專利名稱：：三基因融合的重組牛結(jié)核特異性抗原蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物基罔工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種三基因融合的重組牛結(jié)核特異性抗原蛋白及制備方法。
背景技術(shù)：
：牛結(jié)核病(BovineTuberculosis,bTB)主要是由牛分枝桿菌(,炒co力acfeh冊iwi^s)引起的一種慢性人獸共患傳染病。我國將其列為二類動物疫病。國內(nèi)外的人結(jié)核病原學(xué)調(diào)査均發(fā)現(xiàn)，牛分枝桿菌是人結(jié)核的重要病因之一。世界衛(wèi)生組織專家委員會第七次會議報告指出除非消滅牛結(jié)核，否則人類結(jié)核病的控制是不會成功的。由于目前為止尚未發(fā)現(xiàn)有效藥物與疫苗用于牛結(jié)核病的防治，一些國家普遍采用的是"檢疫-捕殺"政策，即檢疫山的陽性牛一律捕殺來實現(xiàn)控制牛結(jié)核病。因此，準(zhǔn)確而及時的診斷方法對于該病的防治顯得尤為重要。'OIE唯一推薦的方法是牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(Tuberculinskintest,TST)。但由于結(jié)核菌素可能包含有與其它分枝桿菌相同的非特異性抗原組份，檢測時容易出現(xiàn)假陽性；結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)對感染后期的開放性結(jié)核及全身性結(jié)核不敏感。此外，TST程序繁瑣、耗時費力、結(jié)果判斷主觀性強，需專業(yè)人員操作，使"檢疫-撲殺"政策的實施效果大打折扣，且其只能進行活體試驗，而不能對保存的樣品進行冋顧性分析，更不適用于野生動物和邊遠(yuǎn)山區(qū)的牛結(jié)核病普査。因此，人們致力于開發(fā)一種更加簡便、快速、高特異性、高敏感性的新型診斷方法。在關(guān)于牛結(jié)核病診斷的以往研究中，曾經(jīng)報道過結(jié)核特異性抗原MPB70、MPB83、CFPIO、ESAT6等的單獨制備及應(yīng)用，也有關(guān)于以上兩種過多種抗原融合后的應(yīng)用報道，發(fā)現(xiàn)單個抗原在牛結(jié)核的診斷過程中敏感性和特勞性均不高，而采用"雞尾酒"方法制備的融合抗原在應(yīng)用中過的較好的效果(Sigu。Liu,e"丄，Anovelfusionprotein-basedindirectenzyme—linkedimmunosorbentassayforthedetectionofbovinetuberculosis.Tuberculosis,2006，3;C.Aagaard，eta丄，OptimizingAntigenCocktailsforDetectionofMycobacteriumbovisinHerdswithDifferentPrevalencesofBovineTuberculosis:ESAT6-CFP10MixtureShowsOptimalSensitivityandSpecificity,[J].ClinMicrobiol,2006,44(12):4326-4335;CocklePJ，"3,，F(xiàn)ieldevaluationofanoveldifferentialdiagnosticreagentfordetectionofMycobacteriumbovisincattle[J].ClinVaccineImmunol,2006，13(10):1119-1124;KanaujiaGV，3丄，Detectionofearlysecretoryantigenictarget-6antibodyfordiagnosisoftuberculosisin隨-humanprimates[J].CorapMed2003，53(6):602-606)。另一方面，過去乃至現(xiàn)在仍較流行的TST方法中所使用PPD所包含的抗原為致病性分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌及卡介苗(bcg)共有，故不能區(qū)分PPD皮試陽性者是致病性分枝桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌感染抑或是bcg免疫的結(jié)果(OettingerT,HolmA，HaslovK,Characterizationofthedelayedtypehypersensitivity-inducingepitopeofMPT64fromMycobacteriumtuberculosis[J]-ScandJImmunol,1997,45(5):4"-503)。為了排除由于以上原因?qū)е碌纳a(chǎn)中會造成誤診、誤殺的問題，國內(nèi)外研究熱點開始放在如何在牛結(jié)核的特異性診斷上。1998年結(jié)核分枝桿菌基因組破譯成功，運用基因組雜交技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌和卡介苗(BCG)的基因組序列進行比較，發(fā)現(xiàn)P介苗(BCG)相比T結(jié)核分枝桿菌，有16個缺失的基因區(qū)域(RegionofDeletion,RD)，包括RD1-16，其中的RD1區(qū)是僅存在于致病性分枝桿菌包括人型結(jié)核桿菌、牛型結(jié)核桿菌、非洲分枝桿菌及某些非典型分枝桿菌，而不存在于卡介苗(BCG)及其它非致病性分枝桿菌中(LewisKN，LiaoR,GuinnKM,"a/.,Deletionof咖from妙co6a"ar/咖to&wciA/ow'smimicsbacilleCalmette-Guerinattenuation.[J].InfectDis,2003,187(U:117—123;GordonSV,BroschR,BillaultA，a丄，Identificationofvariableregionsinthegenomesoftuberclebacilliusingbacterialartificialchromosomearrays.[J].MolMicrobiol,l的9,32(3):6-655)。研究表明，RD1區(qū)的基因產(chǎn)物極有可能在最初的MTB侵襲細(xì)胞以及在細(xì)胞內(nèi)生長過程中并不發(fā)揮作用，而在之后結(jié)核分支桿菌發(fā)揮毒性作用，即導(dǎo)致細(xì)胞的溶解這一步發(fā)揮關(guān)鍵的作用，代表了一種潛在的毒力因子，具有診斷價值并可作為疫苗的候選物。因此，國內(nèi)外多家科研院所開始著眼于ran區(qū)蛋白的表達(dá)及應(yīng)用。目前，RD1區(qū)基因研究較多的當(dāng)屬CFP10和ESAT6。培養(yǎng)濾液蛋白10(CultureFiltrateProtein10，CFP10)和早期分泌性抗原耙(EarlySecretoryAntigenicTarget6,ESAT6)是由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)操縱子編碼的兩個低分子量蛋白，從結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)濾液中分離得到。Brusasca等(2001)用ESAT6抗原檢測結(jié)核患者血清中的特異性抗體，陽性率為25%,而健康對照組沒有檢出相應(yīng)抗體。