專利名稱：一種柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白60基因及其克隆、表達(dá)與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種新的柔嫩艾美耳球蟲(E. tenella)熱激蛋白 (Heat shock proteins，HSPs)60 (Et HSP60)基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雞球蟲病是由艾美耳球蟲寄生于腸道所引起的一種危害嚴(yán)重的全球性寄生蟲病， 給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前控制球蟲病的主要方法包括化學(xué)藥物防治和疫苗免疫 預(yù)防，但由于這些方法存在安全、價(jià)格以及抗藥蟲株出現(xiàn)等問題，迫切需要尋找新的防治手 段來控制球蟲病。而研制高效安全的抗球蟲病基因工程疫苗和新藥物的關(guān)鍵在于尋找蟲體 抗原基因。本發(fā)明人以對(duì)雞危害最嚴(yán)重的柔嫩艾美耳球蟲(E. tenella)為研究對(duì)象，開展 了 E. tenella孢子生殖發(fā)育階段差異表達(dá)基因的分離、鑒定等研究，為探索雞球蟲的入侵 和生長發(fā)育機(jī)制，研制高效、安全的抗球蟲疫苗和新藥物奠定基礎(chǔ)。熱激蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是指所有原核生物和真核生物在生長發(fā) 育或受到不同理化及病理因素刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)新合成或表達(dá)量增加的一組蛋白質(zhì)家族，屬 非分泌型蛋白質(zhì)。熱激蛋白是物種種系發(fā)生中結(jié)構(gòu)和功能最為保守的一類蛋白質(zhì)，同時(shí)也 是分子伴侶(Molecular chaperone)中最重要的一類蛋白。熱激蛋白的主要生物學(xué)功能是 幫助相關(guān)蛋白質(zhì)的折疊(Folding)、移位(Translocation)、復(fù)性(Renaturation)和降解 (Degradation)，以保護(hù)生物體細(xì)胞免受內(nèi)外不良因素的損害。熱激蛋白能產(chǎn)生一系列相應(yīng) 的生理反應(yīng)，減緩細(xì)胞的損傷，其功能主要包括1)防止蛋白質(zhì)在受到物理或化學(xué)刺激時(shí) 產(chǎn)生沉淀；2)作為分子伴侶協(xié)助蛋白質(zhì)在細(xì)胞器之間轉(zhuǎn)運(yùn)；3)協(xié)助新生肽鏈折疊，并阻止 折疊時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤；4)作為DNA水解酶在堿基錯(cuò)配時(shí)協(xié)助修復(fù)DNA結(jié)構(gòu)；5)調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì) 的合成與功能，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育和分化；6)作為一種重要抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別，參與 抗原的加工和遞呈。熱激蛋白具有以下特點(diǎn)1)在熱休克狀態(tài)下優(yōu)勢表達(dá)，而其他蛋白表 達(dá)受抑制；2)在所有細(xì)胞中均表達(dá)；3)其氨基酸序列在進(jìn)化中高度保守；4)平時(shí)HSPs主要 存在于細(xì)胞質(zhì)中，應(yīng)激時(shí)HSPs迅速進(jìn)入細(xì)胞核和核仁，應(yīng)激恢復(fù)期又迅速進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，當(dāng) 再次應(yīng)激時(shí)HSPs又返回細(xì)胞核；5)HSPs可以提高抗應(yīng)激能力，HSP70生成量與細(xì)胞耐熱力 成正相關(guān)；6)在其基因啟動(dòng)子上游具有熱休克元件，能被特定的熱休克因子啟動(dòng)而表達(dá)。 HSPs在細(xì)胞內(nèi)的含量相當(dāng)高，約占細(xì)胞總蛋白的5%，其功能也涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持和更 新等。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)克隆的柔嫩艾美耳球蟲新熱激蛋白60 (Et HSP60)基因編碼的蛋白具有一個(gè)HSPs家族ClpB的保守結(jié)構(gòu)域(ClpB_D2-small)，且該基因編碼的氨基酸有 ATP結(jié)合位點(diǎn)(ATP binding site)，故其可能在ATP酶的水解過程中起到了重要作用，有分 子伴侶的功能。將測得的核苷酸序列結(jié)果與柔嫩艾美耳球蟲基因組測序網(wǎng)站QliMlZZll^ sanger. ac. uk. /proiects/E tenella/OmniBLAST)進(jìn)行同源性搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與柔 嫩艾美耳球蟲基因組的HSP基因有高度同源性。在GenBank中進(jìn)行Blast搜索，未發(fā)現(xiàn)與之比配的柔嫩艾美耳球蟲基因序列，表明該基因是柔嫩艾美耳球蟲的新基因，按其分子量 大小命名為Et HSP60基因。利用熒光定量PCR驗(yàn)證該基因在E.tenella不同發(fā)育階段蟲 體中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Et HSP60基因在子孢子發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù)最高，提示該蛋 白可能與柔嫩艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞有關(guān)。 