專利名稱：直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乳酸菌凍干粉的制備，具體是指一種直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉 及其制備方法。
技術背景傳統(tǒng)的商業(yè)發(fā)酵劑所含活菌量少，約為107-108個&，不能直接用于生產(chǎn)，需經(jīng)過活化、擴增才能用于乳品生產(chǎn)，這種發(fā)酵劑用量大，制作過程繁雜，質量不易控制，容易污染雜 菌和噬菌體，菌種隨著傳代數(shù)增加而改變，導致發(fā)酵產(chǎn)品質量不穩(wěn)定，可重復性差。直投 式乳酸菌發(fā)酵劑指不需要經(jīng)過活化、擴增而直接應用于生產(chǎn)的一類新型發(fā)酵劑，該種發(fā)酵 劑的關鍵是要活菌數(shù)要高，以保證接種量少，接種后可快速復水，可在比較短的時間內(nèi)完 成發(fā)酵過程。制備這種發(fā)酵劑的關鍵在于增菌培養(yǎng)條件、保護劑和真空干燥條件的選擇，因為干酪 乳桿菌鼠李糖亞種在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乳酸，乳酸積累到一定程度會抑制乳酸菌自身的生長；該菌的收獲時間也非常關鍵，微生物生長分成延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰退期， 收獲采用離心和冷凍干燥，離心和冷凍干燥對不同菌齡的細胞損傷不一樣，因此收獲的菌 齡非常重要；收獲后的菌體細胞需要加入保護劑進行懸浮，菌體細胞懸浮密度對凍干后的 存活率有影響；細菌在冷凍干燥過程中非常容易受到損傷，因此需要加入合適的保護劑， 而保護劑又分成滲透性和非滲透性，只有滲透性保護劑不僅存在細胞表面，而且還可以滲 透到細胞內(nèi)部，從而有效阻止細胞內(nèi)外的冷凍損傷，另外保護劑的持水性對細胞的冷凍損 傷也有非常重要的影響；預凍溫度、預凍時間和預凍速率對細菌細胞的存活率和復水性影 響也很大，因此在預凍過程中盡量生成小冰晶，有利于冷凍干燥后發(fā)酵劑的復水。劉冬梅等人于《華南理工大學學報(自然科學版)》2006年第五期發(fā)表的"潛在益生 菌鼠李糖乳桿菌在大豆奶酪中的穩(wěn)定性"中報道了Za"o6"d〃w;ysubsp, 7'/^m"cww;y 6013 在MRS基礎培養(yǎng)基的培養(yǎng)上清液對S. flww^有很好的抑菌作用。申請?zhí)枮?00610123898.7 的中國發(fā)明公開了 "一種即食含活益生菌的泡菜及其制備方法"，其干酪乳桿菌鼠李糖亞 種6013可用于泡菜的發(fā)酵并在24h完成發(fā)酵。劉冬梅等人于《華南理工大學學報(自然科 學版)》2008年第七期發(fā)表的"丄flcto6ac/〃w caw/ subsp. LCR719抑制泡菜中的 亞硝酸鹽"中報道了該菌在泡菜發(fā)酵過程中能抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生。吳暉等人于《食品工 業(yè)科技》2008年第四期發(fā)表的"鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸培養(yǎng)基的優(yōu)化"中報道了該 菌能發(fā)酵產(chǎn)生L-乳酸的產(chǎn)量高達143.6g/L。為了使該菌能在工業(yè)上大量生產(chǎn)和應用，對其進行增菌培養(yǎng)，以獲得能直接用于生產(chǎn)的高密度發(fā)酵劑。乳酸(Lactic acid)的學名為2-羥基丙酸，結構式為CH3CHOHCOOH，相對分子質量 為90.0S,由于分子內(nèi)含有一個不對稱碳原子，因此具有旋光異構現(xiàn)象，可區(qū)分為L-乳酸和 D-乳酸，當兩者以等比例混合時，即成為內(nèi)消旋的DL-乳酸。由于人體只有代謝L-乳酸的 L-乳酸脫氫酶，世界衛(wèi)生組織提倡在食品及醫(yī)藥行業(yè)中使用L-乳酸取代目前普遍使用的 DL-乳酸，WHO明確規(guī)定，人體每天攝取D-乳酸的量限制在100mg/kg體重以下，而對L-乳酸不加限制。研究含L-乳酸的食品以替代含D-乳酸和DL-乳酸的食品具有重要意義。申請?zhí)枮?00710048203.8的中國發(fā)明公開了一種"高活性泡菜直投式菌劑的制備技 術"，是將植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌、酵母菌按一定的比例混合的復合菌劑。 但是沒有公開菌粉中各個菌的活菌數(shù)量，沒有用到干酪乳桿菌鼠李糖亞種，用于泡菜發(fā)酵 時耗時為48h,也沒有涉及發(fā)酵后泡菜中亞硝酸鹽的情況，同時也沒有明確凍干粉的包裝 方式和包裝條件。專利號為200610010517.4的中國發(fā)明公開了 "直投式酸奶發(fā)酵菌劑的生產(chǎn)方法"，是將 嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等菌進行分別培養(yǎng)，沒有用到干酪乳桿菌鼠李糖亞 種，該菌劑也是復合菌劑且只用于酸奶發(fā)酵，其中的活菌數(shù)量為104-101()個&，同時也沒有 明確凍干粉的包裝方式和包裝條件。專利號為02144963.5的中國發(fā)明專利公開了 "直投式酸奶發(fā)酵劑的制作方法"，是將嗜 熱鏈球菌和保加利亞桿菌進行混合培養(yǎng)，經(jīng)一系列工序制成的復合菌劑。但是沒有公開菌 劑中各個菌的活菌數(shù)量，沒有用到干酪乳桿菌鼠李糖亞種，該菌劑只用于酸奶發(fā)酵。用了 充氮包裝，但沒有明確包裝過程中氣流濕度和環(huán)境濕度。