Dillon等(2003)以重組CFP10作為診斷抗原，用ELISA法檢測活動性結(jié)核患者和非結(jié)核對照者血清中的特異性抗體，在痰涂片陽性結(jié)核患者中陽性率為28%,在痰涂片陰性患者中陽性率為25%從國內(nèi)外看到單獨表達(dá)該兩種蛋白的數(shù)據(jù)均表明，單獨使用任何一種蛋白用于檢測診斷，其敏感性一直很低(姚衛(wèi)，李紅霞，陳建平，曾林了.重組融合蛋白CFP10-ESAT6在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的初步應(yīng)用.西部醫(yī)學(xué)，2008,20(4):854-856)。而當(dāng)兩種蛋白經(jīng)過基因克隆的方法，組裝成融合表達(dá)抗原后，其檢測敏感性的到提高。姚衛(wèi)等使用CFP10-ESAT6融合蛋與進行ELISA檢測結(jié)果敏感性提高到45%。Pinxteren等將CFP10和ESAT6聯(lián)合使用作為新型的診斷抗原B寸，發(fā)現(xiàn)其敏感度為73%(LaurensA.H.vanPinxtei.en,"a/.,DiagnosisofTuberculosisBasedontheTwoSpecificAntigensESAT-6andCFP10.ClinDiagnLabI畫nol，2000'7:155-160)。Rv3872基因所編碼的Rv3872蛋白(PE35)為PE蛋白家族成員之一，與CFP10與ESAT6蛋白同屬RD1區(qū)，是ESAT6-CFP10復(fù)合體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子，敲除Rv3872會中止復(fù)合體的合成與分泌，可能參與了復(fù)合體的合成、分泌過程(PriscilleBrodin'e"丄，DissectionofESAT-6System1of#yco/7a"eri〃/zto^ercWcsisandImpactonI鵬unogenicityandVirulence.InfectionandI咖unity，2006,7488-98)。又有研究表明，Rv3872作為抗原較前兩種蛋白更具有應(yīng)用到血清學(xué)診斷的潛力(P.Mukherjee,"TheRDl-encodedantigenRv3872of妙co力a"er/w/nCwferci/7ow'sasapotentialcandidateforserodiagnosisoftuberculosis.ClinicalMicrobiologyandInfection,2007，13(2):146-152)。鑒于以上三種結(jié)核分支桿菌特異性分泌蛋白的Rv3872、CFP10和ESAT6的特性，以及現(xiàn)階段牛結(jié)核診斷方法研究現(xiàn)狀，本發(fā)明以牛結(jié)核分支桿菌全基因組為模板克隆了Rv3872、CFP10和ESAT6基因，并構(gòu)建了三種基因融合表達(dá)的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)。在每種蛋白之間加入了連接序列以最人限度地保證融合蛋白中各個蛋白的空間構(gòu)像和活性不受影響。對純化的Rv3872-CFP10-ESAT6融合蛋白活性進行鑒定，ELISA初步驗證，三蛋白融合抗原的牛結(jié)核抗體檢出率顯著高于由申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室自行克隆表達(dá)的CFP10-ESAT6二蛋白融合抗原(張桂榮、郭愛珍等，間接ELISA檢測牛分枝桿菌抗體方法的建立及初步應(yīng)用.[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2007,29(29):555-560;張書環(huán)、郭愛珍等，牛分枝桿菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表達(dá)及相關(guān)特性分析.[J].中國人獸共患病學(xué)報，2007，23(12):1238-1242),因此，該新型融合蛋白在牛結(jié)核血清學(xué)診斷與鑒別診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可望利用這個新型融合蛋白開發(fā)更為靈敏、特異的ELISA檢測方法和制備成膠體金免疫層析試紙條，為牛結(jié)核病的快速診斷提供更加有效的確工具。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是獲得具有很好免疫原性的三基因融合的重組牛結(jié)核特異性抗原蛋白，通過對編碼該基因的序列的克隆、表達(dá)，進一步驗證其功能，并獲得一種能快速檢測牛結(jié)核病的抗原成分。本發(fā)明將構(gòu)建的重組融合載體質(zhì)粒pET-28a-RCE轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得一種檢測牛結(jié)核特異性抗體的三基因融合抗原蛋白RCE。包含該重組的三基因融合抗原蛋白基因的大腸桿菌(^c力eT7'c/Wacoh'BL21/pET-28a-RCE)己于2008年12月4日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCCNO:M208244。中請人將獲得的由保藏編號為CCTCCNO:M208244的大腸桿菌表達(dá)的融合抗原蛋白命名為"RCE"，將構(gòu)建過程中獲得的中間載體質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6命名為"CE"。申請人通過分離和克隆，獲得一種融合的基因，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:l所示。.'一種牛結(jié)核特異性三基因融合抗原蛋白的制備方法，其步驟如下(1)以牛結(jié)核分支桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株基因組為模板，擴增牛結(jié)核分支桿菌基因組RD1區(qū)的三個基因Rv3872、CFP10和ESAT6，分別得到321bp，348bP和341bp的目的片段，在基因Rv3872和CFP10的末端分別帶有15bp和45bp的連接序列；(2)采用重疊延伸剪切(S0E)方法，得到CFP10-ESAT6的融合基因'通過酶切連接'構(gòu)建得到中間載體質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6;(3)進一步利用酶切連接方法，獲得重組的三基因融合載體質(zhì)粒pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6,將該重組的三基因融合載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞'異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，得到所述的三基因融合抗原蛋白KCE。本發(fā)明的以下部分將詳細(xì)描述本發(fā)明關(guān)于融合基因的克隆、表達(dá)，蛋白的純化以及生物學(xué)試驗。本發(fā)明構(gòu)建的融合蛋白對檢測牛結(jié)核抗體有較好的敏感性和特異性，對于實際應(yīng)用有較大意義。更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實施方式》所述。