HSP60在其他物種作為一種分子伴侶其重要的生物功能已日益引起人們的重視， 特別在保護(hù)免疫應(yīng)答的特異性靶標(biāo)上起重要作用。另外，HSP60在真菌、線粒體、葉綠體中 還協(xié)同HSPlO參與蛋白的折疊并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到其他的細(xì)胞器中。研究發(fā)現(xiàn)不同物種的HSP60 有高度保守性。由于HSP60在許多病原體傳染過程中都是一種免疫優(yōu)勢抗原，因此未來的 研究有可能會(huì)闡明HSP60在自身免疫發(fā)展中的作用，以及以HSP60為基礎(chǔ)的免疫治療發(fā)展 中的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究擴(kuò)增柔嫩艾美耳球蟲的一種新熱激蛋白 60 (EtHSP60)基因及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白60(EtHSP60)基因，該基因具有以下 序列TCAGATGTGCATTTAAGGCGATTTGAATAAGCTTGTGGGGGCCACGACTTTGGAAGAGTATAAACTCCACATTGAAAAGGACGCGGCCTTTTGCCGCCGCTTCCAGAACATCGTCGTGGAGGCGCCCAGCAAGGAGAAGGCCCTTTCAATCCTGCAAAG AGTGCGTCCGCACTACGAGCAGTTCCACCAGCTGGAAATCCCGGAAGAAGTGCTGGAGGCGGTGACGAACATGTCGGACCAGTACGTGAAGCAGCGGGCCTTTCCCGACAAGGCGCTGGACCTCCTCGACGAGTCTTGTTCTTGGAAACGCGTTTCCCACAACAAAAAAATAAATGTCCCCAACAAGCAGATCGCGCAGCTCAAGAAGAACAAGCTCCCCGAGGAAGAAGAGGAGCTGAAGAAACTGCAGGAGGAGTTGGCTGCTCTCGAGGCGCTCACTGCGGGGGGGCGGCGGCTGGTGCTGGAGACCAACGACGTGGCCCACATCTTGAGCCAGTGGACTGGAATCCCGATGGGCAAAATGACGGAAGACGAAGTCTCGCGGGTGTTGAGGCTCGCCGACATTTTGTCTCTGAGGGTTGTTGGACAAGACCGAGCAGTGAAGGCCGTGGCCGACGCGCTGGCTATTCAGCGCGCGGGGCTGAGTCCGAAGAACAAGCCGCTGGGCACTTTCCTGTTCCTGGGGTCTTC GGGGGTGGGCAAGACGGAGCTGGCGAAGGCGGTGGCCGAGGAAATGTTTGACTCTGAAAAGAACTTAATCAGACTGGACATGGTGGAATATCAAGAAGCCCACAGCATTTCGCGGCTGATCGGCCCGCCGCCGGGCTACATGGGCAACGACGAGGGCGGGCAGCTCACGGAGGCCGTGCGCCAAAAGCCCCACAGCGTGGTGTTGTTCGACGAAGTCGAAAACGCGCACAAGAACTTGTGGTCTTTGCTGCTGCCGATGCTGGACGAGGGCCACCTGTCGGACTCGAAGGGAAACCGGGTGGACTTTACGAATTGTTTGATAATTTTGACTTCCAATATTGGCCAGCAGTACATTTTGGACAGTTACAAGGAAGTGCGGGCGCTGACGGCTGGCAACGAGAAGGACAAGGCCAGCAGCAACGGCAGCAGCAGCAGCAACGGCGAAGAGCCCGGCAAGTCCTCCTTCAAAGGCACGGGCAAATCCCCCAAAGACATTCTCCGGAGAATGCGCCAGAAGGTTCTTAAGGA
GGTCTTCGGCTACTTCAAGCCGCAGGTCATCGGCAGGATGAGCGAGATCATCATATTTGAGCCTCTGGGGGAAACCGCCATGAAGGGGGTTTTGAACTTGAAGCTTTCGGCGCTGCGGAACAGTTTAGCAGCAAAAGGAATTGACTTCAAAGTCGCCGACTCCGCCCTGGGCTACATCTTGGAAAGGGCCTGGTCCCACAAGTTCGGAGGCCGCAGAATGGCCAAGTACCTGGAGAAGTACATAAAGCCCCGAGTGGCGCCGCTTTTGATTTCCGGCAAACTCAAGGCGGGAGACAGAGCCGTCTTGGCGCGCTCCAACACAAACCCCAATCAGCTCAACTTGATTGTGTGCGAGCTGAACGAAGAAGGCGTTTGCAAGCCGGGAACGAAGTACGGCACGAAGCTGGTCACGCAGGAAGTGAAGCCGCAGGACGGAAACGAGGATGAAGAGGACGCAATGGACTAGCAAAAGAATTAAAAGCATTTAAAACATTTAAATGATGCTTTTTATCCCTGGAAAGCGGAGAGA
CAAAGTGAGGAAATGAGGACGGAGCTCCCGTTTTTGGCTACCGTGAGGCAACTGA所述MS為起始密碼子；IM為終止密碼子。本發(fā)明以柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊為驅(qū)動(dòng)組，子孢子為實(shí)驗(yàn)組，利用抑制性消 減雜交技術(shù)構(gòu)建了子孢子的消減cDNA文庫。從構(gòu)建好的消減cDNA文庫中挑選了 1056 個(gè)克隆，制作了 cDNA微陣列(芯片)，將柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊和子孢子的總RNA 制備探針，分別用cy3和cy5標(biāo)記，通過芯片雜交、篩選獲得了柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白 60 (EtHSP60)基因的EST序列。