專利名稱：一種同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的發(fā)酵工藝，具體涉及一種同步式提高異養(yǎng)小球藻的 生物量和葉黃素的方法。
背景技術(shù)：
小球藻(CW0w//a)是一種營養(yǎng)豐富、食用安全的單細(xì)胞綠藻，小球藻保健/功能性食 品是目前國內(nèi)外非常流行的健康食品，具有補(bǔ)充膳食營養(yǎng)、強(qiáng)化免疫、促進(jìn)細(xì)胞生長和延 緩衰老、維持正常血壓和膽固醇水平、解毒等顯著功效。小球藻中的葉黃素(lutein)是一 種天然類胡蘿卜素，抗氧化活性非常突出，具有能防治眼睛年齡相關(guān)性視黃斑退化(AMD) 和白內(nèi)障、抑制腫瘤的發(fā)生與生長、強(qiáng)化免疫等多種功效。葉黃素作為營養(yǎng)、保健、著色 等多功能天然色素，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品、飼料、化妝品等工業(yè)領(lǐng)域。
到目前為止，葉黃素的規(guī)?；a(chǎn)主要是從萬壽菊中提取，但這種生產(chǎn)方式需要占用 大量的種植面積，且易于受到季節(jié)氣候等外在環(huán)境因素的影響。通過發(fā)酵法異養(yǎng)培養(yǎng)小球 藻生產(chǎn)葉黃素，可以充分利用現(xiàn)有的發(fā)酵技術(shù)與設(shè)備，且不受自然條件的限制，是葉黃素 生產(chǎn)的一種的替代方式。
迄今為止，主要是利用光生物反應(yīng)器來實(shí)現(xiàn)小球藻的高細(xì)胞密度培養(yǎng)。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù) 的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Del Campo等在Microbiol Biotechnol (微生物生物技術(shù))發(fā)表的 "Accumulation of astaxanthin and lutein in C7z/o"〃a zo/ wg/emW (小球藻中禾只累葉黃素)， 該文中提出使用C.zo力"g/e朋h藻株，經(jīng)過360h的光照自養(yǎng)培養(yǎng)，得到濃度為21mg/l的葉 黃素，生產(chǎn)效率為0.06 mg/l/h。 Del Campo等在J Biotechnol (生物技術(shù))發(fā)表的"Lutein production by MwWe/Zo; 5^ sp. in an outdoor tubular photobioreactor，，(室夕卜管式光照反應(yīng)器培 養(yǎng)崖^^//0戸&生成葉黃素)，該文中提出使用室外管式光照反應(yīng)器培養(yǎng)Mw7Wto戸&，經(jīng) 過240 h培養(yǎng)得到濃度為35 mg/1的葉黃素，生產(chǎn)效率為0.15 mg/l/h。異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻可以 克服光合自養(yǎng)培養(yǎng)的諸多缺陷，具有生長速度更快、能實(shí)現(xiàn)純種培養(yǎng)、單位體積產(chǎn)率高、 便于自動(dòng)化控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)勢，是提高小球藻產(chǎn)量的有效途徑，比封閉式光生物 反應(yīng)器系統(tǒng)更具有優(yōu)勢。因此利用工業(yè)發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行小球藻的異養(yǎng)化高細(xì)胞密度培養(yǎng)，成 為小球藻大規(guī)模高效工業(yè)化生產(chǎn)的又一發(fā)展趨勢。
有鑒于此，國內(nèi)外的科技工作者主要是研究通過補(bǔ)料流加培養(yǎng)方式來實(shí)現(xiàn)小球藻的高 細(xì)胞密度生長，已取得了相當(dāng)成績的進(jìn)展，如Shi XM(史賢明)等在Biotechnology Progress (生物技術(shù)進(jìn)展)上發(fā)表的"High-yield production of lutein by the green microalga CWore//a jwo^>// eco/cfes in heterotrophic fed-batch culture"(通過原殼小球藻的異養(yǎng)分批-補(bǔ)料培養(yǎng)高效生長葉黃素)，該文中提出一種原殼小球藻的分批-補(bǔ)料培養(yǎng)工藝，并通過間歇式流加培養(yǎng) 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞干重和生產(chǎn)效率達(dá)到48g/l和0.2g/l/h。 