專利號為200410088476.1 (授權公告號CN 1285292C)的中國發(fā)明專利公開了 "一種 用于生產(chǎn)泡菜的直投式復合菌粉產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法"，是復合菌劑，菌粉的活菌數(shù)量為 108~109個&，擴大培養(yǎng)過程中沒有進行在線控制pH，所以無法實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，該菌劑用 于泡菜發(fā)酵耗時36 50h，也沒有涉及發(fā)酵后泡菜中亞硝酸鹽的情況，同時也沒有明確凍干 粉的包裝方式。上述現(xiàn)有技術由于沒有采用在線調控發(fā)酵pH值，并且所選擇的增菌培養(yǎng)基、收獲菌 齡、保護劑、預凍的條件和包裝條件等不合適，普遍存在活菌數(shù)量不高、用于生產(chǎn)時發(fā)酵 時間長、復水速率差等缺點，而且沒有考慮凍干粉中含有乳糖、葡萄糖等糖類，在貯存過 程中會吸潮的問題。5發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種活菌數(shù)含量為10u~1012 cfb/g、用于生產(chǎn)時發(fā)酵時間短、復水性好的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉及其制備 方法。該直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉可用于發(fā)酵生產(chǎn)醬腌菜(含泡菜)、香腸、 酸奶、L-乳酸、玉米粉、豆粕、花生粕和用作益生菌制劑等。本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)一種直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，包括如下步驟和工藝條件-第一步將干酪乳桿菌鼠李糖亞種aactotoc/〃w owe/ subsp. 7'/ww"asw;y 6013 ，簡稱LCR 6013)的凍干粉置于MRS (由de Man， Rogosa和Sharp在1960年發(fā)明，簡稱MRS)培養(yǎng)基 中，于28~30 。C靜止培養(yǎng)24 h~36 h，制成母發(fā)酵劑；以重量份數(shù)計，所述MRS培養(yǎng)基配方 為蛋白胨0.8 1.0份，酵母抽提物0.5 0.7份，葡萄糖1.5 2.0份，檸檬酸二銨0.1 0.2份，硫 酸鎂0.048 0.058份，牛肉膏0.5 1.0份，磷酸氫二鉀0.1 0.2份，硫酸錳0.015 0.025份，乙酸 鈉0.4 0.5份，吐溫80 0.1~0.3份，蒸餾水94.0 96.0份；攪拌溶解均勻后用0.08 0.10 MPa滅 菌15~20 min，冷卻至28~30 。C備用；第二步以體積比為2 5: IOO的比例，將母發(fā)酵劑接入工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基中，于28~30 。C靜止培養(yǎng)24h 36h，制成工作發(fā)酵劑；以重量份數(shù)計，所述工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基配方為-蛋白胨0.8 1.0份，酵母抽提物0.5 0.7份，葡萄糖1.5 2.0份，檸檬酸二銨0.1 0.2份，硫酸鎂 0.048~0.058份，牛肉膏0.5 1.0份，磷酸氫二鉀0.1 0,2份，硫酸錳0.015 0.025份，乙酸鈉 0.4~0.5份，吐溫80 0.1~0.3份，番茄汁6.0 8.0份，胡蘿卜汁4.5 6.0份，抗壞血酸0.02~0.04 份和蒸餾水79.8 85.4份；攪拌溶解均勻后用0.08 0.10 MPa滅菌15 20 min ，冷卻至28~30 。C 備用；第三步以體積比為2 5: IOO的比例，將工作發(fā)酵劑接入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于35~37 。C 下的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程用NaOH溶液調整pH為6.0 6.8，攪拌轉速為100 150 rpm，培養(yǎng)16 24h后收集，得發(fā)酵菌懸液；以重量份數(shù)計，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基配方組成為-蛋白胨2.5 3.0份，酵母抽提物0.5 0.7份，葡萄糖1.5 2.0份，檸檬酸二銨0.1 0,2份，硫酸鎂 0.048 0.058份，牛肉膏0.5 1.0份，磷酸氫二鉀0.1 0.2份，硫酸錳0.015 0.025份，乙酸鈉 0.4~0.5份，吐溫80 0.1~0.3份，番茄汁6.0 8.0份，胡蘿卜汁4.5 6.0份，抗壞血酸0.02~0.04 份，蒸餾水78.0 83.7份；攪拌溶解均勻后用0.08 0.10MPa滅菌15 20min，冷卻至35 37。C 備用；第四步將發(fā)酵菌懸液于5000 8000 rpm，離心20~25 min，舍棄上清液，收集菌泥； 第五步在菌泥中，按復合保護劑溶液的生理鹽水溶液與菌泥的體積比為3 5: l加入復合保護劑溶液，混合均勻為保護劑懸浮液；以重量份數(shù)計，所述的復合保護劑溶液配方 組成為海藻糖5~10份，脫脂奶粉5~10份，氯化鈉0.9份，蒸餾水79.1~89.1份，溶解后 攪拌均勻，用0.08 0.10MPa滅菌15 20min，冷卻至常溫備用；第六步將保護劑懸浮液置于淺盤中，在于-40 °C~-65 。C下預凍0.5 h~2.0 h,使保護劑 懸浮液厚度為5 15 mm;第七步將第六步所得的保護劑懸浮液置于真空冷凍干燥機中，于冷阱溫度為-40 。C -65。C，真空度為1.3 13.0Pa，干燥18 20h，得凍干粉，凍干粉水分重量含量低于3 %， 活菌數(shù)達到1011 1012 cfii/g;第八步用濕度為50~60 %的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢復到常溫，在濕度為50~60 % 的環(huán)境中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的無菌干燥空氣的濕度不應高于 20 %。