利用RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)技術(shù)首次克隆到了編 碼柔嫩艾美耳球蟲的一種新熱激蛋白60(Et HSP60)基因，含有一個(gè)完整的開放閱讀框 (ORF)，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測，該基因在子孢子階段高表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒 (pET28a(+)-Et HSP60)，在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，純化了重組表達(dá)蛋白，并對(duì)表達(dá)的重組 蛋白進(jìn)行了抗原性的鑒定。本發(fā)明的另一目的是提供了一種柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白60(Et HSP60)基因的 克隆和表達(dá)。該方法包括下列步驟(1)試劑與材料Trizol、GeneRace Kit 購自 Invitrogen 公司；TaKaRa Agarose Gel DNA PurificationKit、限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司；pGEM-T-easy vector購自 Promega公司；DEPC、X_Gal、Tag Plus I DNA聚合酶購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司； bacto-yeast extract、AgarA> bacto-tryptone 為 0X0ID 公司產(chǎn)品。丙烯酰胺、N, N ‘-亞 甲基甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨購自Sigama公司；HRP-羊抗兔IgG3購自上海英基 生物科技有限公司；HRP-羊抗雞IgG購自SouthernBiotech公司；蛋白質(zhì)預(yù)染Marker購自 Fermentas ^w] ；High-affinity Ni-NTA Resin ^ g GenScriptCorporation Γ ^a, DNA Marker和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量購自天根生化科技(北京)有限公司。羅曼優(yōu)質(zhì)黃羽雞，購自上海匯中種雞場，出殼后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，籠具、飼料、飲水 等均經(jīng)嚴(yán)格消毒。柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊，編號(hào)CAAS 21111601，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所保存提供。pET28a(+)表達(dá)載體、大腸桿菌T0P10、大腸桿菌BL21(DE3)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上 海獸醫(yī)研究所保存提供，這些菌種都是已公開、常規(guī)使用的。(2)方法
①cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)引物的合成利用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)和cDNA微陣列技術(shù)篩選柔嫩艾美耳球蟲 (E. tenella)孢子發(fā)育階段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子)蟲體差異表達(dá)基因，獲得 了子孢子階段蟲體高表達(dá)基因克隆ZB2-D07。根據(jù)其EST (表達(dá)序列標(biāo)簽)序列，設(shè)計(jì)了 3’ 和5’ RACE引物(引物由上海賽百盛生物有限公司合成)。3’ Primer5’ -TCAGACTGGACATGGTGGAATATCAA-3’3’ Nested Primer 5’ -AGCGTGGTGBTTGTTCGACGAAGT-3’5’ Primer5’ -CTTCACTGCTCGGTCTTGTCCAACA-3’5’ Nested Primer 5’ -CGCGAGACTTCGTCTTCCGTCATT-3’ ；②cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)產(chǎn)物的擴(kuò)增具體步驟按GeneRacer 試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。將擴(kuò)增獲得的RACE產(chǎn)物克隆到 pGEM-T-easy載體中，挑選陽性克隆，進(jìn)行測序(上海英俊生物技術(shù)有限公司)。根據(jù)測序 結(jié)果查找3’和5' RACE產(chǎn)物序列與原EST序列的重疊部分，將三段序列拼接。③含完整開放閱讀框(ORF)全長基因的克隆根據(jù)拼接的cDNA序列設(shè)計(jì)上下游引物，進(jìn)行含ORF cDNA片斷的PCR擴(kuò)增。上游引物5，-CAGATGTGCATTTAAGGCGATTTGA-3‘下游引物5，-CAGTTGCCTCACGGTAGCCA-3，以RACE擴(kuò)增時(shí)mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件 940C 3min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 2min,30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 擴(kuò)增獲得的 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 純化后與pGEM-T-easy載體連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒(命名為pGEM_T_Et HSP60)轉(zhuǎn)化T0P10 感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行蘭白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的單菌 落送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。