專利名稱：牛精子克隆胚胎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用牛精子克隆胚胎的新方法。
背景技術(shù)：
自成功利用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得成活的克隆羊[l]以來，多種哺乳動物甚至包括一些靈長類哺乳動 物相繼克隆成功。盡管動物克隆技術(shù)存在效率低的問題[2]，但卻很好的證明了卵母細(xì)胞質(zhì)和供體細(xì)胞核 能夠支持整個(gè)胚胎發(fā)育過程。并且體細(xì)胞核移植技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)、新藥物開發(fā)、動物育種等方面具有革命 性的應(yīng)用前景，故現(xiàn)在動物克隆技術(shù)仍是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。
然而，國內(nèi)外有關(guān)動物生殖細(xì)胞克隆的研究相對較少。并且考慮到原生殖細(xì)胞處于基因組印記消除狀 態(tài)，現(xiàn)今生殖細(xì)胞克隆技術(shù)一般僅局限于利用動物胚胎期的原生殖細(xì)胞進(jìn)行克隆。Kato等選用妊娠期 14.5-16.5天的小鼠胎兒原生殖細(xì)胞作為供體進(jìn)行核移植，重構(gòu)胚發(fā)育至妊娠期9.5天[3]。隨后，Lee等 報(bào)道，利用妊娠期11. 5-13. 5天的原生殖細(xì)胞作為供體而生產(chǎn)的重構(gòu)胚能發(fā)育至妊娠期11. 5天[4]。在利 用妊娠期10. 5天的原生殖細(xì)胞進(jìn)行克隆的嘗試失敗后[5] ， Yamazaki等根據(jù)他們的研究結(jié)果推斷原生殖細(xì) 胞并不適合作為核移植的供體。但同樣是用妊娠期10. 5天的原生殖細(xì)胞作為供體進(jìn)行核移植，Miki等卻 成功的獲得具有生育能力的后代[6],證明了原生殖細(xì)胞克隆是可以成功的。
目前，國內(nèi)外尚無利用哺乳動物精子進(jìn)行動物克隆的相關(guān)報(bào)道。理論上，精子克隆能夠使得后代中的 遺傳物質(zhì)幾乎全部來自于父本或母本，而且利用性控精液進(jìn)行動物克隆還能控制后代性別。這些是生殖細(xì) 胞克隆技術(shù)的誘人之處，但同時(shí)也有可能是該技術(shù)將面臨的挑戰(zhàn)。Surani等[7]和McGrath等[8]的研究表 明，由于基因組印記的存在使得父源和母源基因組對小鼠的胚胎發(fā)育都是必需的。而Hoppe和Illmensee 卻稱成功的生產(chǎn)出遺傳物質(zhì)全部來自與父本或母本的單性生殖小鼠[9， 10]。近來，Kono等也報(bào)道了孤雌生 殖小鼠的誕生[ll]，引起了世界性的關(guān)注。由此看來，精子克隆雖然在理論上可能存在挑戰(zhàn)，但這都是能 夠克服的，況且小動物上的理論也不一定適用于大動物。
動物精子克隆技術(shù)的研究無論在科學(xué)機(jī)制探討上，還是在技術(shù)推廣應(yīng)用上，都具有非常重大的意義和
價(jià)值。首先，該技術(shù)是首次在哺乳動物去核的中期n卵母細(xì)胞中通過顯微操作注射進(jìn)兩個(gè)精子。這兩個(gè)精
子能否發(fā)生去致密而形成兩個(gè)雄原核，然后兩個(gè)雄原核相互融合并激發(fā)重構(gòu)胚卵裂？兩套來自父本的基因 組能否支持重構(gòu)胚順利通過胚胎發(fā)育的早期阻滯，并發(fā)育至分娩，產(chǎn)下具有生育能力的后代？其次'在家 畜動物精子克隆胚發(fā)育的整個(gè)過程中，重構(gòu)胚的印記狀態(tài)具有什么樣的'變化規(guī)律？這些問題都有待解決。 再次，在動物育種技術(shù)的推廣方面，精子克隆比體細(xì)胞克隆具有更多優(yōu)勢。種公畜的精子比種公畜的體細(xì)胞系更容易獲得、保存、運(yùn)輸。精子克隆技術(shù)還可以選用來自兩個(gè)不同品系家畜的精子，從而加快家畜的 品種改良。況且，性控精子克隆技術(shù)還能實(shí)現(xiàn)后代性別的控制。這些都是體細(xì)胞克隆所無法比擬的。最后， 就像體細(xì)胞核移植技術(shù)成功用于轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)一樣[12-16]，精子克隆技術(shù)同樣也能應(yīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基 因動物，甚至是轉(zhuǎn)基閑性控動物，從而為轉(zhuǎn)基岡動物生產(chǎn)開辟一條新道路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用牛的精子代替體細(xì)胞作為供體用于核移植，從而生產(chǎn)精子克隆胚利用牛卵 細(xì)胞去核，利用精子在體外獲能，通過核移植方法生產(chǎn)獲得牛精子克隆胚胎。 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的 一種牛精子克隆胚胎的方法，其步驟包括
