專利名稱：一種egfr基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說(shuō)關(guān)于一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及 其檢測(cè)方法和應(yīng)用
背景技術(shù)：
癌癥也叫惡性腫瘤，腫瘤是指機(jī)體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細(xì)胞異常 增生而形成的局部腫塊。癌癥病變的基本單位是癌細(xì)胞。人體細(xì)胞老化死亡后會(huì)有新生 細(xì)胞取代它，以維持機(jī)體功能，人體絕大部分細(xì)胞都可以增生，但這種增生是有限度的，而 癌細(xì)胞的增生則是無(wú)止境的，這使患者體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗。同時(shí)，癌細(xì)胞還能釋放 出多種毒素，使人體產(chǎn)生一系列癥狀，晚期時(shí)它轉(zhuǎn)移到全身各處生長(zhǎng)繁殖，最后導(dǎo)致人體消 瘦、無(wú)力、貧血、食欲不振、發(fā)熱及臟器功能受損等，器官功能衰竭而死亡。EGFR表皮生長(zhǎng)因子受體，在生理狀態(tài)下是細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)因子，與其配體如EGF、 TGF-α結(jié)合后發(fā)揮其生理效應(yīng)，可啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)周期，即通過(guò)一系列細(xì)胞內(nèi)傳遞體將生長(zhǎng) 信號(hào)傳導(dǎo)至核內(nèi)引起細(xì)胞的生長(zhǎng)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化和增殖。在惡性腫瘤中，EGFR 過(guò)度表達(dá)，持續(xù)向細(xì)胞內(nèi)傳遞分裂增殖信號(hào)，干擾細(xì)胞分化的正常調(diào)控狀態(tài)，引起細(xì)胞持 續(xù)增殖，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體 (ECFR)和C-erbB-2等生長(zhǎng)因子受體進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面的EGFR和C_erbB_2的 陽(yáng)性率分別為(42. 20士3. 42) %和(57. 03士 5. 06) % 0腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程中，體內(nèi)微環(huán)境 對(duì)腫瘤細(xì)胞的分裂增殖具有重要意義，微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞之間可通過(guò)自分泌、旁分泌和內(nèi) 分泌等方式產(chǎn)生的多種信號(hào)因子，單獨(dú)或聯(lián)合調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)。C-erbB-2與EGFR 的結(jié)構(gòu)相似，已有實(shí)驗(yàn)證明在肺癌和黑色素瘤患者中EGFR陽(yáng)性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和繼發(fā)生長(zhǎng)能 力都強(qiáng)于EGFR陰性的細(xì)胞亞群。實(shí)驗(yàn)中近半數(shù)的腫瘤細(xì)胞表面存在EGFR和C_erbB_2等 生長(zhǎng)因子受體，推測(cè)成釉細(xì)胞瘤本身分泌的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞表面的生長(zhǎng)因子受體可能在腫 瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖和侵襲等過(guò)程中起重要作用。有大量文獻(xiàn)報(bào)道EGFR基因各種癌癥發(fā)病有 關(guān)，EGFR基因表達(dá)變化明顯增加。在肺癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤患者的外周血中 可以檢測(cè)到表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)。肺癌和良性疾病之間外周血血清EGFR水平 無(wú)差別，但在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中的表達(dá)與無(wú)轉(zhuǎn)移組之間差別顯著，血清EGFR水平可 作為肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開(kāi)，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆 時(shí))就能做到基因水平的早期預(yù)測(cè)診斷。采用核酸原位雜交技術(shù)檢測(cè)Egfr基因的表達(dá)量， 對(duì)臨床各種類型癌癥的早期基因水平的診斷有非常重要的臨床意義。EGFR基因序列號(hào) NM_005228，5616bp，mRNA，7pl2" CDS 247......3879bp。本發(fā)明的原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技 術(shù)結(jié)合起來(lái)，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ) 核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)， 從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)試 劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)癌癥疾病藥物中的應(yīng)用，所述 的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。 所述的疾病是腎癌，胰腺癌，結(jié)直腸癌或肺癌。所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其中所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。所述的a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的 時(shí)間為16-24小時(shí)，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或組織細(xì)胞標(biāo)本。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作
1).將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；
3).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；
4).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C )
5).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
6).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42°C )；