Shi XM (史賢明)等在2008年5月發(fā)表 專利《異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的補(bǔ)料優(yōu)化方法》，該專利提出在建立混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的基礎(chǔ)上 進(jìn)行分批-補(bǔ)料培養(yǎng)的優(yōu)化，可使小球藻的最高細(xì)胞濃度和生產(chǎn)效率分別達(dá)到100g/l (干重) 和1.0g/l/h以上。采用簡單的流加培養(yǎng)方式異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻，可以在一定程度上提高小球 藻的細(xì)胞密度，但對同時(shí)提高小球藻中的葉黃素含量效果不一定顯著，難以實(shí)現(xiàn)小球藻在 高細(xì)胞密度下葉黃素的高效積累。
葉黃素作為異養(yǎng)小球藻的初級代謝產(chǎn)物，其生物合成基本屬于生長相關(guān)型的。但目前 以最大生物量為目標(biāo)的發(fā)酵工藝，更關(guān)注的是通過改進(jìn)發(fā)酵工藝來提高小球藻的生物量， 以期提高總的葉黃素產(chǎn)率，缺乏有效的工藝手段與小球藻中葉黃素的合成代謝調(diào)控相結(jié)合， 因此難以在提高生物量的同時(shí)提高葉黃素的含量，最終有效提高葉黃素產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種同步式提高異養(yǎng)小球藻的
生物量和葉黃素的方法。該方法基于對小球藻中葉黃素生物合成代謝調(diào)控的研究，篩選出
了葉黃素合成的有效促進(jìn)劑(合成代謝前體物)，并在流加培養(yǎng)過程中同時(shí)加入促進(jìn)劑，實(shí)
現(xiàn)了異養(yǎng)小球藻的高細(xì)胞密度及葉黃素的高效積累。本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法，包括如下步驟
(1) 活化后的小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)3 5天，使其處于對數(shù)生長期；
(2) 然后將小球藻種子液按10% 50%體積比(即接種量小球藻種子液體積與小球 藻種子液和培養(yǎng)基總體積的比)接種量接入含Basal培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，同時(shí)往發(fā)酵罐中 添加葡萄糖和氮源進(jìn)行分批培養(yǎng)，通過控制通氣量保持發(fā)酵罐中的溶解氧飽和濃度20% 50%，通氣過程中攪拌漿轉(zhuǎn)速與溶氧濃度相偶聯(lián)，起始轉(zhuǎn)速控制在180 200r/m， Basal培 養(yǎng)基的pH控制在6.1 6.5，培養(yǎng)溫度控制在28士0.5'C，葡萄糖和氮源的摩爾比為6 12:
1;
(3) 步驟(2)中的小球藻在發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h 72h，小球藻生長進(jìn)入對數(shù)生長期后， 發(fā)酵罐中的小球藻在保持葡萄糖濃度為7g/L 10g/L條件下采用分段式恒速流加培養(yǎng)，同
時(shí)在發(fā)酵罐中添加番茄汁提取物，以促進(jìn)葉黃素的積累。
上述同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法中，各步驟中的培養(yǎng)基均采用改 良的Basal培養(yǎng)基，其組分mg/L為1升水中含有KH2PO41250， MgSO4'7H2O1000， EDTA500 ， H3B03114.2 ， CaCl2-2H20111 ， FeS04.7H2049.8 ， ZnS04'7H2088.2 ， MnCl2'4H2014.2， Mo037.1， CuS04.5H2015.7， (CoN03)2.6 H204.9。
上述同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法中，所述氮源采用無機(jī)氮源硝酸
4鹽或者有機(jī)氮源尿素。
上述同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法中，葡萄糖和氮源的摩爾比為 8.9 10.1: 1。
上述同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法中，所述分段式恒速流加培養(yǎng)具
體為將整個(gè)培養(yǎng)過程分為4 6階段，每個(gè)階段24h，通過流加培養(yǎng)基的方式控制每個(gè)階 段發(fā)酵罐中的葡萄糖濃度為7g/L 10g/L，同時(shí)在每個(gè)階段開始時(shí)于發(fā)酵罐中添加番茄汁提 取物，以促進(jìn)葉黃素的積累。
上述同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法中，分段式恒速流加培養(yǎng)所用的 培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為480g/L、尿素濃度為68.57g/L，流加用的培養(yǎng)基中的Basal培養(yǎng)基 組分與葡萄糖按比例提供，該比例為上述分批培養(yǎng)時(shí)Basal培養(yǎng)基中的組分與所添加葡萄 糖的比例。
