分析結(jié)果如表2所示。為保證鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，據(jù)LOD值鑒定候選父母時，只有所有微衛(wèi)星座位全部匹配，并符合親本交配體制的才確認(rèn)親子關(guān)系。最終確認(rèn)了 179尾混養(yǎng)后裔的父母，混養(yǎng)家系的親子鑒定率為98. 4%。表29個團頭魴微衛(wèi)星位點在混養(yǎng)家系中的檢測值
權(quán)利要求
1.一種團頭魴微衛(wèi)星家系鑒定方法，其特征包括如下步驟 1)將來自天然群體的團頭魴親本進行人工繁殖，得到至少50個家系，待魚苗孵出10天后，從每個家系中隨機選取200尾魚苗混合放入池塘中，作為用于親子鑒定的家系群體； 2)選取步驟I)的團頭魴繁殖親本的鰭條組織，提取基因組DNA，以DNA為模板，選用12對微衛(wèi)星引物，對 TTFOI, TTF02, TTF03, TTF04, TTF05, TTF06, TTF08, TTF09, MAC31，MAC46，MAC50, MAC53共12個微衛(wèi)星位點進行巢式PCR擴增； 3)步驟2)所述的巢式PCR擴增方法中PCR反應(yīng)體系內(nèi)包含3個引物位點特異性正向引物，其5’末端加有M13通用序列；位點特異性反向引物；FAM、NED、HEX三種熒光標(biāo)記的M13 通用引物；PCR 反應(yīng)體系為 6yL:50ng DNA, 3 μ L JumpStart Red Mix(購自 Sigma 公司)，I. 5pmol反向引物和I. 5pmol的突光標(biāo)記通用引物,O. Ipmol的含加尾序列的正向引物，100 μ M的亞精胺； 4)團頭魴繁殖親本在12個微衛(wèi)星位點的PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI3730基因分析儀根據(jù)熒光標(biāo)記進行基因型分析，使用P-LOCI軟件模擬分析，篩選出適合鑒定團頭魴混養(yǎng)家系的有效微衛(wèi)星位點 9 個 TTFOI, TTF02, TTF03, TTF04, TTF05, TTF08, MAC31, MAC46, MAC50 ； 5)將團頭魴子代混養(yǎng)I年后，隨即選取182尾個體，剪取各個體的鰭條組織，提取個體基因組DNA，選取步驟4)中的9個有效微衛(wèi)星位點，分析各子代的基因型； 6)根據(jù)親本和子代在9個微衛(wèi)星位點的基因型，對不同家系進行區(qū)分，鑒定子代個體的父母本； 其中 步驟2)所述的12對微衛(wèi)星引物的核苷酸序列如下所示TTFOl-F :CAGTCGGGCGTCATCATGGAGATGAAAGCTGAAGGAA(5’ _3’ ),R:ATGCACGAACTGCCACATAA(5， _3，)；TTF02-F :CAGTCGGGCGTCATCAAAACAGCTGCTACCCTTGGA(5’ -3’，)R :TTTGCCAGAAGAGCAAATCA(5，_3，)；TTF03-F :CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA(5’ -3’)，R :CTGACCGGATAGCAAAGTGA(5’ _3’)；TTF04-F :CAGTCGGGCGTCATCAGACTGGAGTCGTCAGGCTTC(5’ -3’)，R :TGCCCCACATTGTTAGACTG(5’ _3’)；TTF05-F :CAGTCGGGCGTCATCACTAGTGGGTAGGTGGCAGGT(5’ -3’)，R :TGACTGGGAGAGACAGAGGAG(5，-3，)；TTF06-F :CAGTCGGGCGTCATCAGGCAGGTCAGGCACATTTAT(5’ -3’ )R :TCTCTACCTCACATTCTCTCATTCT(5’ -3’)；TTF08-F :CAGTCGGGCGTCATCAGGGGAAATAAAGGGAGAAAGTG(5，_3，)R :TTTCTCCTGATCCGTTGACC(5’ -3’)；TTF09-F :CAGTCGGGCGTCATCAAAGACGCCACGGAAACTTTA(5’ -3’)，R :GAGGTGGGACTGTGTGGAAT(5’ -3’)；MAC31-F :CAGTCGGGCGTCATCAGCATCGGTAACAGTCAAA(5，-3，)，R :CAGGGATAATGTAGGAAGAA(5’ -3’)；MAC46-F :CAGTCGGGCGTCATCATACAAGAGCAGGTAAGCA(5’ -3’)，R :CAGCCACTGACTGAACAT(5’ _3’)；MAC50-F :CAGTCGGGCGTCATCAGGTATCGTGCTTGCTTGT(5’ -3’)，R :TTCCATTTAGAGCTACGG(5’ -3’)；MAC53-F :CAGTCGGGCGTCATCAAGCGGGTCTGTGCTAATC(5’ -3’)，R :CGGCCAGTTCCAAAGAGT(5’ -3’)；步驟3)所述通用引物M13的核苷酸序列如下M13 :5， -CAGTCGGGCGTCATCA-3，。
2.權(quán)利要求I所述的方法在團頭魴家系標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于魚的育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及一種利用微衛(wèi)星標(biāo)記準(zhǔn)確鑒定團頭魴混養(yǎng)家系的方法。其步驟包括①采用人工繁殖的方法繁育團頭魴家系，54個家系子代混合放養(yǎng)在同一池塘；②采用熒光標(biāo)記引物和巢式PCR擴增法分析親本在12個微衛(wèi)星位點的基因型，篩選出適合家系鑒定的有效微衛(wèi)星；③分析混養(yǎng)家系子代在有效微衛(wèi)星位點的基因型；④鑒定各子代的親本來源。本發(fā)明首次在團頭魴上建立了親子鑒定的方法，其鑒定準(zhǔn)確率達到了98.4％。通過家系的篩選和鑒定，可以減少在團頭魴群體選育中存在的近親繁殖現(xiàn)象，更有利于實現(xiàn)家系選育，從而加快選育的進程，提高選育效果。
文檔編號C12Q1/68GK102653785SQ20111005118
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月3日
發(fā)明者曾聰, 王衛(wèi)民, 王煥嶺, 羅偉, 高澤霞 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)