專利名稱：一種高穩(wěn)定性的重組羧肽酶b的生產(chǎn)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種高穩(wěn)定性的重組羧肽酶B 的生產(chǎn)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
羧肽酶B在胰腺中含量少，胰腺提取所得的羧肽酶B不能保證去除其它蛋白酶活 性，重組羧肽酶B的生產(chǎn)解決了這一問題，但是在重組羧肽酶B的生產(chǎn)過程中，特別是大腸 桿菌生產(chǎn)過程中，以包涵體的形式，需經(jīng)進(jìn)一步的變性復(fù)性可獲得活性的羧肽酶B，但其復(fù) 性率是影響其規(guī)模化生產(chǎn)的瓶頸。很多原核和真核生物的蛋白酶以酶原形式合成，折疊成熟后，前導(dǎo)序列被相應(yīng) 的蛋白酶識別、切除并降解后，得到有活性的蛋白酶。前導(dǎo)序列作為分子內(nèi)分子伴侶 (InterMolecular Chaperon, IMC)，其中一類主要參與多肽鏈的延伸和正確折疊，它介導(dǎo)的 蛋白酶折疊特點有IMC在體內(nèi)與多肽鏈以共價鍵結(jié)合，具有高度特異性；在結(jié)構(gòu)及編碼基 因上與它作用的蛋白質(zhì)緊密相連；IMC可與經(jīng)它作用后以折疊形式存在的蛋白質(zhì)(酶)相 互作用，并是其競爭性抑制劑；IMC釋放其作用的“底物”不依賴于ATP水解供能，但依賴于 折疊完成的“底物”或胞內(nèi)蛋白酶的酶解作用。有些情況下，沒有IMC的存在，蛋白質(zhì)無法自發(fā)地完成折疊過程，這種依賴于前導(dǎo) 序列的蛋白質(zhì)折疊現(xiàn)象最早是1987年Ikemura等在研究枯草桿菌蛋白酶時發(fā)現(xiàn)的。而且 在不同的IMC幫助下，一級結(jié)構(gòu)完全一樣的蛋白質(zhì)折疊形成的最終構(gòu)象表現(xiàn)出明顯不同的 酶學(xué)特性。大量體內(nèi)表達(dá)、體外重折疊研究結(jié)果表明，前導(dǎo)序列的IMC作用并不一定要求它 與其所幫助折疊的蛋白質(zhì)共價連接在一起，亦即IMC也可以反式地輔助蛋白質(zhì)完成正確的 折疊與成熟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高穩(wěn)定性的重組羧肽酶B的生產(chǎn)及應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種生產(chǎn)重組羧肽酶B的方法，所述方法包括(1)重組表達(dá)N端帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B，獲得包涵體形式的重組蛋白；(2)將步驟(1)獲得的包涵體形式的重組蛋白進(jìn)行變性和復(fù)性，獲得可溶性重組 蛋白(具有正確構(gòu)象的蛋白)；和(3)切除所述步驟(2)獲得的可溶性重組蛋白N端帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶 B的前導(dǎo)序列，獲得重組羧肽酶B (有酶活性)。在一個優(yōu)選例中，所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列， 其中第19位突變?yōu)锳sp ；或所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第34位突變 為Gln ；或
所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第55位突變 為Arg ；或所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，其中第1_5位的 一個或多個氨基酸缺失(包括缺失1、2、3、4或5個氨基酸)。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，用胰蛋白酶處理所述N端帶有突變的前導(dǎo)序列的羧 肽酶B的前導(dǎo)序列，從而切除所述突變的前導(dǎo)序列。在另一優(yōu)選例中，在處理時胰蛋白酶與所述N端帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B 的質(zhì)量比是1 (5-15)；優(yōu)選1 10。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，采用大腸桿菌重組表達(dá)融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，采用8 士 2M的尿素進(jìn)行變性。