上述同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法中，在發(fā)酵罐中進(jìn)行小球藻的分 段式恒速流加培養(yǎng)的同時(shí)，流加番茄汁提取物，每個(gè)階段添加番茄汁提取物的量為3 5ml/L，使得小球藻生物量濃度和葉黃素含量同時(shí)提高。
上述同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法中，番茄汁提取物的制備過程為 市售純番茄汁先冷凍干燥，將番茄汁粉置于離心管中，加入丙酮，在振蕩器上振蕩混勻， 離心，取上清液；渣經(jīng)反復(fù)提取變成白色為止，合并上清液并氮?dú)獯蹈?，用DMSO定容。
上述同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法中，番茄汁提取物的制備方法為 市售純番茄汁先冷凍干燥，稱取250mg的番茄汁粉，置于lOmL的離心管，加5mL的丙 酮，在振蕩器上振蕩混勻，離心，取上清液；渣經(jīng)反復(fù)提取變成白色為止，合并提取液并 氮?dú)獯蹈?，用DMSO定容至50ml。為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟(1)中發(fā)酵罐溶氧濃度 必須保持在20%-50%之間，除了控制通氣量和攪拌漿轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)，可以通過通入純氧以保 證溶氧的穩(wěn)定。
所述步驟(3)中第一次補(bǔ)加培養(yǎng)基優(yōu)選控制在24h。
步驟(3)中根據(jù)小球藻生長期的變化，優(yōu)選的補(bǔ)加培養(yǎng)基時(shí)間段如下(24h-72h)、 (72h-109h)、 (72h-109h)、 (168h-215h)、 (215h-240h)。
所述步驟(4)中，添加的番茄汁提取物每ml含有總類胡蘿卜素0.846^g/ml，主要成 分為番茄紅素。根據(jù)流加補(bǔ)料研究確定添加量為0.0005mg/L番茄紅素。(附HPLC圖) 本發(fā)明采用分段式恒速流加培養(yǎng)基的操作方式，維持發(fā)酵液中的低葡萄糖濃度 (10g/L)，有效延長小球藻的對數(shù)期，小球藻生物量濃度大大提高，實(shí)現(xiàn)了小球藻高細(xì)胞 密度45.5g/L。
本發(fā)明在分段式恒速流加過程中，采用分階段添加葉黃素促進(jìn)劑一番茄汁提取物的方 法，有效增加了合成葉黃素的代謝流量，使得小球藻生物量提高的同時(shí)葉黃素得到高效積累。
本發(fā)明利用葉黃素生物合成途徑的代謝調(diào)控技術(shù)，以低濃度葡萄糖流加補(bǔ)料的發(fā)酵方 式，來實(shí)現(xiàn)異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素同時(shí)高產(chǎn)的方法。具體來說，本發(fā)明采用分段式 恒速流加培養(yǎng)基的操作方式，實(shí)現(xiàn)異養(yǎng)小球藻的高細(xì)胞密度；通過對葉黃素合成代謝途徑 的分析，篩選出了促進(jìn)葉黃葉黃素高效積累和適應(yīng)小球藻細(xì)胞生長的誘導(dǎo)物一番茄汁提取 物，確定了最適于葉黃素大量積累的使用濃度；根據(jù)高密度培養(yǎng)過程中小球藻生長期變化 和葉黃素含量狀況，分段恒速流加培養(yǎng)基和番茄汁提取物，實(shí)現(xiàn)了小球藻高細(xì)胞密度培養(yǎng) 的同時(shí)葉黃素的高效積累。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果
(1) 本發(fā)明將優(yōu)化發(fā)酵工藝和葉黃素誘導(dǎo)積累條件進(jìn)行技術(shù)集成，既能提高小球藻細(xì) 胞濃度，同時(shí)又能高效積累葉黃素， 一舉兩得。
(2) 本發(fā)明采用成本低廉的番茄汁提取物作為葉黃素的合成促進(jìn)劑，其機(jī)理在于番
茄汁提取物提供了大量的合成葉黃素的多種前體物質(zhì)(主要是番茄紅素)，在小球藻細(xì)胞中
直接得到轉(zhuǎn)化，使葉黃素含量較對照組顯著提高40.65%。番茄是一種較為廉價(jià)的果蔬，番
茄汁提取物的制備也和簡單經(jīng)濟(jì)，因此采用番茄汁提取物作為促進(jìn)異養(yǎng)小球藻高產(chǎn)葉黃素 的添加劑具有重要的實(shí)用價(jià)值。
(3) 本發(fā)明采用的分段式恒速流加操作方式簡單可行，放大培養(yǎng)可以按照本發(fā)明中流
加方式實(shí)施放大。


圖1為實(shí)施例1中7L發(fā)酵罐中小球藻分段式恒速流加培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長、葡萄糖消耗的變化 趨勢圖。