為進一步實現(xiàn)本發(fā)明目的，第三步工作發(fā)酵劑與生產(chǎn)培養(yǎng)基的體積比優(yōu)選為3: 100， NaOH溶液的濃度優(yōu)選為l 2mol/L， pH優(yōu)選為6.8，發(fā)酵溫度優(yōu)選為37。C。所述第五步中海藻糖優(yōu)選為10份，脫脂奶粉優(yōu)選為10份，氯化鈉優(yōu)選為0.9份。 第一步或第二步的發(fā)酵溫度優(yōu)選為30 。C，培養(yǎng)時間優(yōu)選為24 h。 第六歩的淺盤厚度為40-50 mm。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果(1) 本發(fā)明的工作發(fā)酵劑用兩種培養(yǎng)基依次培養(yǎng)，使干酪乳桿菌鼠李糖亞種盡量活 化，并處同步生長狀態(tài)。(2) 本發(fā)明所用的生產(chǎn)培養(yǎng)基，采用番茄汁、胡蘿卜汁和抗壞血酸能保證菌體生長 過程中所需要的生長因子，促進菌體大量生長。(3) 本發(fā)明所用的凍干保護劑為5~10%海藻糖和5~10%脫脂奶粉的生理鹽水溶液， 確保了凍干粉的活菌數(shù)達到10" l(^cfu/g。所用的培養(yǎng)基全部為可食用的，保護劑脫脂奶 粉及海藻糖也為可食用的食品配料，急性毒理試驗表明該菌種是無毒可使用的，該菌株也 是中國工業(yè)微生物菌種保藏中心保藏菌種。(4) 本發(fā)明凍干粉用于L-乳酸的生產(chǎn)時，于37 。C發(fā)酵96-120 h，控制其中的pH為 6.5，可使總乳酸的產(chǎn)量達到150g/L，其中L-乳酸的含量為9"/。以上；直接用于益生菌泡 菜(醬腌菜)的發(fā)酵生產(chǎn)時，發(fā)酵時間為24 30h，該菌能抑制發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的產(chǎn) 生，發(fā)酵終止后L-乳酸含量為92.3 %;用于發(fā)酵香腸時，在15-20 。C下發(fā)酵120-240 h， 可使發(fā)酵香腸的pH為5.2~5.8， L-乳酸相對含量為91.2%，發(fā)酵過程中可不使用亞硝酸鹽； 用于發(fā)酵豆粕(花生粕)時，加入原料同等量的水，在25 37。C下發(fā)酵24 72h，可提使7發(fā)酵豆粕(花生粕)的pH為5.0 6.0，其中L-乳酸相對含量為91.5。/。，蛋白質含量可提高 5.5~10.5%，并使大分子的蛋白質降解為24kDa以下；用于發(fā)酵玉米粉時，加入原料同等 量的水，在25~37 。C下發(fā)酵24~72 h，可使發(fā)酵玉米的pH為4.0~5.0，其中L-乳酸的相對 含量為93.0%;用于發(fā)酵酸奶的生產(chǎn)時，于41 。C發(fā)酵4.5~5.5 h，發(fā)酵酸奶酸味純正，濃 厚，發(fā)酵終止后其中含有91。/。以上的L-乳酸；因此可用于發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸、益生菌泡菜、 香腸、豆粕、花生粕、玉米和酸奶等，并使L-乳酸相對含量為91。/。以上。(5) 本發(fā)明制備的凍干粉活菌數(shù)高，不易結塊、復水性很好。(6) 保存方便，易于用于工藝生產(chǎn)，減少接種、擴培環(huán)節(jié)而減少了污染，保證了產(chǎn) 品質量的穩(wěn)定性，縮短了發(fā)酵周期，解決了生產(chǎn)的食品安全問題，符合規(guī)模化生產(chǎn)的需要。


圖1為干酪乳桿菌鼠李糖亞種在基礎MRS和實施例1改良MRS培養(yǎng)基的生長曲線； 圖2為實施例4用的LCR6013凍干粉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸和用傳統(tǒng)方法擴培的LCR6013發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的變化曲線；圖3為實施例5中用手性柱Chirex 3126的高效液相法檢測L-乳酸的含量圖；圖4a為實施例8對照樣的乳酸球菌發(fā)酵48 h的玉米粉的L-乳酸含量高效液相色譜圖；圖4b為實施例8用凍干粉LCR 6013發(fā)酵48 h的玉米粉的L-乳酸高效液相色譜圖。
具體實施方式
為更好理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明做進一步地詳細說明，但是本發(fā)明要求 保護的范圍并不局限于實施例表示的范圍。凍干粉的制備實施例1第一步將干酪乳桿菌鼠李糖亞種(編號CICC 6013，丄arfo6a"7/z^ ca"z' subsp. Aammw^ 6013，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏，地址北京市朝陽區(qū)霄云路32 號，郵編100027)的凍干粉置于MRS培養(yǎng)基中，于30。C靜止培養(yǎng)24h，制成母發(fā)酵劑； MRS培養(yǎng)基的配制蛋白胨10g，酵母抽提物5.0g，葡萄糖20.0g，檸檬酸二銨2.0g，硫酸 鎂0.58g，牛肉膏10.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸錳0.25g，乙酸鈉5.0 g，吐溫80 1mL,蒸 餾水944.0g，于0.08 MPa滅菌20 min，冷卻至30。C備用。第二步以體積比為3: IOO的比例，將母發(fā)酵劑接入工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基中，于30 。C靜 止培養(yǎng)24h，制成工作發(fā)酵劑。工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基的配制蛋白胨10g，酵母抽提物5.0g， 葡萄糖20.0g，檸檬酸二銨2.0g，硫酸鎂0.58g，牛肉膏10.0g，磷酸氫二鉀2.0 g,硫酸錳 0,25 g，乙酸鈉5.0g，吐溫80 1mL，番茄汁80mL，胡蘿卜汁60mL，抗壞血酸0.4g，用蒸餾水804.0g，于0.08 MPa滅菌20 min，冷卻至30 。