專利名稱：一種atdc基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法
一種ATDC基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應
用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關(guān)于一種ATDC基因的原位雜交檢測試劑盒及 其檢測方法和應用
背景技術(shù)：
胰腺癌已成為我國人口死亡的十大惡性腫瘤之一。年輕的胰腺癌病人也較10年 前有明顯增加的趨勢，而且惡性度更高，預后更差。就胰腺癌的發(fā)生部位而言，仍以胰頭部 位最多見，約占70%左右，胰體次之，胰尾部更次之，有的頭體尾部均有，屬于彌漫性病變或 多中心性病變。目前，胰腺癌的發(fā)病原因尚不清楚，已發(fā)現(xiàn)一些環(huán)境因素與胰腺癌的發(fā)生有 關(guān)。其中已定的首要危險因素為吸煙。吸煙者發(fā)生胰腺癌相對危險度是非吸煙者的1. 5倍， 而且隨著吸煙數(shù)量增加而增加。其他高危險因素還有糖尿病、膽石病、飲酒(包括啤酒)以 及慢性胰腺炎等。進食高脂肪、高蛋白飲食和精制的面粉食品，胃切除術(shù)后20年者，也是發(fā) 生胰腺癌的危險因素。胰腺癌致死性特高，可能由于它發(fā)病詭秘隱匿，確診時多已進入晚期 之故。ATDC基因在胰腺癌中過度表達，約正常正常胰腺的20倍，ATDC基因的過表達促 進胰腺的癌變及轉(zhuǎn)移，它在膀胱癌、肺癌的病理演變中也扮演了重要角色。美國密歇根大學 員最新研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細胞中，一種名為ATDC的基因表達水平是正常胰腺細胞中表達 水平的20倍，而且這種基因能增強胰腺癌細胞對現(xiàn)有療法的耐受性。研究人員在3月刊的 《癌細胞》雜志上介紹說，他們將ATDC基因充分表達或被抑制的胰腺腫瘤細胞分別注入兩 組實驗鼠體內(nèi)。60天后，ATDC基因充分表達組的實驗鼠體內(nèi)胰腺腫瘤增大，良性向惡化發(fā) 展，并出現(xiàn)擴散；而對照組實驗鼠只有很小的腫瘤生長跡象。研究人員認為，這表明ATDC基 因促進了胰腺腫瘤細胞的生長和惡性病變。研究認為，這種基因在膀胱癌、肺癌的發(fā)展過程 中可能也扮演了某種角色。負責這項研究的迪亞納·西梅奧內(nèi)說，ATDC基因不僅導致胰腺 癌細胞生長更快、更富有攻擊性，而且會增加其對化療和放療的耐受性。如果開發(fā)出以這種 基因為靶向的藥物或療法，或許能增強現(xiàn)有化療、放療對胰腺癌的治療效果。胰腺癌的早期 診斷非常困難，目前，臨床被發(fā)現(xiàn)的胰腺癌大多是晚期病人，大都只有三個月的生存期，如 何做到早期診斷是臨床和患者十分迫切的。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)檢測ATDC基因， 對胰蛸癌的基因食品的早期診斷有非常重要的臨床意義。ATDC基因序列號NM-012101， 3037bp, Ilq22_q23”cds :125…1891bp。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆 時)就能做到基因水平的早期預測診斷。本發(fā)明的原位雜交技術(shù)(in situ hybri dization)是將分子生物學與細胞化學 技術(shù)結(jié)合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其 原理是使含有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探 測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種ATDC基因的原位雜交檢測試 劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種ATDC基因的原位雜交檢測試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種ATDC基因的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種ATDC基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測胰腺癌疾病藥物中的應用，所 述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。 所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種ATDC基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其中所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種ATDC基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b、檢測a步驟得到的雜交復合體。所述的a步驟中形成雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的 時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本或組織細胞標本。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作
1).將待測標本放入反應槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C )；
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C )；
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)
9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本發(fā)明優(yōu)點在于1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。2、本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。3、本發(fā)明能及早做到ATDC基因表達異常的信息采集，給臨床胰腺癌病患一個真 正的預后早期診斷。這樣才有可能實施胰腺癌的早期診斷、早期預防、早期治療，有可能從 源頭上徹底根治胰腺癌惡疾。

圖1是本發(fā)明實施例中胰腺癌癥病人ATDC基因表達圖片。圖2是本發(fā)明實施例中正常人ATDC基因表達圖片。
具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明具體實施方式
作詳細說明。實施例1一種ATDC基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標記。試劑盒中的其它液體和 標本組成如下消化液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
保護液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
預雜交液1300 μ 1/ f 2管/盒無色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
封閉液1000 μ 1/ f 1管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體ι μ 1/管1管/盒 無色透明液體
顯色劑A175 μ 1/ 管1管/盒 黃色液體
顯色劑B320 μ 1/ 管1管/盒 無色透明液體
緩沖液I IOx90ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液II IOx80ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液III IOx20m/瓶3瓶/盒 淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV IOx90ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
固定液90ml/ 瓶1瓶/盒無色透明液體
陽性對照標本6片/盒上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保護液0. 2g的glycine加入Iml的1 X緩沖液I ；3、預雜交液:1 X緩沖液II 7. 5ml50 X D 3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入Iml IX緩沖液III;5、IOx 緩沖液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2P042g加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、IOx 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加 水至11，并高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高壓滅菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50_60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實施例2一種ATDC基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應用一、標本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；
