專利名稱:修飾的羧肽酶的制作方法
背景技術(shù):
一種生產(chǎn)肽,特別是藥用肽的優(yōu)選方法是借助遺傳工程。然而,通過重組技術(shù)生產(chǎn)肽有特殊的限制。例如,因為遺傳密碼不包括非天然存在的L-氨基酸、D-氨基酸、放射性氨基酸和其它可檢測到的標(biāo)記,所以帶有這些修飾的重組多肽的生產(chǎn)是困難的。
并且,通常在體內(nèi)形成的天然氨基酸修飾如C末端酰胺基團轉(zhuǎn)換難以在體外形成。因為這些翻譯后修飾常常產(chǎn)生肽最強或最長的作用形式,所以它們是對于藥用最需要和最理想的形式。對許多多肽而言,C末端酰胺化作用對生物活性是重要的。然而,大規(guī)模活性多肽生產(chǎn)的重組表達系統(tǒng)并不易于進行所需要的C末端修飾。
已知羧肽酶可催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng),產(chǎn)生C末端酰胺化的多肽。然而,野生型羧肽酶對許多多肽的C末端酰胺化作用是無用的。例如,野生型羧肽酶固有的底物特異性限制了使用此酶可修飾的多肽種類。
特別地,羧肽酶Y表現(xiàn)出對含有次末位非極性殘基的多肽的強烈偏愛。含有具有帶正電側(cè)鏈的次末位氨基酸的底物不能由羧肽酶Y有效轉(zhuǎn)酰基。例如,水解底物FA-Arg-Ala-OH比水解底物FA-Leu-Ala-OH慢500倍。遺憾的是,許多藥學(xué)上重要的多肽包括生長激素釋放因子(GRF)或胰高血糖素樣肽(GLP1)的氨基酸序列都含有具有帶正電側(cè)鏈的次末位或最末位氨基酸,使得羧肽酶Y的轉(zhuǎn)酰胺基作用在商業(yè)上不實用。
盡管已知的一些突變羧肽酶對大量肽底物有增強的水解活性,但是對大量突變羧肽酶的研究證明在具有增強的水解活性的突變體和具有增強的轉(zhuǎn)酶胺基活性的突變體之間沒有特異的聯(lián)系。例如,盡管來自微紫青霉的羧肽酶S1能有效水解含有堿性P1殘基的肽底物,但是酶并不能對它們有效地發(fā)揮轉(zhuǎn)肽作用。引自Breddam,Carlsberg Res.Commun.,53(5)309-320(1988)。
提供對序列上包含具有帶正電側(cè)鏈的次末位氨基酸(P1)的肽底物有增強的轉(zhuǎn)?;钚缘男揎楐入拿甘鞘钟杏玫?。
發(fā)明概述本發(fā)明提供修飾的羧肽酶和轉(zhuǎn)酰胺基的方法。修飾的羧肽酶和方法有效地改善羧肽酶Y對序列中包含具有帶正電側(cè)鏈的次末位氨基酸(P1)的肽底物的轉(zhuǎn)酰基活性。
本發(fā)明的修飾的羧肽酶包含在其S1亞位點(Subsite)的至少一個氨基酸替換。導(dǎo)致與天然羧肽酶相比在S1亞位點更多的負電荷。典型地,這通過用具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸殘基替換具有中性或帶正電側(cè)鏈的氨基酸殘基來實現(xiàn)。S1亞位點內(nèi)用于引入負電荷的優(yōu)選位點的實例包括L178、W312、N241和L245位。具有帶負電氨基酸側(cè)鏈的氨基酸的實例包括天冬氨酸和谷氨酸。修飾的羧肽酶Y也可包含其它突變,例如在一個或多個羧肽酶的S1’,S2和S3亞位點的氨基酸殘基替換。這些額外的修飾能進一步增強對特殊底物的轉(zhuǎn)?;饔茫⑹沟孜锖陀H核物質(zhì)適應(yīng)轉(zhuǎn)酰胺反應(yīng)。
本發(fā)明的方法包括在修飾的羧肽酶Y的參與下使肽底物與親核物質(zhì)反應(yīng)。適當(dāng)?shù)挠H核物質(zhì)的實例包括烷基胺、苯甲基胺和氨基酸的α-氨基。氨基酸親核物質(zhì)可以酸、酯或酰胺形式含有α-羧化物。優(yōu)選地,將肽底物在pH約6.3至約6.7與親核物質(zhì)和修飾的羧肽酶Y一起溫育。
本發(fā)明的另一方面包括含有至少一個用具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸替換的氨基酸殘基N241和L245的修飾的羧肽酶Y。優(yōu)選地,修飾的羧肽酶Y也包含在S1亞位點內(nèi)的其它替換,最優(yōu)選地在L178和/或W312位。修飾的羧肽酶Y可進一步包含在一個或多個羧肽酶亞位點S1’、S2和S3內(nèi)氨基酸殘基處的氨基酸替換。
本發(fā)明的修飾的羧肽酶對重組肽,特別是含有具有帶正電側(cè)鏈的次末位氨基酸的肽的翻譯后修飾特別有用。然而,可以理解通過重組技術(shù)之外的方法產(chǎn)生的肽可以按照本發(fā)明的方法進行轉(zhuǎn)酰胺基作用。發(fā)明詳述本發(fā)明的修飾的羧肽酶設(shè)計為改善或增強含有帶正電次末位氨基酸殘基的肽底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用。優(yōu)選修飾的羧化酶是從已知的絲氨酸或半胱氨酸羧肽酶如羧肽酶Y衍生而來。
為易于理解本發(fā)明,將首先提供與本發(fā)明相關(guān)的所用術(shù)語的簡短討論。術(shù)語本公開使用Schechter等,1967,Biochem.Biophys.Res.Commun.27157-162中的術(shù)語來描述肽底物上和羧肽酶活性位點內(nèi)不同氨基酸殘基位置。
根據(jù)Schechter等的術(shù)語,肽底物的氨基酸殘基用字母“P”表示。底物中肽鍵切割(即“切割點”)N末端側(cè)的氨基酸用Pn…P3、P2、P1表示,其中Pn表示離切割點最遠的氨基酸殘基。肽底物中切割點C末端側(cè)的氨基酸殘基用P’1、P’2、P3’…Pn’表示,其中Pn’表示離切割點最遠的氨基酸殘基。因此,要切割的鍵(即“切割點”)是P1…P1’鍵。因為羧肽酶僅切割C末端的次末位殘基間的多肽鍵,所以羧肽酶的底物僅包括C末端側(cè)P1’位的殘基(即沒有P2’,P3’等殘基)。羧肽酶底物氨基酸的基本結(jié)構(gòu)式如下Pn------P3---P2---P1-----P1’羧肽酶的“活性位點”可分為多個底物結(jié)合亞位點。羧肽酶底物結(jié)合亞位點的表示與肽底物氨基酸殘基的表示方法類似。但是,羧肽酶的結(jié)合亞位點用字母“S”表示并且可包括一個以上氨基酸殘基。在切割點N端位點的氨基酸殘基的底物結(jié)合位點標(biāo)記為Sn…S3、S2、S1。切割點羧基側(cè)的氨基酸的底物結(jié)合亞位點用S1’表示。因此,在羧肽酶中,S1’亞位點與肽底物的“離去基團”和進入的親核物質(zhì)相互作用。描述羧肽酶底物結(jié)合位點的基本結(jié)構(gòu)式是Sn------S3---S2---S1---S1’S1結(jié)合位點結(jié)合肽底物的次末位氨基酸P1的側(cè)鏈。S2結(jié)合位點與相鄰氨基酸殘基P2的側(cè)鏈相互作用。同樣的,S3結(jié)合位點與P3殘基的側(cè)鏈相互作用。
