專利名稱：一種培養(yǎng)基及用該培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物培養(yǎng)基，具體來說涉及一種新的發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)基，以及用這 種培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法。
背景技術(shù)：
腺苷(Adenosine)學(xué)名為腺嘌呤核苷(9-"-ZHUbofuranosyl adenine),是一種遍布人 體細(xì)胞的內(nèi)源性嘌呤核苷，也是三磷酸腺苷(ATP)的降解產(chǎn)物。腺苷具有擴(kuò)血管，擴(kuò)張冠脈， 觸發(fā)或介導(dǎo)心臟缺血預(yù)適應(yīng)，減輕心臟再灌注損傷等作用，是用于心臟保護(hù)的重要的藥物。 另外腺苷還是合成其它抗病毒和抗癌的核苷類藥物如嘌呤霉素、高瓜氨基腺苷、賴氨酰氨基 腺苷、琥珀酰-5'-腺苷酸、s-腺苷蛋氨酸、腺苷乙硫氨酸和抗病毒腺苷如阿糖腺苷、單磷酸 阿糖腺苷(Ara-Amp) 、 ATP、環(huán)腺苷酸等的中間體。另外隨著腺苷下游研發(fā)工作的深入， 一些 新的用途還在不斷地被開發(fā)出來，例如治療惡性腫瘤藥物8-氯腺苷等，因此腺苷的產(chǎn)業(yè)具有 廣闊的市場(chǎng)和發(fā)展前景。
目前腺苷的合成主要采用生物合成法和化學(xué)合成法，其中生物合成法又包括發(fā)酵法和RNA 降解法?；瘜W(xué)合成法主要采用2， 8-二氯嘌呤、2-甲基硫代腺苷、5-胺-4-氰基-l-咪唑-D-核 糖呋喃或其衍生物、2' ，3， ，5'-三乙?；吸S苷、肌苷、次黃嘌呤為起始原料，由于起始 原料價(jià)格太高，使化學(xué)合成法難以用在大規(guī)模生產(chǎn)上。RNA降解法主要是在生產(chǎn)ATP的過程 中降解RNA獲得腺苷原料,而ATP本身就得依賴進(jìn)口，加上得到的RNA產(chǎn)量非常有限，因此使 腺苷的生產(chǎn)成本過于昂貴，同樣不適于大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)酵法主要是采用含有酵母粉，表面活 性劑吐溫80的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，最終積累腺苷10. 37 g / L (高淑紅，毛利 斯，陳長(zhǎng)華，等.表面活性劑對(duì)5aci77"s sp. ATCC 21616合成腺苷的影響[J].工業(yè)微生 物，2008， 38 (2): 42.46.)，或采用含有酵母粉，酵母粉的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)自行選育的腺苷發(fā) 生菌進(jìn)行發(fā)酵，最終積累腺苷10g/L (柏建新，張一平，朱曉宏，等.微生物發(fā)酵生產(chǎn)腺苷 的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001， 27 (3): 16-20.)，或采用含有酵母粉，十六垸基三甲 基溴化銨的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)腺苷產(chǎn)生菌ATCC 21616進(jìn)行發(fā)酵，最終積累腺苷3.6g/L (汪澤， 喬賓福，袁勤生.十六垸基三甲基溴化銨對(duì)枯草桿菌(A s"^"'s)黃嘌呤缺陷型菌株產(chǎn)生腺 苷的影響[J].工業(yè)微生物，2001, 31 (1): 34-36.)。按照目前國內(nèi)腺苷原料的市場(chǎng)價(jià)格為 60 70萬元/噸計(jì)，采用發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的成本最低，如果最終積累腺苷能達(dá)到10g/L以上， 提取總收率80%以上，則生產(chǎn)成本便可控制在20萬元/噸以下。但是由于目前的發(fā)酵培養(yǎng)基 無一例外都添加了價(jià)格昂貴的酵母粉，并且腺苷產(chǎn)量都很難達(dá)到10g/L以上，再加上操作繁瑣，增加了發(fā)酵過程中產(chǎn)生污染雜菌的幾率。因而目前的發(fā)酵法也都未能用于大規(guī)模工業(yè)生
產(chǎn)。因此如何高效率低成本地獲得腺苷成為我國目前一個(gè)比較重要的研究課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)出一種新的發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)基；另一 目的是開發(fā)出一種用這 種培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法。