序列表SEQIDNO:1是編碼牛結(jié)核分枝桿菌特異性抗原蛋白(RCE)的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列。圖l:是本發(fā)明使用的原始pET-28a(+)載體質(zhì)粒圖譜。圖2:是本發(fā)明PCR擴增Rv3872電泳圖譜；圖中M為DL2000;1為陰性對照；2為擴增后得到的321bp的Rv3872片段，其中包括酶切位點和連接序列(Linker)長度。圖3為PCR擴增CFP10和ESAT6電泳圖譜。圖中:.M為DL2000;1，3為陰性對照；2為348bp的CFP10目的片段，其中包括酶切位點和連接序列(Linker)長度；4為341bp的ESAT6目的片段，其中包括酶切位點和連接序列(Linker)長度。圖4:是本發(fā)明三基因融合重組原核表達(dá)載體pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6(即pET-28a-RCE)構(gòu)建流程圖。圖5:是本發(fā)明所構(gòu)建包含CFP10-ESAT6融合基因的中間質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6(即pET-28a-CE)的圖譜。圖6:是本發(fā)明所構(gòu)建包含Rv3872-CFP10-ESAT6三基因的重組表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6(即pET-28a-RCE)的圖譜。圖7:是本發(fā)明重組中間融合基因CFP10-ESAT6PCR擴增后的電泳圖譜。圖中M為DL2000;1為擴增后643bp的CFP10-ESAT6融合基因片段(包括連接序列和兩端酶切位點)；2為陰性空白對照。圖8:是重組中間融合質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6構(gòu)建后酶切鑒定電泳圖譜。圖中Ml為DL2000;M2為DL15000;1為HindIII和Notl雙酶切pET-28a-CFP10-ESAT6質(zhì)粒后出現(xiàn)5363bp和636bp左右的兩個片段；2,3為Notl和HindIII分別單酶切pET-28a-CFP10-ESAT6質(zhì)粒出現(xiàn)5999bp左右的片段。圖9:是本發(fā)明重組融合表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a-RCE構(gòu)建后酶切鑒定電泳圖譜。圖中Ml為DL15000;M2為DL2000;1為EcoRI和Notl雙酶切pET-28a-RCE質(zhì)粒后得到一條5355bp左右的片段和一條959bp左右的片段；2為EcoRI單酶切pET-28a-RCE質(zhì)粒得到6314bp左右的片段。圖10:是本發(fā)明制備的RCE蛋白表達(dá)純化流程圖。圖ll:是本發(fā)明制備的RCE蛋白表達(dá)形式鑒定圖譜。圖中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為IPTG誘導(dǎo)的空載體對照；2為菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的情況；3為超聲波破碎菌體離心后上清取樣；4為超聲波破碎菌體離心后沉淀取樣。圖12:是本發(fā)明制備的RCE蛋白最佳表達(dá)條件。在圖12A中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為0.8鵬ol/LIPTG(分子克隆實驗指南建議濃度)誘導(dǎo)空載體對照；2為IPTG終濃度為0.4mmol/L誘導(dǎo)；3為IPTG終濃度為0.6鵬ol/L誘導(dǎo)；4為IPTG終濃度為0.8mmol/L誘導(dǎo)；5為IPTG終濃度為1.O咖ol/L誘導(dǎo)。在圖12B中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為0.4ramol,/LIPTG誘導(dǎo)空載體；2為0.4腿ol/LIPTG誘導(dǎo)2h;3為0.4mmol/LIPTG誘導(dǎo)3h;4為0.4鵬ol/LIPTG誘導(dǎo)5h;5為0.4咖ol/LIPTG誘導(dǎo)6h。圖13:是本發(fā)明制備的RCE蛋白最佳純化條件。在圖13A中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為WashBuffer:BindingBuffer=l6;2為WashBuffer:BindingBuffer=l:4;3為WashBuffer:BindingBuffer=l:2;4為WashBuffer:BindingBuffer=l:1;5為原濃度的WashBuffer。在圖13B中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為EluteBuffer:BindingBuffer-1:6;2為EluteBuffer■BindingBuffer=l:4;3為EluteBuffer:BindingBuffer=l:2;4為EluteBuffer:BindingBuffer=l:1;5為未稀釋的EluteBuffer:圖14:是本發(fā)明制備的RCE蛋白Western-Blot圖。圖中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為牛結(jié)核陽性血清；2為正常牛血清。圖15:是本發(fā)明制備的RCE蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖15A和圖15B為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品做兩次重復(fù)分別所得標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式。具體實施方式實施例l:目的基因CFPIO、ESAT6和Kv3872的克隆1、質(zhì)粒與宿主菌來源本發(fā)明和實施例所用的原始質(zhì)粒載體pET-28a(+)購自于Novagen公司，其物理圖譜見圖1所示。大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自湖北省武漢生命技術(shù)有限公司。2、引物設(shè)計與合成根據(jù)牛分枝桿菌AF2122/97發(fā)表的序列(GenBank登錄號NC002945)設(shè)計針對CFP10、ESAT6和Rv3872等全長基因的特異性引物。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。所述引物對的DNA序列如下CFP10上游引物(HindIII):5'-TCTGMGCTTGCAGAGATGAAGACCGAT-3'CFP10下游引物(Linker):5'-AGATCCGCCTCCACCTGMCCGCCACCTCCGMGCCCATTTGCGAGGACAGCGCCT-3'ESAT6上游引物(Linker):5'-GGAGGTGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGATCTATGACAGAGCAGCAGTGGMTTTCGCGG-3'ESAT6下游引物(Notl):5'-AGCAGCGGCCGCCTATGCGAACATCCC-3'Rv3872上游引物(EcoRI):5'-TTACGMTTCGAAAAMTGTCACATG-3'Kv3872下游引物(HindIII):5'-GTACMGCTTTCCACCACCACCACCTTCGGCGMGACGCC-3'3、目的基因的PCR擴增以牛型分枝桿菌臨床標(biāo)準(zhǔn)分離株(H37Rv,#7<otecterj'to"sAF2122/97，由湖北出入境檢驗檢疫周郭明星獸醫(yī)師惠贈，其基因組序列登錄號見Genbank登錄號為NC002945)細(xì)菌培養(yǎng)物(將該菌破碎后做模板用)加少量雙蒸水煮沸10min裂解菌體，離心后取上清液作為PCR模板。