專利名稱：：一種細菌單雜交載體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型的細菌單雜交報告載體，可用于高通量的細菌單雜交篩選，以便在大腸桿菌體內(nèi)研究特異的DNA-蛋白質(zhì)相互作用。具體地講，涉及一種細菌單雜交載體的制備及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)和核酸是構(gòu)成生命體最為重要的兩類生物大分子，蛋白質(zhì)與核酸的相互作用是分子生物學研究的中心問題之一。隨著人類基因組計劃的完成，基因的功能問題也成為人們研究的熱點。細胞各種重要的生理過程，包括信號的轉(zhuǎn)導、細胞對內(nèi)外環(huán)境變化的反應(yīng)等，都是以蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)的相互作用為紐帶。研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、DNA-蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用對于人們在分子水平上深入理解各種生物學過程至關(guān)重要。因此，近年來，蛋白質(zhì)間相互作用以及蛋白質(zhì)/核酸間相互作用的研究發(fā)展迅速。目前對于蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究已經(jīng)取得了一定的研究成果，同時仍有許多問題有待解決。目前己有許多種報導過的方法可以比較有效地篩選蠻白質(zhì)-DNA間的相互作用，然而這些方法也同時存在有限制其廣泛應(yīng)用的缺點一些體外的篩選技術(shù)需要純化處于活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子；一些篩選技術(shù)需要反復(fù)許多輪的實驗才能最終得到特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)-DNA信息；而那些基于微陣列技術(shù)的篩選方法雖然可以大批量的分析相互作用關(guān)系，同時也需要對陣列和結(jié)果數(shù)據(jù)熟練的專業(yè)分析。體內(nèi)研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用方法有酵母單雜交和細菌單雜交。細菌單雜交是在酵母單雜交之后產(chǎn)生的另一種直接用于細胞內(nèi)檢測DNA—蛋白質(zhì)相互作用的遺傳學方法。與后者相比，細菌單雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)-DNA分子間相互作用的研究中表現(xiàn)出更明顯的優(yōu)勢。首先，其生長速度較快，因此利用細菌研究蛋白質(zhì)-DNA間相互作用的周期較酵母短；其次，細菌較酵母而言具有更高的轉(zhuǎn)化效率，因此利用細菌構(gòu)建的文庫容量更大，對于研究蛋白質(zhì)-DNA間相互作用而言，信息量更大；再次，實驗室條件下對于細菌DNA的處理較之酵母更便于操作。所有這些都顯示出細菌單雜交系統(tǒng)較之酵母單雜交系統(tǒng)具有無法比擬的優(yōu)點。目前，細菌雙雜交系統(tǒng)已經(jīng)商業(yè)化并被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究，而且，包括人、水稻等模式生物細胞的高通量pTRG基因文庫也已商業(yè)化，可供購買，但是卻沒有一個高效的可以與目前商業(yè)化的細菌雙雜交相容的細菌單雜交系統(tǒng)。本發(fā)明的目的就在于構(gòu)建可以與細菌雙雜交系統(tǒng)通用的細菌單雜交載體，并且它可以快速克隆DNA片段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于獲得一個細菌單雜交載體，該載體是基于雙雜交系統(tǒng)的誘餌載體pBT構(gòu)建的。本發(fā)明構(gòu)建的載體不僅無自激活背景，而且將能夠很好的與商業(yè)載體系統(tǒng)接軌，與pTRG文庫載體配合使用，該載體不僅可以鑒定和發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄因子，而且也能通過已知的轉(zhuǎn)錄因子3反向篩選其特異識別的DNA靶序列。另外我們所構(gòu)建的報告載體中引入S^mHI位點可方便的用于經(jīng)fe"3AI消化后的基因組DNA文庫構(gòu)建；引入的含雙Xcml位點的媒介DNA能夠經(jīng)過一次消化即可產(chǎn)生T-載體，便于目標DNAPCR產(chǎn)物的快速克隆。本研究中新型細菌單雜交載體的構(gòu)建對于發(fā)掘新功能基因及其識別的耙DNA位點具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種細菌單雜交載體pBXcmT，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，其分子量為3794563Da。