我們通過將葡萄糖，腐植酸鉀，麩皮水解液，玉米漿干粉，硫酸銨，CaC03， KH2P04 ， MgS04 ， MnCl2 ，硫酸鐵，腺嘌呤和尿素混合，得到發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)基，然后將腺苷產(chǎn)生菌枯草 芽孢桿菌(&w7^s s"力ti7A ) ATCC 21616菌株接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵得到的腺苷 含量在7g/L以上，且生產(chǎn)成本低廉，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)基，其特征是每升培養(yǎng)基中含有葡萄糖110 160 g，腐植酸 鉀0.2 0.4g，麩皮水解液5 10mL，玉米漿干粉3 5g，硫酸銨6 10g， CaC032 6g， KH2P04 2 4g， MgS04 0. 5 1. 5g, MnCl2 0. 005 0.015g，硫酸鐵O. 005 0. 015 g，腺嘌呤O. 2 0. 6g 和尿素3 6g，其余為水，pH為6.8 7.2。
所述的麩皮水解液是將麩皮與水按質(zhì)量比1:20混合，調(diào)節(jié)pH至l.O，并在0.25MPa壓力下 加熱水解，過濾取濾液得到，所述的麩皮可以從市場(chǎng)上買到，每100g麩皮一般含有蛋白質(zhì)14 16g，碳水化合物28 32g，脂肪3. 5 4. 5g,水分15 15g,膳食纖維30 35g，灰份4 5g,胡蘿卜 素115 125ug，視黃醇當(dāng)量18 22ug，維生素B1 0. 26 0. 34mg,維生素B2 0. 26 0. 34mg, 煙酸12 13mg,維生素E 4. 3 4. 7mg，鉀860 865mg，鈉ll. 5 12. 8mg，鈣200 210mg，鎂 378 390fflg，鐵9. 4 10. 5mg，錳IO. 4 11. 4mg,鋅5. 5 6. 5mg，銅O. 48 0. 58 u g，磷677 687mg,硒7.05 7. 15ug，所述的玉米漿干粉可以從市場(chǎng)上購得，每100g玉米漿干粉一般含 有蛋白質(zhì)41 45g，氨基酸3.8 4.2g，還原糖1.8 2.4g，總磷3.5 3.8g，溶磷l.l 1.6g，酸 度9 12g，乳酸12 13g，總灰份18 22g，鐵O. 045 0. 07g，重金屬O. 0080 0. 0086g。
本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)基用通常的方法制備，是將各組分用水溶解后混合，并用水 定容至規(guī)定體積(比如制備1L培養(yǎng)基，則各組分按以上比例用水溶解后混合，用水定容至1L)， 并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5。/。NaOH調(diào)節(jié)pH至6. 8 7. 2而得到。
用本發(fā)明所述培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法，其特征包括以下的步驟
(1) 將枯草芽孢桿菌(5aciW"s s"6"7A ) ATCC 21616菌株在固體斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 30 34。C培養(yǎng)18 36小時(shí)，再于4。C冷藏1 5天，得到斜面菌種；
(2) 將斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基，于30 34'C的溫度下?lián)u床培養(yǎng)，得到液體種子；
(3) 將液體種子接種到上述本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)基中，于32 37'C的溫度下?lián)u床 振蕩搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72 96小時(shí)得到腺苷，或者于32 38'C通氣攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)60 84h， 其中在發(fā)酵10 18小時(shí)后調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值在5. 9 6. 6，控制排氣中的二氧化碳濃度在體積
4分?jǐn)?shù)1% 5%，當(dāng)排出中二氧化碳的濃度突然下降到體積分?jǐn)?shù)0.2%時(shí)停止發(fā)酵，得到腺苷。
步驟(l)所述的枯草芽孢桿菌(泡cj77m卯Z^L A ) ATCC 21616菌株保藏于美國標(biāo)準(zhǔn)生 物品收藏中心(American Type Culture Collection),簡(jiǎn)稱ATCC (地址Manassas, VA 20108， P.O. Box 1549， USA)，編號(hào)為ATCC 21616，該菌株可以從市場(chǎng)上購得；所述的固體斜面培 養(yǎng)基pH值6.7 7.2，每升培養(yǎng)基中含有蛋白胨3 5g，牛肉膏12 16g，酵母膏5 9g，鳥苷 0.03 0.07g，瓊脂15 22g，其余為水。
