專利名稱：一種利用核酸檢測(cè)技術(shù)鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用核酸檢測(cè)技術(shù)鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒?，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域。在 白酒防偽方面具有非常重要的意義。
二背景技術(shù)：
白酒是我國(guó)獨(dú)有的傳統(tǒng)產(chǎn)品，歷史悠久。近些年來，對(duì)白酒的需求量尤其是對(duì)名優(yōu) 產(chǎn)品的需求量愈來愈大，如何鑒別真假名優(yōu)白酒已受到人們的廣泛重視。目前白酒的防 偽主要采用在酒類產(chǎn)品的瓶口、瓶蓋、外包裝、標(biāo)識(shí)、封口等處使用防偽包裝和防偽印 刷技術(shù)。這些防偽措施雖然起到一定的防偽作用，但與公眾的心理希望及市場(chǎng)管理的需 求都還有一定的距離。它們本身具有卓越的防偽功能，或者還有完善的電話、網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng) 作為支持，但存在的核心問題是，這些技術(shù)實(shí)施的對(duì)象并不是酒品本身，而是酒品的身 外之物，相對(duì)于酒品而言，僅僅是附屬品或寄生物，與酒品并無直接的、內(nèi)在的、必然 的聯(lián)系。它能起到的作用僅是為酒品制作了一套鐵甲和頭盔，當(dāng)遇到狡詐險(xiǎn)惡的制假者 采用偷梁換柱的方法，假酒真包裝時(shí)，這種僅是將防偽單元附加在防偽主題上，重表不 重里思維下的防偽策略，就必然會(huì)給制假者留下可乘之機(jī)，最終導(dǎo)致假冒偽劣產(chǎn)品攪亂 市場(chǎng)秩序。針對(duì)酒品本身的內(nèi)涵防偽技術(shù)主要是利用紅外光譜、氣相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)技 術(shù)建立各種名優(yōu)白酒的指紋圖譜，由于不同的白酒生產(chǎn)廠家所處的地域、氣候、微生物 環(huán)境、水質(zhì)環(huán)境不同及生產(chǎn)工藝的差別，生產(chǎn)出的白酒的成份有所不同，根據(jù)這些成份 的不同采用紅外光譜、氣相色譜和質(zhì)譜進(jìn)行指紋的鑒定。這種內(nèi)涵防偽技術(shù)需要事先建 立各種白酒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，這就需要嚴(yán)格控制生產(chǎn)質(zhì)量，保證不同批次之間的差異縮 小到最小，主要化學(xué)成份不發(fā)生變化。DNA防偽技術(shù)以其自然物質(zhì)復(fù)雜編碼的特點(diǎn)和運(yùn) 用專有技術(shù)能夠及時(shí)檢測(cè)鑒定但又無法復(fù)制和破譯的優(yōu)勢(shì)，越來越受到防偽業(yè)的青睞， 被用作打擊假冒偽劣產(chǎn)品的銳利新武器。DNA防偽技術(shù)即可針對(duì)產(chǎn)品包裝也可針對(duì)產(chǎn)品 "自身"進(jìn)行防偽，當(dāng)其針對(duì)產(chǎn)品包裝進(jìn)行防偽時(shí)同樣存在假酒真包裝的問題，因此本 發(fā)明采用向白酒中加入DNA,然后檢測(cè)白酒中加入的DNA,建立針對(duì)白酒"自身"的 內(nèi)涵防偽技術(shù)，這種內(nèi)涵防偽技術(shù)是專業(yè)防偽技術(shù)，能為各白酒生產(chǎn)廠家、各級(jí)質(zhì)量監(jiān) 督及市場(chǎng)監(jiān)管部門提供技術(shù)支持，讓他們?cè)诰S權(quán)執(zhí)法中主動(dòng)、迅速、準(zhǔn)確的采取行動(dòng)， 保護(hù)企業(yè)和消費(fèi)者的合法權(quán)益。三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前白酒防偽技術(shù)中存在的問題提供一種鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒ā?br> 技術(shù)方案
本發(fā)明提供一種利用核酸檢測(cè)技術(shù)鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒ā?上述利用核酸檢測(cè)技術(shù)鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒?br> (1) 向白酒中加入一種DNA溶液。
(2) 采用乙醇沉淀的方法提取酒中所加入的DNA。
(3) 以提取的DNA作為模板，以相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，取PCR產(chǎn)物7pL，采 用質(zhì)量比2.0X的瓊脂糖凝膠含0.005XGOLDView， 0.5xTBE電泳緩沖液，120V恒壓電 泳40min,紫外燈下觀察電泳結(jié)果。
(4) 真?zhèn)舞b別標(biāo)準(zhǔn)電泳結(jié)果出現(xiàn)目的條帶且大小與所加入的DNA片斷設(shè)計(jì)值相符 即為真酒，不出現(xiàn)目的條帶或大小不相符即為假酒。
有益效果
本發(fā)明提供一種利用核酸檢測(cè)技術(shù)鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒ā楦靼拙粕a(chǎn)廠家、各級(jí) 質(zhì)量監(jiān)督市及場(chǎng)監(jiān)管部門提供技術(shù)支持，讓他們?cè)诰S權(quán)執(zhí)法中主動(dòng)、迅速、準(zhǔn)確的采取 行動(dòng)，保護(hù)企業(yè)及消費(fèi)者的合法權(quán)益。
四