(1) 將采集回的牛卵巢用磷酸緩沖液洗后將卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體抽出，置于成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行體外 培養(yǎng)，使所述的卵母細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)育至第二次減數(shù)分裂中期，用透明質(zhì)酸酶對卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體脫顆粒 細(xì)胞處理；
(2) 先對步驟(1)的卵母細(xì)胞的細(xì)胞核染色，置于卵母細(xì)胞去核液中，再對細(xì)胞核進(jìn)行熒光定位， 準(zhǔn)確吸取所述的細(xì)胞核，得到去核的牛卵母細(xì)胞；
(3) 采集同一頭優(yōu)秀種公牛的精液，或采集同一品種的不同個(gè)體的兩頭優(yōu)秀種公牛的精液，或采集
不同品種的兩頭優(yōu)秀種公牛的精液，或購買性控優(yōu)秀種公牛的商用精液，將所述的種公牛精液置液氮罐中
貯存?zhèn)溆茫?br> (4) 將所述的種公牛精液在37。C下解凍，用精子獲能液使所述的精子獲能，置于卵母細(xì)胞注射液中
備用；
(5) 用顯微操作針一次性將步驟(4)所述的兩個(gè)獲能精子注入去核牛卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，得到精子 重構(gòu)胚；
(6) 將步驟(5)構(gòu)建好的精子重構(gòu)胚用激活培養(yǎng)基-1和激活培養(yǎng)基-2進(jìn)行體外人工激活，使重構(gòu) 胚融合，然后，將激活后的精子重構(gòu)胚置于胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)；
其中
步驟(1)的成熟培養(yǎng)液組分及配比如下
以TCM-199商品培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加胎牛血清10%,乙基哌嗪乙磺酸25ramo1 ，丙酮酸鈉 0. 55mg/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100IU/mL，促卵泡素0. 1IU/mL、促黃體素0. 1IU/mL、雌激素1 u g/mL、 表皮生長因子100ng/mL，調(diào)PH至7. 0-7. 2;
步驟(1)的磷酸緩沖液組分及配比如下氯化鈉8. Og/L+氯化鉀0. 2g/L ，磷酸氫鈉l. 15g/L '磷 酸二氫鉀0. 2 g/L,調(diào)pH至7. 0-7. 2;
5步驟(2)的卵母細(xì)胞去核液基礎(chǔ)液為成熟培養(yǎng)液，添加5pg/mL細(xì)胞松弛素B ，以重量/體積計(jì)
的10°/。聚乙烯吡咯烷酮；
步驟(4)的精子獲能液BO基礎(chǔ)液+6mg/mL牛血清白蛋白，5mM咖啡因，60ug/raL肝素；
步驟(5)的卵母細(xì)跑注射液基礎(chǔ)液為步驟(1)的成熟培養(yǎng)液，添加按重量/體積計(jì)的10%聚乙烯
吡咯烷酮；
步驟(6)的激活培養(yǎng)基-l和激活培養(yǎng)基-2的組分及配比如下 激活培養(yǎng)基-l:
基礎(chǔ)液為成熟培養(yǎng)液附加離子霉素5 u mol/L,調(diào)pH至7. 0-7. 2;
激活培養(yǎng)基-2:
基礎(chǔ)液為成熟培養(yǎng)液附加二甲基氨基嘌呤2咖ol/L,調(diào)pH至7.0-7.2;
步驟(6)的胚胎培養(yǎng)液組分及配比如下 氯化鈉107.63mmol/L，氯化鉀7. 16mmol/L,磷酸二氫鉀1. 19mmol/L，硫酸鎂1. 51mmol/L,青霉素鈉 0.012g/L，硫酸鏈霉素50ug/L ，乳酸鈉5. 35咖ol/L,碳酸氫鈉25.00,1/L，丙酮酸鈉7. 27mniol/L， 氯化鈣1. 78mraol/L,肌醇2. 77鵬ol/L，酚紅10. 0 u g/mL，枸杞酸鈉0. 34mmol/L，必需氨基酸30. 0 u l/ml, 非必需氨基酸10 u 1/mL， L-谷氨酰胺0. 20腿ol/L，牛血清白蛋白3mg/mL，調(diào)pH至7. 0-7. 2;
其中B0基礎(chǔ)液配方mg/100ml
NaCl655.0;
KC130. 0;
CaCL. 2H2033.0;
MgCl2. 6 H2010.6;
NaH2P04.2 H2012. 98;
Na跳310. 8;
葡萄糖275. 5;
丙酮酸鈉16. 5;
青霉素lOOIU/ml;
鏈霉素滿RJ/ml;
補(bǔ)充六蒸水至100ml 。