步驟(2)所述的液體種子培養(yǎng)基pH值6. 8 7. 2，每升培養(yǎng)基中含有葡萄糖18 22g，酵母 膏8 12g，蛋白胨8 12g，尿素3 5g，玉米漿4 8g，其余為水；所述的搖床培養(yǎng)是采用搖 床振幅65 75cm，轉(zhuǎn)速80 110r/min，培養(yǎng)時(shí)間可以是18 24小時(shí)。
步驟(3)所述的液體種子在發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)基中的接種量最好是質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% 10%， 所述的搖床振蕩可以是沖程65 80mm ，轉(zhuǎn)速90 140r/min的往復(fù)式搖床振蕩，所述的通氣攪 拌發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)中每分鐘內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積比可以是l:O. 1 1.0,在發(fā) 酵10 18小時(shí)后用l(m 16免氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH在5. 9 6. 6。
本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，原材料成本低廉，得到的腺苷含量至少在7g/L，最高可達(dá)14g/L以上， 因此本發(fā)明為腺苷的大規(guī)模生產(chǎn)開辟了一條新的途徑。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。 實(shí)施例1:
將購得的麩皮100g與2000g水混合，調(diào)節(jié)pH至l.O，并在0 .25MPa壓力下加熱水解，過濾 取濾液得到麩皮水解液。
將葡萄糖110g，腐植酸鉀0.2g，麩皮水解液5 mL，玉米漿干粉3g，硫酸銨6g， CaC03 2g， KH2P04 2g， MgS04 0,5g, MnCl2 0. 005g，硫酸鐵O. 005g，腺嘌呤O. 2g和尿素3g，加自來水溶解 混合至1L，用5。/。NaOH調(diào)節(jié)上述溶液的pH為6.8，得到腺苷發(fā)酵培養(yǎng)基。
實(shí)施例2:
將購得的麩皮100g與2000g水混合，調(diào)節(jié)pH至l.O，并在0 .25MPa壓力下加熱水解，過濾
取濾液得到麩皮水解液。
將葡萄糖140g，腐植酸鉀0.3g，麩皮水解液8 mL，玉米漿干粉4g，硫酸銨8g， CaC03 4g， KH2P04 3g， MgS041.0g， MnCl20.01g，硫酸鐵O. Olg,腺嘌呤O. 4g和尿素4. 5g，加自來水溶解 混合至1L，用5。/。NaOH調(diào)節(jié)上述溶液的pH為7.0，得到腺苷發(fā)酵培養(yǎng)基。
實(shí)施例3:
將購得的麩皮100g與2000g水混合，調(diào)節(jié)pH至l. 0，并在0 .25MPa壓力下加熱水解，過濾 取濾液得到麩皮水解液。將葡萄糖160g，腐植酸鉀0.4g，麩皮水解液10mL，玉米漿干粉5g，硫酸銨10g, CaC036g， KH2P04 4g， MgS04 L5g， MnCl2 0.015g，硫酸鐵O. 015g，腺嘌呤O. 6g和尿素6g，加自來水溶解 混合至1L，用5。/。NaOH調(diào)節(jié)上述溶液的pH為7.2，得到腺苷發(fā)酵培養(yǎng)基。
實(shí)施例4:
將枯草芽孢桿菌(Sacj'"〃s犯6"h's ) ATCC 21616菌株在固體斜面培養(yǎng)基(pH值6. 7， 蛋白胨3g，牛肉膏12g，酵母膏5g,鳥苷0.03g，瓊脂15g，加自來水溶解混合至1L)上培 養(yǎng)，3(TC培養(yǎng)36小時(shí)，再冷藏于4'C 3天,得到斜面菌種。
用接種針將斜面上約lcm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到裝有20mL液體種子培養(yǎng)基(pH值6. 8， 葡萄糖18g，酵母膏8g，蛋白胨8g，尿素3g，玉米漿4g，加自來水溶解混合至lL)的500mL 三角瓶(0. 07MPa滅菌10min.)中，于30。C往復(fù)式搖床(振幅65cm、搖床轉(zhuǎn)速80r/min)振動(dòng) 培養(yǎng)18小時(shí)，得到液體種子。
將lmL液體種子接種入裝有20mL實(shí)施例l的本發(fā)明培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于32'C，沖程 65mm，轉(zhuǎn)速90r/min的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，停止發(fā)酵。