圖2為實(shí)施例1中7L發(fā)酵罐中小球藻分段式恒速流加培養(yǎng)時(shí)葉黃素產(chǎn)量和葉黃素含量的變 化趨勢圖。
圖3為實(shí)施例中小球藻番茄汁提取液的HPLC圖譜。
圖4為圖3所示HPLC圖譜中峰1對應(yīng)的紫外/可見吸收光譜圖。
圖5為圖3所示HPLC圖譜中峰2對應(yīng)的紫外/可見吸收光譜圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下 進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的 實(shí)施例。
下列實(shí)施例中如無特別說明，可按照常規(guī)條件，例如按照《生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)》(高
等教育出版社，1997)，或按照制造廠商所建議的條件。 實(shí)施例l
(1)所采用的小球藻藻株為C/ /ow〃fl protoAoco/cfey CS-41(購自CSIRO MarineLaboratory Hobart， Australia),將活化后的小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)5天，使其處于對數(shù)生長期；然 后將小球藻種子液按10% (v/v)接種量接入含Basal培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，Basal培養(yǎng)基的組 分mg/l為1升水中含有KH2P04 1250， MgS04'7H20 1000， EDTA 500， H3B03 114.2， CaCl2'2H20 111， FeS04.7H20 49.8， ZnS04.7H20 88.2， MnCl2.4H20 14.2， Mo03 7.1， CuS04'5H20 15.7， (CoN03)2《H20 4.9;同時(shí)在Basal培養(yǎng)基中添加葡萄糖和尿素，葡萄糖 添加量為10g/L，葡萄糖和尿素的摩爾比為8.9。在7升發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為培養(yǎng)基裝量3.5升；接種量10。/。(v/v); pH6.5±0.2;溫度28士0.5'C，溶解氧50%飽和 濃度；攪拌漿轉(zhuǎn)速與溶氧濃度相偶聯(lián)，起始轉(zhuǎn)速控制在200r/rn;在外接補(bǔ)充純氧時(shí)，可在 氣路中添加一個(gè)無菌水瓶以保持氣流濕潤，維持發(fā)酵罐內(nèi)的水分平衡。
(2) 小球藻在發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h后，小球藻生長進(jìn)入對數(shù)生長期后，發(fā)酵罐中的小球
藻采用分段式恒速流加培養(yǎng)，即開始在發(fā)酵罐中流加培養(yǎng)基，維持發(fā)酵罐中的葡萄糖濃度
在10g/L左右；流加用的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為480g/L、尿素濃度為68.57g/L，流加用的
培養(yǎng)基中的其他組分與葡萄糖按比例提供，比例為上述分批培養(yǎng)時(shí)Basal培養(yǎng)基中的組分
與所添加葡萄糖的比例(重量比)。
小球藻接種24h后小球藻生長進(jìn)入對數(shù)期，葡萄糖消耗速率很快，開始進(jìn)行分段式恒
速流加培養(yǎng)，補(bǔ)加葡萄糖，具體分段如下第一段(從起始點(diǎn)24h-72h)培養(yǎng)基的流加速率為
3.5ml/h;到72h因耗糖速率增大，改變流加速率。第二段(72h-109h)流加速率為4.68 ml/h;
到109h進(jìn)入對數(shù)旺盛期，耗糖速率更快，加大流加速率，第三段(72h-109h)流加速率為
6.2 ml/h;到168h進(jìn)入對數(shù)后期，雖然耗糖速度下降，但是生物量濃度仍不斷上升，降低
流加速率，第四段(168h-215h)流加速率為3.12ml/h;到215h糖的消耗速率進(jìn)一步降低，
進(jìn)入生長穩(wěn)定期，因此降低流加速度。第五段(215h-240h)流加速率為1.6ml/h。
(3) 在24h、 72h、 109h和168h時(shí)分別添加番茄汁提取物10.5ml;
(4) 待培養(yǎng)結(jié)束后取樣測定生物量濃度和葉黃素含量，生物量采用干重法測定，測得 生物量濃度最高為45.5g/L;葉黃素含量通過HPLC來測定，測得葉黃素含量最高為 2.825mg/g。
在上述整個(gè)培養(yǎng)過程中，要定時(shí)取樣監(jiān)測生物量濃度、葡萄糖濃度、葉黃素含量，計(jì) 算總?cè)~黃素產(chǎn)量。葡萄糖濃度的測定采用SBA-80生物分析儀進(jìn)行測定；小球藻生物量采 用細(xì)胞干重法測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖1和附圖2.