如此處所用的,親核物質(zhì)是向電子受體提供一對電子,在此例中是肽底物次末位氨基酸殘基的α-羧化基團?;?,以形成共價鍵的分子。適當(dāng)?shù)挠H核物質(zhì)包括氨基酸、氨基酸衍生物如氨基酸酯和氨基酸酰胺、酰胺如氨或苯甲基胺。適合用于本方法的化合物的一個特異基團包含可切割的親核物質(zhì)(在轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)之后的步驟中)以產(chǎn)生缺乏衍生于親核物質(zhì)的殘基并具有C末端羧酰胺的肽。實例包括可通過光解作用(solvalysis)、溶劑分解作用、還原作用、重排作用、水解或氧化作用切割的親核物質(zhì),如那些在美國專利號5,580,751中公開的那些物質(zhì),在此引用作為參考。應(yīng)當(dāng)指出底物肽的次末位氨基酸在C末端殘基已從轉(zhuǎn)酰胺基產(chǎn)物上切割下來后成為最末位殘基。
本發(fā)明包括從已知的絲氨酸或半胱氨酸羧肽酶衍生的“修飾的羧肽酶”,其中已用不同氨基酸替換某些氨基酸殘基以提供能改善轉(zhuǎn)酰胺基作用的羧肽酶?!案纳频霓D(zhuǎn)酰胺基作用”可通過測量得到的氨解比例(fa)來檢驗。
因為氨解的低比例可能是由于轉(zhuǎn)酰胺基產(chǎn)物通過水解降解,所以修飾的羧肽酶與相應(yīng)的天然羧肽酶相比有高至少約0.1的氨解比例(fa)是更優(yōu)選的。
另一個有用的酶效力測量標(biāo)準(zhǔn)是KN(app),即達到fa最大/2時的酶濃度。KN(app)描述了親核物質(zhì)的表觀結(jié)合常數(shù)。因為競爭性水解反應(yīng)主要在離去基團仍結(jié)合于酶上時發(fā)生,所以KN(app)是優(yōu)選的。轉(zhuǎn)酰胺基作用本發(fā)明的修飾羧肽酶與相應(yīng)的羧肽酶相比能改善在P1亞位點具有帶正電氨基酸殘基的肽底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用。如此處所用的,“轉(zhuǎn)酰基作用”是其中離去基團替換為親核物質(zhì)的反應(yīng)。轉(zhuǎn)?;磻?yīng)包括轉(zhuǎn)?;饔煤娃D(zhuǎn)肽反應(yīng)。“轉(zhuǎn)肽作用”,如此處所用的,在氨基酸或氨基酸衍生物作用為離去基團并且親核物質(zhì)是氨基酸或氨基酸衍生物如氨基酸酯或氨基酸酰胺時發(fā)生?!稗D(zhuǎn)酰胺基作用”包括轉(zhuǎn)肽作用,其中在親核物質(zhì)和肽底物之間形成酰胺鍵。但是,在轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)中,親核物質(zhì)不必需是氨基酸。基本轉(zhuǎn)?;磻?yīng)如下所示
根據(jù)本發(fā)明,肽底物可在修飾的羧肽酶的參與下與親核物質(zhì)反應(yīng)以形成其中親核物質(zhì)通過酰胺鍵與肽底物P1殘基的α-羧基連接的產(chǎn)物。通過絲氨酸羧肽酶進行的C末端?;饔檬莾刹椒磻?yīng)。在第一步中,酶攻擊C末端肽鍵,置換P1’“離去基團”并在肽底物P1殘基和酶之間形成?;I。此中間產(chǎn)物稱為“?;?酶中間體”。在適當(dāng)親核物質(zhì)的參與下,在適當(dāng)條件下,酶使親核物質(zhì)加入到切割的肽底物上以產(chǎn)生?;霓D(zhuǎn)肽產(chǎn)物??梢源_信,親核物質(zhì)與?;?酶中間體的羧基結(jié)合并從?;?酶中間體將酶替換下來。以這種方式,使親核物質(zhì)與肽底物的羧基基團連接?;蛘撸;?酶中間體可能通過水脫?;援a(chǎn)生水解產(chǎn)物。本發(fā)明的修飾的羧肽酶設(shè)計為優(yōu)先產(chǎn)生多于水解產(chǎn)物的?;D(zhuǎn)肽產(chǎn)物。
圖解I,如下所示,是羧肽酸催化的轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)的圖示,其中E代表游離酶;S代表底物;ES為酶底物復(fù)合物;EAP代表有結(jié)合的離去基團的?;?酶中間體,其中A是?;煞郑琍是離去基團;EA是?;福籒代表親核物質(zhì);并且AN代表所需的氨解產(chǎn)物。
圖解I
如圖解I中所示的,水解可以在轉(zhuǎn)酰胺基作用中的兩個階段發(fā)生。?;?酶中間體可以被水解,從酶上釋放出酰基成分和離去基團,而沒有所需的氨解產(chǎn)物產(chǎn)生。目前認為水解主要發(fā)生在轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)中的這一點上?;蛘撸;?酶可能在離去基團從酰基-酶中間體上解離后水解。修飾的羧肽酶本發(fā)明的修飾羧肽酶設(shè)計為與天然的絲氨酸或半胱氨基羧肽酶相比改善或增強肽底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用。對天然羧肽酶修飾的基礎(chǔ)是在肽底物和酶的活性位點之間提供“最佳匹配”。進行修飾時考慮的因素包括減少空間阻礙和減少水接近?;?酶中間體的機會。