所述的載體pBXcmT，它是通過如下步驟獲得的1)以起始載體pBT為材料，切除該載體pBT中XcI基因和lac-UV5啟動子；2)在步驟l)所述的切除了載體pBT中？icI基閔和lac-UV5啟動子的切入點位置上定向插入歷W-aaW雙報告基因片段；3)消除M^-""W雙報告基因片段內(nèi)部的^wjffl位點，得到初始載體pRpb;4)在步驟3)的/fo3-aflL4雙報告基因序列上游插入一段能夠抑制自激活的間隔核苷酸序列，其序列如序列表SEQIDNO:1所示；5)在載體pRpb中消除^2oI、五coRI和1542bp處的So;wHI酶切位點，保留2524bp處的5"wHI位點，得到中間載體pRpb-S7;6)將包含有兩個Xc附I位點的如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列引入到中間載體pRpb-S7的多克隆位點，得到載體pBXcmT。一種細菌單雜交載體pBXcmT的制備方法，其步驟如下1)以起始載體pBT為材料，切除該載體pBT中XcI基因和lac-UV5啟動子；2)在步驟l)所述的切除了載體pBT中)xI基因和lac-UV5啟動子的切入點位置上定向插入Zfe3-aaflL4雙報告基因片段；3)消除^/W-flflflL4雙報告基因片段內(nèi)部的fi"wHI位點，得到初始載體pRpb;4)在步驟3)的i/W-"a必雙報告基因序列上游插入一段能夠抑制自激活的間隔核苷酸序列，其序列如序列表SEQIDNO:l所示；5)在載體pRpb中消除WoI、&oRI和1542bp處的5owffl酶切位點，保留2524bp處的5amHT位點，得到中間載體pRpb-S7;6)將包含有兩個Xcml位點的如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列引入到中間載體pRpb-S7的多克隆位點，得到載體pBXcmT。更詳細的技術(shù)方案及其應(yīng)用參見《具體實施方式》。本發(fā)明的積極效果是1、本發(fā)明在初始報告載體pRpb中插入間隔DNA序列，該序列將///W-aaW和Ori間隔開'有42、本發(fā)明構(gòu)建的細菌單雜交報告載體pBXcmT，其多克隆位點經(jīng)過優(yōu)化融合了利用限制性內(nèi)切酶快速構(gòu)建T-載體。它包含有^wl媒介DNA的報告載體在XcTMl充分消化后可以快速構(gòu)建線性T-載體，方便目標DNA序列PCR產(chǎn)物的快速克隆。3、本發(fā)明將廣泛商業(yè)化的細菌雙雜交系統(tǒng)改造成為細菌單雜交系統(tǒng)，基本操作與細菌雙雜交系統(tǒng)相同，只改變了部分篩選條件，且能較好的與商業(yè)化的載體系統(tǒng)接軌，與現(xiàn)有的pTRG文庫通用，使細菌單雜交系統(tǒng)更加方便和高效。圖1:是本發(fā)明初》臺載體pRpb的構(gòu)建示意圖2.:是中間載體pRpb-S7的構(gòu)建示意圖3.:是本發(fā)明獲得的細菌單雜交載體pBXcmT的構(gòu)建示意圖4.:是本發(fā)明獲得的細菌單雜交載體pBXcmT核苷酸序列表，表中含有下劃線的序列為pl5A復(fù)制原點；斜體字表示的序列為間隔核苷酸序列；含有方框的序列為XcmI媒介DNA;粗體表示的序列為/^J-aaW雙報告基因含有陰影的序列為氯霉素抗性基因。具體實施例方式實施例l本發(fā)明載體的制備1.報告基閑M^-aaW片段得獲得以細菌雙雜交系統(tǒng)報告菌株XL1-BlueMRF'Kan(購于Stratagene公司)總DNA為模板，以Rpb-f(5，-TAGAGGATCCTTGTCGAAGATCTTCGACAAC-3，和Rpb-r(5，-GAACCTCGAGTTATTTGCCAACTACCTTAGTGATCTCG-3')為引物進行PCR擴增PCR擴增，獲得了約1.7kb的報告基因片段，所獲得的PCR產(chǎn)物克隆到pBS-T載體(購自TIANGEN公司)，將陽性克隆對應(yīng)樣品測序(由INVITROGEN測序)，以驗證目的PCR產(chǎn)物的正確性。PCR過程如下反應(yīng)體系反應(yīng)程序2xGCBufferI37，96°C5min;2.5mMdNTP8pJ94°C50sec;Rpb-f2^157°C50sec;Rpb-r2pl72。C2min:基因組DNA2^430個循環(huán)；ExTaq聚合酶0.6pl72°C10min;加水補至7(V1。目的片段測序后，經(jīng)PrimerPremier軟件分析，發(fā)現(xiàn)在該片段內(nèi)部存在5awHI限制性內(nèi)切酶識別位點，該位點與此片段上游引物Rpb-沖的5amHI位點相矛盾'影響后續(xù)載體的進一步改造，因此利用末端補齊修飾的方法將此位點消除形成pBS-RpbB(見圖l)。