由圖1所示，在維持10g/L的葡萄糖濃度下培養(yǎng)小球藻，小球藻細(xì)胞生長有短暫的延 滯期，隨后即開始大量消耗葡萄糖，小球藻生物量濃度也逐漸增加。當(dāng)培養(yǎng)到24小時(shí)時(shí)，小球藻細(xì)胞即進(jìn)入對數(shù)生長前期，小球藻細(xì)胞生長迅速，生物量濃度迅速增加，由于葡萄 糖耗糖速率很快，因此必須開始補(bǔ)加培養(yǎng)基，其中流加葡萄糖濃度為480g/L，流加培養(yǎng)基 中的其他組分與葡萄糖按比例提供，流加速率為3.5mL/h;到72小時(shí)時(shí)，由圖所示，小球 藻細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長中期，耗糖速率不斷加大，因此加大流加的速率，改變流加速率為 4.68mL/h;至ljl09小時(shí)時(shí)，小球藻細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)旺盛期，耗糖速率更快，加大流加的速率， 流加速率為6.2mL/h;到168h小球藻生長進(jìn)入對數(shù)后期，雖然耗糖速度下降但是生物量濃 度仍不斷上升，改變流加速率，流加速率為3.12mL/h;到215h殘?zhí)堑臐舛认陆邓俾瘦^小， 進(jìn)入生長穩(wěn)定期，因此降低流加速度，流加速率為1.6 mL/h。從圖中可以看到從補(bǔ)料開始 小球藻的生物量持續(xù)上升，到215小時(shí)時(shí)，達(dá)到最高的生物量，小球藻生物量濃度為45.5g/L。 因此采用215小時(shí)為收獲小球藻生物量濃度的最適時(shí)間。
由圖2所示，由于轉(zhuǎn)接的小球藻種子液是處于生長對數(shù)期的種子液，因此小球藻細(xì)胞 中葉黃素的含量相對較高，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，0-24小時(shí)段，葉黃素含量不斷降低，但是由 于生物量濃度增加，因此葉黃素產(chǎn)量不斷增加。在進(jìn)入對數(shù)生長期后，葉黃素含量也不斷 上升，在細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后，細(xì)胞進(jìn)一步合成葉黃素，但葉黃素含量上升變得緩慢，當(dāng)培 養(yǎng)至190小時(shí)，葉黃素含量達(dá)到最高值為2.825mg/g,這時(shí)葉黃素含量不再上升，而生物量 濃度仍有微量上升，因此葉黃素產(chǎn)量仍有微量上升，當(dāng)培養(yǎng)至215小時(shí)，葉黃素產(chǎn)量達(dá)到 最高值為128.31mg/L。因此采用215小時(shí)為收獲葉黃素的最適時(shí)間。
在上述過程中采用的番茄汁提取物的制備方式為市售純番茄汁先置于冷凍干燥機(jī)中
處理直至得到番茄細(xì)胞干粉，稱取10mg的番茄汁粉，置于10mL的離心管，加約2mL的
丙酮，在振蕩器上至充分振蕩混勻，離心，取上清液；渣經(jīng)反復(fù)提取變成白色為止。合并
提取液并氮?dú)獯蹈?，用DMSO定容至2ml，并按此方法制備番茄汁提取物50ml，番茄汁的
色譜圖如圖3、 4、 5所示。小球藻番茄汁提取液的HPLC圖譜見圖3。從圖中可以觀察到
兩個(gè)主要峰，通過與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間和紫外-可見吸收光譜進(jìn)行比較，峰l和
峰2分別確定為(3-胡蘿卜素和番茄紅素。 實(shí)施例2
(1)所采用的小球藻藻株為C7z/we化； rato決oco/cfey CS-41(購自CSIRO Marine Laboratory Hobart, Australia),將活化后的小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)5天，使其處于對數(shù)生長期；然 后將小球藻種子液按10% (v/v)接種量接入含Basal培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，Basal培養(yǎng)基的組 分mg/1為1升水中含有KH2P04 1250， MgS04'7H20 1000， EDTA 500， H3B03 114.2，
8CaCl2.2H20 111， FeS04.7H20 49.8， ZnS04.7H20 88.2， MnCl2.4H20 14.2, Mo03 7.1， CuS04'5H20 15.7， (CoN03)2'6H20 4.9;同時(shí)在Basal培養(yǎng)基中添加葡萄糖和尿素，葡萄糖 添加量為7g/L，葡萄糖和尿素的摩爾比為10.1。在7升發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為培養(yǎng)基裝量3.5升；接種量10。/。(v/v); pH6.5士0.2;溫度28士0.5。C，溶解氧20%飽和 濃度；攪拌漿轉(zhuǎn)速與溶氧濃度相偶聯(lián)，起始轉(zhuǎn)速控制在200r/m;
