專利名稱：重組人淀粉樣多肽Aβ42的簡易可溶性表達純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及疏水性多肽的可溶性表達和純化等技術，具體涉及重組人淀粉樣多肽A β 42的可溶性表達、純化及鑒定等技術。
背景技術：
阿茲海默病(Alzheimer' s disease，簡稱AD)又稱老人癡呆癥，全世界有2400萬 病患，是一種持續(xù)性神經(jīng)功能障礙。最顯著的早期癥狀為健忘，通常表現(xiàn)為逐漸增加的短期 記憶缺失，而長期記憶則相對不受病情的影響。隨著病情的加重，病人的語言能力，空間辨 別能力，認知能力會逐步衰退。隨著人們生活水平的不斷提高，社會趨于老齡化，阿爾茨海 默氏已成為重要的死亡原因。疾病的成因未明，目前沒有準確診斷和有效治療的方法。目 前，該疾病的病因和治療方法已成為世界范圍內(nèi)研究人員關注的焦點。老年癡呆癥的致病機理目前尚不完全清楚，但普遍接受的觀點是，它與蛋白質(zhì)錯 誤折疊而導致的淀粉樣蛋白聚集沉淀密切相關。1984年Glermer首先從AD患者腦脊液中 成功分離出相對分子量約為4. 2kD的淀粉樣多肽，并測定了其序列，由于其結(jié)構(gòu)中含大量 β-sheet片層，故稱其為β-淀粉樣多肽(i3-amyloid，Ai3)。老年癡呆癥的主要特征在病 理學上顯示出腦組織萎縮、大腦皮質(zhì)出現(xiàn)老年斑等現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)老年斑是A β淀粉樣蛋 白的沉積所造成。早期的研究認為，根據(jù)Αβ淀粉樣蛋白的形成機制及影響因素，設計方案 防止淀粉樣蛋白沉積，并清除已形成的斑塊，就可以達到預防和治療老年癡呆癥，然而，最 近的老年斑清除藥物的臨床實驗數(shù)據(jù)表明，老年斑的清除并沒有明顯改善病癥、延長壽命 真正對神經(jīng)細胞起損傷作用的是寡聚的Aβ蛋白。Αβ多肽來源于β-淀粉樣蛋白前體蛋白(β-amyloid precursor protein, APP)，APP經(jīng)β-及Y-分泌酶酶切生成的一種小肽。該小肽包含39-43個氨基酸殘基，具 有很強的疏水性，由42個殘基組成的A β 42被認為是最容易折疊的，因此A β 42也被認為 是產(chǎn)生老年斑的主要因素。當Αβ 42發(fā)生聚集時，寡聚體和聚集體可能會引起蛋白質(zhì)和脂 質(zhì)等生物大分子的氧化，最終引發(fā)神經(jīng)元的凋亡。因此，Αβ42多肽成為老年癡呆癥致病機 理和相應治療藥物開發(fā)等研究的焦點?，F(xiàn)在，有許多基于抗氧化性和清除金屬離子來抑制A β蛋白聚集的方法來開發(fā)新 藥物的，但是這些藥物是否對改善癥狀有效還不得而知。有些天然藥物，長期以來一直作為 中醫(yī)治療老年癡呆癥的必需配藥，如姜黃素、兒茶酚等。有資料報道，印度人老年癡呆癥發(fā) 病率較其他地區(qū)偏低，可能與他們長期以姜黃為食用佐料有關。這類天然藥物有效成分多 為具有共軛烯酮或酚酮結(jié)構(gòu)的分子，有較強對金屬離子的絡合能力。人們以Αβ蛋白作為 研究對象來探索可能的致病因素、尋找可能的藥物，所以有關Αβ的研究首先需要獲得高 純度A β多肽。由于A β 42多肽C末端33-42位氨基酸殘基具有很高的疏水性，直接溶解于水溶 液的Αβ42多肽溶解后容易發(fā)生聚集，形成不可溶性的沉淀物，這給其合成與純化造成了 困難。目前，研究及臨床中應用的高純度Aβ通常是采用化學合成的和基因重組生物合成兩種，但是化學合成方法產(chǎn)率較低、成本昂貴，基因重組表達的方法則難以可溶性表達目標蛋白、效率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組人淀粉樣多肽Αβ42的可溶性表達方法。本發(fā)明提供了一種重組人淀粉樣多肽Αβ 42的簡易可溶性表達純化方法，包括重 組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選、表達與純化，步驟如下(1)將6His-SUMO_Ai3 42融合基因的核苷酸編碼序列插入表達載體的多克隆位 點，獲得重組表達載體質(zhì)粒；(2)將(1)獲得的重組表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株，得到能與分子伴侶 共表達的A β 42原核表達菌株；(3)誘導SUMO-Αβ 42融合蛋白和分子伴侶的表達，過柱純化。本發(fā)明中，6His-SUMO-A β 42融合基因可以通過化學合成方法獲得，即跟據(jù)其編碼 序列，用人工合成方法獲得。例如根據(jù)SEQ ID NO 3的序列，將核苷酸分子逐個連接，獲得 序列如SEQ ID NO 3的DNA分子。6個組氨酸殘基(His)可以簡化SUMO-A β 42融合蛋白的純化，有利于目標多肽 A β 42的提純。