5末端補齊修飾的具體實驗方法為1)用所需修飾位點對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化該載體，使載體在該位點斷裂；2)凝膠回收酶切產(chǎn)物后，根據(jù)酶切后所形成的粘性末端，依據(jù)堿基配對原則，利用dNTP(或適當dATP/dTTP/dGTP/dCTG的混合物)和KlenowFragment聚合酶的聚合活性配制反應(yīng)體系；3)將體系置于37'C反應(yīng)約20min，從而使其以單鏈末端為模板聚合成雙鏈末端；4)回收步驟3)所述經(jīng)末端補齊后的產(chǎn)物并使其環(huán)化，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞后，挑取轉(zhuǎn)化子并抽提質(zhì)粒，通過酶切驗證獲得成功消除掉限制性酶切位點的轉(zhuǎn)化子。2.帶有/f^3-""W目的片段的初始報告載體構(gòu)建為了獲得pBT載體的復(fù)制起始區(qū)和氯霉素抗性基因序列，利用該質(zhì)粒多克隆位點含有的A^1限制酶位點及啟動子上游的C/"I位點，將該載體經(jīng)過雙酶切處理后，回收2.4kb的目的片段，該目的片段包含有完整的氯霉素抗性基因和可控制質(zhì)粒低拷貝數(shù)的復(fù)制原點(pl5Aorigin)。將該線性片段的末端采用KlenowFragment和dNTPs補平后，使其環(huán)化形成pOriC質(zhì)粒(見圖1)。以本實施例的第1步得到的重組質(zhì)粒pBS-RpbB為模板，以Rpb-f和Rpb-r為引物擴增i^W-flaflL4目的片段(其內(nèi)部5awHI位點已消除)。該產(chǎn)物經(jīng)5mwHI和J^ol雙酶切處理后定向克隆到pOriC質(zhì)粒中，形成初始載體pRpb(見圖1)。3.初始載體的改造為了有效抑制自激活，降低篩選背景，采取的改造策略為在/foJ-woL4序列上游5"wffl位點插入一段間隔DNA序列，將i^d-aad4和Ori間隔開，形成載體pRpb-Sso7-4(見圖2)。pRpb-Sso在其if/W-aoW序列上游2524bp處的萬amHI位點可以直接用于經(jīng)Saw3AI不完全酶切基因文庫的插入，但由于該載體內(nèi)部存在其他位點，因此采取末端補齊修飾方法(方法同上)將其6flmffli542、屈ol和￡coRI位點消除，將得到中間載體命名為pRpb-S7(見圖2)。4.本發(fā)明目標載體pBXcmT的構(gòu)建極端嗜熱古菌S.wZ/ator/CMS的微型染色體維持基因(mini-chromosomemaintenance-likegene,MCM，Genebank登錄號ID:1455038)被選定為初始Icml媒介DNA。采用正向引物BTXcm-f(V-rTArTCGAATTCGTCCAGGGATAGGGTGGATGGAAATTCCTAGTAAAC-3，)和反向引物ycm-w;5，-GGATGGCTCGAGCCAGGGATAGGGTGGTTAGACTTTTTTGTAACAT-3，)從極端嗜熱古菌S.w//flto^W>$基因組屮擴增獲得2.0kb的MCM基因。上面引物對中￡coRI和Wol位點用粗體表示，兩個被引入的Xc/nl位點用下劃線表示。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)￡coRI和Wol雙酶切后克隆到pBT線性質(zhì)粒中，將重組質(zhì)粒命名為pBTMCM。由于在MCM內(nèi)部存在兩個5awHI限制性內(nèi)切酶識別位點，則pBTMCM質(zhì)粒經(jīng)^附HI充分酶切后形成缺失844個堿基的線性片段，隨后將該片段經(jīng)末端補齊修飾方法處理形成pBTMCMA(見圖3)。PCR過程如下反應(yīng)體系反應(yīng)程序10xExBufferI5jxl96。C5min;2.5mMdNTP4pl94。Clmin;BTXcm-f2pl52°Clmin;Xcm-r2|jJ72°C2min;基因組DNA2|il30個循環(huán)；ExTaq聚合酶0.3pl72°C8min;加水補至50^1。用正向引物NXcm隱f(5，-GATAGGATCCAGGGATAGGGTGGATGGAAATTCCTAGTAAA-3，)和反向引物NXcm-r(5，-GGTAGGATCCAGGGATAGGGTGGTTAGACTTTTTTGTAACA-3，)分別與MCMA基因的3，末端和5'末端序列配對，被用來擴增L2kb的MCMAPCR產(chǎn)物，上述5flwHI位點用粗體字表示，兩個被引入的XcwI位點用下劃線表示。PCR過程如下反應(yīng)體系反應(yīng)程序10xExBuffer15pl96°C5min;2.5mMdNTP4pl94°Clmin;NXcm-f2|jl52。Clmin;NXcm-r2pl72°C2min;pBTMCMA2pl30個循環(huán)；ExTaq聚合酶0.3^172。C8min;加水補至50^1。以pBTMCMA質(zhì)粒為模板經(jīng)PCR擴增所得的MCMA片段被稱為JTcmI媒介DNA,其兩端通過引物設(shè)計引進了兩個5"mHI限制性位點，因此該片段經(jīng)過^/mHI充分酶切后能被插入到同樣經(jīng)過^wjHI消化處理后的線性pRpb-S7載體中，形成的重組載體被命名為pBXcmT。包含有ZcwI媒介DNA的pBXcmT重組質(zhì)粒經(jīng)過Xc附I充分酶切后將產(chǎn)生線性T-載體，便可用于PCR產(chǎn)物的直接克隆(圖3)。實施例2:用pBXcmT載體進行高通量細菌單雜交篩選的方法(生物學應(yīng)用實施例)1、篩選培養(yǎng)基的制備本發(fā)明篩選培養(yǎng)基所使用的試劑均購自Stratagene公司。