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)之后，還包括將獲得的重組羧肽酶B在4士2 °C ； 20士 10% (ν/ν)甘油中保存。優(yōu)選地，將獲得的重組羧肽酶B在4士 1°C;20士5% (ν/ν)甘 油中保存。在本發(fā)明的另一方面，提供一種突變的前導(dǎo)序列，所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于 SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，其中第19位突變?yōu)锳sp ；或所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第34位突變 為Gln ；或所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第55位突變 為 Arg ；所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，其中第1_5位的 一個或多個氨基酸缺失(包括缺失1、2、3、4或5個氨基酸)。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的突變的前導(dǎo)序列的用途，用于與羧肽酶B的N端 連接，促進(jìn)羧肽酶B的重折疊。在本發(fā)明的另一方面，提供一種核酸，所述的核酸編碼所述的突變的前導(dǎo)序列。在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有所述的核酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有所述的表達(dá) 載體；或其基因組中整合有所述的表達(dá)載體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1、重組羧肽酶B在含有前導(dǎo)序列(pro(+))及不含前導(dǎo)序列(pro(-))的復(fù)性液 中的復(fù)性動力學(xué)比較。圖2、含有分子內(nèi)分子伴侶的重組羧肽酶原B的復(fù)性過程。圖3、Trypsin酶解proCPB不同時間的Tricine-SDS-PAGE。其中，泳道1 8分 別是酶解20min ；40min ；Ih ；1. 5h ；2h ；2. 5h ；3h ；3. 5h后酶解產(chǎn)物的電泳結(jié)果。箭頭所示為 前導(dǎo)肽(pro)。圖4、DEAE_FF連續(xù)梯度洗脫電泳圖。泳道1 8分別是連續(xù)洗脫管號37 ；38 ；39 ； 40 ；41 ；42 ；43 ；44。
圖5、N-端延長的前導(dǎo)序列抑制羧肽酶的激活。其中，泳道1表示復(fù)性液，泳道2 表示復(fù)性液酶解后，泳道3表示上清，泳道4表示上清酶解后。圖6、突變后前導(dǎo)序列的編碼基因序列。
具體實施例方式為了解決現(xiàn)有技術(shù)中難以重組表達(dá)重組羧肽酶B或表達(dá)效率不高的技術(shù)缺陷，本 發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，出乎意料地找到一種生產(chǎn)高活性的重組羧肽酶B的方法。本發(fā)明 人采用一種分子內(nèi)分子伴侶提高了羧肽酶B的體外折疊，該分子內(nèi)分子伴侶來源于羧肽酶 B的前導(dǎo)序列的突變體或截短體。本發(fā)明的方法獲得的重組羧肽酶B穩(wěn)定性高，可良好地抗 胰蛋白酶酶解。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)
成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。羧肽酶B如本文所用，重組羧肽酶B表示通過重組體DNA方法和其他人工方法制備的重組 多肽，它具有與任何天然存在的羧肽酶B相同的或基本上相同的氨基酸序列。羧肽酶原B 是羧肽酶B的前體形式，受胰蛋白酶酶解可被激活成具有活性的羧肽酶原B。任何來源的重組羧肽酶B均可用于本發(fā)明。例如，一種鼠源的重組羧肽酶原B是 具有的蛋白序列與GenBank登錄號NP_036665. 1所示的序列基本上相同，其編碼序列如 GenBank登錄號P19223所示的序列基本上相同。其前導(dǎo)序列如SEQ ID NO :2所示。眾所周知，根據(jù)已公開的重組羧肽酶B序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過PCR擴(kuò)增等 方法制備重組羧肽酶B的編碼序列，然后將其插入表達(dá)載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化常見的宿主細(xì)胞(如 大腸桿菌)，就可以表達(dá)重組羧肽酶B。