圖1為加入短小芽孢桿菌CGMCCNo.2337基因組DNA的各種度數(shù)白酒樣品和不加 短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的各種度數(shù)白酒樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳 檢測(cè)結(jié)果。M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp); 1為加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的38°白酒；2為未加入短小芽孢 桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的38°白酒；3為加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337 基因組DNA的45°白酒；4為未加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的45 °白酒；5為加入短小芽孢桿菌CGMCCNo.2337基因組DNA的52。白酒；6為未加入 短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的52°白酒;7為加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的55°白酒；8為未加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組 DNA的55。白酒；9為加入短小芽孢桿菌CGMCCNo.2337基因組DNA的65°白酒；10為未加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的65°白酒；11為短小芽孢桿 菌CGMCC No.2337基因組DNA樣品。 五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一以向白酒中加入雞基因組DNA為例鑒別白酒真?zhèn)?br> 1按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取 雞肉中基因組DNA。
2向500mL白酒中加入lmg雞基因組DNA溶液。
3提取白酒中雞基因組DNA。
(1) 取含有雞基因組DNA的白酒40(^L置于1.5mL離心管中，加入3.0mol/L的醋酸 鈉溶液40pL，充分混勻。
(2) 加入90(VL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14^L，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0°C, 12000r/min，離心20min，回收雞基因組DNA。
(4) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 力[]70(^L的70^的乙醇，于4。C， 12000r/min，離心20min。
(6) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將雞基因組DNA沉淀溶于10pLpH 8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。
4以從酒中提取的雞基因組DNA為模板，以序列表中SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2 引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的條帶為261bp。
25nLPCR反應(yīng)體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL， 1Opmol/L上、 下游引物各lpL，模板DNA5pL，補(bǔ)水至25^L。
循環(huán)參數(shù)為94°C，預(yù)變性5min。 94'C變性30s， 55。C退火30s, 72。C延伸lmin， 重復(fù)10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5'C;然后94'C變性15s， 5(TC退火30s， 72'C延 伸lmin，重復(fù)20個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸5min。
5取PCR產(chǎn)物7jiL，采用質(zhì)量比2.0X的瓊脂糖凝膠含0.005XGOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果出現(xiàn)261bp的目 的條帶即為真酒，不出現(xiàn)目的條帶或大小不相符即為假酒。
實(shí)施例二以向白酒中加入大豆基因組DNA為例鑒別白酒真?zhèn)?br> 1按照新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取大豆新
5鮮嫩葉片中的大豆基因組DNA。
2向500mL白酒中加入lmg大豆基因組DNA溶液。 3提取白酒中大豆基因組DNA。
(1) 取含有大豆基因組DNA的白酒400pL置于1.5mL離心管中，加入3.0mol/L的醋 酸鈉溶液40pL，充分混勻。
(2) 加入卯OpL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14pL，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0°C， 12000r/min，離心20min，回收大豆基因組DNA。
(4) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 加700fiL的70X的乙醇，于4。C， 12000r/min,離心20min。
(6) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將大豆基因組DNA沉淀溶于10pLpH8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。
4以從酒中提取的大豆基因組DNA為模板，序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID N0.4 引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的條帶為436bp 。
25pLPCR反應(yīng)體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL， 1Onmol/L上、 下游引物各lpL，模板DNA5pL，補(bǔ)水至25tiL。
循環(huán)參數(shù)為94°C,預(yù)變性5min。 94卩變性30s， 55t)退火30s， 72'C延伸lmin， 重復(fù)10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5。C;然后94'C變性15s， 5(TC退火30s， 72"C延 伸lmin，重復(fù)20個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5min。