用ProbestDNA聚合酶(購自寶生物工程(大連)有限公司)PCR分別擴增CFP10、ESAT6和Rv3872。PCR擴增反應(yīng)體系為10XTaqBuffer5.0nL，25mmol/LMgCl2l.Oul，2畫1/LdNTPs1.5uL，20uniol/L上、下游引物各1.0nL，TaqDNA聚合酶1.0nL，模板3pL,無菌雙蒸水加至50yL。擴增的循環(huán)參數(shù)95'C預(yù)變性5min;然后95'C變性30s，60'C退火30s，72°(;延伸305，30個循環(huán)；最后72。C延伸10min。擴增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖2和圖3)，檢測結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物正確，然后用膠回收試劑盒(購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司，參照該試劑盒說明書)純化PCR產(chǎn)物。4、PCR產(chǎn)物回收采用上海生工生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收DNA片段，按照該UNIQ-10柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒的說明書的提供步驟進行，具體操作如下用0.8%的瓊脂糖膠電泳，使目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，在長波紫外燈下，用在酒精燈火焰上燒過的手術(shù)刀片切下含有目的DNA片段的瓊脂塊，放入1.5niL滅菌離心管中。按每100mg瓊脂糖膠加入400ABindingBuffer,置50-60'C水浴中10min，使瓊脂糖凝膠徹底融化(加熱溶膠時，每2min混勻一次)。將UNIQ-IO柱放入收集管中，將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到UNIQ-IO柱中，室溫靜置2rain，室溫8000r/min離心lmin。取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，加入500HLWashSolution,室溫8000r/min離心lmin。重復(fù)步驟4，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，室溫12000r/min離心15sec。將UNIQ-10柱放入一個滅菌的1.5mL離心管中，根據(jù)PCR產(chǎn)物量的相對多少，在柱子底部的膜中央加10-20PLElutionBuffer或ddH20，室溫或37'C放置2min室溫12000r/min離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20'C備用。實施例2、融合基因Rv3872-linker"CFP10-linker-ESAT6的構(gòu)建(見圖4)1、中間質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6的構(gòu)建采用重疊延伸剪切技術(shù)(艮卩SOE,NikolaiAvchuk，Constructionoflong靈moleculesusinglongPCR-basedfusionofseveralfragmentssimultaneously-NucleicAcidsResearch,2004,32(2):el9)獲得CFP10和ESAT6的融合基因CFP10-ESAT6。以上述純化的PCR產(chǎn)物CFP10和ESAT6為模板'以cfplO上游(HindIII)和esat6下游(Notl)為引物，用ProbestDNA聚合酶進行PCR。反應(yīng)體系(50yL〉:上下游引物各300nmol/L，CFP10和ESAT6PCR產(chǎn)物各0.5nL，ProbestDNA聚合酶1.25U。退火溫度為63°C(lmin)，其它條件同上。回收CFP10-ESAT6的PCR產(chǎn)物(見圖7)，將pET-28a空載體和回收得到的PCR產(chǎn)物用HindIII和Notl(購自寶生物工程(大連)有限公司)雙酶切，酶切產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。將純化的酶切產(chǎn)物用T4DNALigase(購自Fermentas公司)進行粘末端連接，16'C水浴連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。2、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取感受態(tài)細(xì)胞DH5a100liL加入到滅菌1.5mLEP管中，將連接后的中間質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6各10liL加入并混勻。置冰上30min后，42。C熱激90sec,冰浴3-5min。加入400uLLB液體培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.5，121。C高壓滅菌20min,4'C保存?zhèn)溆谩Ｔ诿?00毫升LB液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂粉即為固體LB培養(yǎng)基，121'C高壓滅菌20min，4'C保存?zhèn)溆?，于37'C恒溫?fù)u床200r/min振蕩培養(yǎng)45min使其復(fù)蘇。復(fù)蘇后的重組大腸桿菌懸液于4'C5000r/min離心10min，棄去400nL上清，用剩余的100uL重懸沉淀涂布于含有25ug/raL卡那霉素(購自Invitrogen公司)的LB瓊脂平板。37'C增殖lh，再將平板翻過來，倒置37'C培養(yǎng)14-16h至菌落出現(xiàn)。3、質(zhì)粒的提取使用堿裂解法(參照薩姆布魯克.J,弗里奇.E.F，曼尼阿蒂斯.T主編，分子克隆實驗指南，黃培唐等譯，第三版，科學(xué)出版社，北京，2002版的方法)進行，具體操作如下用滅菌牙簽在LB平板上隨機挑取數(shù)個單菌落，分別接種于3mL25ug/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37。C恒溫?fù)u床200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將菌液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管內(nèi)，于4'C8000r/min離心3min，棄上清，再將剩余的1.5mL菌液重復(fù)離心，倒立離心管于吸水紙上，使液體流盡。