具體地,修飾的羧肽酶設(shè)計為通過用具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸替換S1亞位點的氨基酸殘基來改善或增強含有帶正電次末位氨基酸殘基的肽底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用。除了在P1位帶正電殘基,為增強在P3位含有帶正電氨基酸的肽底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用,可進行第二次替換,其中在S3亞位點或另一能與肽底物P3殘基相互作用的亞位點內(nèi)的殘基用具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。對于在P2位具有丙氨酸殘基的肽底物,羧肽酶S2亞位點內(nèi)的殘基可以用具有疏水側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。具體地,修飾的羧肽酶可用于改善生長激素釋放因子(GRF)前體或胰高血糖樣肽(GLP)前體的轉(zhuǎn)酰胺基作用。GRF(1-44),GLP1(1-36)-Xaa和GLP(7-36)-Xaa的序列如下所示,其中Xaa是作用為離去基團的C-末端氨基酸殘基。Xaa殘基通常具有不帶電的氨基酸側(cè)鏈,并且優(yōu)選地是丙氨酸殘基。GRF(1-43)-Xaa[SEQ ID NO1]Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-XaaGLP1(1-36)-Xaa[SEQ ID NO2]His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-XaaGLP1(7-36)-Xaa[SEQ ID NO3]His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa為制備本發(fā)明的修飾的羧肽酶,可進行點特異誘變以替換天然羧肽酶活性位點中的氨基酸殘基。具體地,可進行點特異誘變以用帶負電氨基酸殘基替換S1亞位點內(nèi)的氨基酸殘基。為進一步增強修飾的羧肽酶的轉(zhuǎn)酰胺基活性,可在S2,S3或S1’亞位點內(nèi)對氨基酸殘基進行其它替換。并且,轉(zhuǎn)酰胺基作用優(yōu)選地在pH約6.3到約6.7進行以進一步增強反應(yīng)效率。S1亞位點內(nèi)的替換羧肽酶的S1亞位點與肽底物的C末端次末位殘基相互作用。通常,S1亞位點在決定羧肽酶的底物特異性方面起重要作用。這對于羧肽酶Y尤其正確。
本發(fā)明的第一方面涉及對含有帶正電次末位氨基酸殘基的肽底物進行轉(zhuǎn)酰胺基作用的方法。根據(jù)本發(fā)明,在羧肽酰的S1亞位點內(nèi)引入具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸以制備對含有帶正電P1殘基的肽底物具有增強的轉(zhuǎn)酰胺基活性的羧肽酶。
術(shù)語“具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸”用于本發(fā)明的上下文中時,包括L-氨基酸和氨基酸衍生物如氨基酸酯或氨基酸酰胺。合適的具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸的實例包括天冬氨酸和谷氨酸。
在一個實施方案中,在羧肽酶Y的S1亞位點內(nèi)的N241、L245、L178或W312位的至少一個位置引入具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸。更優(yōu)選的替換的實施例包括N241D、N241E、L245D、L245E、L178D、L178E、W312D和W312E。
S1亞位點內(nèi)用于增強轉(zhuǎn)酰胺基作用的其它替換包括L178A、L178S和W312L。在L178位用丙氨酸或絲氨酸替換亮氨酸或在312位用亮氨酸替換色氨酸,導(dǎo)致原有氨基酸殘基替換為體積更小的殘基或極性更強的殘基??梢源_信,體積更小的殘基的引入可通過減少空間阻礙增強轉(zhuǎn)酰胺基作用。S1結(jié)合位點的大小因此而擴大從而可改善含有相對長側(cè)鏈的P1氨基酸殘基如精氨酸或賴氨酸的肽的轉(zhuǎn)酰胺基作用。極性殘基如絲氨酸也能為帶電的P1殘基提供更有利的環(huán)境。S1’亞位點內(nèi)的替換本發(fā)明的修飾羧肽酶對特異肽底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用可通過替換天然羧肽酶S1’亞位點中的氨基酸殘基得到進一步增強。在轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)中,S1’亞位點與進入的親核物質(zhì)和肽底物的離去基團的相互作用。因為認為競爭性水解反應(yīng)主要在離去基團仍與酶結(jié)合時發(fā)生。所以S1’亞位點內(nèi)增加離去基團從酰基-酶中間體上解離的速率和/或降低離去基團仍結(jié)合酶時水的進入的替換將通過減少競爭性水解反應(yīng)來增加氨解產(chǎn)物的比例。優(yōu)選地,這些替換對親核物質(zhì)與肽底物的結(jié)合沒有不利影響。