④生物信息學(xué)分析利用在線軟件 ORF finder (http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/Rorf/Rorf. html)分 析獲得的新基因的全長cDNA序列，找出編碼框。利用ProtParam工具(http://cn. expasy. orR/tools/protparam. html)計(jì)算編碼蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等。利 用北京大學(xué)生物信息學(xué)中心WebLab中提供的Antigenic程序(http//Veblab. cbi. pku. edu. cn/program. inputForm. do ？ program = antigenic)分析其抗原位點(diǎn)。禾丨J用 Singal P3. 0 在線分析軟件(http://www, cbs. dtu. dk/services/SinRnalP/)分析編碼蛋白有無信 號(hào)月太。ProtScale 在線分析軟件(http//www, expasy. org/cgi-bin/protscale. pi)分析 編碼蛋白的疏水性。利用 TMHMM 服務(wù)器(http //www, cbs. dtu. dk/services/TMHMM-2. 0/) 分析編碼蛋白有無跨膜結(jié)構(gòu)。BLASTp軟件(http://www, ncbi. nlm. nih. rov/BLAST/)以 及 FASTA 軟件(http://www, ebi. ac. uk/fasta33)用于同源蛋白的搜索，利用 CDD(http:// www, ncbi. nlm. nih. Rov/Structure/cdd/cdd. shtml)軟件查詢 NCBI 保守區(qū)的功能域數(shù)據(jù) 庫，查詢有無保守功能域。利用 motif scan (http //myhits. isb-sib. ch/cRi-bin/motif scan),分析功能結(jié)構(gòu)域。⑤熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR 利用Real-time PCR對(duì)獲得的柔嫩艾美耳球蟲熱擊蛋白60 (EtHSP60)基因在生活 史不同發(fā)育階段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、裂殖子)的表達(dá)情況進(jìn)行分析，選擇柔嫩艾美耳球蟲的看家基因18s rRNA作為內(nèi)參。首先提取柔嫩艾美耳球蟲未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子的總RNA，去除基因 組DNA后，利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，EtHSPBO基因定量PCR的引物為Sense Primer 5' -GCTGGCAACGAGAAGGAC-3‘，Antisense Primer 5' -GACCTGCGGCTTGAAGTAG-3‘18S rRNA 的引物為 Sense Primer 5' -TGTAGTGGAGTCTTGGTGATTC-3‘，Antisense Primer 5' -CCTGCTGCCTTCCTTAGATG-3‘采用SYBR Green I熒光染料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)體系20 μ L 10 μ mol/L上 游引物0.8口1^，10口11101/1下游引物0.8口1^25\3￥81 Green I 10 μ L, Easy dilutiobn 8. 2 μ L，模板(cDNA) 1. 0μ L0 反應(yīng)條件:95 V 90s ； 95 °C 5s, 58 °C 30s, 80 °C 10s,40 個(gè)循環(huán)， 其中58°C 30s結(jié)束時(shí)間點(diǎn)為熒光信號(hào)檢測點(diǎn)。蟲體的每個(gè)發(fā)育階段做3個(gè)樣本重復(fù)，每個(gè) 樣本做3次技術(shù)重復(fù)。⑥重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEM-T-Et HSP60，利用克隆載體pGEM-T-easy載體和 表達(dá)載體pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)，選擇合適的酶BamH I和Not I進(jìn)行雙酶切，酶切后回 收Et HSP60片段和pET28a(+)片段，連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒(pET28a (+) _EtHSP60)，連接后 轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽性克隆的鑒定(PCR鑒定和雙酶切鑒定)，對(duì)篩選的 陽性克隆提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。⑦重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a (+) -Et HSP60在大腸桿菌中的表達(dá)將鑒定好的pET28a(+)_Et HSP 60/BL21(DE3)轉(zhuǎn)化菌接種于液體LB (含卡那青霉 素)培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)過夜的菌液按的比例接種到另一 LB (含卡那青 霉素)液體培養(yǎng)基中，37°C，200r/min，振蕩培養(yǎng)2h-3h，使細(xì)菌生長至對(duì)數(shù)生長期，0D600 = 0. 