加入100uL冰預(yù)冷的溶液I(0.05mol/L葡萄糖,0.025mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.01mol/LEDTA)，渦旋使菌體充分懸浮，再加入200uL新配制的溶液I1(0.2mol/LNaOH,1%十二垸基磺酸鈉'即SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用)，反復(fù)顛倒離心管數(shù)次，冰浴5min，最后加入150uL冰預(yù)冷的溶液III(5mol/L乙酸鈉60mL，冰乙酸11.5raL，水28.5mL，pH5.0)，溫和顛倒離心管數(shù)次，冰浴10min。于4。C以12000r/min離心10min，吸取上清至另一支1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混和均勻，室溫靜置5min。室溫12000r/min離心10min,棄上清，沉淀用75%冷乙醇漂洗后，真空干燥或自然干燥。沉淀用200uL含20yLRnase(20ug/mL)的TE(pH8.0)溶解'56'C水浴30miri或37。C水浴lh以除去RNA。加7.5mol/L歸c100uL，室溫靜置5min，再于室溫12000r/min離心5min。吸取上清到另一1.5mL的EP管中，加入2倍體積的冷無水乙醇，冰浴置10min。于4'C12000r/min離心10min,棄上清，沉淀用75%冷乙醇漂洗后，真空干燥后溶于20uLddH20或TE(lmmolZLEDTA，1Ommol/LTris-Cl，pH8.0),置-20。C冰箱保存?zhèn)溆谩?、中間載體質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6的酶切鑒定利用HindIII和Notl分別進行單酶切和雙酶切中間載體質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6(見圖6)，酶切后出現(xiàn)預(yù)期大小的外源片段和載體片斷，將包含該中間載體質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a菌液送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果與Genbank(登錄號NC002945)中公布的CFP10和ESAT6的序列進行比對，結(jié)果完全符合，中間連接序列也正確，說明本發(fā)明中構(gòu)建的中間載體質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于下一步三聯(lián)體(三基因融合)重組表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建。5、三聯(lián)體(三基因融合)重組表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建取純化的Rv3872PCR產(chǎn)物和中間載體質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6分別使用HindIII和EcoRI(購自寶生物工程(大連)有限公司)進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠純化，純化后的酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNALignase于16'C水浴連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。參照上述的《分子克隆實驗指南》的方法提取質(zhì)粒，并使用Notl和EcoRI進行單酶切和雙酶切，鑒定重組融合表達(dá)載體。申請人將獲得的該重組表達(dá)載體質(zhì)粒命名為pET-28a-RCE(見圖7)，將包含該載體質(zhì)粒的BL21(DE3)菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的抗原蛋白簡稱為"RCE"。經(jīng)酶切鑒定，所構(gòu)建重組表達(dá)載體質(zhì)粒酶切后條帶與預(yù)期一致。將酶切鑒定后的重組表達(dá)載體PET-28a-RCE送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。測序后的序列與Genbank中公布的Rv3872的標(biāo)準(zhǔn)序列(登錄號NC002945)經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)載體pET-28a-RCE的插入片段序列與理論序列完全符合，表明該融合基因構(gòu)建成功。其完整的閱讀框(編碼區(qū))的核苷酸序列見序列表SEQIDNO:l所示，序列全長為1053bp,編碼350個氨基酸。將該重組表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a-RCE轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞進行誘導(dǎo)表達(dá)。具體步驟如下取感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)100uL加入到1.5mLEP管中，將重組表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a-RCE2yL加入并混勻。置冰上30min后，42。C熱激90sec,冰浴3-5min。將其涂布于含有25ug/mL卡那霉素的LB瓊脂平板。37。C正置lh，再將平板翻過來，倒置37t:培養(yǎng)14-16h至菌落出現(xiàn)。實施例3、目的融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化1、目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)將包含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株DH5a接種于含有25yg/mL卡那霉素的3mLLB液體培養(yǎng)基，于37。C搖床培養(yǎng)至OD,達(dá)到0.6-0.8。從培養(yǎng)好的大腸桿菌菌液中取100nL菌液接種于10mL含有25ug/mL卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37'C振蕩培養(yǎng)約3h，至OD,達(dá)到0.6-0.8，加異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG,購自Invitrogen公司)至終濃度為0.8mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)3h后收集菌體(圖8)。2、表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析SDS-PAGE電泳樣品的制備將誘導(dǎo)后的重組大腸一菌8000r/min離心15min。沉淀用1/10體積的50mMTris-HC1(PH8.0)重懸，冰浴30min。冰浴條件下進行超聲碎破，直至菌液不再粘稠，10000r/min，離心30min。分別取少量裂解后的上清和沉淀，加入2X蛋白電泳上樣緩沖液(10O腿ol/LTris-HCl(pH6.8)，200mmol/L二硫蘇糖醇(DTT，購自Amresco公司)，4%SDS(電泳級)，0.2%溴酚藍(lán)，20%甘油)125uL，振蕩混勻，100。C煮沸10min，腦Or/min離心5min，取上淸進行SDS-PAGE電泳分析。SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制及電泳12%分離膠配制:純化水1.6mL，30%丙烯酰胺溶液2.OmL，1.5mol/LTris-Base溶液(PH8.8)1.3mL，10%SDS0.05mL，10%過硫酸銨0.05mL,TEMED0.003mL;各成分加入后迅速混合，加入制膠板中，上面加異丁醇。'5%濃縮膠配制純化水2.lmL，30%丙烯酰胺溶液0.5mL，1.Omol/LTris-Base溶液(pH6.8)0.38mL，10%SDS0.03raL，10%過硫酸銨0.03mL，TEMED0.003mL;各成分加入后迅速混合，加入制膠板的分離膠的上面，灌滿后插入加樣梳。待積層膠凝固后，取下梳子；將凝膠固定于電泳裝置上，加入足夠量的Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入各樣品；電泳電壓80V，待溴酚藍(lán)至分離膠界面時，電壓改為120V，至溴酚藍(lán)泳出膠底面，終止電泳。聚丙烯酰胺凝膠染色與脫色卸下凝膠，用考馬斯亮藍(lán)R250染色液(45%甲醇，45%純化水，10%冰乙酸，0.25%的考馬斯亮藍(lán)R250)染色4h以上，再用脫色液(45%甲醇，45%純化水，10%冰乙酸)進行脫色至背景色完全脫去，觀察結(jié)果。確定目的蛋白是可溶性表達(dá)還是以包涵體的形式表達(dá)。重組蛋白的純化，將收集的重組蛋白表達(dá)菌使用結(jié)合緩沖液Bindingbuffer(20mMTris-HC1pH7.9，5mMImidazole,0.5MNaCl)重懸，超聲波破碎，4°C12000g離心15min取上清上樣。使用Ni-NTAHisBand層析柱(購自Novagen公司)純化目的蛋白。分別使用結(jié)合Bindingbuffer和洗滌緩沖液Washingbuffer(20mMTris-HClpH7.9,15mMImidazole,0.5MNaCl)洗柱直至OD值達(dá)到基線附近，換用洗脫緩沖液Elutebuffer(20mMTris-HClpH7.9，40mMImidazole,0.5MNaCl)洗脫結(jié)合的重組蛋白，收集波峰部分蛋白作為純化的重組蛋白用于進一步分析。3、目的蛋白表達(dá)最佳條件的確定根據(jù)上述步驟2(即表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析)的步驟，檢測表明本發(fā)明制備的重組融合蛋白(RCE)為可溶性表達(dá)(圖ll)。重新復(fù)蘇保存的轉(zhuǎn)化有pET-28a-RCE的大腸桿菌BL21(DE3)菌液，37'C搖床培養(yǎng)至OD,達(dá)到0.6-0.8時，按照IPTG濃度分別為0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.OmM，和分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后2h、3h、5h、6h取樣，SDS-PAGE分析。確定RCE蛋白的最佳表達(dá)條件為IPTG0.4mmol/L，37。C誘導(dǎo)3h表達(dá)量最高(圖12)。4、重組蛋白純化最佳條件的確定為摸索WashBuffer禾tlEluteBuffer中最佳的咪唑濃度，將WashBuffer和EluteBuffer分別與BindingBuffer按體積比1:6、1:4、1:2、11、10(此濃度為原濃度的WashBuffer或EluteBuffer)五個濃度梯度稀釋，將細(xì)菌破碎后離心得到的上清上柱后、加BindingBuffer后、依次加五個濃度WashBuffer、依次加五個濃度EluteBuffer后分別接收樣品，SDS-PAGE分析。確定RCE蛋白純化的最佳WashBuffer和EluteBuffer體積比為1:4禾卩1:0(圖13)。實施例4:重組蛋白RCE的特性分析1.Western-blot分析重組蛋白的抗原性將上述純化的重組融合蛋白RCE進行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)移切出6張Whatman3M濾紙和l'張硝酸纖維膜(NC膜)，濾紙和膜的大小要和凝膠的大小完全相等或略小于凝膠，用鉛筆在濾膜一角作標(biāo)記，確保轉(zhuǎn)印后膜與凝膠的相對方向；將硝酸纖維膜在純化水中浸泡5min;在另一淺托盤中加入少量轉(zhuǎn)移緩沖液(39咖ol/L甘氨酸，48ramol/LTris堿，0.037%SDS(電泳級)，20%甲醇)，將6張Whatman3M濾紙浸泡于其中。然后按照如下方法安裝轉(zhuǎn)移電泳槽平放石墨電極的底座(負(fù)極)，依次放3層3M濾紙、聚丙烯酰胺凝膠、硝酸纖維膜和3層3M濾紙。徹底排除各層間的氣泡；將轉(zhuǎn)移電泳槽的上蓋扣到石墨電極一轉(zhuǎn)移膜膠復(fù)合體上；連接電源，根據(jù)凝膠板面積按照0.65-1.0mA/cm2的參數(shù)接通電流，電泳轉(zhuǎn)移0.5-2h。將NC膜置-丁-含1%BSA和5%的脫脂奶粉的1XTBST(10mmol/LTris-HCl，150睡1/LNaCl，0.05%Tween-20,pH8.0)中，室溫封閉過夜或至少30min;洗膜棄封閉液，用1XTBST洗滌NC膜3遍，每次5rain;一抗孵育將NC膜放入用1XTBST稀釋的陽性血清(體積比為1:100),37。C孵育0.5-lh;洗膜取出NC膜，用1XTBST洗膜3次，每次10min;二抗孵育將膜轉(zhuǎn)入1XTBST稀釋的冊P(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗牛IgG(購自Sigma公司)抗體(體積比為1:10000),37。C孵育0.5-lh;洗膜取出NC膜，用1XTBST洗膜3次，每次10min;顯色將NC膜置于新配置的DAB顯色液中，置暗處顯色，待蛋白帶的顏色深度達(dá)到要求后，用IXTBST沖洗以終止反應(yīng)。結(jié)果如圖14所示，陽性血清組RCE蛋白表現(xiàn)出很高的免疫原性，而陰性血清對照組沒有出現(xiàn)反應(yīng)。2.重組蛋白濃度的測定(Bradford法)將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自北京賽馳生物科技有限公司)牛血清白蛋白用1XPBS緩沖液(NaCl8.0g,KC10.2g,KH2P040.24g，Na2HP0412H203.628g，溶于800mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值為7.4,蒸餾水定容至1000niL，滅菌)溶解，然后進行倍比稀釋。分別取每個濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液100uL，加入到5mL的染料液中，反應(yīng)45min后，在波長595nm處測吸光度，根據(jù)測得的0D值與相應(yīng)濃度的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推導(dǎo)出換算公式。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖15。由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得RCE蛋白的濃度為2.15mg/mL。3.重組融合蛋白RCE間接ELISA最佳條件的確定將已知濃度的重組融合蛋白RCE在96孔板上，按照表1所示將重組融合蛋白RCE和牛血清做倍比稀釋，二抗按照上述推薦的濃度使用。