SUMO即酵母小分子泛素相關修飾蛋白。由于SUMO蛋白具有幫助目標蛋白可溶性 表達的功能，所以，利用該表達載體可以實現(xiàn)疏水性多肽和蛋白質(zhì)的可溶性表達，可以用于 難以化學合成的多肽和蛋白質(zhì)的基因重組合成，也可用于具有生物活性、以天然構(gòu)象存在 的基因工程多肽和蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)。此外，SUMO融合蛋白經(jīng)酶切后可以得到不多含一個 氨基酸的目的多肽，可以避免傳統(tǒng)的用GST融合蛋白加Thrombin酶切位點無法得到不多含 一個氨基酸的目的多肽的缺點。本發(fā)明中，所述的表達載體是pET21b。也可以采用類似的大腸桿菌表達載體。本發(fā)明中，所述的表達菌株是E coli.BL21(DE3)-groES-groEL-tig。本發(fā)明中，所述的分子伴侶是groES-groEL-tig。分子伴侶技術是提高目標蛋白可 溶性表達的常用手段。本方法中，我們選用groES-groEL-tig(Tf2)這一分子伴侶系統(tǒng)，大 大的提高了 SUMO-A β 42融合蛋白的可溶性表達量。本發(fā)明使用異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達。本發(fā)明中，所述的過柱純化分為兩步細胞破碎后先過親和層析柱進行純化，然后 再用Superdex 200分子篩柱進一步純化并得到目的多肽A β 42。本發(fā)明中，可以將所得的重組人淀粉樣多肽Αβ 42通過Tricine-SDS-PAGE電泳或 者MALDI-T0F-T0F(基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜)方法進行鑒定。本發(fā)明還提供了一種重組人淀粉樣多肽Αβ42的表達載體，該表達載體是將 6His-SUMO-A β 42融合基因的核苷酸編碼序列插入表達載體pET21b的多克隆位點獲得的， 稱為pET21b-SUM0/A3 42。其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。具體而言，本發(fā)明重組人淀粉樣多肽Αβ42的可溶性表達及純化，包括可溶 性表達載體的構(gòu)建，分子伴侶協(xié)助可溶表達，SUMO-Ai342融合蛋白的原核表達及純化， SUMO-Aβ 42融合蛋白的酶切，Aβ 42多肽的純化和鑒定。分別說明如下
步驟一可溶性表達載體的構(gòu)建(1)首先化學合成6His-SUMO_Ai3 42融合基因。
序列如下ATGCACCATCATCATCATCATATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCA GAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGAC CACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACG ACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGA GAACAGATTGGTGGCGATGCGGAATTTCGCCATGATTCTGGCTATGAAGTGCATCATCAGAAACTGGTGTTTTTTGC GGAAGATGTGGGCTCTAACAAAGGCGCGATTATTGGCCTGATGGTGGGCGGCGTGGTGATAGCATGA(SEQID NO 3)(2)引物設計及PCR:根據(jù)合成的DNA序列設計引物，把所合成基因克隆到 β ET21b表達載體上，酶切位點選擇NdeI和SacI，引物序列如下正向弓I 物 SUMO/Αβ 42-F(NdeI) :TTCCATATGCACCATCATCATCATCAAT (SEQ ID NO 1)；反向引物SUMO/A β 42-R (SacI) TACGAGCTCTCATGCTATCACCACGCCGC (SEQ IDNO 2)。以化學合成的DNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物片斷長度約為440bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊 脂糖凝膠電泳后，膠純化回收PCR產(chǎn)物?