采用紙層析法測(cè)定發(fā)酵液中腺苷含量發(fā)酵液4000r/min離心10min后，用微量進(jìn)樣器取 20uL離心上清液輕輕點(diǎn)在新華3號(hào)濾紙(長(zhǎng)30cmX寬2cm)底部(離底邊約l. 5cm)，用電吹干， 懸掛浸入展層液中約O. 5cra，展層液為正丁醇，乙酸和水按體積比4:1:1混合的溶劑，展層析7 8小時(shí)后，取出，烘干，用短波紫外分析儀觀察紫外吸收斑點(diǎn)，剪下斑點(diǎn)，用pH為l的鹽酸溶 液10mL浸泡2小時(shí)，于波長(zhǎng)260nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定光密度(0D26(L)。以點(diǎn)樣體積20 UL為例，腺苷含量=(0D26(LX浸泡體積X分子量)+ (摩爾消光系數(shù)X點(diǎn)樣體積)= (0D260nmX 10X267. 24) + (14. 3X 103X20X 10一3) = 0D260服X9. 344 g/L。測(cè)出本實(shí)施例得 到的發(fā)酵液中腺苷含量為8. 34g/L。
實(shí)施例5:
將枯草芽孢桿菌(fec/7/us s"&j'h's ) ATCC 21616菌株在固體斜面培養(yǎng)基(pH值7.2， 蛋白胨5g，牛肉膏16g，酵母膏9g，鳥苷0.07g，瓊脂22g，加自來水溶解混合至1L)上培養(yǎng)， 34'C培養(yǎng)18小時(shí)，再冷藏于4'C l天,得到斜面菌種。
用接種針將斜面上約lcm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到裝有20mL液體種子培養(yǎng)基(pH值7. 0， 葡萄糖20g，酵母膏10g，蛋白胨10g，尿素4g，玉米漿6g，加自來水溶解混合至lL)的500mL 三角瓶(0.07MPa滅菌10min)中，于32。C往復(fù)式搖床(振幅75cm、搖床轉(zhuǎn)速100r/min)振動(dòng) 培養(yǎng)24小時(shí)，得到液體種子。
將2mL液體種子接種入裝有20mL實(shí)施例2的本發(fā)明培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于32'C，沖程 75,，轉(zhuǎn)速120r/min的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)84小時(shí)，停止發(fā)酵。
根據(jù)實(shí)施例4的方法，算出本實(shí)施例得到的發(fā)酵液中腺苷含量為14. 60g/L。實(shí)施例6:
將枯草芽孢桿菌(few77〃s s〃6z^7A ) ATCC 21616菌株在固體斜面培養(yǎng)基(pH值7. 0， 蛋白胨4g，牛肉膏14g，酵母膏7g，鳥苷0.05g，瓊脂20g，加自來水溶解混合至1L)上培養(yǎng)， 32。C培養(yǎng)30小時(shí)，再冷藏于4。C 5天，得到斜面菌種。
用接種針將斜面上約lcm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到裝有20mL液體種子培養(yǎng)基(pH值7. 2， 葡萄糖22g，酵母膏12g，蛋白胨12g,尿素5g，玉米漿8g，加自來水溶解混合至lL)的500mL 三角瓶(0. 07MPa滅菌10min)中，于34'C往復(fù)式搖床(振幅70cm、搖床轉(zhuǎn)速110r/min)振動(dòng) 培養(yǎng)22小時(shí)，得到液體種子。
將l. 5mL液體種子接種入裝有20mL實(shí)施例3的本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于37'C， 沖程80mm，轉(zhuǎn)速140r/min的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)96小時(shí)，停止發(fā)酵。
根據(jù)實(shí)施例4的方法，算出本實(shí)施例得到的發(fā)酵液中腺苷含量為12. 11g/L。
實(shí)施例7:
將枯草芽孢桿菌(萬aw7^/s幼力"7A ) ATCC 21616菌株在固體斜面培養(yǎng)基(pH值7. 0， 蛋白胨4g，牛肉膏14g，酵母膏7g，鳥苷0.05g，瓊脂20g，加自來水溶解混合至1L)上培養(yǎng)， 32'C培養(yǎng)30小時(shí)，再冷藏于4'C 3天，得到斜面菌種。
用接種針將斜面上約lcm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到裝有20mL液體種子培養(yǎng)基(pH值7. 2， 葡萄糖18g，酵母膏8g，蛋白胨8g，尿素3g，玉米漿4g，加自來水溶解混合至lL)的500mL三 角瓶(0.07MPa滅菌10min)中，于3(TC往復(fù)式搖床(振幅65cm、搖床轉(zhuǎn)速80r/min)振動(dòng)培養(yǎng) 18小時(shí),得到液體種子。