7).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；8).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；9).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。2、本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。3、本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測(cè)癌癥發(fā)生動(dòng)態(tài)過(guò)程，以及用于癌癥預(yù)防醫(yī) 學(xué)的檢測(cè)和篩選工具。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測(cè)癌胚蛋白標(biāo)志物，以及影像 醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上檢測(cè)EGFR異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢查及其 它檢查未發(fā)現(xiàn)占位性癌癥病灶之前，癌癥生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫塊之前，能 及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床癌癥病患一個(gè)真正的預(yù)后早期診斷。這樣 才有可能實(shí)施癌癥的早期診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治癌癥惡疾。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例中腎癌癥病人EGFR基因表達(dá)圖片。圖2是本發(fā)明實(shí)施例中胰腺癌癥病人EGFR基因表達(dá)圖片。圖3是本發(fā)明實(shí)施例中肺癌癥病人EGFR基因表達(dá)圖片。圖4是本發(fā)明實(shí)施例中正常人EGFR基因表達(dá)圖片。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標(biāo)記。試劑盒中的其它液體和
標(biāo)本組成如下
消化液100 μ 1/管1管/盒無(wú)色透明液體
保護(hù)液100 μ 1/管1管/盒無(wú)色透明液體
預(yù)雜交液1300 μ 1/ ,f 2管/盒無(wú)色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管/盒無(wú)色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管/盒無(wú)色透明液體
封閉液1000 μ 1/ ,f 1管/盒無(wú)色透明液體
堿性磷酸酶抗體ι μ 1/管1管/盒 無(wú)色透明液體
顯色劑A175 μ 1/ 管;1管/盒 黃色液體
顯色劑B320 μ 1/ 管;1管/盒 無(wú)色透明液體
緩沖液I 1Ox90ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液II 1Ox80ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液III 1Ox20m/瓶3瓶/盒 淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液IV 1Ox90ml/ 瓶1瓶/盒 淺黃色或無(wú)色透明液體
5
固定液90ml/瓶 1瓶/盒 無(wú)色透明液體陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本 6片/盒上述試劑成分說(shuō)明(所有試劑購(gòu)自SIGMA)1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保護(hù)液0. 2g的glycine加入Iml的1 X緩沖液I ；3、預(yù)雜交液=IX緩沖液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloki ng(購(gòu)買(mǎi)自羅氏公司)加入Iml IX緩沖液III ；5、IOx 緩沖液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2P042g加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、1Ox 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加 水至11，并高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高壓滅菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50_60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實(shí)施例2
一種EGFR基因原位雜交檢測(cè)方法及其試劑盒應(yīng)用一、標(biāo)本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細(xì)胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細(xì)胞分離液(血淋巴細(xì)胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細(xì)胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機(jī)制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標(biāo)本可保存在_20°C，或繼續(xù)做實(shí)驗(yàn)。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液III;4、10X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、取每位待檢者標(biāo)本兩張，(另外兩張留作復(fù)查用)及陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本兩張(每次 實(shí)驗(yàn)做一對(duì)陽(yáng)性對(duì)照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預(yù)熱10分鐘。放進(jìn)16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護(hù)液(保護(hù)液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過(guò)程都在玻璃缸進(jìn)行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標(biāo)本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥； 9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5ml IX緩沖液III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結(jié)果判斷在光鏡下計(jì)數(shù)100-300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染上紫色細(xì)胞的百分比。陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對(duì)照應(yīng)無(wú)色。地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克 服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過(guò)程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探 針與人體血液白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過(guò)檢測(cè)底物細(xì)胞中的EGFR 基因表達(dá)量，用來(lái)確定癌癥是否發(fā)生。