；厥盏哪康钠魏蚿ET21b載體分別用NdeI和SacI 雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，膠純化回收酶切產(chǎn)物進行連接反應，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感 受態(tài)細胞，冰浴30min，42 °C，lmin,冰浴2min，加入400 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，250rpm, 37 °C 培養(yǎng)lh，涂布Amp抗性的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單菌落到5mL的LB液體培養(yǎng)基中， 250rpm，37°C過夜培養(yǎng)。PCR鑒定陽性克隆后進行測序。測序鑒定正確的pET21b_SUM0陽性 克隆抽提質(zhì)粒備用。(3) A β 42原核表達菌株的獲得將測序鑒定正確的pET21b-SUM0/A β 42陽性克隆 抽提質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株E coli. BL21 (DE3)-groES-groEL-tig中，得到能與 分子伴侶groES-groEL-tig(Tf2)共表達的A β 42原核表達菌株BL21 (DE3) -Tf2/Α β 42
步驟二 SUMO-A β 42融合蛋白的原核表達及純化(4) SUMO-A β 42融合蛋白的原核表達采用異丙基_ β _硫代半乳糖苷(IPTG)誘 導融合蛋白的表達，同時，與分子伴侶groES-groEL-tig(Tf2)的共表達可以顯著增加融合 蛋白的可溶性表達量，低溫誘導過夜，將大腸桿菌的培養(yǎng)液離心收菌，得到含SUMO-A β 42 融合蛋白的大腸桿菌菌體；(5) SUMO-Aβ 42融合蛋白的純化將所得大腸桿菌菌體重懸于緩沖溶液中，冰浴 中超聲破菌，收集上清液；將上清液過Ni-NTA(Qiagen)親和層析柱，用緩沖溶液充分洗滌 柱子后，再用含IOmM咪唑的Buffer A洗2個柱體積，隨后加入一種SUMO特異性蛋白酶 YULPl酶，進行柱上酶切過夜，第二天用緩沖溶液進行洗脫，收集洗脫液，即得到初步純化的 A β 42多肽；(6) A β 42多肽的分子篩柱純化將經(jīng)Ni-NTA柱純化得到的A β 42蛋白經(jīng) Superdex200柱進行進一步的純化，最后得到純度約為超過90% Aβ 42多肽。步驟三Α β 42多肽的鑒定(7)Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定每步純化得到的Aβ 42多肽都進行三層膠電泳 以確定純度及分子量，電泳結(jié)果顯示A β 42多肽的分子量在5kDa附近；
(8)MALDI-T0F-T0F鑒定從電泳膠上把對應的A β 42多肽條帶切割下來進行質(zhì)譜分析，鑒定結(jié)果表明我們所得到的目的產(chǎn)物確實為A β 42多肽；上述使用的試劑未特別注明來源的，均由市售獲得。操作步驟未及詳述的，均根據(jù) 冷泉港實驗室手冊——如《分子克隆》、《抗體》和《細胞》進行操作。本發(fā)明提供了能原核表達人淀粉樣多肽Αβ 42的原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法，并將 可溶性表達載體導入大腸桿菌表達系統(tǒng)，經(jīng)誘導表達、酶切及純化后得到有生物活性的目 標Αβ 42多肽。本方法的大腸桿菌表達系統(tǒng)，具有表達效率高，表達量大，易于操作，成本較 低等特點，所表達的Αβ 42多肽純化步驟簡單、產(chǎn)率高等優(yōu)點。該Αβ 42多肽可用于老年癡 呆癥致病機理和相應藥物開發(fā)的研究中。本發(fā)明的意義在于實現(xiàn)了疏水性Αβ42多肽的可溶性表達，并且A β 42多肽的純 化步驟簡單、生產(chǎn)效率高、成本低廉，為AD疾病致病機理和相應藥物開發(fā)的研究提供了很 好的基礎，對AD病疫苗治療和藥物篩選的研究起到了促進作用。


圖lpET21b_SUM0/A3 42質(zhì)粒構(gòu)建框架圖。
具體實施例方式實施例1 :pET21b_SUM0/A β 42 質(zhì)粒構(gòu)建(1)首先化學合成6His-SUM0-A3 42融合基因。(2)引物設計及PCR 根據(jù)合成的DNA序列設計引物，把所合成基因克隆到PET21B 表達載體上，酶切位點選擇NdeI和SacI，引物序列如下正向引物SUMO/Αβ 42-F(NdeI) TTCCATATGCACCATCATCATCATCAAT (SEQ ID N01)； 反向引物 SUMO/Αβ 42-R(SacI) TACGAGCTCTCATGCTATCACCACGCCGC(SEQ ID N02)。以化學合成的DNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物片斷長度約為440bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊 脂糖凝膠電泳后，膠純化回收PCR產(chǎn)物?