作為優(yōu)選方案之一，在本發(fā)明的步驟(4)中注入牛卵母細(xì)胞的兩個(gè)精子來自同一個(gè)體種公牛。 作為優(yōu)選方案之二，在本發(fā)明的步驟(4)中注入牛卵母細(xì)胞的兩個(gè)精子來自同一品種的不同個(gè)體的 種公牛。
6作為優(yōu)選方案之三，在本發(fā)明的步驟(4)中注入牛卵母細(xì)胞的兩個(gè)精子來5不同品種的種公牛。 作為優(yōu)選方案之四，在本發(fā)明的步驟(4)中注入牛卵母細(xì)胞的兩個(gè)精子來自于商用的種公牛的兩個(gè)
X-精子或是1個(gè)X-精子和1個(gè)Y-精子的組合。
作為本發(fā)明的關(guān)鍵操作步驟，下列的技術(shù)特征是重要的上述的卵母細(xì)胞去核率必需保證100%;
本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明采用傳統(tǒng)的核移植方式和步驟，只是在供體上我們采用的是精子來代替體細(xì)胞，本發(fā)明的供體
是優(yōu)秀種公牛的精子，精子采用常規(guī)的體外獲能方法；在去核的操作中改進(jìn)了現(xiàn)有的盲吸法去核不完全的
缺點(diǎn)，我們在去核方面采用先染色，后熒光定位核，在準(zhǔn)確吸核，我們既保障了去核率在100%，又降低了
對操作人員試驗(yàn)操作技能的要求和增加了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。從而證明了我們得到的克隆胚胎完全是精子克隆 胚胎。本發(fā)明經(jīng)過十五次的試驗(yàn)已經(jīng)證明了利用精子作為供體通過核移植方法是可以得到精子克隆胚胎
的，現(xiàn)在我們已經(jīng)獲得16-細(xì)胞期的克隆胚胎2枚，4-細(xì)胞期的精子克隆胚胎10枚，2-細(xì)胞期的精子克隆 胚胎30枚，后面的工作我們還在進(jìn)行中。 更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實(shí)施方式
》。


圖l:是本發(fā)明的牛精子重構(gòu)胚胎的技術(shù)路線圖。
圖2:是成熟卵母細(xì)胞的顯微觀察圖像(光學(xué)顯微鏡100x)。
圖3:是熒光照射定位核顯微觀察圖像(光學(xué)顯微鏡200x)。
圖4:是本發(fā)明實(shí)施例中精子克隆胚胎發(fā)育至2期，4期的顯微觀察圖像(光學(xué)顯微鏡100x)。 圖5:是本發(fā)明實(shí)施例中精子克隆胚胎發(fā)育至16期顯微觀察圖像(光學(xué)顯微鏡200x)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
1、 采樣將從湖北省武漢市江南牛屠宰場采集的健康黃牛母牛卵巢保存于39'C的磷酸緩沖液(配方 見《發(fā)明內(nèi)容》)，3小時(shí)內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室；
2、 牛卵母細(xì)胞收集與培養(yǎng)用注射器(商業(yè)購買的獸用16號針頭)從牛卵巢表面2-8mm卵泡中吸取牛 卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體，將該牛卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體經(jīng)成熟培養(yǎng)液(配方見《發(fā)明內(nèi)容》)洗滌3 遍，轉(zhuǎn)入100ul成熟培養(yǎng)液(配方見《發(fā)明內(nèi)容》所述)微滴中培養(yǎng)22h (培養(yǎng)條件是39°C、相對濕度 為100%, 5%0)2培養(yǎng)箱)；
3、牛卵母細(xì)胞的成熟度判定將在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)了22h的牛卵母細(xì)胞在0. 1%透明質(zhì)酸酶處理成熟卵 母細(xì)胞的脫凈外圍卵丘細(xì)胞。然后將胞質(zhì)均勻，形狀規(guī)則'脂滴含量豐富并且排除第一極體的牛卵母細(xì)胞 轉(zhuǎn)入含有10ug/mL細(xì)胞松弛素B的50ul的卵母細(xì)胞去核液微滴(配方見《發(fā)明內(nèi)容》所述)中。用石蠟油
7石蠟油覆蓋該微滴，置于39° C，相對濕度為100%， 5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。在直徑為60腿的培養(yǎng)皿蓋 中制作去核和注精子微滴；
4、 供體精子的準(zhǔn)備取優(yōu)秀種牛的冷凍精液或商用性控精液(精液來源參見《發(fā)明內(nèi)容》所述)，35 'C水浴解凍20秒，將精液沿離心管管壁輕輕推入離心管底部，將加有精液和5mlB0液的離心管在C02培養(yǎng)箱 傾斜45放置10 60min，使離心管底部有活力的精子盡可能上浮至液面上部，然后取出離心管，吸取上層約 4. 5ml含有精于的B0液移至另一離心管，再加入lmlBO液，離心(1500r/min， 5min)，棄上清液，用150 u l精子 獲能液(配方見《發(fā)明內(nèi)容》所述)懸浮分離精子，并調(diào)整精子濃度為lX103個(gè)/ml。在C02培養(yǎng)箱孵育獲能。