(1)準確稱量7.5g瓊脂粉，用蒸餾水定容至380mL，調(diào)整pH在6.8-7.0，12rC滅菌20min后保溫備用；(2)待瓊脂冷卻至70。C時，迅速加入50mL10xMQsalts,混合均勻(3)待上述混合物冷卻至5(TC時，迅速加入67.5mLM9mediaadditive,0,5mL氯霉素(34mg/mL)，0.5mL四環(huán)素(12.5mg/mL)，10mL3-AT(lM)，lmL鏈霉素(8mg/mL)，快速混勻；(4)將上述混合均勻的培養(yǎng)基快速倒平板即為篩選平板，將該平板置于4'C備用(保存時間7不超過一個月)。上述篩選強度為初始篩選強度，可根據(jù)不同情況更改3-AT與鏈霉素的濃度。2、篩選方法(1)將待篩選的DNA片段的PCR產(chǎn)物直接克隆到充分消化的pBXcmT線性載體中或者將基因組DNA用^!AAI不完全酶切處理后插入到經(jīng)充分酶切后并經(jīng)過CIAP去磷酸化處理的pBXcmT線性載體中；(2)將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒與pTRG文庫共轉(zhuǎn)化到報告菌株XL1-BlueMRF'Kan(購于Stratagene公司)中(共轉(zhuǎn)化方法見Stratagene公司的細菌雙雜交系統(tǒng)操作手冊BacterioMatch⑧IITwo-HybridSystemLibraryConstructionKit),再將共轉(zhuǎn)化菌株涂于篩選平板，待菌液吸收后，將平板倒置與30'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-4天，培養(yǎng)過程中需要隨時觀察培養(yǎng)結(jié)果(培養(yǎng)時間可根據(jù)具體情況而改變)。實施例3:初始載體pRpb的功能驗證根據(jù)本申請人已經(jīng)發(fā)表的文獻(JiangPX,FengY，HeZGFunctionaldifferentiationandcooperativeinteractionbetweentwoeukaryote-likearchaeal0rcl/Cdc6proteinsontheimplicationorigin.BiochemBiophysResCommun.2007Dec28;364(4):945—51),極端嗜熱古菌6W/b/otoswZfafan'c〃sP2復(fù)制起始蛋白Cdc6與復(fù)制原點0ril之間的特異性相互作用，并且Cdc62的C-端負責這種相互作用。然而，體外實驗表明，Cdc62缺失了C-端之后的蛋白質(zhì)(Cdc62Ac)仍舊保留了部分與0ril相互作用的功能。因此本發(fā)明在此基礎(chǔ)上選擇S.so7/a&rj'csP2復(fù)制起始蛋白Cdc61、Cdc62、Cdc62Ac(Cdc62的C端缺失體)基因和S.so7/atar/c"sP2復(fù)制原點0ril序列分別克隆到pTRG(購于Stratagene公司)和初始報告載體pRpb中，以檢驗本發(fā)明的初始載體的功能，具體步驟如下1、將S.so7/ataWcMP2復(fù)制原點Oril引入到初始報告載體pRpb中以so/ater7'cusP2基因組DNA為模板，以O(shè)ril-f'(5'-TACGATTTGAATTCGMGTGGGACCCATCTAT-3')和0ri卜r(5'-TATGGATCCCCTTTGTTTCCACTGGAGAACTT-3')為引物，擴增0ril目的片段。&oRI和萬aWI內(nèi)切酶識別位點以粗體表示。將經(jīng)過&oRI和酶切后的0ril(0.2kb)目的片段克隆到經(jīng)和酶切后的pRpb載體中，從而將復(fù)制原點0ril引入沿's^aa^！報告序列上游，將得到的質(zhì)粒命名為pRpb-0ril。PCR過程如下反應(yīng)體系反應(yīng)程序10xExBufferI96。C3min;2.5mMdNTP4jxl94°C50sec;NXcm隱f2pl55。C50sec;NXcm-r2jjJ72°C50sec;基因組DNA2ji130個循環(huán)；ExTaq聚合酶0.3(xl72'C8min;加水補至50pl。82、pTRG重組質(zhì)粒的構(gòu)建將3.幼//加^/(^P2Cdc62、Cdc62△c目的序列克隆到pTRG中，分別命名為pTRG-62、pTRG-62Ac。制備方法與細菌雙雜交系統(tǒng)的pTRG克隆方法(見Stratagene公司的細菌雙雜交系統(tǒng)操作手冊BacterioMatch⑧IITwo-HybridSystemLibraryConstructionKit)相同。3、共轉(zhuǎn)化菌株構(gòu)建將上述構(gòu)建的pRpb重組報告載體與pTRG重組表達載體分別共轉(zhuǎn)化到報告菌株XL1-BlueMRF'Kan中，見表l所示；表1用于實施例3的共轉(zhuǎn)化菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注女表示檢測蛋白質(zhì)與DNA之間有無相互作用；眾表示檢測有無自激活作用。