；厥盏哪康钠魏蚿ET21b載體分別用NdeI和SacI 雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，膠純化回收酶切產(chǎn)物進行連接反應，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感 受態(tài)細胞，冰浴30min，42°C，lmin，冰浴2min，加入400 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，250rpm，37 °C 培養(yǎng)lh，涂布Amp抗性的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單菌落到5mL的LB液體培養(yǎng)基中， 250rpm，37°C過夜培養(yǎng)。PCR鑒定陽性克隆后進行測序。經(jīng)測序確認重組表達質(zhì)粒構(gòu)建正確 后，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導入DH5 α菌株擴增保種，然后提取質(zhì)粒pET21b-SUM0/A β 42備 用。(3) A β 42的原核表達菌株的獲得首先將含分子伴侶groES-groEL-tig 的質(zhì)粒(pG-Tf2)轉(zhuǎn)入E. coli BL21(DE3)菌株，得到表達菌株E coli. BL21 (DE3)-groES-groEL-tig (Tf2)，然后將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 pET21b_SUM0/A β 42 轉(zhuǎn)導入 表達菌株E co 1 i. BL21 (DE3) -groES-groEL-t i g (Tf 2)中，即得到A β 42的原核表達菌株 pET2Ib-SUMO(pG-Tf2)/Aβ 42/BL21。實施例2 SUMO-A β 42融合蛋白的原核表達和純化。(4)目標融合蛋白的表達首先進行預表達來優(yōu)化表達條件(包括分子伴侶的選 用、表達溫度、誘導條件、表達時間)，盡量增加可溶性目標融合蛋白的表達量，然后根據(jù)最優(yōu)表達條件來大量表達目標融合蛋白。大量表達時采用的過程為將已構(gòu)建好的A β 42和分子伴侶 groES-groEL-tig(Tf2)的原核表達菌株 pET21b_SUM0 (pG_Tf2)/A β 42/BL21 分別 于37°C培養(yǎng)，新鮮菌按1 100接種，振搖培養(yǎng)至0D600為0.8-1.0，將培養(yǎng)箱溫度降低至 16°C，然后加入ImM的IPTG誘導，過夜(15h)表達，最后，3500rpm離心lh，收集菌體。(5) SUMO-A β 42融合蛋白的純化將所得大腸桿菌菌體重懸于緩沖溶液(Buffer A =IOmM pH7. 2, Tris-HCl, 300mM NaCl,5% Glycerol)中，冰浴中超聲破菌，收集上清液；將 上清液過Ni-NTA(Qiagen)親和層析柱，用Buffer A充分洗滌柱子后，再用含IOmM咪唑的 BufferA洗2個柱體積，隨后按約1 500的比例加入一種SUMO特異性蛋白酶YULPl酶， 4°C下進行柱上酶切過夜，第二天用含5mM咪唑的Buffer A進行洗脫，收集洗脫液，即得到 純度約85%的Αβ 42蛋白；(6) A β 42多肽的分子篩柱純化將經(jīng)Ni-NTA柱純化得到的A β 42蛋白經(jīng) Superdex200柱進行進一步的純化，該步純化中用IOmM pH7. 2Tris-HCl, 300mMNaCl做為純 化buffer進行純化，最后得到純度約為超過90% Αβ42多肽。實施例3 :Α β 42多肽的鑒定(A)Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定將酶切后的蛋白溶液和提純的Αβ 42多肽進行 Tricine-SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示酶切基本完全，A β 42多肽的分子量在3. 5-6. 5kDa之間。(B)MALDI-TOF-TOF 將純的A β 42多肽進行氨基酸序列測定，證實其序列與人淀 粉樣多肽A β 42 —致。實施例4Α β 42多肽的聚集實驗已知熒光物質(zhì)硫磺素(ThT)能與淀粉樣的β -sheet結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合而顯著增強 ThT的熒光強度，取30 μ M純的A β 42多肽溶于Buffer A緩沖溶液中，取兩個樣本分別置 于-20、37°C孵育7天，然后各組取20 μ 1孵育液和180 μ 1用BufferA配置的ThT溶液，震 動混合均勻后，在激發(fā)波長445nm、發(fā)射波長486nm條件下測量熒光強度.結(jié)果顯示純化得到的A β 42多肽在37°C下形成聚集體。從另一個角度說明本發(fā) 明得到的A β 42多肽與人淀粉樣多肽A β 42 —致。序列表<210>1<211>28<212>DNA<213>Artificial<400>1ttccatatgc accatcatca tcatcaat28<210>2<211>29<212>DNA<213>Artificial<400>2tacgagctct catgctatca ccacgccgc29<210>3