例如，通過IPTG誘導(dǎo)使得大腸桿菌表達(dá)重組羧肽酶 B，然后回收該重組羧肽酶B。突變的前導(dǎo)序列本發(fā)明提供了有助于生產(chǎn)高活性的重組羧肽酶B的分子內(nèi)伴侶，即基于重組羧肽 酶B的前導(dǎo)序列進(jìn)行改造獲得的突變形式的前導(dǎo)序列或截短體。與采用非改造的前導(dǎo)序列 重組表達(dá)獲得的重組羧肽酶B相比，所述經(jīng)改造的突變的前導(dǎo)序列的編碼分子與重組羧肽 酶B的編碼分子連接后重組表達(dá)獲得的重組羧肽酶B具有顯著高的酶活性和穩(wěn)定性。所述的突變的前導(dǎo)序列為對應(yīng)于SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，其中第19位 突變?yōu)锳sp (即除了第19位上突變?yōu)锳sp，該氨基酸序列其它位點的氨基酸序列與SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列相同)；或?qū)?yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第34位突 變?yōu)镚ln ；或?qū)?yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第55位突變?yōu)锳rg ；或?qū)?yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第1-5位的一個或多個氨基酸缺失(包括缺失1、2、3、4 或5個氨基酸)。將突變引入蛋白序列中的方法是本領(lǐng)域人員所熟知的。作為本發(fā)明的更優(yōu)選方式，所述的突變的前導(dǎo)序列為對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示 的氨基酸序列，其中第19位突變?yōu)锳sp ；或?qū)?yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第 1-5位的5個氨基酸缺失。本發(fā)明還提供了編碼所述的突變的前導(dǎo)序列的分離的核酸，也可以是其互補鏈。編碼本發(fā)明突變的前導(dǎo)序列的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR擴(kuò)增的方法獲得。通常可將所述的突變的前導(dǎo)序列的編碼分子連接于成熟的羧肽酶B編碼序列的 5’端；或者，可直接獲得帶有前導(dǎo)序列的羧肽酶B的編碼分子，然后在對應(yīng)于指定的氨基酸 突變位點的堿基位置引入突變。從而，獲得帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B的編碼序列。在獲得了編碼帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B的DNA序列之后，將其連入合適的 表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過分離純化得到帶 有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B。因此，本發(fā)明還提供了包含編碼所述帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B的核酸分子 的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，以便于 所述帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B的表達(dá)?！安僮餍韵噙B”或“可操作地連于”指這樣一 種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如 果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳 動物細(xì)胞的克隆和表達(dá)的載體，如Pouwels等，克隆載體實驗室手冊(Elsevier最新版) 中所描述的?？蛇x用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將 編碼所述帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B的DNA序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成蛋 白表達(dá)載體。在本發(fā)明的一種實施方式中，所述的載體為原核載體。