5取PCR產(chǎn)物7nL，采用質(zhì)量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果出現(xiàn)436bp的目 的條帶即為真酒，不出現(xiàn)目的條帶或大小不相符即為假酒。
實(shí)施例三以向白酒中加入酵母基因組DNA為例鑒別白酒真?zhèn)?br> 1按照酵母基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取酵母基因組 DNA。
2向500mL白酒中加入IO嗎酵母基因組DNA溶液。 3提取白酒中酵母基因組DNA。
(1)取含有酵母基因組DNA的白酒400nL置于1.5mL離心管中，加入3.0mol/L的醋 酸鈉溶液40pL，充分混勻。(2) 加入900pL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14pL，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0°C， 12000r/min，離心20min，回收酵母基因組DNA。
(4) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 加700nL的70X的乙醇，于4。C， 12000r/min，離心20min。
(6) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將酵母基因組DNA沉淀溶于10pLpH8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。
4以從酒中提取的酵母基因組DNA為模板，以序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID N0.6引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的條帶為730bp 。
25pLPCR反應(yīng)體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL, 1Onmol/L上、 下游引物各lpL，模板DNA5piL,補(bǔ)水至25iiL。
循環(huán)參數(shù)為94°C，預(yù)變性5min。 94。C變性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸lmin， 重復(fù)10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5。C;然后94。C變性15s， 50。C退火30s， 72。C延 伸lmin，重復(fù)20個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5min。
5取PCR產(chǎn)物7nL，采用質(zhì)量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min,紫外燈下觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果出現(xiàn)730bp的目 的條帶即為真酒，不出現(xiàn)目的條帶或大小不相符即為假酒。
實(shí)施例四以向白酒中加入短小芽孢桿菌CGMCCNo.2337基因組DNA為例鑒別白酒真 偽
1按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取短小芽孢桿 菌CGMCC No.2337基因組DNA。
2向500mL白酒中加入l昭短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA溶液。 3提取白酒中短小芽孢桿菌CGMCCNo.2337基因組DNA。
(1) 取含有短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的白酒400^iL置于1.5mL離 心管中，加入3.0mol/L的醋酸鈉溶液40pL，充分混勻。
(2) 加入900pL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14nL,充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) (TC， 12000r/min，離心20min，回收短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA。
(4) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。(5) 力口 700nL的70%的乙醇，于4。C， 12000r/min，離心20min。
(6) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA沉淀溶于lOpL pH 8.0的TE溶液 中，充分漂洗管壁。
4以從酒中提取的短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA為模板，以序列表中 SEQ ID NO.7和SEQ ID N0.8引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的條帶為U69bp 。
25pLPCR反應(yīng)體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL, 1Onmol/L上、 下游引物各lpL，模板DNA5pL，補(bǔ)水至25nL。
循環(huán)參數(shù)為94°C,預(yù)變性5min。 94。C變性30s， 55。C退火30s, 72。C延伸lmin， 重復(fù)10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5'C;然后94。C變性15s, 5(TC退火30s， 72'C延 伸lmin，重復(fù)20個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸5min。
5取PCR產(chǎn)物7pL，采用質(zhì)量比2.0X的瓊脂糖凝膠含0.005XGOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果出現(xiàn)1169bp的目 的條帶即為真酒，不出現(xiàn)目的條帶或大小不相符即為假酒。