C即得到工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基。番茄汁或胡蘿卜汁的制作將番茄或胡蘿卜用打漿機榨汁，將搾出的汁于8000 rpm, 離心20min，收集上清液，即得到番茄汁或胡蘿卜汁。第三步以體積比為2: IOO的比例，將工作發(fā)酵劑接入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于37 。C下的發(fā) 酵罐中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程用濃度為2 mol/L的NaOH溶液保持pH為6.8，攪拌轉速為150 rpm;培養(yǎng)20h后收集發(fā)酵菌懸液；生產(chǎn)培養(yǎng)基的配制蛋白胨30g，酵母抽提物5.0 g，葡 萄糖20.0g，檸檬酸二銨2.0g，硫酸鎂0.58g，牛肉膏10.0g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉5.0g，吐溫80 1mL，番茄汁80mL,胡蘿卜汁60mL，的抗壞血酸0.4 g，蒸餾水 790,0 g，于0.08 MPa滅菌20 min，冷卻至37 。C即得到生產(chǎn)培養(yǎng)基。第四步將發(fā)酵菌懸液于8000 rpm，離心20 min，舍棄上清液，收集菌泥； 第五步在菌泥中，按復合保護劑溶液與菌泥體積比為3: l加入復合保護劑溶液，混合 均勻為保護劑懸浮液；以重量份數(shù)計，所述的復合保護劑溶液配方組成為海藻糖IO g， 脫脂奶粉10g，氯化鈉0.9g，蒸餾水79.1g，溶解后攪拌均勻，用0.08 MPa滅菌20 min，冷 卻至常溫備用；第六步將保護劑懸浮液置于厚度為40mm淺盤中，于-65 。C下預凍0.5 h，使其在容器 壁上的厚度約為10mm;第七步將鋪上菌體的淺盤置于真空冷凍干燥機中，于冷阱溫度為-65。C，真空度為1.3 Pa，干燥18h，凍干粉的水分含量為2.0%，活菌數(shù)達到10"cfu/g。第八步用濕度為50 %的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢復到常溫，在濕度為50 %的環(huán)境 中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的無菌干燥空氣的濕度為15%，保證了 凍干粉不吸潮。通過對干酪乳桿菌鼠李糖亞種aa"o6ac/〃^ ca e/ subsp. r/^附wwws 6013)培養(yǎng)條件的 深入研究，嚴格控制發(fā)酵劑的發(fā)酵培養(yǎng)條件、發(fā)酵時間、凍干保護劑和真空干燥條件，選 擇兩次擴大發(fā)酵培養(yǎng)，盡量使所有的細胞處于同步生長時期，再在改良MRS培養(yǎng)基中進 行擴大培養(yǎng)，在線控制發(fā)酵pH和嚴格控制收獲時間，活細胞數(shù)達到1011 cfu/g，并保證了 該菌齡細胞免受離心和冷凍干燥凍干的損傷。以發(fā)酵時間對干酪乳桿菌鼠李糖亞種 aa"o6ac/〃^a^/subsp./'/7amwmw6013)活菌數(shù)的對數(shù)值作曲線如圖1，從圖1可以看 出，在MRS基礎培養(yǎng)基中，20h菌數(shù)達到最高值時，活菌數(shù)僅為4.50xl()Scfu/mL，而在 優(yōu)化的增菌培養(yǎng)基中經(jīng)過較短的遲滯期后即進入對數(shù)生長期，在12h左右進入對數(shù)生長期 末期，16h菌數(shù)可達1.67xl09cfu/mL，比MRS基礎培養(yǎng)基的提高了近4倍。與MRS基礎 培養(yǎng)基的相比較，在改良的MRS基礎培養(yǎng)基中生長時，pH下降較為緩慢，這說明氮源的增加可以中和生長后期菌體代謝的有機酸，從而有利于菌體繁殖。LCR6013在改良培養(yǎng)基 中約16h左右菌數(shù)達到最高，約為1.67xl09cfU/mL， 16 28h處于穩(wěn)定期，活菌數(shù)基本保 持不變。因此，最佳菌體收獲時間為16 24h之間。10% (質量)的海藻糖可使細胞存活 率達85.8%，添加15% (質量)的海藻糖可使其成活率達到91.9%，海藻糖比其它任何糖 對保護干的生物材料更有效。而選用大分子保護劑脫脂奶粉作為干燥介質，因為(1) 脫脂奶粉可以通過穩(wěn)定細胞膜的組成來防止細胞損傷；(2)在冷凍干燥過程中產(chǎn)生多孔 結構，使得脫水更加容易；(3)脫脂奶粉本身含有蛋白質可為細胞提供一個保護層的作 用。不同MnS04濃度對菌體存活率有著較大的影響，適當?shù)臐舛瓤梢蕴岣呔w的存活率。 而現(xiàn)有的技術當中由于選擇的發(fā)酵培養(yǎng)基不合適，沒有經(jīng)過兩次的擴大培養(yǎng)后再進行發(fā)酵 生產(chǎn)，沒有在線嚴格控制發(fā)酵pH，沒有嚴格控制收獲菌齡，凍干保護劑的選擇比較單一， 最后得到的活菌數(shù)都普遍較低。 實施例2第一步將干酪乳桿菌鼠李糖亞種(編號CICC 6013，丄""o6""7/w m e/ subsp. Aammw^ 6013，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏，地址北京市朝陽區(qū)霄云路32 號，郵編100027)的凍干粉置于MRS培養(yǎng)基中，于28。C靜止培養(yǎng)36h，制成母發(fā)酵劑； MRS培養(yǎng)基的配制蛋白胨8.0g，酵母抽提物7.0g，葡萄糖15.0g，檸檬酸二銨l.O g，硫 酸鎂0.48g，牛肉膏5.0g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸錳0.15g，乙酸鈉4.0g，吐溫80 3mL,蒸 餾水960g，于0.10MPa滅菌15min，冷卻至28。C備用。