S1’亞位點內(nèi)可能進行有效替換的位置包括T60、F64、L267、L272、S297和M398。這些殘基限定了羧肽酶Y的S1’側(cè)鏈結(jié)合口袋。其它適于替換的殘基包括Y49、N51、E65和E145。這些殘基在S1’亞位點內(nèi)形成氫鍵網(wǎng)。下列突變的羧肽酶與野生型羧肽酶相比對于更大的,疏水的離去基團如亮氨酸殘基表現(xiàn)出所得氨基產(chǎn)物比例的改善T60A、T60W、T60Y、T60D、M398G、M398A、M398V、M398I、M398L、M398F、M398Y、M398C、M398N和M398E。對于以下突變,觀察到最顯著的改善T60Y、M398V、M398I、M398L、M498F、M398Y、M398C和M398E。多種替換如T60、M398和/或N51進一步增強用突變酶獲得的氨解產(chǎn)物的比例。S2亞位點內(nèi)的替換使用在S2亞位點內(nèi)有替換的羧肽酶可進一步增強修飾的羧肽酶對含P2丙氨酸殘基的肽底物的活性。因為羧肽酶的S2亞位點在P2與底物殘基相互作用,所以在S2亞位點內(nèi)引入疏水性殘基如苯丙氨酸或丙氨酸補充了肽底物并能增強羧肽酶對底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用。具體地,含P2丙氨酸的底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用可以通過包含以下替換的突變羧肽酶而得到增強E296F、S297A、N303A和N303F。S3亞位點內(nèi)的替換除了在S1亞位點內(nèi)引入帶負電荷殘基,在P1和P3均含有帶正電荷殘基的肽底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用可通過引入第二個替換得到進一步增強,如在S3亞位點或其它能與肽底物P3殘基相互作用的位置內(nèi)的帶負電荷殘基??梢源_信,引入第二個帶負電荷殘基可減少在肽底物上兩個堿性氨基酸殘基之間對S1亞位點內(nèi)帶負電荷殘基的競爭。
優(yōu)選地,在S3亞位點或能與肽底物P3殘基相互作用的位置內(nèi)如在N241、N242、L245或A246位引入帶負電氨基酸殘基。適當(dāng)?shù)奶鎿Q的實例包括N241D、N241E、N242D、N242E、L245D、L245E、A246D和A246E。N241和L245位看來與底物肽上的P3和P1殘基相互作用。增強轉(zhuǎn)?;饔玫钠渌揎棻M管羧肽酶Y能在較寬的pH范圍(從約pH到pH10)對肽底物進行轉(zhuǎn)酰胺基作用,但是進行轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)的pH會影響羧肽酶的底物或產(chǎn)物偏愛性。為提高轉(zhuǎn)酰胺基作用的產(chǎn)率,pH應(yīng)該使酶偏愛肽底物勝過偏愛產(chǎn)物。轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)的最適pH依賴于肽底物、親核物質(zhì)和所需產(chǎn)物而有所不同。一般而言,轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)最適于在pH約5.5與約8.5之間進行。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),使用在L178和M398位含有替換(L178S+M398L)的修飾羧肽酶對肽底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用優(yōu)選地在pH約6.3到約6.7進行。
并且,獲得的氨解比例可通過增加可利用的親核物質(zhì)的濃度來提高。定點誘變根據(jù)本發(fā)明的方法,已知的絲氨酸或半胱氨酸羧肽酶的突變可通過點特異誘變來實現(xiàn)。點特異誘變需要知道羧肽酶的DNA序列和編碼底物結(jié)合位點氨基酸密碼子的位置。編碼羧肽酶Y的PRC1基因的DNA序列和限制酶圖譜及DNA序列的來源在Valls等,細胞,48887-889(1987)中得到描述。
在活性位點內(nèi)的氨基酸如那些在S1、S1’、S2和S3亞位點內(nèi)的氨基酸可通過改變已知的羧肽酶的DNA序列中編碼氨基酸的密碼子來修飾。根據(jù)本發(fā)明,修飾的DNA序列包括編碼羧肽酶活性位點內(nèi)氨基酸的一個或多個密碼子。優(yōu)選地,羧肽酶的修飾涉及與已知的絲氨酸或半胱氨酸羧肽酶活性位點中密碼子編碼的氨基酸不同的氨基酸的密碼子的替換。優(yōu)選地,替換涉及編碼羧肽酶S1、S1’、S2或S3結(jié)合亞位點內(nèi)的氨基酸的密碼子。氨基酸的密碼子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
點特異誘變可通過在所述密碼子位置摻入含有突變或修改的密碼子的寡核苷酸來完成。可以使用如Maniatis等《分子克隆指南》(1989)中所述的其它點特異誘變方法。優(yōu)選的將寡核苷酸摻入編碼已知羧肽酶的DNA序列的方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和標(biāo)準(zhǔn)的克隆技術(shù)。
含有修飾密碼子的寡核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法包括自動合成獲得。自動合成DNA的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
合成的寡核苷酸一旦形成,就將其摻入已知的羧肽酶DNA序列的框架中。合成寡核苷酸的插入可通過用至少一種限制性內(nèi)切酶切割使靶位點內(nèi)的DNA序列缺失,接著通過將合成的寡核苷酸連接入原始DNA序列缺失的位點而實現(xiàn)。合適的限制性內(nèi)切酶可通過檢查靶位點周圍的核苷酸序列和要插入到該位點的合成寡核苷酸的大小來決定。限制性酶的識別序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知,并且酶的適當(dāng)組合可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員選出。修飾的羧肽酶的表達;在優(yōu)選的形式中,羧肽酶Y S1亞位點內(nèi)氨基酸的密碼子得到修飾以編碼具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸如谷氨酸或天冬氨酸。為實現(xiàn)羧肽酶中氨基酸的替換,使用已知的定點誘變方法突變編碼羧肽酶的基因以表達所需的替換的氨基酸。
