專利名稱：一種dpc4基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
一種DPC4基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)
用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關(guān)于一種DPC4基因的原位雜交檢測試劑盒及 其檢測方法和應(yīng)用
背景技術(shù)：
胰腺癌已成為我國人口死亡的十大惡性腫瘤之一。年輕的胰腺癌病人也較10年 前有明顯增加的趨勢，而且惡性度更高，預(yù)后更差。就胰腺癌的發(fā)生部位而言，仍以胰頭部 位最多見，約占70%左右，胰體次之，胰尾部更次之，有的頭體尾部均有，屬于彌漫性病變或 多中心性病變。目前，胰腺癌的發(fā)病原因尚不清楚，已發(fā)現(xiàn)一些環(huán)境因素與胰腺癌的發(fā)生有 關(guān)。其中已定的首要危險因素為吸煙。吸煙者發(fā)生胰腺癌相對危險度是非吸煙者的1. 5倍， 而且隨著吸煙數(shù)量增加而增加。其他高危險因素還有糖尿病、膽石病、飲酒(包括啤酒)以 及慢性胰腺炎等。進食高脂肪、高蛋白飲食和精制的面粉食品，胃切除術(shù)后20年者，也是發(fā) 生胰腺癌的危險因素。胰腺癌致死性特高，可能由于它發(fā)病詭秘隱匿，確診時多已進入晚期 之故。DPC4基因又稱MADH4或SMAD4基因，是一個新的胰腺癌抑癌基因。DPC4基因的失 活多發(fā)生在胰腺癌惡變的較晚階段，表達或不表達DPC4的胰腺癌患者，其中位生存期有顯 著不同。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆 時)就能做到基因水平的早期預(yù)測診斷。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)檢測DPC4基因，對 臨床早期的胰蛸癌的基因水平診斷有非常重要的臨床價值。DPC4基因序列號NM_005359， 8789bp, mRNA, 18q21. 1 “，CDS, 539··· · 2197bp。本發(fā)明的原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細胞化學(xué)技 術(shù)結(jié)合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原 理是使含有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補 核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學(xué)方法對標記探針進行探測， 從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種DPC4基因的原位雜交檢測試 劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種DPC4基因的原位雜交檢測試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種DPC4基因的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種DPC4基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測胰腺癌疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。
所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種DPC4基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其中所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種DPC4基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。所述的a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的 時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本或組織細胞標本。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作
1).將待測標本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預(yù)雜交(42°C )；
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C )；
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10).取出封片鏡檢。
本發(fā)明優(yōu)點在于
1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。
2、本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
3、本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測胰腺癌發(fā)生動態(tài)過程，以及用于胰腺癌預(yù)
防醫(yī)學(xué)的檢測和篩選工具。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物，以及 影像醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上檢測DPC4異常表達，在影像醫(yī)學(xué)檢查 及其它檢查未發(fā)現(xiàn)占位性胰腺癌病灶之前，癌癥生化指標未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫塊 之前，能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床胰腺癌病患一個真正的預(yù)后早期診斷。這樣才有可能實施胰腺癌的早期診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根 治胰腺癌惡疾。

圖1是本發(fā)明實施例中胰腺癌癥病人DPC4基因表達圖片。圖2是本發(fā)明實施例中正常人DPC4基因表達圖片。
具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明具體實施方式
作詳細說明。實施例1一種DPC4基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標記。試劑盒中的其它液體和 標本組成如下消化液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
保護液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
預(yù)雜交液1300 μ 1/ ,f 2管/盒無色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
封閉液1000 μ 1/ ,f 1管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體ι μ 1/管1管/盒 無色透明液體
顯色劑A175 μ 1/ 管;1管/盒 黃色液體
顯色劑B320 μ 1/ 管;1管/盒 無色透明液體
緩沖液I IOx90ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液II IOx80ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液III IOx20m/瓶3瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV IOx90ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
固定液90ml/ 瓶1瓶/盒無色透明液體
陽性對照標本6片/盒上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保護液0. 2g的glycine加入Iml的1 X緩沖液I ；3、預(yù)雜交液:1 X緩沖液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入Iml IX緩沖液III;5、IOx 緩沖液 I (PH7. 1-7. 4)
NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2P042g加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、10x 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:IM Tris-HCl (PH9.5) =Tirs 121.1g 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加水至11，并高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58.44 加水至 11，并高壓滅菌；0.5M MgCl2 101.65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50-60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT 1g 加 70% DMFl 1.44ml ；11、顯色劑 B =BCIP 1g 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實施例2一種DPC4基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應(yīng)用一、標本處理1、用10ml的離心管，裝4.5ml淋巴細胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心10min ；2、吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心10min ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心10min ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1 X緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標本可保存在-20°C，或繼續(xù)做實驗。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度
1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩沖液III ；4、10 X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實驗步驟1、取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復(fù)查用)及陽性對照標本兩張(每次 實驗做一對陽性對照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預(yù)熱10分鐘。放進16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護液(保護液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2 X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5ml IX緩沖液 III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結(jié)果判斷在光鏡下計數(shù)100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。陽性對照標本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對照應(yīng)無色。地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探 針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的基因的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細胞中的DPC4 基因表達量，用來確定胰腺癌的預(yù)后。臨床研究表明，DPC4基因在胰腺癌中低表達，因為 DPC4基因在正常人高表達，DPC4基因的低表達說明胰腺癌已發(fā)生，DPC4基因的表達程度與 胰腺癌的預(yù)后有關(guān)，屬負相關(guān)，表達愈低預(yù)后愈差。從而獲得胰腺癌的診斷信息。如上所述， 當檢測DPC4基因表達時，可預(yù)測受試者為胰腺癌情況。具體結(jié)果請見圖1和圖2。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司<120> 一種DPC4基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>8789<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1
0144]atgctcagtggcttctcgacaagttggcagcaacaacacggccctggtcgtcgtcgccgc600145]tgcggtaacggagcggtttgggtggcggagcctgcgttcgcgccttcccgctctcctcgg1200146]gaggcccttcctgctctcccctaggctccgcggccgcccagggggtgggagcgggtgagg1800147]ggagccaggcgcccagcgagagaggccccccgccgcagggcggcccgggagctcgaggcg2400148]gtccggcccgcgcgggcagcggcgcggcgctgaggaggggcggcctggccgggacgcctc3000149]ggggcgggggccgaggagctctccgggccgccggggaaagctacgggcccggtgcgtccg3600150]cggaccagcagcgcgggagagcggactcccctcgccaccgcccgagcccaggttatcctg4200151]aatacatgtctaacaattttccttgcaacgttagctgttgtttttcactgtttccaaagg4800152]atcaaaattgcttcagaaattggagacatatttgatttaaaaggaaaaacttgaacaaat5400153]ggacaatatgtctattacgaatacaccaacaagtaatgatgcctgtctgagcattgtgca6000154]tagtttgatgtgccatagacaaggtggagagagtgaaacatttgcaaaaagagcaattga6600155]aagtttggtaaagaagctgaaggagaaaaaagatgaattggattctttaataacagctat7200156]￡1 ￡1C ￡1C ￡1 ￡1 ￡1 ggagctcatcctagtaaatgtgttaccatacagagaacattggatgggag7800157]gcttcaggtggctggtcggaaaggatttcctcatgtgatctatgcccgtctctggaggtg8400158]gcctgatcttcacaaaaatg3.3. C 3.3.3.3. C 3.tgttaaatattgtcagtatgcgtttgactt9000159]aaaatgtgatagtgtctgtgtgaatccatatcactacgaacgagttgtatcacctggaat9600160]tgatctctcaggattaacac tgcagagtaa tgctccatca agtatgatgg tgaaggatga
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權(quán)利要求
一種DPC4基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測胰腺癌疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標記物選自放射性核素或非 放射性標記物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的 增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8.—種DPC4基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其特征在于，所述的 雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。
9.一種DPC4基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本或 組織細胞標本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DPC4基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種DPC4基因原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測胰腺癌疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101988116SQ20091005610
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日 公開號200910056106.發(fā)明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司