第二步以體積比為5: IOO的比例，將母發(fā)酵劑接入工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基中，于28 。C靜 止培養(yǎng)36h，制成工作發(fā)酵劑。工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基的配制蛋白胨8.0g，酵母抽提物7.0g， 葡萄糖15.0g，檸檬酸二銨1.0g，硫酸鎂0,48g，牛肉膏5.0g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸錳0.15 g，乙酸鈉4,0g，吐溫80 3mL，番茄汁60mL，胡蘿卜汁45mL，抗壞血酸0,2g，蒸餾水850.0 g，于0.1MPa滅菌15min，冷卻至28 。C即得到工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基。番茄汁或胡蘿卜汁的制作將番茄和胡蘿卜用打漿機搾汁，將搾出的汁于8000 rpm， 離心20min，收集上清液，即得到番茄汁或胡蘿卜汁。第三步以體積比為5: IOO的比例，將工作發(fā)酵劑接入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于35 。C下的發(fā) 酵罐中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程用l mol/L的NaOH溶液保持pH為6.5，攪拌轉速為IOO rpm， 培養(yǎng)24 h后收集，為發(fā)酵菌懸液；生產(chǎn)培養(yǎng)基的配制蛋白胨25 g，酵母抽提物7.0 g，葡 萄糖15.0g，檸檬酸二銨1.0g，硫酸鎂0.48g，牛肉膏5.0g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸錳0.15g， 乙酸鈉4,0g，吐溫80 3mL，番茄汁60mL，胡蘿卜汁45mL，抗壞血酸0.2 g，蒸餾水835.0 g， 于O.IO MPa滅菌15 min，冷卻至35 。C即得到生產(chǎn)培養(yǎng)基。第四步將發(fā)酵菌懸液于6500 rpm，離心22 min，舍棄上清液，收集菌泥；
第五步在菌泥中，按復合保護劑的溶液與菌泥體積比為5: l加入復合保護劑溶液，混 合均勻為保護劑懸浮液；復合保護劑的配制海藻糖5.0g，脫脂奶粉5.0g，氯化鈉0.9g, 蒸餾水89.1g，溶解后攪拌均勻，用0.1MPa滅菌15min，冷卻至常溫備用；
第六步將保護劑懸浮液置于厚度為50mm淺盤中，在于-40 。C下預凍2.0 h，使其在容 器壁上的厚度為15mm;
第七步將鋪上菌體的淺盤置于真空冷凍干燥機中，于冷阱溫度為-40。C，真空度為13 Pa，干燥20h，凍干粉的水分含量為3.0%，活菌數(shù)達到l(^cfU/g。
第八步用濕度為60 %的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢復到常溫，在濕度為60 %的環(huán)境 中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的無菌干燥空氣的濕度為20%，保證了 凍干粉不吸潮。 實施例3
第一步將干酪乳桿菌鼠李糖亞種(編號CICC 6013， ￡acto6ad〃ra c"w/ subsp, 6013，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏，地址北京市朝陽區(qū)霄云路32 號；郵編100027)的凍干粉置于MRS培養(yǎng)基中，于29。C靜止培養(yǎng)30h，制成母發(fā)酵劑； MRS培養(yǎng)基的配制蛋白胨9.0g，酵母抽提物6.0g，葡萄糖17.5g，檸檬酸二銨1。5 g，硫 酸鎂0.53g，牛肉膏7.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸錳0.20g，乙酸鈉4.5 g，吐溫80 2mL，蒸 餾水950.0g,于0.09MPa滅菌18min，冷卻至29。C備用。
第二步以體積比為2: IOO的比例，將母發(fā)酵劑接入工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基中，于29 。C靜 止培養(yǎng)30h，制成工作發(fā)酵劑。工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基的配制蛋白胨9.0g，酵母抽提物6.0g， 葡萄糖17.5g，檸檬酸二銨1.5g，硫酸鎂0.53g，牛肉膏7.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸錳0.20 g，乙酸鈉4.5g，吐溫80 2mL，番茄汁70mL，胡蘿卜汁53mL，抗壞血酸0.3g，蒸餾水828。0 g，于0.09MPa滅菌18min，冷卻至29 。C即得到工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基。
番茄汁或胡蘿卜汁的制作將番茄和胡蘿卜用打漿機搾汁，將搾出的汁于8000 rpm， 離心20min，收集上清液，即得到番茄汁或胡蘿卜汁。
第三步以體積比為3.5: IOO的比例，將工作發(fā)酵劑接入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于36。C下的發(fā) 酵罐中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程用l mol/L的NaOH溶液保持pH為6.0,攪拌轉速為120 rpm， 培養(yǎng)16h后收集發(fā)酵菌懸液；生產(chǎn)培養(yǎng)基的配制蛋白胨27.5g，酵母抽提物6.0g，葡萄糖 17.5 g，檸檬酸二銨1.5g，硫酸鎂0.53g，牛肉膏7.5g，磷酸氫二鉀L5 g，硫酸錳0.20 g, 乙酸鈉4.5g，吐溫80 2mL，番茄汁70 mL，胡蘿卜汁55mL，抗壞血酸0.3 g，蒸餾水807,0 g， 于0.09 MPa滅菌18 min，冷卻至36 。C即得到生產(chǎn)培養(yǎng)基。