編碼羧肽酶Y的PRC1基因可從質(zhì)粒pTSY3獲得,pTSY3可從在Rockville,MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)得到,保藏號為75580。包含所需的替換的序列,即在對應(yīng)于天然密碼子的位點包含氨基酸替換的密碼子的寡核苷酸可通過例如自動DNA合成的方法合成。PCR技術(shù)可用于將替換摻入羧肽酶Y的基因中。
然后將修飾的DNA序列摻入載體以進行篩選和表達。適當(dāng)?shù)妮d體包括酵母細菌穿梭載體YEp24、pRA21ABAM、pYSP1、pTSY2、pRA21和pYSP32。修飾的DNA序列用已知的如Maniatis等,同上述和Nielsen等,Appl.Microbiol.Biotechnol.33307(1990)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法摻入載體中。
將載體導(dǎo)入合適的宿主細胞以進行篩選和表達。合適的宿主細胞包括細菌如大腸桿菌和酵母如釀酒酵母。優(yōu)選的宿主細胞包括具有等基因的vp1突變、δ-prc1突變和ura3突變的釀酒酵母菌株。特別優(yōu)選的宿主是如上所引用的Nielsen等所述的具有導(dǎo)致活性羧肽酶Y分泌的vp1突變的釀酒酵母菌株。優(yōu)選的載體是質(zhì)粒pTSY,它是如上所述的帶有含有在PRC1啟動子控制下的PRC1基因的3.2kb DNA插入片段的酵母細菌穿梭載體YEp24。
合適的宿主細胞通過一些標(biāo)準(zhǔn)方法進行轉(zhuǎn)化,包括用磷酸鈣、氯化擇。通過用如上所引用的Nielsen等所述的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測轉(zhuǎn)化細胞水解肽底物的能力,來篩選轉(zhuǎn)化的酵母細胞產(chǎn)生的突變羧肽酶活性。
一旦轉(zhuǎn)化的細胞得到選擇和擴增,修飾的羧肽酶可用標(biāo)準(zhǔn)方法如高效液相層析和親和層析來純化。使用修飾的羧肽酶對底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用本發(fā)明也提供使用修飾的羧肽酶以親核物質(zhì)對肽底物轉(zhuǎn)酰胺基的方法。本發(fā)明的修飾羧肽酶設(shè)計為改善含有帶正電次末位氨基酸殘基的肽底物的轉(zhuǎn)酰胺基作用。
轉(zhuǎn)酰胺基作用一般在水緩沖溶液中進行。優(yōu)選的緩沖液包含50mMHEPES和5mM EDTA pH7.5或50mM CHES和5mM EDTA pH9.5。重要的是所選緩沖液不能在轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)中作用為親核物質(zhì)。
轉(zhuǎn)酰胺基作用產(chǎn)物的生產(chǎn)一般通過高效液相層析或其它適當(dāng)?shù)姆治黾夹g(shù)來監(jiān)測。反應(yīng)通過加入酸性溶液使反應(yīng)混合物的pH下降到約pH1-3而終止?;蛘撸磻?yīng)可通過加入酶抑制劑如苯甲基磺酰氟(PMSF)或二異丙基氟磷酸(DFP)而終止。轉(zhuǎn)酰胺基產(chǎn)物可通過反相層析、疏水作用層析、離子交換層析或高效液相層析從反應(yīng)混合物分離。
或者,轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)在有機溶劑中進行。對轉(zhuǎn)酰胺基作用合適的有機溶劑包括二甲基亞砜(DMSO)、N,N’-二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺和其它類似溶劑。有機溶劑中轉(zhuǎn)酰胺基作用的方法學(xué)在Bongers等Int.J.Peptide Protein Res.,40268(1992)中得到描述。
在水溶液中轉(zhuǎn)酰胺基的一個實施例中,肽底物GRF(1-44)-Ala溶于5%醋酸溶液中。親核物質(zhì)如亮氨酰胺溶于50mM HEPES,5mMEDTA至500mM終濃度。每950μl親核物質(zhì)溶液加入25μl GRF(1-44)-Ala溶液,并且20℃時pH為7.5。每毫升溶液加入溶于25μl水中的修飾羧肽酶如L178S+M398L+N51Q修飾羧肽酶Y至混合物中,得達到約0.002到0.07mg/ml酶濃度。反應(yīng)通過高效液相層析監(jiān)測并在沒有其它產(chǎn)物形成時通過加入一倍體積的2.5%三氟乙酸來中止。
在另一實施例中,肽底物GLP1(7-36)-Ala溶于5%醋酸溶液中。親核物質(zhì)O-硝基苯甘氨酰胺(“ONPGA”)溶于50mM HEPES,50mMEDTA至250mM終濃度。每950μl親核物質(zhì)溶液加入25μl的40mM GLP1中。親核物質(zhì)O-硝基苯甘氨酰胺(“ONPGA”)溶于50mM HEPES,50mMEDTA至250mM終濃度。每950μl親核物質(zhì)溶液加入25μl的40mM GLP1(7-36)-Ala溶液,并且pH在20℃時為7.5。每毫升溶液加入溶于25μl水中的修飾羧肽物如L178S+M398L+N51Q修飾羧肽酶至混合物中,得到約0.002到0.07mg/ml的酶濃度。反應(yīng)后接著進行高效液相層析并在沒有其它產(chǎn)物形成時通過加入一倍體積的2.5%三氟乙酸來中止。
轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物GLP1(7-36)-ONPGA可通過光解作用切割。將溶于12.5ml甲醇中的GLP1(7-36)-ONPGA加入80mM NaHSO3(12.5ml)中并且pH用5N NaOH調(diào)節(jié)到9.5。然后反應(yīng)混合物用N2清洗15分鐘,隨后用SP200燈在氮氣環(huán)境下光解。然后分別在光解后0、30、60和120分鐘提取樣品進行分析。用高效液相層析分析每一樣品,將結(jié)果與對照樣品比較。