6-1. 0時(shí)，加入終濃度為ImmoL/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在加入IPTG誘導(dǎo)后0h，2h，4h，6h，8h， 10h, 12h分別收集菌體，應(yīng)用SDS-PAGE分析菌體蛋白，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量在誘 導(dǎo)6h即達(dá)到高峰。Et HSP60基因的ORF含1455個(gè)核苷酸，編碼484個(gè)氨基酸，理論分子量 為53. 5kDa，采用His基因融合表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)目的基因進(jìn)行高效表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白帶有 分子量為3. 5kDa的His標(biāo)簽，則重組質(zhì)粒pET28a(+)_Et HSP表達(dá)的重組蛋白分子量大約 為57kDa，SDS-PAGE電泳結(jié)果與預(yù)期的大小一致。⑧重組蛋白的分離純化根據(jù)確定的最佳誘導(dǎo)時(shí)間，將重組質(zhì)粒pET28a(+)_Et HSP60轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 后，加入終濃度為ImmoL/L IPTG，于37°C搖床振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，當(dāng)表達(dá)量達(dá) 到高峰時(shí)，離心，收集菌體，確定重組表達(dá)蛋白以可溶形式存在，還是以包涵體形式存在，利 用His Resin (樹脂)純化重組表達(dá)蛋白。由于pET28a(+)-EtHSP60表達(dá)載體在起始密碼 子之后有His標(biāo)記，可利用His Resin親和層析柱將目的蛋白吸附，將結(jié)合在柱上的融合蛋 白洗脫下來，從而達(dá)到分離純化重組蛋白的目的。pET28a(+)-Et HSP60重組表達(dá)菌經(jīng)超聲 裂解后，離心，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體形式 存在。采用包涵體蛋白純化技術(shù)，將包涵體蛋白溶解于8mmoL/L尿素中，經(jīng)透析后復(fù)性融合 蛋白，再利用His柱純化重組蛋白pET28a(+)-Et HSP60, SDS-PAGE分析表明獲得了較高純 度的重組蛋白。
⑨Western-blot檢測重組表達(dá)蛋白將純化的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用柔嫩艾美耳球蟲卵 囊口服免疫雞的抗血清(pET28a(+)/BL21大腸桿菌裂解液吸附處理后)作為一抗，辣根過 氧化酶標(biāo)記的羊抗雞IgG為二抗進(jìn)行Western-blot檢測分析。本發(fā)明的柔嫩艾美耳球蟲一種新熱激蛋白60(Et HSP60)基因的克隆及生物信息 學(xué)分析如下本試驗(yàn)利用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)和cDNA微陣列技術(shù)篩選柔嫩艾美耳球蟲 子孢子階段蟲體差異表達(dá)基因，獲得了一個(gè)克隆號(hào)為ZB2-D07基因的EST序列，利用RACE 技術(shù)對(duì)EST序列進(jìn)行了 3’和5’端的延伸擴(kuò)增，將獲得的3’和5’端RACE擴(kuò)增產(chǎn)物測序后 與EST序列拼接得到了 一個(gè)2356bp的DNA片段，進(jìn)一步利用PCR技術(shù)獲得了 一個(gè)1802bp的 cDNA (見

圖1)，該基因含一個(gè)1455bp的開放閱讀框，編碼484個(gè)氨基酸。利用NCBI網(wǎng)站的 Blast在線分析發(fā)現(xiàn)該序列與已知的柔嫩艾美耳球蟲基因無明顯同源性。利用NCBI的CDD 程序?qū)υ摶蚓幋a的氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示該基因編碼的氨基酸具有一 個(gè)HSPs家族ClpB的保守結(jié)構(gòu)域(ClpB_D2-small)，將測得的核苷酸序列結(jié)果與E. tenella 基因組測序網(wǎng)站(http //www, sanger. ac. uk. /proiects/E tenella/OmniBLAST)進(jìn)行同 源性搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與E. tenella基因組的HSP基因有高度同源性。在GenBank中 進(jìn)行Blast搜索，未發(fā)現(xiàn)與之比配的E. tenella基因序列，表明該基因是E. tenella的新基 因，按其分子量大小命名為Et HSP60基因。；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白具有2個(gè)酰胺化位 點(diǎn)、1個(gè)N端糖基化位點(diǎn)、1個(gè)ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化 位點(diǎn)、4個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)N端豆蔻?；稽c(diǎn)、10個(gè)PKC磷酸化位點(diǎn)、1個(gè) 酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)核定位序列(NLS)和1個(gè)NACHT結(jié)構(gòu)域(見表1)。表1編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析
權(quán)利要求