(2) 小球藻在發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h后，小球藻生長進(jìn)入對數(shù)生長期后，發(fā)酵罐中的小球
藻采用分段式恒速流加培養(yǎng)，即開始在發(fā)酵罐中流加培養(yǎng)基，維持發(fā)酵罐中的葡萄糖濃度
在10g/L左右；流加用的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為480g/L、尿素濃度為68.57g/L，流加用的
培養(yǎng)基中的其他組分與葡萄糖按比例提供，比例為上述分批培養(yǎng)時(shí)Basal培養(yǎng)基中的組分
與所添加葡萄糖的比例(重量比)。
小球藻接種24h后小球藻生長進(jìn)入對數(shù)期，葡萄糖消耗速率很快，開始進(jìn)行分段式恒
速流加培養(yǎng)，補(bǔ)加葡萄糖，具體分段如下第一段(從起始點(diǎn)24h-72h)培養(yǎng)基的流加速率為
2.45ml/h;到72h因耗糖速率增大，改變流加速率。第二段(72h-109h)流加速率為3.28 ml/h;
到109h進(jìn)入對數(shù)旺盛期，耗糖速率更快，加大流加速率，第三段(72h-109h)流加速率為
4.34ml/h;到168h進(jìn)入對數(shù)后期，雖然耗糖速度下降，但是生物量濃度仍不斷上升，降低
流加速率，第四段(168h-215h)流加速率為2.18ml/h;到215h糖的消耗速率進(jìn)一步降低，
進(jìn)入生長穩(wěn)定期，'因此降低流加速度。第五段(215h-240h)流加速率為1.12ml/h。
(3) 在24h、 72h、 109h和168h時(shí)分別添加番茄汁提取物10.5ml;
(4) 待培養(yǎng)結(jié)束后取樣測定生物量濃度和葉黃素含量，生物量采用干重法測定，測得 生物量濃度最高為43.6g/L;葉黃素含量通過HPLC來測定，測得葉黃素含量最高為2.53 mg/g。
實(shí)施例3
(1)所采用的小球藻藻株為CWwe//。 ； ro欣/2ocoz'cfe CS-41(購自CSIRO Marine Laboratory Hobart, Australia),將活化后的小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)5天，使其處于對數(shù)生長期；然 后將小球藻種子液按10% (v/v)接種量接入含Basal培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，Basal培養(yǎng)基的組 分mg/l為1升水中含有KH2P04 1250， MgS04.7H20 1000， EDTA 500， H3B03 114.2， CaCl2.2H20 111， FeS04.7H20 49.8， ZnS04.7H20 88.2， MnCI2.4H20 14.2， Mo03 7.1， CuS04'5H20 15.7， (CoN03)2'6H20 4.9;同時(shí)在Basal培養(yǎng)基中添加葡萄糖和尿素，葡萄糖 添加量為10g/L，葡萄糖和尿素的摩爾比為8.9。在7升發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為培養(yǎng)基裝量3.5升；接種量50% (v/v); pH6.1士0.2;溫度28士0.5。C，溶解氧50%飽和濃度；攪拌漿轉(zhuǎn)速與溶氧濃度相偶聯(lián)，起始轉(zhuǎn)速控制在200r/m;
(2) 小球藻在發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h后，小球藻生長進(jìn)入對數(shù)生長期后，發(fā)酵罐中的小球
藻采用分段式恒速流加培養(yǎng)，即開始在發(fā)酵罐中流加培養(yǎng)基，維持發(fā)酵罐中的葡萄糖濃度
在10g/L左右；流加用的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為480g/L、尿素濃度為68.57g/L，流加用的
培養(yǎng)基中的其他組分與葡萄糖按比例提供，比例為上述分批培養(yǎng)時(shí)Basal培養(yǎng)基中的組分
與所添加葡萄糖的比例(重量比)。
小球藻接種24h后小球藻生長進(jìn)入對數(shù)期，葡萄糖消耗速率很快，開始進(jìn)行分段式恒
速流加培養(yǎng)，補(bǔ)加葡萄糖，具體分段如下第一段(從起始點(diǎn)24h-72h)培養(yǎng)基的流加速率為
3.25ml/h;到72h因耗糖速率增大，改變流加速率。第二段(72h-109h)流加速率為4.50ml/h;
到109h進(jìn)入對數(shù)旺盛期，耗糖速率更快，加大流加速率，第三段(72h-109h)流加速率為
5.82ml/h;到168h進(jìn)入對數(shù)后期，雖然耗糖速度下降，但是生物量濃度仍不斷上升，降低