此處公開的對羧肽酶的任何修飾適用于上述兩種轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)的任意一個。修飾的羧肽酶包含其中將帶負電氨基酸殘基引入S1亞位點中,優(yōu)選地178位的替換。合適的替換包括L178D或E。優(yōu)選地,修飾的羧肽酶進一步包含在S1’亞位點優(yōu)選地在M398位的替換。合適的替換包括M398L。并且,修飾的羧肽酶可進一步包含引入能與肽底物P3位如241位或245位帶正電氨基酸殘基相互作用的具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸殘基的替換。用于對GRF前體進行轉(zhuǎn)酰胺基的羧肽酶優(yōu)選地在S2亞位點含有疏水性替換以增強羧肽酶與P2丙氨酸殘基的相互作用。
實施例本發(fā)明將通過下列實施例進一步得到說明。這些實施例并不意味著限制前面描述中已充分說明的本發(fā)明的范圍。本發(fā)明觀念內(nèi)的變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。實施例1方法用于這些研究的突變羧肽酶基本上按照公開的PCT專利申請?zhí)朩O95/20039中所述的步驟通過定點誘變產(chǎn)生。一般而言,使用合成的編碼氨基酸替換的寡核苷酸制備突變的酶。
轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)基本上按照PCT申請WO95/20039中所述的進行。一般而言,方法包括將親核物質(zhì)(H-Leu-NH2,除非另有說明)溶于50mMHEPES,5mM EDTA并調(diào)節(jié)pH到7.5。將5μl肽底物(8mM Bz-G-A-R-A-R-A-OH,除非另外說明,在甲醇中)加入190μl親核物質(zhì)溶液中,然后加5μl酶,得到0.2mM底物濃度。
反應(yīng)過程中,從反應(yīng)混合物取出20μl等分樣品并將其加入50μl的1%三氟乙酸中以中止反應(yīng)。反應(yīng)物的成分通過高效液相層析使用裝有C-18 Waters Novapac 4μ反相柱和0.1%三氟乙酸中不同乙腈梯度的Waters高效液相層析測定。在254nm處測到分離,使得可以從總的峰面積直接對產(chǎn)物定量。反應(yīng)混合物的成分在反應(yīng)過程中至少測定兩次,第一次是在底物在反應(yīng)中消耗了20~50%(優(yōu)選地35%)時,第二次是肽底物消耗了50-90%(優(yōu)選地80%)時。
酸水解之后收集反應(yīng)產(chǎn)物并用Pharmacia Alpha Plus分析儀通過氨基酸分析加以鑒定。進一步的鑒定通過真正標(biāo)準(zhǔn)的化合物的混合層析法進行。
氨解比例(fa)表示為形成的氨解產(chǎn)物與所有形成產(chǎn)物的總和之間的比率。未消耗的底物未計算在內(nèi)。表1羧肽酶Y和S1突變體在含P1位丙氨酸的底物的轉(zhuǎn)肽作用中的氨解比例(fa)。<
>t=分析時間反應(yīng)用2mM底物于pH7.5進行[E]=0.1mg/mlN=親核物質(zhì)(H-Leu-NH2)S=底物(Bz-G-A-R-A-R-A-OH)P=產(chǎn)物(Bz-G-A-R-A-R-L-NH2)以及fa=氨解比例從得到的較低的氨解比例(fa=0.05)可以看出,野生羧肽酶Y不能有效地用亮氨酰胺親核物質(zhì)催化在P1含精氨酸殘基的肽底物的轉(zhuǎn)肽作用。相反,用丙氨酸、絲氨酸成天冬氨酸替換178位亮氨酸或用天冬酰胺或天冬氨酸替換312位色氨酸使獲得的氨解比例大幅上升。用帶負電氨基酸殘基如谷氨酸替換241位上的精氨酸,在375mM親核物質(zhì)濃度時顯著增加獲得的氨解比例。并且,帶負電氨基酸殘基如谷氨酸在245位的替換也使氨解比例上升。突變組合包括在L178和W312位或L245和W312位上的替換,也表現(xiàn)出氨解比例的顯著升高。實施例2方法點特異突變?nèi)鐚嵤├?中所述的進行以產(chǎn)生下面所用的S1’突變體。
轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)如實施例1中所述的進行。表2用S1’突變的羧肽酶Y對FA-Ala-Xaa-OH與H-Gly-NH進行轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的氨解比例(fa)
反應(yīng)條件0.2mM FA-Ala-Xaa-OH底物,1.9M H-Gly-NH2親核物質(zhì),50mM HEPES,5mM EDTA,pH7.5,室溫從表2中的數(shù)據(jù)可以看出,在轉(zhuǎn)肽反應(yīng)中,野生型羧肽酶Y對在P1’位含丙氨酸作為離去基因的肽底物有非常強和狹窄的偏愛性。在羧肽酶Y S1’亞位點內(nèi)T60和M398位的氨基酸替換拓寬了羧肽酶的特異性,使氨解比例在其它氨基酸(如纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸)作為離去基因時上升。從表中可以看出,取決于離去基因,不同替換對氨解比例有不同效應(yīng)。亮氨酸作為離去基因時,T60位的替換如T60A、T60W或T60Y在氨解比例的提高方面最有效。并且,M398位上的替換在亮氨酸作為離去基團時對氨解比例有顯著效應(yīng)。增強用羧肽酶Y和含亮氨酸作為離去基團的底物的轉(zhuǎn)肽作用的M398位上的替換的實例包括M398A、M398V、M398G、M398I、M398L、M398F、M398Y、M398C、M398N和M398E。同時在T60和M398位替換進一步改善以亮氨酸為離去基團的底物的氨解比例,包括T60F+M398F、T60A+M398L、T60Y+M398I、T60D+M398L、T60A+M398Y、T60Y+M318Y和T60D+M398Y。實施例3方法點特異誘變按實施例1所述的進行以產(chǎn)生下面所述的特異替換突變體。轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)按實施例1中所述的進行。