一種柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白60基因，其特征在于所述柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白60基因具有以下序列TCAGATGTGCATTTAAGGCGATTTGAATAAGCTTGTGGGGGCCACGACTTTGGAAGAGTATAAACTCCACATTGAAAAGGACGCGGCCTTTTGCCGCCGCTTCCAGAACATCGTCGTGGAGGCGCCCAGCAAGGAGAAGGCCCTTTCAATCCTGCAAAGAGTGCGTCCGCACTACGAGCAGTTCCACCAGCTGGAAATCCCGGAAGAAGTGCTGGAGGCGGTGACGAACATGTCGGACCAGTACGTGAAGCAGCGGGCCTTTCCCGACAAGGCGCTGGACCTCCTCGACGAGTCTTGTTCTTGGAAACGCGTTTCCCACAACAAAAAAATAAATGTCCCCAACAAGCAGATCGCGCAGCTCAAGAAGAACAAGCTCCCCGAGGAAGAAGAGGAGCTGAAGAAACTGCAGGAGGAGTTGGCTGCTCTCGAGGCGCTCACTGCGGGGGGGCGGCGGCTGGTGCTGGAGACCAACGACGTGGCCCACATCTTGAGCCAGTGGACTGGAATCCCGATGGGCAAAATGACGGAAGACGAAGTCTCGCGGGTGTTGAGGCTCGCCGACATTTTGTCTCTGAGGGTTGTTGGACAAGACCGAGCAGTGAAGGCCGTGGCCGACGCGCTGGCTATTCAGCGCGCGGGGCTGAGTCCGAAGAACAAGCCGCTGGGCACTTTCCTGTTCCTGGGGTCTTCGGGGGTGGGCAAGACGGAGCTGGCGAAGGCGGTGGCCGAGGAAATGTTTGACTCTGAAAAGAACTTAATCAGACTGGACATGGTGGAATATCAAGAAGCCCACAGCATTTCGCGGCTGATCGGCCCGCCGCCGGGCTACATGGGCAACGACGAGGGCGGGCAGCTCACGGAGGCCGTGCGCCAAAAGCCCCACAGCGTGGTGTTGTTCGACGAAGTCGAAAACGCGCACAAGAACTTGTGGTCTTTGCTGCTGCCGATGCTGGACGAGGGCCACCTGTCGGACTCGAAGGGAAACCGGGTGGACTTTACGAATTGTTTGATAATTTTGACTTCCAATATTGGCCAGCAGTACATTTTGGACAGTTACAAGGAAGTGCGGGCGCTGACGGCTGGCAACGAGAAGGACAAGGCCAGCAGCAACGGCAGCAGCAGCAGCAACGGCGAAGAGCCCGGCAAGTCCTCCTTCAAAGGCACGGGCAAATCCCCCAAAGACATTCTCCGGAGAATGCGCCAGAAGGTTCTTAAGGAGGTCTTCGGCTACTTCAAGCCGCAGGTCATCGGCAGGATGAGCGAGATCATCATATTTGAGCCTCTGGGGGAAACCGCCATGAAGGGGGTTTTGAACTTGAAGCTTTCGGCGCTGCGGAACAGTTTAGCAGCAAAAGGAATTGACTTCAAAGTCGCCGACTCCGCCCTGGGCTACATCTTGGAAAGGGCCTGGTCCCACAAGTTCGGAGGCCGCAGAATGGCCAAGTACCTGGAGAAGTACATAAAGCCCCGAGTGGCGCCGCTTTTGATTTCCGGCAAACTCAAGGCGGGAGACAGAGCCGTCTTGGCGCGCTCCAACACAAACCCCAATCAGCTCAACTTGATTGTGTGCGAGCTGAACGAAGAAGGCGTTTGCAAGCCGGGAACGAAGTACGGCACGAAGCTGGTCACGCAGGAAGTGAAGCCGCAGGACGGAAACGAGGATGAAGAGGACGCAATGGACTAGCAAAAGAATTAAAAGCATTTAAAACATTTAAATGATGCTTTTTATCCCTGGAAAGCGGAGAGACAAAGTGAGGAAATGAGGACGGAGCTCCCGTTTTTGGCTACCGTGAGGCAACTGA所述ATG為起始密碼子；TAG為終止密碼子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白60基因，其特征在于所述基因全長1802bp，含1455bp的開放閱讀框，編碼484個(gè)氨基酸；所述基因編碼的氨基酸具有一 個(gè)HSPs家族ClpB的保守結(jié)構(gòu)域，與E. tenella基因組的HSP基因有高度同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白60基因，其特征在于所述基 因具有2個(gè)酰胺化位點(diǎn)、lfN端糖基化位點(diǎn)、1個(gè)ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)cAMP和cGMP依 賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)N端豆蔻?；稽c(diǎn)、10個(gè) PKC磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)核定位序列和1個(gè)NACHT結(jié)構(gòu)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白60基因，其特征在于所述基因 的蛋白N-端不具有信號(hào)肽，也無跨膜結(jié)構(gòu)；在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為41. 86，高于域值40， 在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定；脂肪族指數(shù)90. 68，總親水性-0. 430，蛋白質(zhì)總體疏水性較高。