臨床研究表明，EGFR基因是癌癥的特異基因，因?yàn)?EGFR基因在正常人中不表達(dá)，唯獨(dú)在癌表達(dá)，說(shuō)明癌癥已經(jīng)發(fā)生，用來(lái)確定癌癥是否發(fā)生， 或是正常。從而獲得癌癥的診斷信息。本發(fā)明實(shí)施例采樣為腎癌病人5名，胰腺癌病人5名，肺癌病人5名，正常對(duì)照組 5名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細(xì)胞)做原位雜交。結(jié)果表示，所有癌癥患 者EGFR基因有過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞染色；正常對(duì)照組EGFR基因不表達(dá)，細(xì)胞無(wú)染色。具體結(jié)果 請(qǐng)見(jiàn)圖1，圖2，圖3和圖4。實(shí)施例3用EGFR基因試劑盒檢測(cè)腎癌疾病與用VEGF基因試劑盒檢測(cè)腎癌疾病之間平行實(shí) 驗(yàn)。為了科學(xué)評(píng)價(jià)上述基因各自在腎癌疾病的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性。我們用平行試 驗(yàn)的方法，同時(shí)檢測(cè)上述基因的mRNA，檢測(cè)技術(shù)采用核酸原位雜交技術(shù)，用同一例腎癌疾病 患者的外周血，同時(shí)檢測(cè)EGFR基因和VEGF基因的mRNA(進(jìn)行核酸原位雜交、免疫組化染 色、鏡下記數(shù)、結(jié)果報(bào)告等均采用實(shí)施例1和實(shí)施例2的原位雜交技術(shù)的相同方法和步驟及 試劑)。發(fā)現(xiàn)EGFR基因在腎癌疾病病人中表達(dá)量比VEGF基因在同一疾病病人的表達(dá)量要 高。結(jié)果表明，EGFR基因?qū)δI癌疾病診斷的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性比VEGF基因更好，原位 雜交基因表達(dá)圖顯示，EGFR基因的表達(dá)量是70%，VEGF基因的表達(dá)量是50%。本發(fā)明的試 劑盒作于腎癌疾病診斷的指標(biāo)有非常重要的臨床意義。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司<120> 一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用<130>/
<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>5616<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1ccccggcgca gcgcggccgc agcagcctcc gccccccgca cggtgtgagc gcccgacgcg 60gccgaggcgg ccggagtccc gagctagccc cggcggccgc cgccgcccag accggacgac 120aggccacctc gtcggcgtcc gcccgagtcc ccgcctcgcc gccaacgcca caaccaccgc 180gcacggcccc ctgactccgt ccagtattga tcgggagagc cggagcgagc tcttcgggga 240gcagcgatgc gaccctccgg gacggccggg gcagcgctcc tggcgctgct ggctgcgctc 300tgcccggcga gtcgggctct ggaggaaaag aaagtttgcc aaggcacgag taacaagctc 360acgcagttgg gcacttttga agatcatttt ctcagcctcc agaggatgtt caataactgt 420gaggtggtcc ttgggaattt ggaaattacc tatgtgcaga ggaattatga tctttccttc 480ttaaagacca tccaggaggt ggctggttat gtcctcattg ccctcaacac agtggagcga 540attcctttgg aaaacctgca gatcatcaga ggaaatatgt actacgaaaa ttcctatgcc 600ttagcagtct tatctaacta tgatgcaaat aaaaccggac tgaaggagct gcccatgaga 660aatttacagg aaatcctgca tggcgccgtg cggttcagca acaaccctgc cctgtgcaac 720gtggagagca tccagtggcg ggacatagtc agcagtgact ttctcagcaa catgtcgatg 780gacttccaga accacctggg cagctgccaa aagtgtgatc caagctgtcc caatgggagc 840tgctggggtg caggagagga gaactgccag aaactgacca aaatcatctg tgcccagcag 900tgctccgggc gctgccgtgg caagtccccc agtgactgct gccacaacca gtgtgctgca 960
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一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)癌癥疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非 放射性標(biāo)記物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或31P 中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化酶或熒光素中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的 增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8.—種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其特征在于，所述的 雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
9.一種EGFR基因的原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時(shí)間為16-24小時(shí)，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或 組織細(xì)胞標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種EGFR表皮生長(zhǎng)因子受體基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種EGFR基因原位雜交檢測(cè)方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測(cè)癌癥疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101988112SQ20091005610
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日 公開(kāi)號(hào)200910056102.發(fā)明者張?jiān)聘? 裘建英 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司