在下面的表3中,KN(app)代表fa為最大值的一半時親核物質(zhì)的濃度(親核物質(zhì)解離常數(shù)的測量值)。famax是在酶與親核物質(zhì)飽合時可能獲得的最高fa。表3用雙替換突變體時FA-Ala-OBzl與H-Leu-NH2的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)
>稱為a的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差是±0-3%,而標(biāo)為b的表示±3-10%的偏差,標(biāo)為c的表示±10%-30%。底物=FA-Ala-OBzl(0.2mM),親核物質(zhì)=H-Leu-NH2,pH=7.5。
KN(app)表示達到famax/2時親核物質(zhì)的濃度并因此描述了親核物質(zhì)的表觀結(jié)合常數(shù)。因為認為競爭性水解反應(yīng)是在離去基團仍然與?;?酶中間體結(jié)合時發(fā)生的,所以低KN(app)是優(yōu)選的。
在圖3中,下列突變體在KN(app)降低時表現(xiàn)famax上升T60F、T60C和M2398。其它突變體如T60V、T60L、T60F、T60W、T60C、T60M、M298L和M398F表現(xiàn)famax和KN(app)的同時上升。實施例4方法點特異誘變按實施例1中所述的進行以產(chǎn)生下述的特異突變體。轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)按實施例1中所述的進行。表4Bz-G-A-R-A-R-X-OH在pH7.5底物消耗50%時的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)
反應(yīng)條件2mM Bz-G-A-R-A-R-X-OH底物;375mM H-Leu-NH2親核物質(zhì);[E]=0.1mg/mL,pH=7.5;Pmax=峰產(chǎn)品產(chǎn)量(peak product yield)表4中的數(shù)據(jù)證明底物的轉(zhuǎn)肽作用比率受離去基團性質(zhì)的影響。S1’亞位點內(nèi)N51和M398位的替換增強對特定離去基團的轉(zhuǎn)肽作用。例如,用下列突變體增加亮氨酸作為離去基團時的氨解比例T60Y+L178S+M2398L和N51Q+L178S+M398L。并且,峰產(chǎn)品產(chǎn)量通過野生型突變體在L178、M398、N51或T60Y位的替換從0開始得到增強。L178S含有S1內(nèi)的突變。當(dāng)與S1’內(nèi)的替換如M398L或T60Y和M398L或N51Q和M398L結(jié)合時,以亮氨酸為離去基團的氨解比例顯著上升,分別從0.01上升到0.39、0.71和0.76。并且,峰產(chǎn)品產(chǎn)量也有相應(yīng)上升,分別從0.01上升到0.39、0.53和0.73。實施例5方法點特異誘變按實施例1中所述的進行以產(chǎn)生下列特異突變體。轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)按實施例1中所述的進行。表5Bz-G-A-R-A-R-X-OH于pH6.5在底物消耗50%時的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)
反應(yīng)條件2mM Bz-G-A-R-A-X-OH底物;750mM H-Leu-NH2親核物質(zhì);[E]=0.1mg/ml,pH 6.5;Pmax=峰產(chǎn)品產(chǎn)量。
表5中的數(shù)據(jù)表明在S1和S1’亞位點內(nèi)含有替換的羧肽酶突變體在pH 6.5時得到的氨解比例得到增加(與表4中的pH 7.5相比)。例如,以亮氨酸作為離去基團,突變體N51Q+L178S的fa從0.20上升到0.28,Pmax從0.18上升到0.26。實施例6方法點特異誘變按實施例1中所述的進行以產(chǎn)生下述特異突變體。轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)按前面實施例所述的進行。表6Bz-G-A-R-A-R-A-OH和FA-Arg-Ala-OH的轉(zhuǎn)酰胺基作用
*[s]=0.2mM親核物質(zhì)=H-Leu-NH2[N]=375mMpH=7.5[E]=0.1mg/mL對于含有帶正電荷P1氨基酸殘基如精氨酸的肽底物的轉(zhuǎn)肽反應(yīng),S1(L178S)和S1’(M398L)亞位點中氨基酸殘基的同時替換使在P1含有帶正電荷氨基酸殘基的肽底物的所得氨解比例和峰產(chǎn)品產(chǎn)量顯著上升。并且,在S1亞位點如N241、L245或W312中帶負電荷氨基酸殘基如天冬氨酸或谷氨酸的替換也導(dǎo)致fa和Pmax的上升。
本說明書中所有公開文獻和專利申請表明了與本發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平。所有公開文獻和專利申請在此相同程度地引用作為參考,就如每個單獨的公開文獻或?qū)@暾埦唧w并獨立地作為參考。
本發(fā)明已參考各個具體并優(yōu)選的實施方案和技術(shù)得到描述。然而,應(yīng)當(dāng)理解在保持本發(fā)明的精神和范圍之下可進行多種變化和修飾。
序列表(1)基本信息(i)申請人CARLSBERG實驗室(ii)本發(fā)明題目修飾的羧肽酶(iii)序列數(shù)3(iv)聯(lián)系地址(A)收信人Merchant,Gould,Smith,Edell,Welter &