于4'C過夜包被酶標(biāo)板，次日取出后洗滌液(含0.05%Tween-20的1XPBS)洗滌3次，用洗漆液稀釋的5%脫脂奶粉37'C封閉lh，洗滌液洗板3次后取陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清按表1中所示倍比稀釋，37'C反應(yīng)30min。洗板3次后加入為1:10000(體積比)稀釋的羊抗牛IgG,37'C反應(yīng)30min。洗板5次后加入100uL底物液(含lrag/mL四甲基聯(lián)苯胺TMB和0.03%H202)，避光顯色10min后加入0.25%HF終止反應(yīng)，于OD,讀數(shù)。表1RCE蛋白間接ELISA最佳工作條件確定<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>確定KCE蛋白工作最佳包被濃度為25ng/孔'血清最佳稀釋度為1:100(體積比)。4.重組融合蛋白RCE對牛結(jié)核特異性抗體敏感性和特異性檢測為了比較本發(fā)明中三基因融合表達(dá)的抗原RCE與本發(fā)明申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室自行構(gòu)建表達(dá)的二基因融合表達(dá)的抗原CFP10-ESAT6(即CE)在其生物學(xué)活性上的差異，將本發(fā)明申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室自行構(gòu)建表達(dá)的二蛋白融合蛋白CFP10-ESAT6(張桂榮等，間接ELISA檢測牛分枝桿菌抗體方法的建立及初步應(yīng)用.[J]中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2007,29(29):555-560)為對照組，按照以上確定本發(fā)明中的三基因融合抗原KCE最佳工作條件的方法確定CE蛋白的最佳包被濃度為4ug/mL，血清稀釋度為1:100(體積比)，二抗工作濃度為1:10000(體積比)。取26份牛結(jié)核陽性血清，18份牛結(jié)核陰性血清，分別在RCE和CE的最佳工作濃度下，進行間接ELISA試驗檢測血清中的抗體。方法如下使用牛結(jié)核特異性抗原于4'C過夜包被酶標(biāo)板，洗滌液洗滌3次'用洗滌液稀釋的5%脫脂奶粉37'C封閉lh，洗滌液洗板3次后加入1:100(體積比)倍稀釋血清，100uL/孔，每孔重復(fù)3次，37'C反應(yīng)30min。洗板3次后加入體積比為1:10000(體積比)稀釋的羊抗牛IgG，37。C反應(yīng)30min。洗板5次后加入100uL底物液(含lmg/mLTMB和0.03%H202),避光顯色lOmin后加入0.25%HF終止反應(yīng)，于0De3。讀數(shù)。RCE蛋白間接ELISA對牛結(jié)核特異性抗體檢測的敏感性為69.23%(18/26),特異性為94.44%(17/18)。CE蛋白間接ELISA對牛結(jié)核特異性抗體檢測的敏感性為15.38%(4/26)，特異性為94.44%(17/18)。由此看出，RCE蛋白和CE蛋白相比，在對牛結(jié)核抗體檢測特異性沒有降低的情況下，敏感性獲得了顯著提高(提高了53.85%),因而該新型融合蛋白在牛結(jié)核病的臨床檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景(表2，3)。表226份牛結(jié)核陽性血清的檢測結(jié)果陽性數(shù)陰性數(shù)i^f陽性數(shù)404CE陰性數(shù)14822表318份PPD陽性的檢測結(jié)果陽性數(shù)陰性數(shù)陽性數(shù).ioiCE陰性數(shù)01717<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>505560acggcgctg3cgtcggtgaccgggctggttcccgcgggggccgatgsg240ThrAlaLeuThrSerValThrGlyLeuValProAlaGlyAlaAspGlu65707580gtctecgcccaagcggcgacggcgttcacatcggagggcatecaattg288ValSerAlaGinAlaAlaThrAlaPheThrSerGluGlylieGinLeu859095ctggettecaatgcatcg'gcccaagaccagetccaccgtgcgggcgaa336LeuAlaSerAsnAlaSerAlaGinAspGinLeuHisArgAlaGlyGlu100105110gcggtccaggacgtcgcccgcacctattcgcaaategacgacggcgcc384AlaValGinAspValAlaArgThrTyrSerGinlieAspAspGlyAla115120125gccggcgtcttcgccg肌ggtggtggtggtgga犯gcttgcagsgatg432AlaGlyValPheAlaGluGlyGlyGlyGlyGlyLysLeuAlaGluMet130135'140aagaccgatgccgetacc.etcgcgcaggaggcaggtaatttcgagegg480LysThrAspAlaAla.ThrLeuAlaGinGluAlaGlyAsnPheGluArg145150155160atetecggcgacctgaeiaacccagategaccaggtggagtcgacggca528lieSerGlyAspLeuLysThrGinlieAspGinValGluSerThrAla165170175ggttcgttgcagggccagtggcgcggcgcggcggggacggccgcccag576GlySerLeuGinGlyGinTrpArgGlyAlaAlaGlyThrAlaAlaGin180185,190gccgcggtggtgcgcttccaagaagcagccaataagcagaagcaggaa624AlaAlaValValArgPheGinGluAlaAlaAsnLysGinLysGinGlu195200205etcgacgagatetcgacgaatattcgtcaggccggcgtccaatactcg672LeuA印GlulieSerThrAsnlieArgGinAlaGlyValGinTyrSer210215220agggccgacgaggagcagcagcaggcgctgtectegcaaatgArgAlaAspGluGluGinGinGinAlaLeuSerSerGinMet225230235ggtggcggtggaageggcggtggcggaageggcggtggcggcGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly245250acsgsgC3gcsgtggsatttcgcgggt3tcgsggccgcggcaThrGluGinGinTrpAsnPheAlaGlylieGluAlaAlaAla260265270atecagggaaatgtcacgtecattcattecetccttgacgaglieGinGlyAsnValThrSerlieHisSerLeuLeuAspGlu275280285cagtecctgaccaagetcgcagcggcctggggcggtageggtGinSerLeuThrLysLeuAlaAlaAlaTrpGlyGlySerGly290295300gcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgccacggetaccAlaTyrGinGlyValGinGinLysTrpAspAlaThrAlaThr305310,315aacaacgcgctgcagaacctggcgeggacgateagegaagccAsnAsnAlaLeuGinAsnLeuAlaArgThrlieSerGluAla325330gcaatggettegaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcaAlaMetAlaSerThrGluGlyAsnValThrGlyMetPheAla340345350<210>2〈211〉350〈212〉PRT<213>牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)<400〉2MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015ggcttc720GlyPhe240ageatg768SerMet255agegca816SerAlagggaag864GlyLysteggag912SerGlugagctg960GluLeu320ggtcag1008GlyGin335tag1053ArgGlySerHisMetAlaSerMetThrGlyGlyGinGinMetGlyArg202530GlySerGluPheGluLysMetSerHisAspProlieAlaAlaAsplieGlu35GinValSerSerHisAspProlieAla4045AlaLeuHisGlyValThrAlaGlySerGlyThrGinValSerAspAsnAlaLeuHisGlyVal505560ThrAlaLeuThrSerValThrGlyLeuValProAlaGlyAla6570ValSerAlaGinAlaAlaThrAla85;LeuAlaSerAsnAlaSerAlaGinPro巧AlaPheThrSerGluGlylieThr90GinLeuHisArgAspGlu80GinLeu95GlyGluAlaValGin115ValPheAlaGluAsnAlaSerAlaGinAspGinLeuHisArgAla100105110AspValAlaArgThrTyrSerGinlieAspAspGlyAlaGly135LeuThrTyrSerGinlieAsp120125GlyGlyGlyGlyLysLeuAlaGluMetAlaGly130LysThrAspAlaAlaThrLeuAlaGinGlu145150lieSerGlyAspLeuLys,ThrGinlieAspGinValGluSerAla155GinLys140GlyAsnPheLeuLys,ThrGinlieAsp165170GlySerLeuGinGlyGinTrpArgGlyAlaAlaGlyThr180185ValArgPheGinGluAlaAlaAsnLysGluArg160ThrAla175AlaAlaGin190LysGinGluAlaAlaValValArgPheGinGluAlaAlaAsnLysGin195200205GlulieSerThrAsnlieArgGinAlaGlyValGinTyrSerAsnlieArgGinAlaGly215220AspGluGluGinGinGinAlaLeuSerSerGinMetLeuAsp210ArgAlaAspGluGluGin225230GlyGlyGlyGlySerGlySerGlyGlyGlyGlySer245250ThrGluGinGinTrpAsnPheAlaGlylieSer235GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGluAlaAlaAla18GlyPhe240SerMet255SerAla260265270lieGinGlyAsnValThr'SerlieHisSerLeuLeuAspGluGlyLys275280285GinSerLeuThrLysLeuAlaAlaAlaTrpGlyGlySerGlySerGlu290295300AlaTyrGinGlyValGinGinLysTrpAspAlaThrAlaThrGluLeu305310315320AsnAsnAlaLeuGinAsnLeuAlaArgThrlieSerGluAlaGlyGin325330335AlaMetAlaSerThrGluGlyAsnValThrGlyMetPheAla340345350權(quán)利要求1、一種融合的基因，它是序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2、一種融合的基因，它是序列表SEQIDNO:l所示的氨基酸序列。3、一株能夠表達(dá)牛結(jié)核特異性融合抗原蛋白的重組大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21/pET28a-RCE，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M208244。4、一種由權(quán)利要求3所述重組大腸桿菌表達(dá)的牛結(jié)核特異性融合抗原蛋白。5、一種牛結(jié)核特異性三基因融合抗原蛋白的制備方法，其特征在于以下步驟(1)以牛結(jié)核分支桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株基因組為模板，擴增牛結(jié)核分支桿菌基因組RD1區(qū)的三個基因Rv3872、CFP10和ESAT6，分別得到321bp，348bp和341bp的目的片段，在基因Rv3872的下游帶有15bp的鏈接序列，CFPIO的下游和ESAT6的上游均帶有45bp的連接序列；(2)采用重疊延伸剪切方法，得到CFP10-ESAT6的融合基因，通過酶切連接，構(gòu)建得到中間載體質(zhì)粒pET-28a-CFP10-ESAT6;(3)進一步利用酶切連接方法，獲得重組的三基因融合載體質(zhì)粒pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6，將該重組的三基因融合載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)，得到所述的牛結(jié)核特異性三基因融合抗原蛋白RCE。全文摘要本發(fā)明屬于微生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種三基因融合的重組牛結(jié)核特異性抗原蛋白其及制備方法。該牛結(jié)核特異性融合抗原蛋白的基因，具有如序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列和氨基酸序列。公開了一株能夠表達(dá)牛結(jié)核特異性融合抗原蛋白的重組大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21/pET28a-RCE，其保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNOM208244。進一步本發(fā)明公開了這種三基因融合抗原蛋白的制備方法。文檔編號C12R1/32GK101538578SQ20091006091公開日2009年9月23日申請日期2009年3月2日優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日發(fā)明者于清龍,凌潔玉,劉冬光,廖娟紅,莎曹,郭愛珍,陳煥春,陳穎鈺申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)