5、 將步驟3中獲得成熟的牛卵母細(xì)胞去核先用熒光染色劑Hoechst33342染色成熟的牛卵母細(xì)胞 15minutes，然后用持卵針吸住固定一個(gè)卵母細(xì)胞在熒光照射定位核，利用常規(guī)的顯微注射針把牛卵母細(xì) 胞核準(zhǔn)確吸出，去核操作應(yīng)控制在3秒內(nèi)，如此反復(fù)的操作，最后將成功去核的牛卵母細(xì)胞重新放置成熟 培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 4h后轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞注射液(配方見《發(fā)明內(nèi)容》所述)微滴中，培養(yǎng)10min。
6、 精于重構(gòu)胚的構(gòu)建先將步驟4)獲能的精子注入注精子微滴做供體，再用常規(guī)的顯微注射針吸兩 個(gè)形態(tài)止常的精子作為供體，然后用固定針固定一個(gè)牛卵母細(xì)胞，用常規(guī)的顯微注射針刺入牛卵母細(xì)胞胞 質(zhì)內(nèi)增加壓力使精子釋放進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)，然后將構(gòu)建的精子重組胚胎轉(zhuǎn)移到微滴的一邊并釋放，重復(fù)以上步 驟直到所有去核卵母細(xì)胞的顯微操作完成為止(所述精子的選擇參見《發(fā)明內(nèi)容》所述)。
7、 將步驟6所得的精子重構(gòu)胚轉(zhuǎn)到成熟培養(yǎng)液的微滴中培養(yǎng)(使其休整)3-4h。
8、 將步驟7所得的細(xì)胞膜完整的精子重構(gòu)胚轉(zhuǎn)移到激活培養(yǎng)基-l中激活5min，然后轉(zhuǎn)移到激活培養(yǎng)基-2 中3-4h (配方見《發(fā)明內(nèi)容>〉所述)，激活完成后轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液(配方見《發(fā)明內(nèi)容》所述)微滴中培養(yǎng)， 觀察記錄發(fā)育情況，獲得如圖2、圖3和圖4的結(jié)果。
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權(quán)利要求
1、牛精子克隆胚胎的方法，其步驟包括(1)將采集回的牛卵巢用磷酸緩沖液洗后將卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體抽出，置于成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)，使所述的卵母細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)育至第二次減數(shù)分裂中期，用透明質(zhì)酸酶對卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體脫顆粒細(xì)胞處理；(2)先對步驟(1)的卵母細(xì)胞的細(xì)胞核染色，置于卵母細(xì)胞去核液中，再對細(xì)胞核進(jìn)行熒光定位，準(zhǔn)確吸取所述的細(xì)胞核，得到去核的牛卵母細(xì)胞；(3)采集同一頭優(yōu)秀種公牛的精液，或采集同一品種的不同個(gè)體的兩頭優(yōu)秀種公牛的精液，或采集不同品種的兩頭優(yōu)秀種公牛的精液，或購買性控優(yōu)秀種公牛的商用精液，將所述的種公牛精液置液氮罐中貯存?zhèn)溆茫?4)將所述的種公牛精液在37℃下解凍，用精子獲能液使所述的精子獲能，置于卵母細(xì)胞注射液中備用；(5)用顯微操作針一次性將步驟(4)所述的兩個(gè)獲能精子注入去核牛卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，得到精子重構(gòu)胚；(6)將步驟(5)構(gòu)建好的精子重構(gòu)胚用激活培養(yǎng)基-1和激活培養(yǎng)基-2進(jìn)行體外人工激活，使重構(gòu)胚融合，然后，將激活后的精子重構(gòu)胚置于胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)；其中步驟(1)的成熟培養(yǎng)液組分及配比如下以TCM-199商品培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加胎牛血清10％，乙基哌嗪乙磺酸25mmol，丙酮酸鈉0.55mg/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100