4、共轉(zhuǎn)化菌株生長趨勢的檢測分別接種共轉(zhuǎn)化菌株單菌落至LB液體培養(yǎng)基(30昭/mLKm+34嗎/mLCm+12.5ng/mL—Tm),過夜培養(yǎng)后再取等量菌液點種于篩選平板及LB對照平板上，點板后將平板正向置于30'C培養(yǎng)箱中倒置避光培養(yǎng)約3d，并隨時觀察培養(yǎng)結(jié)果(見表2)。表2表1所示的共轉(zhuǎn)化菌株的生長趨勢<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注篩選平板的篩選強度為5Q0mL篩選培養(yǎng)基含有4mL3-AT和0.9mL鏈霉素;+的數(shù)量表示菌落生長的強弱。由表2可以看出，空報告載體(沒有在//^3-fl"W上游引入Oril序歹ij，即pRpb)與空轉(zhuǎn)錄因子表達載體(空pTRG)共轉(zhuǎn)化報告菌株XL卜BlueMRF'Kan后，同樣會在篩選條件下生長，同吋檢測自激活現(xiàn)象的共轉(zhuǎn)化菌株也表現(xiàn)出一定程度的生長。分析pRpb質(zhì)粒圖譜后，推測該自激活現(xiàn)象是由于在該質(zhì)粒中，i^W-卯^4序列與其上游的低拷貝復(fù)制原點(Ori)緊密連接，從而導致與轉(zhuǎn)錄因子表達載體共轉(zhuǎn)化報告菌株XL1-BlueMRF'Kan之后，會在某種程度上募集RNAP結(jié)合到初始報告載體的Ori區(qū)域，從而激活了其下游/fe3-a"W報告基因的表達，由此表現(xiàn)出來上述的自激活現(xiàn)象。實施例4:用pBXcmT載體驗證古菌復(fù)制原點Oril與復(fù)制起始蛋白Cdc62間的相互作用根據(jù)實施例3中所敘述的已發(fā)表結(jié)果，本發(fā)明將8.//&^/￡^P2復(fù)制起始蛋白Cdc62、Cdc62Ac基因和復(fù)制原點Oril序列分別克隆到pTRG和pBXcmT中，來驗證pBXcmT載體的功能。1、將S^oZ/fltorZcMP2復(fù)制原點Oril引入到報告載體pBXcmT中將來源于極端嗜熱古菌51.^//"tan'c^P2的復(fù)制原點Oril的PCR產(chǎn)物直接克隆到Zcwl充分消化的pBXcmT線性載體中，挑取轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒并驗證片段插入方向，挑選正向插入(F)和反向插入(R)的轉(zhuǎn)化子，見共獲得的轉(zhuǎn)化子命名為pRpb-SOF(正向)和pRpb-SOR(反向)。2、pTRG重組質(zhì)粒的構(gòu)建同實施例3第2步3、共轉(zhuǎn)化菌株構(gòu)建將上述構(gòu)建的pBXcmT重組報告載體與pTRG重組表達載體分別共轉(zhuǎn)化到報告菌株XL1-BlueMRF'Kan中，見表3。表3用于實施例4的共轉(zhuǎn)化菌株構(gòu)建pTRG-62pTRG-62△cpTRGpRpb-SOF★★☆pRpb-SOR★★☆pRpb-S7☆注女表示檢測蛋白質(zhì)與DNA之間有無相互作用；眾表示檢測有無自激活作用。4、共轉(zhuǎn)化菌株生長趨勢的檢測采用與實施例3第4步相同的方法制備表3屮共轉(zhuǎn)化菌株的菌液點種于篩選平板上，并隨時觀察培養(yǎng)結(jié)果(見表4)。表4表3的共轉(zhuǎn)化菌株的生長趨勢pTRG-62pTRG隱62△cpTRGpRpb-SOF+++++-pRpb-SOR+++—pRpb-S7-注篩選平板的篩選強度為500mL篩選培養(yǎng)基含有4mL3-AT和0.9mL鏈霉素；-表示沒有生長+的數(shù)量表示菌落生長的強弱。對表4中共轉(zhuǎn)化菌株在篩選條件下的生長情況加以分析，結(jié)果表明pBXcmT載體有效的抑制了篩選過程中普遍存在的自激活現(xiàn)象；并且利用該載體對古菌復(fù)制原點與古菌復(fù)制起始蛋白間相互作用的檢測也表明，該載體可以被應(yīng)用于DNA-蛋白質(zhì)間相互作用的研究。細菌單雜交結(jié)果顯示Cdc62Ac比Cdc62結(jié)合能力更強，可能是閑為Kco/!'不是cdc62的天然宿主，蛋白質(zhì)在￡.co//中的構(gòu)象也許發(fā)生了改變，將負責DNA結(jié)合的部分包裹在內(nèi)部，從而影響其DNA結(jié)合能力。而Cdc62Ac則改變了這種構(gòu)象，有利于其結(jié)合DNA。并且，從實驗結(jié)果來看pRpb-SOF比pRpb-SOR與Cdc62結(jié)合能力強，證明蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合有一定的方向性。10200910060524實施例5:用pBXcmT載體驗證病原菌啟動子序列與轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用根據(jù)文獻(DavidR.Sherman"a/Rv3133c/dosRisatranscriptionfactorthatmediatesthehypoxicresponseofMycobacteriumtuberculosis.MolMicrobiol.2003May;48(3):833-43.)