實(shí)施例五以向白酒中加入犬細(xì)小病毒基因組DNA為例鑒別白酒真?zhèn)?br> 1按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取犬細(xì)
小病毒基因組DNA。
2向500mL白酒中加入lpg犬細(xì)小病毒基因組DNA溶液。 3提取白酒中犬細(xì)小病毒基因組DNA。
(1) 取含有犬細(xì)小病毒基因組DNA的白酒400pL置于1.5mL離心管中，加入3.Omol/L 的醋酸鈉溶液40nL,充分混勻。
(2) 加入900nL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14pL，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0'C， 12000r/min,離心20min，回收犬細(xì)小病毒基因組DNA。
(4) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 加700iiL的70W的乙醇，于4。C， 12000r/min,離心20min。
(6) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將犬細(xì)小病毒基因組DNA沉淀溶于lOpLpH 8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。4以從酒中提取的犬細(xì)小病毒基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.9和SEQ ID NO.10 進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的條帶為448bp。
25laLPCR反應(yīng)體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL， 10[imol/L上、 下游引物各1HL,模板DNA5pL，補(bǔ)水至25nL。
循環(huán)參數(shù)為94°C，預(yù)變性5min。 94'C變性30s， 55'C退火30s， 72'C延伸lmin， 重復(fù)10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5'C;然后94。C變性15s， 50'C退火30s， 72'C延 伸lmin，重復(fù)20個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸5min。
5取PCR產(chǎn)物7pL，采用質(zhì)量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果出現(xiàn)448bp的目 的條帶即為真酒，不出現(xiàn)目的條帶或大小不相符即為假酒。
實(shí)施例六以向白酒中加入pUC57質(zhì)粒DNA為例鑒別白酒真?zhèn)?br> 1向500mL白酒中加入lng pUC57質(zhì)粒DNA (Fermentas International Inc.)溶液。 2提取白酒中pUC57質(zhì)粒DNA。
(1)取含有pUC57質(zhì)粒DNA的白酒400pL置于1.5mL離心管中，加入3.0mol/L的 醋酸鈉溶液4(^iL，充分混勻。
(2〉加入900pL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14pL，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0'C， 12000r/min，離心20min，回收pUC57質(zhì)粒DNA。
(4) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 力n 700laL的70X的乙醇，于4。C, 12000r/min,離心20min。
(6) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將pUC57質(zhì)粒DNA沉淀溶于10pLpH 8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。
3以從酒中提取的pUC57質(zhì)粒DNA為模板，以SEQ ID NO.ll和SEQ ID N0.12進(jìn) 行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的條帶為174bp 。
25pLPCR反應(yīng)體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL， 1Onmol/L上、 下游引物各lpL，模板DNA5^iL，補(bǔ)水至25pL。
循環(huán)參數(shù)為94'C，預(yù)變性5min。 94'C變性30s， 55。C退火30s， 72'C延伸lmin， 重復(fù)10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5'C;然后94。C變性15s， 50。C退火30s， 72。C延 伸lmin，重復(fù)20個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸5min。
94取PCR產(chǎn)物7pL,采用質(zhì)量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果出現(xiàn)174bp的目 的條帶即為真酒，不出現(xiàn)目的條帶或大小不相符即為假酒。
實(shí)施例七以向白酒中加入豬基因組DNA片段為例鑒別白酒真?zhèn)?br> 1按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取 豬肉中基因組DNA。
2以提取的豬的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增目的條帶為600bp 。 25^LPCR反應(yīng)體系為2xPCRMixl2.5pL， 1Opmol/L上、 下游引物各1HL，模板DNAlpL，補(bǔ)水至25pL。循環(huán)參數(shù)為94°C， 2預(yù)變性min。 94°C 變性15s， 55。C退火30s， 68。C延伸lmin，重復(fù)10個(gè)循環(huán)；94。C變性15s， 50。C退火30s， 68。C延伸lmin,重復(fù)10個(gè)循環(huán)；94。C變性15s， 45。C退火30s， 68。C延伸lmin，重復(fù)10 個(gè)循環(huán)；68。C延伸5min。