此外，含有編碼所述帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B的核酸序列的重組細(xì)胞也包 括在本發(fā)明中。在本發(fā)明中，所述的“重組細(xì)胞”通常是原核細(xì)胞。常用的原核細(xì)胞包括 大腸桿菌、枯草桿菌等；優(yōu)選的可為大腸桿菌細(xì)胞(E. coli)，如大腸桿菌HMS174(DE3)、或 BL21(DE3)。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，以表達(dá)所述帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B。 根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。生產(chǎn)重組羧肽酶B的方法本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組羧肽酶B的方法，所述方法包括(1)重組表達(dá)N端帶有突 變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B，獲得包涵體形式的重組蛋白；(2)將步驟(1)獲得的包涵體形式 的重組蛋白進(jìn)行變性和復(fù)性，獲得可溶性重組蛋白(復(fù)性后的蛋白)；和(3)切除所述步驟 (2)獲得的可溶性重組蛋白N端帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B的前導(dǎo)序列，獲得重組活性 羧肽酶B。本發(fā)明的方法的特點是先重組表達(dá)獲得帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B，經(jīng)變 復(fù)性后將位于N端的前導(dǎo)序列切除，得到高活性的重組羧肽酶B。切除帶有前導(dǎo)序列的羧肽酶B的前導(dǎo)序列、以獲得羧肽酶B的方法是本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的，通常采用一些適合的蛋白內(nèi)切酶。優(yōu)選地，采用胰蛋白酶處理所述的融合蛋白，從而切除N端的前導(dǎo)序列。利用胰蛋白酶處理來切除所述的前導(dǎo)序列，其能夠識別Lys 和Arg，在它們的羧基端切開。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在處理時胰蛋白酶與所述N端帶有突變的前導(dǎo)序列的羧 肽酶B的質(zhì)量比是1 (5-20)；優(yōu)選地是1 (5-15)；更優(yōu)選1 10。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用大腸桿菌重組表達(dá)所述N端帶有突變的前導(dǎo)序列的 羧肽酶B，最優(yōu)選的是大腸桿菌BL21 (DE3)。對于表達(dá)重組羧肽酶B的大腸桿菌，通過本領(lǐng)域人員常用的破細(xì)胞手段(如珠磨 法破碎、液氮研磨破碎、壓力杯法破碎、超聲破碎等)，可以獲得包涵體形式的重組羧肽酶 B。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用超聲破碎細(xì)胞可以獲得良好的細(xì)胞破碎效果。獲得包涵體形式的重組羧肽酶B后，可進(jìn)一步進(jìn)行變性和復(fù)性，以獲得可溶性的 重組羧肽酶B。對于包涵體的變性和復(fù)性的方法沒有特別的限制。優(yōu)選地，采用8士2M(優(yōu) 選8M)尿素而不是6M鹽酸胍進(jìn)行變性。復(fù)性優(yōu)選采用含有IOOmM Gly-NaOH, pH 9.5，GSH ImM,0. ImM ZnCl2 的復(fù)性液。獲得的復(fù)性的重組羧肽酶B可進(jìn)一步進(jìn)行純化，或在激活后進(jìn)一步進(jìn)行純化。一 種優(yōu)選的純化方法為陰離子交換層析法；優(yōu)選的陰離子樹脂包括DEAE陰離子交換樹脂(如 DEAE-FF陰離子交換樹脂)；優(yōu)選的純化方法包括連續(xù)NaCl梯度洗脫；優(yōu)選的NaCl洗脫的 濃度范圍為0-0. 5M。為了提高重組羧肽酶B的穩(wěn)定性，本發(fā)明人還研究了其經(jīng)濟(jì)實用的保存方法，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，將獲得的重組羧肽酶B在4士2°C;20士 10% (體積比)甘油中保存是較為優(yōu)選的， 其在保存120天后仍然能夠保留100%的酶活性。更優(yōu)選地，在4士 1°C;20士5% (體積比) 甘油中保存。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)本發(fā)明人找到了對于重組羧肽酶B非常合適的分子內(nèi)分子伴侶，有效地提高 了重組羧肽酶B的復(fù)性率以及酶活性。(2)本發(fā)明的方法獲得的重組羧肽酶B穩(wěn)定性高，抗胰蛋白酶酶解，液體狀態(tài)4°C 放置，1年以上沒有酶活損失。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、羧肽酶B的重組表達(dá)1、帶有前導(dǎo)序列的羧肽酶B (羧肽酶原B)的重組表達(dá)設(shè)計以下引物正向5，GCGCCA TGG CAT GCT TCC GAG GAG CAC TTT GATGGC-3，(SEQ ID NO 3)，含Nco I限制性酶切位點；