流加速率，第四段(168h-215h)流加速率為2.75 ml/h;到215h糖的消耗速率進(jìn)一步降低，
進(jìn)入生長穩(wěn)定期，因此降低流加速度。第五段(215h-240h)流加速率為U0ml/h。
(3) 在24h、 72h、 109h和168h時(shí)分別添加番茄汁提取物10.5ml;
(4) 待培養(yǎng)結(jié)束后取樣測定生物量濃度和葉黃素含量，生物量采用干重法測定，測得 生物量濃度最高為41.2g/L;葉黃素含量通過HPLC來測定，測得葉黃素含量最高為 2.45mg/g。
實(shí)施例4一
(1) 所采用的小球藻藻株為CWow//a戶ra欣/zocoZ^y CS-41(購自CSIRO Marine Laboratory Hobart, Australia),將活化后的小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)3天，使其處于對數(shù)生長期；然 后將小球藻種子液按10% (Wv)接種量接入含Basal培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，Basal培養(yǎng)基的組 分mg/l為1升水中含有KH2P04 1250， MgS04.7H20 1000， EDTA 500， H3B03 114.2， CaCl2-2H20 111， FeS04.7H20 49.8， ZnS04.7H20 88.2， MnCl2.4H20 14.2， Mo03 7.1， CuSO(5H20 15.7， (CoN03)r6H20 4.9;同時(shí)在Basal培養(yǎng)基中添加葡萄糖和尿素，葡萄糖 添加量為10g/L，葡萄糖和尿素的摩爾比為8.9。在7升發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為培養(yǎng)基裝量3.5升；接種量20。/。(v/v); pH6.1士0.2;溫度28士0.5。C，溶解氧50%飽和 濃度；攪拌槳轉(zhuǎn)速與溶氧濃度相偶聯(lián)，起始轉(zhuǎn)速控制在180r/m;
(2) 小球藻在發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h后，小球藻生長進(jìn)入對數(shù)生長期后，發(fā)酵罐中的小球 藻采用分段式恒速流加培養(yǎng)，即開始在發(fā)酵罐中流加培養(yǎng)基，維持發(fā)酵罐中的葡萄糖濃度 在10g/L左右；流加用的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為480g/L、尿素濃度為68.57g/L，流加用的培養(yǎng)基中的其他組分與葡萄糖按比例提供，比例為上述分批培養(yǎng)時(shí)Basal培養(yǎng)基中的組分
與所添加葡萄糖的比例(重量比)。
小球藻接種24h后小球藻生長進(jìn)入對數(shù)期，葡萄糖消耗速率很快，開始進(jìn)行分段式恒
速流加培養(yǎng)，補(bǔ)加葡萄糖，具體分段如下第一段(從起始點(diǎn)24h-48h)培養(yǎng)基的流加速率為
3.5ml/h;到48h因耗糖速率增大，改變流加速率，第二段(72h-109h)流加速率為6.2ml/h;
到72h進(jìn)入對數(shù)旺盛期，耗糖速率更快，加大流加速率，第三段(72h-109h)流加速率為
8.2ml/h;到109h進(jìn)入對數(shù)后期，雖然耗糖速度下降，但是生物量濃度仍有微量上升，降低
流加速率，第四段(168h-215h)流加速率為3.50 ml/h;到168h時(shí)小球藻生物量濃度達(dá)到
了最高值為40.08 g/L。
(3) 在24h、 48h、 72h和109h時(shí)分別添加番茄汁提取物10.5ml;
(4) 待培養(yǎng)結(jié)束后取樣測定生物量濃度和葉黃素含量，生物量采用干重法測定，測得 生物量濃度最高為40.8g/L;葉黃素含量通過HPLC來測定，測得葉黃素含量最高為 225mg/g。
1權(quán)利要求
1、一種同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法，其特征在于包括如下步驟(1)活化后的小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)3～5天，使其處于對數(shù)生長期；(2)然后將小球藻種子液按10％～50％體積接種量接入含Basal培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，同時(shí)往發(fā)酵罐中添加葡萄糖和氮源進(jìn)行分批培養(yǎng)，通過控制通氣量保持發(fā)酵罐中的溶解氧飽和濃度20％～50％，通氣過程中攪拌漿轉(zhuǎn)速與溶氧濃度相偶聯(lián)，起始轉(zhuǎn)速控制在180～200r/m，Basal培養(yǎng)基的pH控制在6.1～6.5，培養(yǎng)溫度控制在28±0.5℃，葡萄糖和氮源的摩爾比為6～12∶1；(3)步驟(2)中的小球藻在發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h～72h，小球藻生長進(jìn)入對數(shù)生長期后，發(fā)酵罐中的小球藻在保持葡萄糖濃度為7g/L～10g/L條件下采用分段式恒速流加培養(yǎng)，同時(shí)在發(fā)酵罐中添加番茄汁提取物，以促進(jìn)葉黃素的積累。