5.一種如權(quán)利要求1所述柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白60基因的克隆和表達(dá)方法，其特征 在于該方法包括下列步驟(1)試劑與材料Trizol、GeneRace Kit ；TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit、限制性內(nèi)切酶； pGEM-T-easy vector ;DEPC、X_Gal、Tag Plus I DNA 聚合酶；bacto-yeastextract、AgarA、 bacto-tryptone ；丙烯酰胺、N，N ‘_亞甲基甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨；HRP-羊抗 兔IgG3 ；HRP-羊抗雞IgG ；蛋白質(zhì)預(yù)染Marker ；High-AffinityGST Resin ；羅曼優(yōu)質(zhì)黃羽 雞；柔嫩艾美耳球蟲；pET28a(+)表達(dá)載體、大腸桿菌T0P10、大腸桿菌BL21DE3 ；(2)方法①柔嫩艾美耳球蟲子孢子的收集從4°C冰箱取出保存的柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊，室溫離心，洗去重鉻酸鉀溶液后， 計(jì)數(shù)孢子化卵囊的數(shù)量，按孢子化卵囊5X IO4個(gè)/羽經(jīng)口感染2周齡無球蟲雛雞。接種后 第8天分別收集盲腸和糞便中的卵囊。收集的未孢子化卵囊在適宜的條件下培養(yǎng)成孢子化 卵囊。孢子化卵囊用玻璃勻漿器破碎卵囊壁后，在胰酶好雞膽汁的消化下，釋放出子孢子， 利用G3和G4砂芯漏斗再純化出子孢子。純化的子孢子保存液氮備用；②柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA的提取取液氮中凍存的柔嫩艾美耳球蟲子孢子，按Trizol試劑說明書進(jìn)行總RNA的提?。虎踓DNA末端快速擴(kuò)增引物的合成和RACE產(chǎn)物的擴(kuò)增利用抑制性消減雜交技術(shù)和cDNA微陣列技術(shù)篩選柔嫩艾美耳球蟲孢子發(fā)育階段的未 孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子蟲體差異表達(dá)基因，獲得子孢子階段蟲體高表達(dá)基因克隆 ZB2-D07、根據(jù)其表達(dá)序列標(biāo)簽序列，設(shè)計(jì)了 3’和5’ RACE引物3' Primer5' -TCAGACTGGACATGGTGGAATATCAA-3'3’ Nested Primer 5’ -AGCGTGGTGBTTGTTCGACGAAGT-3’5' Primer5' -CTTCACTGCTCGGTCTTGTCCAACA-3'5’ Nested Primer 5’ -CGCGAGACTTCGTCTTCCGTCATT-3’ ；利用合成的引物進(jìn)行RACE產(chǎn)物的擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得的RACE產(chǎn)物克隆到pGEM-T-easy載 體中，挑選陽性克隆，進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果查找3’和5’ RACE產(chǎn)物序列與原EST序列的 重疊部分，將三段序列拼接；④含完整開放閱讀框全長基因的克隆根據(jù)拼接的cDNA序列設(shè)計(jì)上下游引物，進(jìn)行含ORF cDNA片斷的PCR擴(kuò)增；上游引物5’ -CAGATGTGCATTTAAGGCGATTTGA-3’下游引物5，-CAGTTGCCTCACGGTAGCCA-3，以RACE擴(kuò)增時(shí)mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件 940C 2min ；94°C 30s, 52°C 40s, 72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin ；擴(kuò)增獲得的 PCR產(chǎn)物經(jīng)純 化后與pGEM-T-easy載體連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEM-T_EtHSP60轉(zhuǎn)化TOP 10感受態(tài)細(xì)胞， 進(jìn)行蘭白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)鑒定正確的陽性菌落測序；⑤生物信息學(xué)分析利用在線軟件ORF finder分析獲得的新基因的全長cDNA序列，找出編碼框； ProtParam工具計(jì)算編碼蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成；Antigenic程序分析 其抗原位點(diǎn)；利用Singal P3.0在線分析軟件分析編碼蛋白有無信號(hào)肽；ProtScale在線分 析軟件分析編碼蛋白的疏水性；利用TMHMM服務(wù)器分析編碼蛋白有無跨膜結(jié)構(gòu)；BLASTp軟 件以及FASTA軟件用于同源蛋白的搜索；利用CDD軟件查詢NCBI保守區(qū)的功能域數(shù)據(jù)庫， 查詢有無保守功能域；利用motif_SCan分析功能結(jié)構(gòu)域；⑥熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR利用Real-time PCR對(duì)獲得的柔嫩艾美耳球蟲熱擊蛋白60 (EtHSP60)基因在生活史不 同發(fā)育階段未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、裂殖子的表達(dá)情況進(jìn)行分析，選擇柔嫩艾 美耳球蟲的看家基因18s rRNA作為內(nèi)參，首先提取柔嫩艾美耳球蟲未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子的總RNA，去除基因組 DNA后，利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，EtHSPBO基因定量PCR的引物為Sense Primer 5' -GCTGGCAACGAGAAGGAC-3‘，Antisense Primer 5' -GACCTGCGGCTTGAAGTAG-3‘18S rRNA 的引物為 Sense Primer 5' -TGTAGTGGAGTCTTGGTGATTC-3‘，Antisense Primer 5' -CCTGCTGCCTTCCTTAGATG-3‘采用SYBR Green I熒光染料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)體系20 μ L 10 μ mol/L上游 引物 0. 