<211>444
<212>DNA
<213>Artificial
〈400>3
atgcaccatcatcatcatcatatgtcggactcagaagtca atcaagaagctaagccagag60
gtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaa aggtgtccgatggatcttca120
gagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaa ggctgatggaagcgttcgct180
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aaactggtgttttttgcggaagatgtgggctctaacaaag gcgcgattattggcctgatg420
gtgggcggcgtggtgatagcatga44權利要求
一種重組人淀粉樣多肽Aβ42的簡易可溶性表達純化方法，包括重組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選、表達與純化，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)將6His SUMO Aβ42融合基因的核苷酸編碼序列插入表達載體的多克隆位點，獲得重組表達載體質(zhì)粒；(2)將(1)獲得的重組表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株，得到能與分子伴侶共表達的Aβ42原核表達菌株；(3)誘導SUMO Aβ42融合蛋白和分子伴侶的表達，過柱純化。
2.如權利要求1所述的重組人淀粉樣多肽Aβ 42的簡易可溶性表達純化方法，其特征 在于，6His-SUMO-Aβ 42融合基因是通過化學合成方法獲得。
3.如權利要求1所述的重組人淀粉樣多肽Aβ 42的簡易可溶性表達純化方法，其特征 在于，所述的表達載體是pET21b。
4.如權利要求1所述的重組人淀粉樣多肽Aβ 42的簡易可溶性表達純化方法，其特征 在于，所述的大腸桿菌表達菌株是E coli.BL21(DE3)-groES-groEL-tig。
5.如權利要求1所述的重組人淀粉樣多肽Aβ 42的簡易可溶性表達純化方法，其特征 在于，所述的分子伴侶是groES-groEL-tig。
6.如權利要求1所述的重組人淀粉樣多肽Aβ 42的簡易可溶性表達純化方法，其特征 在于，使用異丙基_ β _硫代半乳糖苷進行誘導表達。
7.如權利要求1所述的重組人淀粉樣多肽Αβ42的簡易可溶性表達純化方法，其 特征在于，所述的過柱純化分為兩步細胞破碎后先過親和層析柱進行純化，然后再用 Superdex 200分子篩柱進一步純化并得到目的多肽A β 42。
8.—種重組人淀粉樣多肽Αβ 42的表達載體，其特征在于，該表達載體是將 6His-SUMO-A β 42融合基因的核苷酸編碼序列插入表達載體pET21b的多克隆位點獲得的。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，提供了一種重組人淀粉樣多肽Aβ42的簡易可溶性表達純化方法，包括重組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選、表達與純化。具體步驟如下(1)將6His-SUMO-Aβ42融合基因的核苷酸編碼序列插入表達載體的多克隆位點，獲得重組表達載體質(zhì)粒；(2)將(1)獲得的重組表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株，得到能與分子伴侶共表達的Aβ42原核表達菌株；(3)誘導SUMO-Aβ42融合蛋白和分子伴侶的表達，過柱純化。本發(fā)明實現(xiàn)了疏水性Aβ42多肽的可溶性表達，并且純化步驟簡單、生產(chǎn)效率高、成本低廉，為AD疾病致病機理和相應藥物開發(fā)的研究提供了很好的基礎。
文檔編號C12N15/70GK101967492SQ200910055489
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月28日 優(yōu)先權日2009年7月28日
發(fā)明者周平, 江騰, 蔡建華, 鄧益斌 申請人:復旦大學