4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1 X緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標本可保存在_20°C，或繼續(xù)做實驗。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩沖液III ；4、10 X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實驗步驟1、取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復查用)及陽性對照標本兩張(每次 實驗做一對陽性對照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預熱10分鐘。放進16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護液(保護液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2 X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5ml IX緩沖液 III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；
14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結(jié)果判斷在光鏡下計數(shù)100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對照應無色。地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克 服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探 針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的基因的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細胞中的ATDC 基因表達量，用來確定胰腺癌是否發(fā)生。臨床研究表明，ATDC基因是胰腺癌的特異基因，因 為ATDC基因在正常人中不表達，唯獨在癌表達，說明胰腺癌已經(jīng)發(fā)生，用來確定胰腺癌是 否發(fā)生，或是正常。從而獲得胰腺癌的診斷信息。本發(fā)明實施例采樣為胰腺癌病人5名，正常對照組5名。抽所有待檢人的外周血 3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結(jié)果表示，所有胰腺癌患者ATDC基因有過度表達，細 胞染色；正常對照組ATDC基因不表達，細胞無染色。具體結(jié)果請見圖1和圖2。實施例3用ATDC基因試劑盒檢測胰腺癌疾病與用VEGF基因試劑盒檢測胰腺癌疾病之間平 行實驗。為了科學評價上述基因各自在胰腺癌疾病的特異性、敏感性、準確性。我們用 平行試驗的方法，同時檢測上述基因的mRNA，檢測技術(shù)采用核酸原位雜交技術(shù)，用同一例 胰腺癌疾病患者的外周血，同時檢測ATDC基因和VEGF (VEGF基因序列號NM-OO1025366， 6pl2”3665bp cds:492。。。。1730bp)基因的mRNA(進行核酸原位雜交、免疫組化染色、鏡下 記數(shù)、結(jié)果報告等均采用實施例1和實施例2的原位雜交技術(shù)的相同方法和步驟及試劑)。 發(fā)現(xiàn)ATDC基因在胰腺癌疾病病人中表達量比VEGF基因在同一疾病病人的表達量要高。結(jié) 果表明，ATDC基因?qū)σ认侔┘膊≡\斷的特異性、敏感性、準確性比VEGF基因更好，原位雜交 基因表達圖顯示，ATDC基因的表達量是70 %，VEGF基因的表達量是50 %。本發(fā)明的試劑盒 作于胰腺癌疾病診斷的指標有非常重要的臨床意義。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司<120> 一種ATDC基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>3037
<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1ctcctcacag gtgtgtctct agtcctcgtg gttgcctgcc ccactccctg ccgagacgcc 60tgccagaaag gtcacctatc ctgaacccca gcaagcctga aacagctcag ccaagcaccc 120tgcgatggaa gctgcagatg cctccaggag caacgggtcg agcccagaag ccagggatgc 180ccggagcccg tcgggcccca gtggcagcct ggagaatggc accaaggctg acggcaagga 240tgccaagacc accaacgggc acggcgggga ggcagctgag ggcaagagcc tgggcagcgc 300cctgaagcca ggggaaggta ggagcgccct gttcgcgggc aatgagtggc ggcgacccat 360catccagttt gtcgagtccg gggacgacaa gaactccaac tacttcagca tggactctat 420ggaaggcaag aggtcgccgt acgcagggct ccagctgggg gctgccaaga agccacccgt 480tacctttgcc gaaaagggcg agctgcgcaa gtccattttc tcggagtccc ggaagcccac 540ggtgtccatc atggagcccg gggagacccg gcggaacagc tacccccggg ccgacacggg 600ccttttttca cggtccaagt ccggctccga ggaggtgctg tgcgactcct gcatcggcaa 660caagcagaag gcggtcaagt cctgcctggt gtgccaggcc tccttctgcg agctgcatct 720caagccccac ctggagggcg ccgccttccg agaccaccag ctgctcgagc ccatccggga 780ctttgaggcc cgcaagtgtc ccgtgcatgg caagacgatg gagctcttct gccagaccga 840ccagacctgc atctgctacc tttgcatgtt ccaggagcac aagaatcata gcaccgtgac 900agtggaggag gccaaggccg agaaggagac ggagctgtca ttgcaaaagg agcagctgca 960gctcaagatc attgagattg aggatgaagc tgagaagtgg cagaaggaga aggaccgcat 1020caagagcttc accaccaatg agaaggccat cctggagcag aacttccggg acctggtgcg 1080
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一種ATDC基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測胰腺癌疾病藥物中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的標記物選自放射性核素或非 放射性標記物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述的非放射性標記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的 增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8.—種ATDC基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其特征在于，所述的 雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。
9.一種ATDC基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b、檢測a步驟得到的雜交復合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本或 組織細胞標本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種ATDC基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種ATDC基因原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測胰腺癌疾病藥物中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101988114SQ20091005610
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日 公開號200910056104.發(fā)明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司