報道，結(jié)核分枝桿菌H37基因組基因Rv2031受到轉(zhuǎn)錄因子Rv3133c的調(diào)控，即Rv3133c蛋白質(zhì)可以結(jié)合Rv2031的啟動子序列(Rv2031R);Rv3133c的C-端負責與DNA相互作用，因此Rv3133c的C-端缺失體不與Rv2031R相互作用；并且Rv2Q31R上有4個堿基對該DNA序列與Rv3133c起到重要作用，若將這4個堿基從ccaa突變?yōu)間gtt將影響Rv3133c與Rv2031R的結(jié)合。根據(jù)此結(jié)論我們采用與實施例3相同的方法構(gòu)建了重組質(zhì)粒pRpb-Rv2031R(將Rv2031R正向克隆到pBXcmT載體中)禾BpRpb-ARv2031R(將突變了4個堿基的Rv2031R正向克隆到pBXcmT載體中)以及pTRG-Rv3133c(將Rv3133c基因序列定向克隆到pTRG載體中)和pTRG-Rv3133Ac(將Rv3133c缺失C-端的基因序列定向克隆到pTRG載體中)。將重組質(zhì)粒按照表5構(gòu)建共轉(zhuǎn)化菌株。表5用于實施例5的共轉(zhuǎn)化菌株構(gòu)建<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注女表示檢測蛋,質(zhì)與DNA之間有無相互作用；眾表示檢測有無自激活作用。相互作用結(jié)果如表6所示，該結(jié)果與文獻報道結(jié)論相同，證明了本發(fā)明載體pBXcmT的可靠性。表6表5的共轉(zhuǎn)化菌株生長趨勢<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注篩選平板的篩選強度為500mL篩選培養(yǎng)基含有10mL3-AT和lraL鏈霉素;-表示沒有生長；+的數(shù)量表示菌落生長的強弱。序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120>—種細菌單雜交載體及制備方法與應(yīng)用<130>〈141>2009-01-07<160>1<170〉Patentlnversion3.1〈210>1<211>6253<212>腿<213>大腸桿菌〈220〉<221>gene〈222>(1)..(6253)<223〉<400>1gcgctagcgg3gtgtatactggcttactatgttggcactgstgaigggtgtC3gtg卿tg60cttcatgtggcaggagaa犯犯ggCtgC3Ccggtgcgtcagcagaatatgtgatacagga120tatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcgg180a組ggctt3cg犯cggggcggagatttcctggei卿tgcCtt￡L￡lC￡lggg240aagtg鄉(xiāng)gggCCgCggC6L6Lagccgtttttccataggctccgcccccctgac肌gcatca300cg犯atctgacgctcaaatc敏ggtggcg肌acccgacag8t3CC3ggC360gtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgt420cattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggt鄉(xiāng)480cagttcgctcc犯gctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgcct540tatccggtaactatcgtcttgagtccaacccgg犯8gacatgc犯a^gcaccsctggcag600cagccactggt33ttgatttgtcttgaagtcatgcgccggtt肌ggctaa660c^gttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttca犯gag720ttggt鄉(xiāng)tcCg^l犯6lCCgccctgc犯ggcggttttttcgttttC3g8g780cgcgcagaccaaaacgatctcaag犯g3tc840tatttct.tttcagtgC3atttatctctcacctgaagtcagccccata900tgt犯ttctcatgtttg3cagcttatcatcgggccgcatcgaatt肌ttcccggggatcg3gt3tC犯ttatcacgitattcatagctatt1020ttactaa犯tcatcacatgca犯tacga犯a犯tctcttgtat3tgtt8gctcac犯tcc1080ttaactcccaatactcttg33Eita^gtgtg33ggttgtCC3tatctaaaaat朋taccttg1140tscccag犯gcagagat犯ttctcgctaact3g3gCtttt1200cctttaatactC8犯3gtctgatgatatt;cgttatc犯taattctctctatgtaatactc1260tatatctcgtttccgcttcatatataaaacgtattgtata