反向5，-CGCAAG CTT TCA CTA ATA TAG ATG TTC TCG GAC ATAATT-3，(SEQ ID NO :4)，含Hind III限制性酶切位點及終止密碼子。以胰腺cDNA文庫(購自Invitrogen)為模板，用前述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得帶有 前導(dǎo)序列的羧肽酶B的編碼序列。前述獲得的序列用Nco Ι/HindIII酶切后插入到pET表達(dá)載體(購自 Invitrogen)的相應(yīng)位點中，測序鑒定獲得正確插入的重組表達(dá)載體。將該重組表達(dá)載體常 規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆菌落，接種至30mL LB培養(yǎng)液中(含100 μ g/mLAmp)， 置于37°C搖床過夜培養(yǎng)(10 12h)后，以2%接種量轉(zhuǎn)入二級瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。菌密度 至0D600 0. 5 0. 6時，于37°C和12°C下分別加入終濃度0. 5mmol/LIPTG誘導(dǎo)4小時， IOOOOrpm離心收集菌體，棄上清，菌體超聲破碎，離心后獲得包涵體形式的帶有前導(dǎo)序列的 重組羧肽酶B。2、帶有前導(dǎo)序列的羧肽酶B(羧肽酶原B)的包涵體的變性、復(fù)性，及激活純化獲得 重組活性羧肽酶B將上述獲得的包涵體用8M尿素按照20mg/ml進(jìn)行溶解，離心，上清滴加到復(fù)性液 (IOOmM Gly-NaOH, pH 9. 5，GSH ImM, 0. ImM ZnCl2)中，至終蛋白濃度為 200μ g/ml，放置復(fù) 性24h。調(diào)pH8.0，按照1 10(w/w)的比例加入胰蛋白酶，37°C激活2h，測活。測活方法如下以馬尿酰-L-精氨酸(Sigma)為底物，或根據(jù)Sigma規(guī)定的測定羧 肽酶B的方法?；盍挝欢x為在0. OOlM的底物濃度下每分鐘的底物水解百分?jǐn)?shù)，測活緩 沖液為0. 025M Tris-HCl，ρΗ7· 65，含 0. IM NaCl。用2Χ 15cm離子交換層析柱，離子交換柱事先用20mM Tris-HCl，pH 8. 0的緩沖液 平衡，然后激活后的復(fù)性液上樣，用相同的緩沖液平衡至基線平穩(wěn)后，用含0 0. 5M NaCl 梯度洗脫，分部收集，測定每管的0D280和酶活，把有酶活的收集液合并，測總酶活和總蛋 白含量。合并酶活高的收集管，即得純化的活性重組羧肽酶B (CPB)。純化結(jié)果見圖4。此外，采用相同的方法，但是在復(fù)性后不進(jìn)行胰蛋白酶酶解激活，純化后可得帶有 前導(dǎo)序列的重組羧肽酶B (羧肽酶原B，proCPB)。3、前導(dǎo)序列的制備對不同酶解時間的羧肽酶原B樣品進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE，由圖3可以很清楚地 看到酶解時間為20min時，前導(dǎo)肽(分子量為IOkD)沒有完全酶解；而40min時前導(dǎo)肽濃度 與20min相比，濃度有所降低，此時酶解時間稍微過長，部分前導(dǎo)肽(pro)被消化；繼續(xù)延 長酶解時間，在3. 5h時，前導(dǎo)肽幾乎已經(jīng)完全被酶解消化掉。所以，當(dāng)胰蛋白酶和羧肽酶原 B (proCPB)質(zhì)量比為1 140，37°C酶解時，選取30min為最佳酶解時間。為了制備大量的前導(dǎo)肽，本發(fā)明人選取最佳酶解比例和時間，對羧肽酶原B復(fù)性 液酶解，然后進(jìn)行陰離子交換層析，利用連續(xù)濃度梯度洗脫，獲得前導(dǎo)肽。測定蛋白濃度為 0. lmg/ml04、N端添加6個組氨酸的帶有前導(dǎo)序列的羧肽酶原B的重組表達(dá)重組表達(dá)方法同前述“1”，不同點在于，通過引物設(shè)計在對應(yīng)帶有前導(dǎo)序列的羧肽 酶原B的N端的編碼序列之前加上編碼6個組氨酸的一段編碼序列，獲得N端添加6個組 氨酸的帶有前導(dǎo)序列的羧肽酶原B的編碼序列。