Schmidt(B)街道3100 Norwest Center,90 South 7th Street(C)城市Minneapolis(D)州MN(E)國家美國(F)ZIP55402(v)計算讀取形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM兼容機(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ for Windows 2.0版(vi)日前申請資料(A)申請?zhí)栁粗付?B)申請日1998年2月27日(C)分類(vii)優(yōu)先申請資料(A)申請?zhí)杘8/807,263(B)申請日1997年2月28日(viii)律師/代理人信息(A)姓名Kettelberger,Denise M(B)登記號33,924(C)參考/著錄號8648.71WO 01(ix)電信信息
(A)電話612-332-5300(B)傳真612-332-9081(C)電報(2)有關(guān)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度44個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線形(xi)序列描述SEQ ID NO1Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln1 5 10 15Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly20 25 30Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Xaa35 40(2)有關(guān)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線形(xi)序列描述SEQ ID NO2His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val1 5 10 15Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu20 25 30Val Lys Gly Arg Xaa35(2)有關(guān)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線形(xi)序列描述SEQ ID NO3His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa20 25 30
權(quán)利要求
1.一種用于對含有具有帶正電側(cè)鏈的P1氨基酸殘基的肽底物進行轉(zhuǎn)酰胺基作用的方法,此方法包括在修飾的羧肽酶Y的參與下使肽底物與親核物質(zhì)反應(yīng),其中修飾的羧肽酶包含至少一個在S1亞位點中使用具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸的替換。
2.權(quán)利要求1的方法,其中修飾的羧肽酶包含至少一個在氨基酸殘基L178、W312、N241或L245處的替換。
3.權(quán)利要求2的方法,其中L178、W312、N241或L245中的至少一個由天冬氨酸或谷氨酸替換。
4.權(quán)利要求1的方法,其中親核物質(zhì)包括氨基酸酯或氨基酸酰胺。
5.權(quán)利要求4的方法,其中親核物質(zhì)包括Leu-OH、Leu-OR或Leu-NRR’。
6.權(quán)利要求1的方法,其中修飾的羧肽酶包含至少一個在S1’、S2或S3亞位點中的替換的氨基酸。
7.權(quán)利要求1的方法,其中修飾的羧肽酶進一步包含至少一個選自N51Q、T60W、T60Y、T60A、M398L、M398G、M398A、M398V、M398I、M398F、M398Y、M398C、M398N和M398E的S1’亞位點中的替換。
8.權(quán)利要求7的方法,其中修飾的羧肽酶進一步包含在S1’亞位點中的兩個或多個氨基酸替換。
9.權(quán)利要求8的方法,其中S1’亞位點中的兩個或多個替換包括至少一個T60位的替換和至少一個M398位的替換。
10.權(quán)利要求9的方法,其中T60位的替換是T60F、T60L、T60Y或T60D。
11.權(quán)利要求9的方法,其中M398位的替換是M398F、M398L或M398Y。
12.權(quán)利要求1的方法,其中修飾的羧肽酶進一步包含在S2亞位點中的至少一個氨基酸替換。
13.權(quán)利要求12的方法,其中S2亞位點中的替換是在E296、S297或N303位的至少其中之一中。
14.權(quán)利要求12的方法,其中S2亞位點中的替換是E296F、S297A、N303A或N303F。
15.權(quán)利要求12的方法,其中肽底物在P2包含丙氨酸殘基。
16.權(quán)利要求1的方法,其中修飾的羧肽酶Y進一步包含至少一個能與具有帶正電側(cè)鏈的肽底物P3殘基相互作用的氨基酸殘基的第二個替換。
17.權(quán)利要求1的方法,其中修飾的羧肽酶包含至少一個能與肽底物P3殘基相互作用的氨基酸殘基的第二個替換,其中第二個替換引入具有帶負電側(cè)鏈的氨基酸。
18.權(quán)利要求16的方法,其中第二個替換是在N241、N242、L245或A246位的至少其中之一中。
19.權(quán)利要求1的方法,其中反應(yīng)是在約pH6.3到約pH6.7進行。
20.修飾的羧肽酶Y,包含在N241或N245位的至少其中之一中的替換的氨基酸,其中替換的氨基酸有帶負電的側(cè)鏈。
21.權(quán)利要求20的修飾的羧肽酶,進一步包含至少一個在S1’、S2或S3亞位點中的替換的氨基酸殘基。
22.權(quán)利要求20的修飾的羧肽酶,進一步包含在L178或W312位的至少其中之一中的替換的氨基酸殘基。
23.權(quán)利要求20的修飾的羧肽酶,進一步包含替換L178S和M398L。
全文摘要
本發(fā)明涉及對含有具有帶正電側(cè)鏈的P
文檔編號C12P13/02GK1252836SQ98802877
公開日2000年5月10日 申請日期1998年2月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月28日
發(fā)明者U·莫坦森, K·歐萊森, H·斯坦尼科, S·B·索蘭森, K·布萊丹姆 申請人:卡爾斯伯格實驗室