3按照普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(天根生化科技有限公司)說明回收PCR產(chǎn)物。
4向500mL白酒中加入10ngPCR產(chǎn)物。
5提取白酒中PCR產(chǎn)物。
(1) 取含有PCR產(chǎn)物的白酒400pL置于1.5mL離心管中，加入3.Omol/L的醋酸鈉溶 液4(HiL，充分混勻。
(2) 加入900pL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14|_iL，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0°C， 12000r/min,離心20min，回收PCR產(chǎn)物。
(4) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 力B70(HiL的70X的乙醇，于4。C， 12000r/min，離心20min。
(6) 用自動(dòng)微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將PCR產(chǎn)物沉淀溶于10pLpH 8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。
6以從酒中提取的PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增目的條帶為364bp 。
25pLPCR反應(yīng)體系為2xPCRMix(天根生化科技有限公司)12.5pL， 10^mol/L上、 下游引物各1HL，模板DNA5pL，補(bǔ)水至25pL。
循環(huán)參數(shù)為94°C，預(yù)變性5min。 94。C變性30s， 55'C退火30s, 72。C延伸lmin,重復(fù)10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5t:;然后94。C變性15s， 5(TC退火30s， 72。C延 伸lmin，重復(fù)20個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5min。
7取PCR產(chǎn)物7pL，采用質(zhì)量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView， 0.5x丁BE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果出現(xiàn)364bp的目 的條帶即為真酒，不出現(xiàn)目的條帶或大小不相符即為假酒。序列表
<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> —種利用核酸檢測(cè)技術(shù)鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒?br> <130> 說明書
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<170> Patentin version 3.1
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tggacttaac actgctattg cc 22
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權(quán)利要求
1.一種利用核酸檢測(cè)技術(shù)鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在?1)向白酒中加入一種DNA溶液。(2)采用乙醇沉淀的方法提取酒中所加入的DNA。(3)以提取的DNA作為模板，以相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，取PCR產(chǎn)物7μL，采用質(zhì)量比2.0％的瓊脂糖凝膠含0.005％GOLDView，0.5×TBE電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。(4)真?zhèn)舞b別標(biāo)準(zhǔn)電泳結(jié)果出現(xiàn)目的條帶且大小與所加入的DNA片斷設(shè)計(jì)值相符即為真酒，不出現(xiàn)目的條帶或大小不相符即為假酒。
2. 如權(quán)利要求l所述的鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于所述DNA來自動(dòng)物、 植物、微生物或人工合成的基因組DNA或基因片段。
3. 如權(quán)利要求1所述的鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒ㄔ谒衅放瓢拙普鎮(zhèn)舞b別方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用核酸檢測(cè)技術(shù)鑒別白酒真?zhèn)蔚姆椒ǎ瑢儆谏锔呒夹g(shù)領(lǐng)域。向白酒中加入一種DNA溶液，然后提取酒中所加入的DNA，采用PCR反應(yīng)檢測(cè)目的基因，根據(jù)電泳結(jié)果中擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及大小判斷白酒的真?zhèn)?。該方法具有快速、?jiǎn)單、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。適合為各白酒生產(chǎn)廠家、各級(jí)質(zhì)量監(jiān)督、市場(chǎng)監(jiān)管部門提供技術(shù)支持，讓他們?cè)诰S權(quán)執(zhí)法中主動(dòng)、迅速、準(zhǔn)確的采取行動(dòng)，保護(hù)企業(yè)和消費(fèi)者的合法權(quán)益。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101665825SQ200910035889
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日 公開號(hào)200910035889.發(fā)明者姚大偉, 楊德吉, 許家榮, 新 鄭 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)