N端添加6個組氨酸的帶有前導(dǎo)序列的羧肽酶原B的重組表達(dá)同前述“1”。5、N-端前導(dǎo)序列突變的羧肽酶原B突變體的重組表達(dá)重組表達(dá)方法同前述“1”，不同點在于，羧肽酶原B的N-端前導(dǎo)序列突變?yōu)槿缦?序列按照實施例1中的序列進(jìn)行突變，選擇的位點為第19位由甘氨酸(G)突變?yōu)楣劝?酸(D)，該突變后前導(dǎo)序列的編碼基因(SEQ ID NO 1)見圖6 ；第2位由丙氨酸㈧突變?yōu)?組氨酸(H)；第34位由谷氨酸(E)突變?yōu)楣劝孵０?Q)；第49位由亮氨酸(L)突變?yōu)榻M氨 酸(H)；第55位由組氨酸(H)突變?yōu)榫彼?R)。所述突變通過設(shè)計突變引物以及PCR擴(kuò) 增來實現(xiàn)。N-端前導(dǎo)序列突變的羧肽酶原B突變體的重組表達(dá)同前述“1”。實施例2、前導(dǎo)序列作為分子間分子伴侶對羧肽酶B折疊的作用lmg/ml的純化后所得重組羧肽酶B，在8M尿素中變性2h后，直接10倍稀釋到復(fù) 性緩沖液(IOOmM Gly-NaOH, pH 9.5，GSH ImM,0. ImM ZnCl2)中，此時復(fù)性緩沖液中的蛋白 終濃度為0. lmg/ml。從稀釋復(fù)性開始計時，每間隔一定時間取樣0. Iml測活。100%酶活定 義為原酶液(lmg/ml)直接在pH9. 5,0. IMGly-NaOH稀釋10倍的活力。活性測定以馬尿酰-L-精氨酸為底物，活力單位定義為在0. OOlM的底物濃度下每 分鐘的底物水解百分?jǐn)?shù)，測活緩沖液為0. 025M Tris-HCl，ρΗ7· 65，含0. IM NaCl。按照摩爾比CPB pro = 1 1，將前導(dǎo)序列(pro)加入到復(fù)性液中，之后將變性 CPB滴加到復(fù)性液中，其余步驟同上述。圖1為重組羧肽酶B在含有及不含有前導(dǎo)序列的復(fù)性液中的復(fù)性動力學(xué)。重組羧 肽酶B在8M尿素中變性2h后滴加到復(fù)性液中開始復(fù)性。0時的活力正好與圖中CPB在8M 尿素中變性2h時的活力相當(dāng)。在整個復(fù)性過程中，羧肽酶B在加與不加前導(dǎo)序列的復(fù)性液 中，活力基本沒有明顯區(qū)別；由此可見，復(fù)性液中加入小分子前導(dǎo)序列對于重組羧肽酶B來 說并沒有促進(jìn)重折疊，也就是說，前導(dǎo)序列不能作為分子外伴侶對羧肽酶B的復(fù)性起作用。 為了進(jìn)一步確證這一結(jié)果，本發(fā)明人把活性CPB在8M尿素中變性24h，使活力完全喪失，然 后重復(fù)以上復(fù)性過程，經(jīng)過24h復(fù)性后測定酶活，依然未檢測到活性。這就進(jìn)一步說明，對 于CPB來說，加入分子間分子伴侶對其活力恢復(fù)沒有幫助，同時也說明了，當(dāng)CPB完全變性 后，本身不能自發(fā)復(fù)性。實施例3、前導(dǎo)序列作為CPB的分子內(nèi)分子伴侶對羧肽酶B的復(fù)性作用0. 5mg/ml的復(fù)性純化后的酶原proCPB(即帶有前導(dǎo)序列的重組羧肽酶B，復(fù)性后 未經(jīng)胰蛋白酶酶解激活，純化后所得)在8M尿素中變性24h后，直接5倍稀釋到復(fù)性緩沖 液中，室溫復(fù)性，此時終蛋白濃度為0. lmg/ml。從稀釋復(fù)性開始計時，每間隔一段時間取 lml，立刻加入胰蛋白酶酶解激活，其中羧肽酶原B 胰蛋白酶的質(zhì)量比為10 1，37°C保溫 40min后，測定CPB活性。100%酶活定義為原酶液(lmg/ml)直接在稀釋5倍后，相同方法 酶解激活后測定的活力。包涵體形式的酶原(即帶有前導(dǎo)序列的重組羧肽酶B)在8M尿素中變性24h后，其 活性的天然結(jié)構(gòu)完全喪失。經(jīng)過復(fù)性，活力在7h內(nèi)即可恢復(fù)，之后稍微下降，并趨于穩(wěn)定， 最終活力恢復(fù)了約25%，見圖2。由此可見，對于CPB來說，分子內(nèi)前導(dǎo)序列的存在可幫助 CPB重折疊，使其恢復(fù)活力，而前導(dǎo)序列不能作為分子間分子伴侶起作用。實施例4、N-端延長的前導(dǎo)序列抑制羧肽酶的激活
N端添加6個組氨酸的帶有前導(dǎo)序列的羧肽酶原B的激活測定方法同前述實施例 3中對帶有前導(dǎo)序列的重組羧肽酶B的激活測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羧肽酶原B前導(dǎo)序列N端加6個組氨酸不能被激活。見圖5。復(fù)性液在43KDa處有條帶，復(fù)性液經(jīng)胰蛋白酶酶解后在35KDa處有條帶， 上清和上清酶解后均在43KDa處有條帶。實施例5、N-端的前導(dǎo)序列突變體增加羧肽酶B的激活胰蛋白酶的激活方法如下測定復(fù)性液中蛋白含量，根據(jù)蛋白含量按照 10 l(w w)的比例加入胰蛋白酶，37°C酶解2小時測活。酶活性的測定同前述實施例1中。結(jié)果見表1。表 權(quán)利要求