將l. 25L液體種子接種到裝有25L實(shí)施例1的本發(fā)明培養(yǎng)基的40L發(fā)酵罐中(接種前120'C滅 菌8分鐘，)，通風(fēng)量(即每分鐘內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積比)為l:O.l， 32'C發(fā)酵 培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至18小時(shí)，用10y。氨水控制發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH在6.6，發(fā)酵排氣中二氧 化碳的濃度控制在體積分?jǐn)?shù)1%，發(fā)酵84h后排出中二氧化碳的濃度突然下降到體積分?jǐn)?shù)0. 2%， 停止發(fā)酵，得到腺苷。按實(shí)施例4的方法測(cè)得發(fā)酵液中腺苷含量為7. 26g/L。
實(shí)施例8:
將枯草芽孢桿菌(泡c/77"s s"力"7/s ) ATCC 21616菌株在固體斜面培養(yǎng)基(pH值7. 2， 蛋白胨5g，牛肉膏16g，酵母膏9g，鳥苷0.07g，瓊脂22g，加自來水溶解混合至1L)上培養(yǎng)， 34'C培養(yǎng)18小時(shí)，再冷藏于4'C l天，得到斜面菌種。
用接種針將斜面上約lcm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到裝有20mL液體種子培養(yǎng)基(pH值7. 0， 葡萄糖20g，酵母膏10g，蛋白胨10g，尿素4g，玉米漿6g，加自來水溶解混合至lL)的500mL 三角瓶(0.07MPa滅菌10min)中，于32。C往復(fù)式搖床(振幅75cm、搖床轉(zhuǎn)速100r/min)振動(dòng) 培養(yǎng)24小時(shí)，得到液體種子。
7將2. 5L液體種子接種到裝有25L實(shí)施例2的本發(fā)酵培養(yǎng)基的40L發(fā)酵罐中(接種前12(TC滅 菌12分鐘，)，通風(fēng)量(即每分鐘內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積比)為1:0.6， 36r發(fā)酵 培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至12小時(shí)，用16y。氨水控制發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH在6.0，發(fā)酵排氣中二氧 化碳的濃度控制在體積分?jǐn)?shù)4%，發(fā)酵72h后排出中二氧化碳的濃度突然下降到體積分?jǐn)?shù)0. 2%， 停止發(fā)酵，得到腺苷。按實(shí)施例4的方法測(cè)得發(fā)酵液中腺苷含量為13.44g/L。
實(shí)施例9:
將枯草芽孢桿菌(&w77"s w力^7is ) ATCC 21616菌株在固體斜面培養(yǎng)基(pH值6. 7， 蛋白胨3g,牛肉膏12g，酵母膏5g，鳥苷0.03g，瓊脂15g，加自來水溶解混合至1L)上培 養(yǎng)，30'C培養(yǎng)36小時(shí)，再冷藏于4t: 2天，得到斜面菌種。
用接種針將斜面上約lcm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到裝有20mL液體種子培養(yǎng)基(pH值6. 8， 葡萄糖22g，酵母膏12g，蛋白胨12g，尿素6g,玉米漿8g，加自來水溶解混合至lL)的500mL 三角瓶(0. 07MPa滅菌10min)中，于32"C往復(fù)式搖床(振幅70cm、搖床轉(zhuǎn)速110r/min)振動(dòng) 培養(yǎng)22小時(shí),得到液體種子。
將l. 875L液體種子接種到裝有25L實(shí)施例3的本發(fā)明培養(yǎng)基的40L發(fā)酵罐中(接種前12(TC 滅菌12分鐘，)，通風(fēng)量(即每分鐘內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積比)為l:l.O， 38'C發(fā) 酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至10小時(shí)，用13。/。氨水控制發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH在5.9，發(fā)酵排氣中二 氧化碳的濃度控制在體積分?jǐn)?shù)5%，發(fā)酵60h后排出中二氧化碳的濃度突然下降到體積分?jǐn)?shù) 0.2%，停止發(fā)酵，得到腺苷。按實(shí)施例4的方法測(cè)得發(fā)酵液中腺苷含量為11.21g/L。
權(quán)利要求
1. 一種發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)基，其特征是每升培養(yǎng)基中含有葡萄糖110～160g，腐植酸鉀0.2～0.4g，麩皮水解液5～10mL，玉米漿干粉3～5g，硫酸銨6～10g，CaCO32～6g，KH2PO42～4g，MgSO40.5～1.5g，MnCl20.005～0.015g，硫酸鐵0.005～0.015g，腺嘌呤0.2～0.6g和尿素3～6g，其余為水，pH為6.8～7.2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)基，其特征是所述的麩皮水解液是將 麩皮與水按質(zhì)量比1:20混合，調(diào)節(jié)pH至l.O，并在0.25MPa壓力下加熱水解，過濾取濾液得到。