11第四步將發(fā)酵菌懸液于5000 rpm，離心25 min，舍棄上清液，收集菌泥； 第五步在菌泥中，按復合保護劑溶液與菌泥體積比為4: l加入復合保護劑溶液，混合 均勻為保護劑懸浮液；復合保護劑溶液的配制海藻糖7.5g，脫脂奶粉7.5g，氯化鈉0.9g， 蒸餾水84.1g，溶解后攪拌均勻，用0.09MPa滅菌18min，冷卻至常溫備用；
第六步將保護劑懸浮液置于厚度為45mm淺盤中，在于-50 。C下預凍l h，使其在容器 壁上的厚度為5mm;
第七步將鋪上菌體的淺盤置于真空冷凍干燥機中，于冷阱溫度為-50。C，真空度為7.5 Pa，干燥19h，凍干粉的水分含量為2.5 %，活菌數(shù)達到10^cfii/g。
第八步用濕度為55 %的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢復到常溫，在濕度為55 %的環(huán)境 中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的無菌干燥空氣的濕度為15%，保證了 凍干粉不吸潮。
凍干粉的應用
實施例4 L-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)
將實施例l制備的凍干粉于種子培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)24h，得到種子液，以5%(體 積)的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 。C培養(yǎng)110h (可為108 h-120 h)，用2-4 mol/L的NaOH溶液控制pH為6.5，攪拌轉速為120 rpm (可為100-150 rpm)，得到L-乳酸的產(chǎn)量達150 g/L，如圖2所示，用手性柱Chirex3126的高效液相法檢測發(fā)酵過程中 的L-乳酸的含量，分析儀器高效液相色譜儀系統(tǒng)，配備Waters 600泵多通道輸送系統(tǒng)； Waters 717自動進樣器；Waters 2996 PDA 二極管陣列檢測器；色譜柱手性柱Chirex 3126 (D)-peiiicillami， 4.6 mm IDX250 mm L。分析條件流動相為0.002 moL/L的硫酸銅溶液 溶劑為5% (質量)的異丙醇溶液，使用前經(jīng)0.45 pm濾膜過濾，超聲脫氣；流動相流速 為0.7mL/min;柱溫30。C; 二極管陣列Waters 2996，檢測波長為254nm;標準和樣品溶 液用前均經(jīng)過0.45 pm濾膜過濾后超聲脫氣；進樣量為2 ^L;用Empower積分軟件積分， 進行峰面積法外標定量。從圖2可以看出，用高密度的LCR6013凍干粉進行L-乳酸發(fā)酵， 在發(fā)酵108小時后L-乳酸達到150 g/L，而傳統(tǒng)方法擴培的LCR 6013在發(fā)酵130 h后才達 到86g/L。
乳酸分子內(nèi)含有一個不對稱碳原子，因此具有旋光異構現(xiàn)象，區(qū)分為L(+)-乳酸(簡稱 L-乳酸)和D(-)-乳酸(簡稱D-乳酸)。由于人體只有可代謝L-乳酸的L-乳酸脫氫酶，世界 衛(wèi)生組織提倡在食品及醫(yī)藥行業(yè)中使用L-乳酸取代目前普遍使用的DL-乳酸。因此研究能 多發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的工藝顯得非常必要。其中種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基配制如下
種子培養(yǎng)基配制葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，乙酸鈉2 g/L，擰檬酸銨2 g/L，吐溫80 1 mL/L， MgS04.7H20 0.2 g/L， K2HP04 2 g/L， MnS04 *H20 0.05 g/L，用蒸餾水定容至1000 mL， pH 6.5，于0.10 MPa滅菌20 min，即得到L-乳酸生
產(chǎn)種子培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)基配制葡萄糖200g/L (或相當數(shù)量的玉米粉的酶解液)，酵母粉5g/L，蛋 白胨10 g/L(或相當數(shù)量的豆粕的酶解液)，牛肉膏15 g/L，吐溫80 1 ml/L，番茄汁50 ml/L， 白菜汁50ml/L，用生產(chǎn)用飲用水定容至1000 mL， pH 6.5，于0.10 MPa滅菌20 min，即 得到L-乳酸生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基配制。
番茄汁或白菜汁的制備將番茄或白菜用榨汁機榨汁，將榨出的汁于5000-8000rpm, 離心20min，收集上清液，即得到番茄汁或白菜汁。
實施例5:益生菌泡菜
選擇沒有爛葉的芥菜或大白菜，清洗干凈后，瀝干表面水分，切成一定的大小并用開 水燙漂，在無菌環(huán)境下冷卻至37 °C，按菜質量百分比接入5 %的將實施例1制備的凍干粉， 輕輕攪拌均勻，用滅菌水密封，于37。C發(fā)酵120h，瀝干水分進行真空包裝。泡菜制作過 程中要有充足的泡漬液浸沒蔬菜，使菜不得浮出液面，以滿足乳酸菌厭氧生長和發(fā)酵，整 個制作過程中盡可能在潔凈環(huán)境下進行。經(jīng)檢測，本實施例生產(chǎn)的益生菌泡菜的亞硝酸鹽 變化情況如表1所示，不含亞硝酸鹽。亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物，亞硝酸鹽在適宜的 條件下，可與食品中蛋白質的分解產(chǎn)物胺反應，生成N-亞硝基化合物。亞硝酸鹽的急性中 毒作用是導致高鐵血紅蛋白癥，即把人體血液中攜氧能力的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅 蛋白，而失去攜氧能力，因而引起組織缺氧中毒，并且活體和離體試驗表明有致突變和致 癌的作用。