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，各步驟中的培養(yǎng)基均采用改良的Basal培 養(yǎng)基，培養(yǎng)基的組分mg/L為1升水中含有KH2PO41250， MgSO4'7H2O1000， EDTA500， H3B03114.2， CaCl2.2H20111， FeS04.7H2049.8， ZnS04.7H2088.2， MnCl2.4H2014.2， Mo037.1， CuS04.5H2015.7， (CoN03)2.6 H204.9。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述氮源為無機(jī)氮源硝酸鹽或有機(jī)氮源尿素。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是葡萄糖和氮源的摩爾比為8.9 10.1: 1。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述分段式恒速流加培養(yǎng)具體為將整個(gè)培養(yǎng)過程分為4 6階段，每個(gè)階段24h，通過流加培養(yǎng)基的方式控制每個(gè)階段發(fā)酵罐中的葡 萄糖濃度為7g/L 10g/L，同時(shí)在每個(gè)階段開始時(shí)于發(fā)酵罐中添加番茄汁提取物，以促進(jìn)葉 黃素的積累。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是分段式恒速流加培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中葡萄糖 濃度為480g/L、尿素濃度為68.57g/L，流加用的培養(yǎng)基中的Basal培養(yǎng)基組分與葡萄糖按 比例提供，該比例為上述分批培養(yǎng)時(shí)Basal培養(yǎng)基中的組分與所添加葡萄糖的比例。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是在發(fā)酵罐中進(jìn)行小球藻的分段式恒速流加培 養(yǎng)的同時(shí)，流加番茄汁提取物，每個(gè)階段添加番茄汁提取物的量為3 5ml/L，使得小球藻 生物量濃度和葉黃素含量同時(shí)提高。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是番茄汁提取物的制備過程為市售純番琉汁 先冷凍干燥，將番茄汁粉置于離心管中，加入丙酮，在振蕩器上振蕩混勻，離心，取上清 液；渣經(jīng)反復(fù)提取變成白色為止，合并上清液并氮?dú)獯蹈桑肈MSO定容。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征是番茄汁提取物的制備方法為市售純番茄汁 先冷凍干燥，稱取250mg的番茄汁粉，置于10mL的離心管，加5mL的丙酮，在振蕩器 上振蕩混勻，離心，取上清液；渣經(jīng)反復(fù)提取變成白色為止，合并提取液并氮?dú)獯蹈?，?DMSO定容至50ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同步式提高異養(yǎng)小球藻的生物量和葉黃素的方法，包括如下步驟活化后的小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)3～5天，使其處于對數(shù)生長期；然后將小球藻種子液按10％～50％體積接種量接入含Basal培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)；小球藻在發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h～72h，小球藻生長進(jìn)入對數(shù)生長期后，發(fā)酵罐中的小球藻在保持葡萄糖濃度為7g/L～10g/L條件下采用分段式恒速流加培養(yǎng)，同時(shí)在發(fā)酵罐中添加番茄汁提取物，以促進(jìn)葉黃素的積累。本發(fā)明采用分段恒速流加培養(yǎng)基和番茄汁提取物，實(shí)現(xiàn)了小球藻高細(xì)胞密度培養(yǎng)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)葉黃素的高效積累。
文檔編號(hào)C12N1/12GK101555454SQ20091003953
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者吳耀庭, 東 魏 申請人:華南理工大學(xué)