3. —種用權(quán)利要求l所述的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法，其特征包括以下的步驟(1) 將枯草芽孢桿菌(5aciWiA w力"7i5 ) ATCC 21616菌株在固體斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 30 34'C培養(yǎng)18 36小時(shí)，再于4t冷藏1 5天，得到斜面菌種；(2) 將斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基，于30 34t:的溫度下?lián)u床培養(yǎng)，得到液體種子；(3) 將液體種子接種到權(quán)利要求l所述的培養(yǎng)基中，于32 37t:的溫度下?lián)u床振蕩搖瓶發(fā) 酵培養(yǎng)72 96小時(shí)得到腺苷，或者于32 38'C通氣攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)60 84h，其中在發(fā)酵 10 18小時(shí)后調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值在5. 9 6. 6，控制排氣中的二氧化碳濃度在體積分?jǐn)?shù)1% 5%， 當(dāng)排出中二氧化碳的濃度突然下降到體積分?jǐn)?shù)O. 2%時(shí)停止發(fā)酵，得到腺苷。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法，其特征是步驟(l)所述的固體斜面培養(yǎng)基 pH值6.7 7.2，每升培養(yǎng)基中含有蛋白胨3 5g，牛肉膏12 16g，酵母膏5 9g，鳥苷0. 03 0.07g，瓊脂15 22g，，其余為水；步驟(2)所述的液體種子培養(yǎng)基pH值6.8 7.2，每升培養(yǎng) 基中含有葡萄糖18 22g，酵母膏8 12g，蛋白胨8 12g，尿素3 5g，玉米漿4 8g，其余為 水；所述的搖床培養(yǎng)是采用搖床振幅65 75cm，轉(zhuǎn)速80 110r/min，培養(yǎng)時(shí)間是18 24小時(shí)， 步驟(3)所述的液體種子在發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)基中的接種量是質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% 10%，所述的搖 床振蕩是沖程65 80rara ，轉(zhuǎn)速90 140r/min的往復(fù)式搖床振，所述的通氣攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵培 養(yǎng)中每分鐘內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積比是l:O. 1 1.0，在發(fā)酵10 18小時(shí)后用 10y。 16。/。氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH在5. 9 6. 6。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基及用該培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法。其特征是每升該培養(yǎng)基中含有葡萄糖110～160g，腐植酸鉀0.2～0.4g，麩皮水解液5～10mL，玉米漿干粉3～5g，硫酸銨6～10g，CaCO₃ 2～6g，KH₂PO₄ 2～4g，MgSO₄ 0.5～1.5g，MnCl₂ 0.005～0.015g，硫酸鐵0.005～0.015g，腺嘌呤0.2～0.6g和尿素3～6g，其余為水。將枯草芽孢桿菌ATCC 21616菌株用固體斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)得到斜面菌種，然后將斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到的液體種子接種到上述本發(fā)明培養(yǎng)基上，搖床振蕩搖瓶發(fā)酵或通氣攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)得到腺苷。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，原材料成本低廉，得到的腺苷含量至少在7g/L，最高達(dá)14g/L以上，為腺苷大規(guī)模生產(chǎn)開辟了一條新途徑。
文檔編號(hào)C12P19/40GK101475974SQ20091003689
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者施慶珊, 李良秋, 林小平, 歐陽友生, 疏秀林, 虹 許, 謝小保, 邱曉穎, 邱玉棠, 陳儀本, 黃小茉 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所