測定用LCR 6013凍干粉發(fā)酵和不加菌的傳統(tǒng)發(fā)酵的不同發(fā)酵時間的泡菜榨出 的汁中亞硝酸鹽的含量(GB/T5009.33-2003的鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽法)如表1所 示，從表1可看出，新鮮芥菜中的亞硝酸鹽的含量為2.87mg/L，接種LCR6013凍干粉的 泡菜在發(fā)酵24h后降為1.35mg/L，到48 h后檢測不到亞硝酸鹽。而未接種的對照樣中的 亞硝酸鹽的含量呈現(xiàn)先升高，后降低的趨勢，在第48 h出現(xiàn)亞硝酸鹽的峰值45.300 mg/。 可見，添加凍干粉LCR 6013對抑制泡菜中亞硝酸鹽的異常積累非常有效。用高效液相法 測定LCR60D凍干粉用于泡菜發(fā)酵過程中的L-乳酸的含量，如圖3所示，圖中保留時間 為9.214min的為L-乳酸，占總乳酸的含量為92.3 % (檢測方法同圖1的檢測)。此外，本 實施例利用實施例1制備的凍干粉制作出來的泡菜制作時間短為24小時，而傳統(tǒng)方法需 要168小時，加入LCR6013凍干粉的泡菜中，LCR 6013是優(yōu)勢菌群，能快速生長及快速 產(chǎn)酸，使得泡菜經(jīng)過24h發(fā)酵即達到了發(fā)酵終點，pH為3.50，顏色好和風味好。表1 泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的變化規(guī)律
發(fā)酵時間(h)024487296120
LCR6013凍干粉發(fā)酵(mg/L)2.871.350.000.000.000.00
自然發(fā)酵(mg/L)2.872.8745.3024.5010.3010.50
實施例6:發(fā)酵香腸
將原料肉剔骨后，切碎并斬拌，以重量計，加入3.0%的蔗糖、2.0%的食鹽和1.5%的 料酒，混合均勻后接種實施例2制備的凍干粉，使以重量計活菌數(shù)達107個/§，混合均勻 后灌腸，捆扎好在20。C、相對濕度為95 %的環(huán)境下進行發(fā)酵，當發(fā)酵至pH5.0時終止發(fā) 酵，放入15。C，相對濕度為80%的環(huán)境下進行后熟發(fā)酵7天，入壇腌制成各種風味。由 于活菌含量高，進行優(yōu)勢菌群發(fā)酵，無需添加亞硝酸鹽，生產(chǎn)出的發(fā)酵香腸滋氣味非常純 正，顏色自然，絕不含亞硝酸鹽。
實施例7 發(fā)酵豆粕和花生粕的生產(chǎn)
以重量計，將l:l的豆粕(還可是花生粕)與水混合，在0.10MPa滅菌20min，冷卻 至37。C接入實施例2的凍干粉，使以重量計活菌數(shù)達107個/§，于30。C密閉環(huán)境下發(fā)酵 36 h，發(fā)酵結束后pH為5.0-6.0，將發(fā)酵產(chǎn)物進行熱風氣流干燥，干燥進風溫度控制250 。C， 混合溫度控制150。C，出料溫度控制75。C。 L-乳酸的相對含量在91.5。/。，蛋白質的含量可 提高5.5%，干燥物料水分控制12%以下，使大分子的蛋白質降解為24kDa以下。由于使 用了高活菌數(shù)的凍干粉，所以大大縮短了發(fā)酵時間，提高了發(fā)酵效率并提高了蛋白質含量、 降低了蛋白質的分子量和有利于消化吸收。
實施例8 發(fā)酵玉米的生產(chǎn)
以重量計，將l:l玉米粉與水混合，冷卻至37。C左右接入實施例3的凍干粉，使以重 量計活菌數(shù)達l(T個/g，于30。C密閉環(huán)境下發(fā)酵48h，發(fā)酵結束后pH為4.0 5.0，將發(fā)酵 產(chǎn)物進行熱風氣流干燥，干燥進風溫度控制280。C，混合溫度控制18(TC，出料溫度控制 80 。C。如圖4b所示(檢測方法同圖2的檢測)，用凍干粉LCR6013發(fā)酵48 h的玉米粉的 L-乳酸高效液相色譜圖，從圖4b中可看出L-乳酸占總乳酸的含量為93.0y。，圖4a為對照 樣的乳酸球菌的玉米發(fā)酵的L-乳酸含量，從圖4a可看出(檢測方法同圖2的檢測)，L-乳 酸占總乳酸的含量僅為18.80%。干燥物料水分控制12%以下。
實施例9 發(fā)酵酸奶的生產(chǎn)
按重量計，全脂奶粉12.5%、白糖8.5%、酸奶穩(wěn)定劑0.3%，用生產(chǎn)用飲料水定容至
14刻度，均勻混合后，預熱至60 °C進行均質，冷卻至41 °C，按每噸奶中接入30 g的凍干粉， 于41 °C發(fā)酵5.0 h，發(fā)酵結束后酸奶的酸度達到65 °T, L-乳酸占總乳酸的含量達到91.5%。 凍干粉用氣流分裝機立即進行鋁塑包裝。用濕度為50 %的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢 復到常溫，在濕度為50~60%的環(huán)境中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的 無菌干燥空氣的濕度不應高于20%，保證了凍干粉不吸潮。根據(jù)本發(fā)明制備的凍干粉活菌 數(shù)高，不易結塊、復水性很好。
權利要求
1、一種直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件第一步 將干酪乳桿菌鼠李糖亞種的凍干粉置于MRS培養(yǎng)基中，于28～30℃靜止培養(yǎng)24h～36h，制成母發(fā)酵劑；以重量份數(shù)計，所述MRS培養(yǎng)基配方為蛋白胨0.8～1.0份，酵母抽提物0.5～0.7份，葡萄糖1.5～2.0份，檸檬酸二銨0.1～0.2份，硫酸鎂0.048～0.058份，牛肉膏0.5～1.0份，磷酸氫二鉀0.1～0.2份，硫酸錳0.015～0.025份，乙酸鈉0.4～0.5份，吐溫800.1～0.3份，蒸餾水94.0～96.0份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至28～30℃?zhèn)溆?；第二? 