簡acgctcatgagtgtgattg3'gaaatttgttcgacaatgaa1380tgctagagaacctatggatactaattttcc1440caggttattga卿ggaggatggeiga犯肌ctccacctatttgtacttaa鄉(xiāng)3gCtg犯1500gccattttataacaaatatatttttatacataactaacttaacatctgta1560g^ttageig3ccttgagatacattacaata犯g犯g犯gtgcg犯g郷ctgatg犯gat1620ttcgt犯gcct3gcgtatgagtatattagcaggctaagat1680gg自gtagttacct犯agttaagtaaccgtaactcttat1740gaaagccctagttttcgaca卿gtggttt3g犯a^tctc犯ggt犯犯g1800accacaattaggtccgcatgacgttttgeitaaatctggttt犯accccat1860agattactttgttattaacgC3attccagttactccaatgccccatatccCCgg3gC卿1920actagctggagtagttgaaa犯gtgggggeitcc3ggg3tagggtggstggaaBttcctag1980gactatagagacgtattteitagagtttctgac肌ctttca2040taatcaaaaccgagctagtagcgtatagga2100ttttctgatgtactttcgttcaatgaaaatttggcttstg2160attattctaccaattctggaaggtgcattgtcttgcaatt2220ggatcgatcc8C8gCtgC3ggtttaacagctgctgtagtag^ctgg卿2280gtattacttag鄉(xiāng)ctggtgcgttagtscttgctgatggtgga自gc兆tt3ttg3tg323403tg鄉(xiāng)gatgaagatag3gtagccattcatgaggc犯tgg2400agtctcaatagc肌肌gctgtaaattaaacgctagggctgcagttaitagc2460tgcaggg組CCgaEL3ttCgggagatac3taagtga犯gaccagtgtcig2520cctacctccaac犯tcttgtC犯g3tttg8cctaatattt2580cg犯ttacatcattcagg犯aatccacaaa2640cattaaga幼城gc犯ggaaatacgttac2700accaaaaatt3Ct3gtg鄉(xiāng)ctaagaatctg￡ittacag￡itttcttcgtagaagitgaggaa2760gaaacacctgattgataactCC犯g8LC犯tt3g3ggCttt2820tcag犯gcctatgccaagatggctcttaaiggCtg犯gtC3Ct3g3g3flgEl2880tgcaga犯gagcaata犯tatcatgagacttttcctagagagtgtaggagttgatatgg32940肌gtgg肌aag3Ctggt^￡lCCt犯33gCg3000犯tgatgaaataatagatagtttagctgtaagttctgagtgcgca犯agt3060ctaaaagaagctcaacaagt3ggC3ttg冊taga犯aatt3120acttacagatatatgaagca3180agtct犯ccaccctatccctggatccttgtcgaagatcttcgacaacacgC3Cggtgtt33240cattaggcaccccgggctttax;acttt3tgcttccggctcg城gttgtgtCg3CCg3gC3300gg8t犯C犯tttC3C3C3ggg3C卿gC3ga犯gccctagta犯gcgtaa33603CC犯g3ttC3gattgcgstCtCtt3犯gggtggtcccctagcgatagag3420cactcgatcttcccagaaaa聊ggcag犯gC3gt鄉(xiāng)3g犯c3ggccac3480gtgst恤cgtccacacaggt￡tt￡lgggtttctggax:cat3tgatacatgctCtggCC33g3540cattccggctggtcgc爐tcgttgagtgcattggtgacttacacatagacgaccatcac36003CC8Ctg^gactgcgggattgctctcggtcaagcttttaaagaggccct3ggggCCgtg3660cgtggag她3犯ggtttggatcaggatttgcgcctttggatgaggcactttccagagcg3720gtggt卿tctttcgaacaggCCg"teiCgCELgttgtcgaacttggtttgca3780gt鄉(xiāng)卿tctctcttgcgagatgatcccgcattttcttg犯3gCtttgC卿ggct柳3840tccscgttgattgtctgcgaggcaag感g(shù)atcatcaccgtsgtg卿gt3900gcgttc卿gctcttgcggttgccat犯gagaagccacctcgccc肌tggt3CC犯Cg3t3960gttccctccacca犯ggtgttcttatgtagtgacaccgattgc郷gccc4020c8gc"Utgaggg犯gcggtgstcgccg犯gtatcgactcaactotcagag4080gtagttggcgtcatcgagcgccatctcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtecggc4140txcgcagtggatggcggcctgaagccacacagtgatattgatttgctggttacggtgacc4200gt卿gcttgatgaaacaacgcgg鄉(xiāng)gctttgatcaacgaccttttggaaacttcggct4260tcccctggag聊gcg卿ttctccgcgctgtsgaagtC3ccattgttgtgC3cgscgac4320atcattccgtggcgtteitccagct犯gcgcg犯ctgcastttgg鄉(xiāng)eitggcagcgcatSLt4380gacattcttgcaggtatcttCg3gCC3gCCttgatctggctatcttgctg4440ac犯犯gcaacgttgccttggt鄉(xiāng)tccagcggcgg郷aactctttgat4500ccggttcctgattt眺gcgatggaactcg4560ccgcccgactgggctggcgatgagcga犯tgtsgtgcttacgttgtcccgcatttggtac4620agcgcsgt犯ccggcaaBtcgcgccg卿gatgtcgctgccgactgggca3tgg3gCgCC4680tgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggac犯g卿4740犯gatcgcttggcctcgcgcgC3g8tC3gttgg犯g犯tttgtccactacgtgs卿gcg480014<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1、一種細菌單雜交載體pBXcmT，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，其分子量為3794563Da。2、權(quán)利要求l所述的一種細菌單雜交載體pBXcmT，它是通過如下步驟獲得的1)以起始載體pBT為材料，切除該載體pBT中人cI基因和lac-UV5啟動子；2)在步驟l)所述的切除了載體pBT中kI基因和lac-UV5啟動子的切入點位置上定向插入Ms3-"W雙報告基因片段；3)消除i^3-"flW雙報告基因片段內(nèi)部的^m7HI位點，得到初始載體pRpb;4)在步驟3)的//^3-"flW雙報告基因序列上游插入一段能夠抑制自激活的間隔核苷酸序列，其序列如序列表SEQIDNO:l所示；5)在載體pRpb中消除^zo1、EcoRI和1542bp處的5awHI酶切位點，保留2524bp處的BawHI位點，得到中間載體pRpb-S7;6)將包含有兩個XcmI位點的如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列引入到中間載體pRpb-S7的多克隆位點，.得到載體pBXcmT。'3、一種細菌單雜交載體pBXcmT的制備方法，其步驟如下1)以起始載體pBT為材料，切除該載體pBT中XcI基因和lac-UV5啟動子；2)在步驟l)所述的切除了載體pBT中XcI基因和lac-UV5啟動子的切入點位置上定向插入M^-fl"W雙報告基因片段；3)消除M^-flaW雙報告基因片段內(nèi)部的B"附HI位點，得到初始載體pRpb;4)在步驟3)的///d-"flflL4雙報告基因序列上游插入一段能夠抑制自激活的間隔核苷酸序列，其序列如序列表SEQIDNO:l所示；5)在載體pRpb中消除Wol、五coRI和1542bp處的5flwHI酶切位點，保留2524bp處的5awHI位點，得到中間載體pRpb-S7;6)將包含有兩個JfcmI位點的如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列引入到中間載體pRpb-S7的多克隆位點，得到載體pBXcmT。全文摘要本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，目的在于構(gòu)建一種細菌單雜交載體，該載體被命名為pBXcmT，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，其分子量為3794563Da。本發(fā)明的載體的突出優(yōu)點在于與現(xiàn)有的細菌雙雜交商業(yè)化基因文庫、報告菌株以及試驗試劑等完全相容，特別是它整合有TA克隆，能夠方便快捷地用于短的調(diào)控核苷酸序列的快速克隆。這種細菌單雜交載體在鑒定和篩選DNA-蛋白質(zhì)相互作用中具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號C12N15/70GK101475959SQ20091006052公開日2009年7月8日申請日期2009年1月15日優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日發(fā)明者何正國,輝馮,郭曼曼申請人:華中農(nóng)業(yè)大學