一種生產(chǎn)重組羧肽酶B的方法，其特征在于，所述方法包括(1)重組表達(dá)N端帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B，獲得包涵體形式的重組蛋白；(2)將步驟(1)獲得的包涵體形式的重組蛋白進(jìn)行變性和復(fù)性，獲得可溶性重組蛋白；和(3)切除所述步驟(2)獲得的可溶性重組蛋白N端帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B的前導(dǎo)序列，獲得重組羧肽酶B。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQID NO 2所示的氨基酸序列，其中第19位突變?yōu)锳sp ；或所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第34位突變?yōu)?Gln ；或所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第55位突變?yōu)?Arg ；或所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第1-5位的一個 或多個氨基酸缺失。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，用胰蛋白酶處理所述N端帶有 突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B的前導(dǎo)序列，從而切除所述突變的前導(dǎo)序列。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在處理時胰蛋白酶與所述N端帶有突變的前 導(dǎo)序列的羧肽酶B的質(zhì)量比是1 (5-15)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，采用大腸桿菌重組表達(dá)融合蛋白。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，采用8士2M的尿素進(jìn)行變性。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)之后，還包括將獲得的重組羧肽 酶B在4士2°C ；20士 10% (ν/ν)甘油中保存。
8.一種突變的前導(dǎo)序列，其特征在于，所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQID Ν0:2所示 的氨基酸序列，其中第19位突變?yōu)锳sp ；或所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第34位突變?yōu)?Gln ；或所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第55位突變?yōu)锳rg ；所述的突變的前導(dǎo)序列對應(yīng)于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第1-5位的一個 或多個氨基酸缺失。
9.權(quán)利要求8所述的突變的前導(dǎo)序列的用途，其特征在于，用于與羧肽酶B的N端連 接，促進(jìn)羧肽酶B的重折疊。
10.一種核酸，其特征在于，所述的核酸編碼權(quán)利要求8所述的突變的前導(dǎo)序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高穩(wěn)定性的重組羧肽酶B的生產(chǎn)及應(yīng)用。公開了一種生產(chǎn)重組羧肽酶B的方法，所述方法包括(1)重組表達(dá)N端帶有突變的前導(dǎo)序列的羧肽酶B，獲得包涵體形式的重組蛋白；(2)將包涵體形式的重組蛋白進(jìn)行變性和復(fù)性，獲得可溶性重組蛋白；和(3)切除所述可溶性重組蛋白N端帶有前導(dǎo)序列的羧肽酶B的前導(dǎo)序列，獲得重組羧肽酶B。本發(fā)明采用一種分子內(nèi)分子伴侶提高了羧肽酶B的體外折疊，獲得的重組羧肽酶B穩(wěn)定性高，可良好地抗胰蛋白酶酶解。
文檔編號C12N15/12GK101967467SQ20091005549
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者馮矗, 趙致 申請人:上海雅心生物技術(shù)有限公司