IU/mL，促卵泡素0.1IU/mL、促黃體素0.1IU/mL、雌激素1μg/mL、表皮生長因子100ng/mL，調(diào)pH至7.0-7.2；步驟(1)的磷酸緩沖液組分及配比如下氯化鈉8.0g/L+氯化鉀0.2g/L，磷酸氫鈉1.15g/L，磷酸二氫鉀0.2g/L，調(diào)pH至7.0-7.2；步驟(2)的卵母細(xì)胞去核液基礎(chǔ)液為成熟培養(yǎng)液，添加5μg/mL細(xì)胞松弛素B，以重量/體積計(jì)的10％聚乙烯吡咯烷酮；步驟(4)的精子獲能液BO基礎(chǔ)液+6mg/mL牛血清白蛋白，5mM咖啡因，60ug/mL肝素；步驟(5)的卵母細(xì)胞注射液基礎(chǔ)液為步驟(1)的成熟培養(yǎng)液，添加按重量/體積計(jì)的10％聚乙烯吡咯烷酮；步驟(6)的激活培養(yǎng)基-1和激活培養(yǎng)基-2的組分及配比如下激活培養(yǎng)基-1基礎(chǔ)液為成熟培養(yǎng)液附加離子霉素5μmol/L，調(diào)pH至7.0-7.2；激活培養(yǎng)基-2基礎(chǔ)液為成熟培養(yǎng)液附加二甲基氨基嘌呤2mmol/L，調(diào)pH至7.0-7.2；步驟(6)的胚胎培養(yǎng)液組分及配比如下氯化鈉107.63mmol/L，氯化鉀7.16mmol/L，磷酸二氫鉀1.19mmol/L，硫酸鎂1.51mmol/L，青霉素鈉0.012g/L，硫酸鏈霉素50μg/L，乳酸鈉5.35mmol/L，碳酸氫鈉25.00mmol/L，丙酮酸鈉7.27mmol/L，氯化鈣1.78mmol/L，肌醇2.77mmol/L，酚紅10.0μg/mL，枸杞酸鈉0.34mmol/L，必需氨基酸30.0μl/ml，非必需氨基酸10μl/mL，L-谷氨酰胺0.20mmol/L，牛血清白蛋白3mg/mL，調(diào)pH至7.0-7.2；其中BO基礎(chǔ)液配方mg/100mlNaCl655.0；KCl 30.0；CaCl2.2H2O 33.0；MgCl2.6H2O 10.6；NaH2PO4.2H2O12.98；NaHCO3 310.8；葡萄糖 275.5；丙酮酸鈉16.5；青霉素 100IU/ml；鏈霉素 100IU/ml補(bǔ)充六蒸水至100ml。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中注入牛卵母細(xì)胞的兩個(gè)精子來自同一個(gè)體 種公牛。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中注入牛卵母細(xì)胞的兩個(gè)精子來自同一品種 的不同個(gè)體的種公牛。 ，
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中注入牛卵母細(xì)胞的兩個(gè)精子來自不同品種 的種公牛。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的的方法，其特征在于，步驟(5)中注入牛卵母細(xì)胞的兩個(gè)精子來自于商用 的種公牛的兩個(gè)X-精子或是1個(gè)X-精子和1個(gè)Y-精子的組合。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及牛精子克隆胚胎的新方法。步驟如下(1)將采集的牛卵巢洗后將卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體抽出，體外培養(yǎng)，使卵母細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)育至第二次減數(shù)分裂中期(2)對卵母細(xì)胞的細(xì)胞核染色和熒光定位，并去核得到去核的牛卵母細(xì)胞；(3)采集優(yōu)秀種公牛的精液，或取自性控優(yōu)秀種公牛的商用精液置液氮罐中貯存；(4)解凍精液并做獲能處理，置于卵母細(xì)胞注射液中；(5)將兩個(gè)獲能精子注入去核牛卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，得到精子重構(gòu)胚；(6)將精子重構(gòu)胚激活培養(yǎng)。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)核移植中供體細(xì)胞只能是體細(xì)胞單一模式，是利用雙精子取代體細(xì)胞作為供體注入去核牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)生產(chǎn)牛胚胎的一種新方法。
文檔編號C12N15/06GK101492669SQ20091006052
公開日2009年7月29日 申請日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者鑫 張, 楊利國, 滇 王, 遙 肖, 霍立軍 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)