8yL，10ymol/L 下游引物 0. 8yL，25XSYBR Green I 10 μ L，Easy di lutiobn 8. 2 μ L，模板 cDNAl. 0μ L0 反應(yīng)條件:95V 90s ；95°C 5s, 58°C 30s, 80°C 10s, 40 個(gè)循環(huán)，其 中58°C 30s結(jié)束時(shí)間點(diǎn)為熒光信號(hào)檢測點(diǎn)。蟲體的每個(gè)發(fā)育階段做3個(gè)樣本重復(fù)，每個(gè)樣 本做3次技術(shù)重復(fù)；⑦重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEM-T-Et HSP60,利用克隆載體pGEM-T-easy和表達(dá)載體 pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)，選擇合適的限制性內(nèi)切酶Bam HI和Not I進(jìn)行雙酶切，酶切后回 收Et HSP和pET28a (+)片段，連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a (+) _EtHSP60，連接后轉(zhuǎn)化大 腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽性克隆的鑒定，對(duì)篩選的陽性克隆提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸 桿菌 BL21DE3。⑧重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+) -Et HSP60在大腸桿菌中的表達(dá)將鑒定好的pET28a(+)-Et HSP60/BL21 (DE3)轉(zhuǎn)化菌接種于液體LB含卡那霉素培養(yǎng) 基，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)過夜的菌液按1 %的比例接種到另一 LB含卡那霉素液體培 養(yǎng)基中，37°C，200r/min，振蕩培養(yǎng)2h_3h，使細(xì)菌生長至對(duì)數(shù)生長期，0D600 = 0. 6-1. 0時(shí)， 加入終濃度為ImmoL/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在加入IPTG誘導(dǎo)后0h，2h，4h，6h，8h，IOh分別收集菌體，應(yīng)用SDS-PAGE分析菌體蛋白，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間；⑨重組蛋白的分離純化根據(jù)確定的最佳誘導(dǎo)時(shí)間，將重組質(zhì)粒pET28a(+)-Et HSP60轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后，加 入終濃度為ImmoL/L IPTG，于37°C搖床振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，當(dāng)表達(dá)量達(dá)到高峰 時(shí)，離心，收集菌體，確定重組表達(dá)蛋白以可溶形式存在，還是以包涵體形式存在，利用His Resin純化重組表達(dá)蛋白；⑩Western-blot檢測重組表達(dá)蛋白將純化的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用柔嫩艾美耳球蟲卵囊口 服免疫雞的抗血清經(jīng)pET28a(+)/BL21大腸桿菌裂解液吸附處理后作為一抗，辣根過氧化 酶標(biāo)記的羊抗雞IgG為二抗，進(jìn)行Western-blot檢測分析。
6. 一種如權(quán)利要求1所述柔嫩艾美耳球蟲熱激蛋白60基因在制備抗雞球蟲病藥物或 抗雞球蟲病疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)的一種新熱激蛋白60(Et HSP60)基因，克隆號(hào)ZB2-D07，全長1802bp，含有一個(gè)1455bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼484個(gè)氨基酸(Genbank登錄號(hào)FJ911605)。本發(fā)明將該基因連接到原核表達(dá)載體pET28a(+)，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a(+)-Et HSP60，并在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。通過純化重組蛋白pET28a(+)-Et HSP60進(jìn)行SDS-PAGE，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用E.tenella卵囊口服免疫雞的抗血清作為一抗，羊抗雞IgG作為二抗進(jìn)行Western-blot分析，表明它有一定的抗原性，能用于制備抗雞球蟲病藥物和制備抗雞球蟲病疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/30GK101988069SQ20091005572
公開日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者周杰, 姜連連, 平憲卿, 李洋, 董輝, 趙其平, 郭濤, 韓紅玉, 顏彥, 黃兵 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所