以體積比為2～5∶100的比例，將母發(fā)酵劑接入工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基中，于28～30℃靜止培養(yǎng)24h～36h，制成工作發(fā)酵劑；以重量份數(shù)計，所述工作發(fā)酵劑培養(yǎng)基配方為蛋白胨0.8～1.0份，酵母抽提物0.5～0.7份，葡萄糖1.5～2.0份，檸檬酸二銨0.1～0.2份，硫酸鎂0.048～0.058份，牛肉膏0.5～1.0份，磷酸氫二鉀0.1～0.2份，硫酸錳0.015～0.025份，乙酸鈉0.4～0.5份，吐溫800.1～0.3份，番茄汁6.0～8.0份，胡蘿卜汁4.5～6.0份，抗壞血酸0.02～0.04份和蒸餾水79.8～85.4份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至28～30℃?zhèn)溆?；第三? 以體積比為2～5∶100的比例，將工作發(fā)酵劑接入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于35～37℃下的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程用NaOH溶液調整pH為6.0～6.8，攪拌轉速為100～150rpm，培養(yǎng)16～24h后收集，得發(fā)酵菌懸液；以重量份數(shù)計，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基配方組成為蛋白胨2.5～3.0份，酵母抽提物0.5～0.7份，葡萄糖1.5～2.0份，檸檬酸二銨0.1～0.2份，硫酸鎂0.048～0.058份，牛肉膏0.5～1.0份，磷酸氫二鉀0.1～0.2份，硫酸錳0.015～0.025份，乙酸鈉0.4～0.5份，吐溫800.1～0.3份，番茄汁6.0～8.0份，胡蘿卜汁4.5～6.0份，抗壞血酸0.02～0.04份，蒸餾水78.0～83.7份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至35～37℃?zhèn)溆?；第四? 將發(fā)酵菌懸液于5000～8000rpm，離心20～25min，舍棄上清液，收集菌泥；第五步 在菌泥中，按復合保護劑溶液的生理鹽水溶液與菌泥的體積比為3～5∶1加入復合保護劑溶液，混合均勻為保護劑懸浮液；以重量份數(shù)計，所述的復合保護劑溶液配方組成為海藻糖5～10份，脫脂奶粉5～10份，氯化鈉0.9份，蒸餾水79.1～89.1份，溶解后攪拌均勻，用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至常溫備用；第六步 將保護劑懸浮液置于淺盤中，在于-40℃～-65℃下預凍0.5h～2.0h，使保護劑懸浮液厚度為5～15mm；第七步 將第六步所得的保護劑懸浮液置于真空冷凍干燥機中，于冷阱溫度為-40℃～-65℃，真空度為1.3～13.0Pa，干燥18～20h，得凍干粉，凍干粉水分重量含量低于3％，活菌數(shù)達到1011～1012cfu/g；第八步 用濕度為50～60％的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢復到常溫，在濕度為50～60％的環(huán)境中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的無菌干燥空氣的濕度不應高于20％。
2、 根據(jù)權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在于第三步工作發(fā)酵劑與生產(chǎn)培養(yǎng)基的體積比為3: 100。
3、 根據(jù)權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在 于所述第三步中NaOH溶液的濃度為l 2mol/L。
4、 根據(jù)權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在 于所述第三步中pH為6.8。
5、 根據(jù)權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在 于所述第五步中海藻糖為10份，脫脂奶粉為10份，氯化鈉為0.9份。
6、 根據(jù)權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在 于第一步或第二步的發(fā)酵溫度為30。C，培養(yǎng)時間為24h。
7、 根據(jù)權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在 于所述第三步發(fā)酵溫度為37。C。
8、 根據(jù)權利要求1所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征 在于第六步的淺盤厚度為40 50mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉及其制備方法。該方法將干酪乳桿菌鼠李糖亞種經(jīng)過“兩步法”擴大培養(yǎng)，盡量使細胞處于同步生長時期，然后在生產(chǎn)培養(yǎng)基中，用NaOH溶液在線控制pH為6.0～6.8，于35℃～37℃培養(yǎng)16h～24h，離心后收集菌泥，加入保護劑溶液，于-40℃～-65℃下預凍0.5h～2.0h，使其在容器壁上厚度為5～15mm，干燥制成直投式凍干粉。該凍干粉的活菌數(shù)達10¹¹～10¹²cfu/g，并具有復水性好、色澤好、流動性好、易于貯運、方便生產(chǎn)等特點。用該凍干粉可直接用于發(fā)酵生產(chǎn)醬腌菜、香腸、酸奶、L-乳酸、玉米粉、豆粕、花生粕和用作益生菌制劑等。
文檔編號A23L1/36GK101580809SQ20091004026
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月16日 優(yōu)先權日2009年6月16日
發(fā)明者劉冬梅, 暉 吳, 湯石生, 蕾 邢 申請人:華南理工大學