專利名稱：構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外發(fā)育模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外發(fā)育模型的方法。
背景技術(shù)：
尿道下裂發(fā)病因素繁多，機制復雜，遺傳因素是尿道下裂發(fā)生的一個原因，但近年 來環(huán)境中內(nèi)分泌干擾性化學物質(zhì)的增多，特別是雌激素攝入的增多被認為是尿道下裂發(fā)病 率增加的一個關(guān)鍵因素，我們已經(jīng)成功建立了雌激素誘導的尿道下裂動物模型，研究一些 內(nèi)分泌干擾化學物質(zhì)與陰莖發(fā)育之間的關(guān)系，特別是揭示其中的機制對尿道下裂的防治至 關(guān)重要，但在研究陰莖發(fā)育時目前缺乏相關(guān)的工具，動物模型研究雖然有效但不方便，小鼠 陰莖的發(fā)育與人類相似，我們在研究中發(fā)現(xiàn)小鼠生殖結(jié)節(jié)發(fā)育在性分化期(E14. 5d)前小 于lmm 適于器官培養(yǎng)。我們設想通過生殖結(jié)節(jié)在體外進行器官培養(yǎng)建立尿道體外發(fā)育模 型，為進一步研究陰莖尿道發(fā)育機制和外生殖器畸形的發(fā)病機制提供有效工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方法合理，易操作的構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外 發(fā)育模型的方法。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是 —種構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外發(fā)育模型的方法，其特征是依次包括下列 步驟 (1)精確孕期小鼠的獲取取8-10周齡近交系小鼠，于晚上按雌雄4 : l合籠，第 二天早上分籠，分籠時觀察雌鼠陰道內(nèi)陰栓情況，以陰道口看見白色漿液性栓子者為交配 成功，予以分開飼養(yǎng)，定為孕0. 5d計算，交配未成功者可予以再交配；
(2)胚胎性別鑒定采用解剖法或PCR法進行性別鑒定；
(3)生殖結(jié)節(jié)的切取和培養(yǎng) ①斷頸處死孕鼠，將其固定于取材板上，75%酒精消毒皮膚，剖開腹部及子宮，取 出胎鼠放入培養(yǎng)皿中； ②解剖顯微鏡下尋找到生殖結(jié)節(jié)，于其根部用膜狀內(nèi)障剪迅速剪下，將離體生殖 結(jié)節(jié)迅速轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中； ③將Millicel產(chǎn)-CM插入式細胞培養(yǎng)皿預先放入BGJB培養(yǎng)液中37"浸泡30分鐘， 然后在6孔板中每孔加培養(yǎng)液1. lml，放入Millicel產(chǎn)-CM板； ④將待培養(yǎng)的生殖結(jié)節(jié)放置于Millicelf-CM板的微孔膜上，保留生殖結(jié)節(jié)表面
的液膜；⑤每塊Millicelf1 -CM板的微孔膜上均勻放置4 5枚生殖結(jié)節(jié)； 將6孔板放入C02培養(yǎng)箱中，24小時換液一次，每次換液注意調(diào)節(jié)液面，使得生 殖結(jié)節(jié)一直處于氣液相交界處；⑦培養(yǎng)分組將生殖結(jié)節(jié)分成加生理濃度10nM DHT的DHT組及不加DHT的無DHT組； (4)培養(yǎng)生殖結(jié)節(jié)的鑒定采用生殖結(jié)節(jié)培養(yǎng)前后形態(tài)和大小測量方法、生殖結(jié)
節(jié)激光共聚焦三維成像方法、生殖結(jié)節(jié)冰凍切片HE染色法中至少一種進行鑒定。
步驟(2)中的解剖法包括下列步驟小鼠胚胎腹部取大十字切口，切開后去除腹
腔內(nèi)容物，顯示后腹腔，于腎臟下方，膀胱外上方尋找性腺，睪丸為微小球形，邊緣有附睪附
著，并與輸精管相連，下方有睪丸引帶附著，卵巢為一細線形的組織；有睪丸者為雄性胚胎，
未找到睪丸或找到卵巢者為雌性。
步驟(2)中的PCR法包括下列步驟 ①PCR擴增對象小鼠胚胎肝臟； ②常規(guī)基因組DNA提取 ③PCR檢測 a、引物設計SRY(雄性性別決定基因)上游引物5 ' -ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3 '，下游引物5 ' -CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3 '，內(nèi)參GAPDH，上游弓| 物5 ' -GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3 '，下游弓|5' -ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3'。
b、反應體系 取PCR反應專用的0. 25ml薄壁EP(德國E卯endorf公司簡稱)管，按下列順序加入各試劑10X反應緩沖液2. 0 ii 1 ;25mmol/L MgCl22 ii 1 ;2. 5mmol/L dNTPs 0. 5 ii 1 ;25pmol/iiL SRY基因上下游引物各0.8ii1 ;25pmo1/y LGAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)上下游引物各0.8iU ;5u/iU Taq酶0.25 iil ;模板DNA liU;加無菌去離子水11. 05 iil至20 iil ，，溶液混合均勻，4°C下離心，使溶液沉于管底； c、擴增程序按下列程序在PCR擴增儀上操作，94°C 4min預變性，然后94。C變性30秒，63t:退火30秒，72t:延伸15秒，共35次循環(huán)，最后72。C延伸5min后終止擴增；
d、稱取瓊脂糖1. 2g，加入10倍電泳緩沖液10ml，再加入蒸餾水90ml，在電爐上加熱溶解，配制成1. 2%瓊脂糖凝膠；稍涼后加入配好的EB溶液2滴。 e、將電泳模板兩端密封，倒入瓊脂糖凝膠溶液，插入梳子，冷凝后將梳子撥出，電泳膠放入電泳槽中； f 、加樣取樣品溶液10 iU，加入1/5體積加樣緩沖液，混勻后，將溶液加到樣品孔中，同時在另一樣品孔中加入標準分子量DNA。 一般DNA樣品最好控制在0. 5 1. 0 ii g之間。 g、電泳加入1 X Tris-乙酸緩沖液(TAE緩沖液)，通電維持80V，電泳至溴酚藍走到膠中后1/3處停止電泳； h、染色及觀察電泳完畢，取出凝膠模具，將其推到一塊干凈的玻璃板上，于254nm或300nm波長紫外燈下觀察，DNA存在的位置呈現(xiàn)橙黃色熒光，即時拍照；
④結(jié)果的判定 170bp為內(nèi)參GAPDH， 122bp為SRY基因，內(nèi)參陽性者為擴增有效，SRY陽性為雄性，陰性為雌性。 生殖結(jié)節(jié)培養(yǎng)前后形態(tài)和大小測量方法包括下列步驟 1)將6孔板直接放于解剖顯微鏡下觀察，調(diào)節(jié)至同一放大倍數(shù)，以細胞計數(shù)板刻度為刻度標準，解剖顯微鏡連接相機對每個生殖結(jié)節(jié)拍照； 2)對每個生殖結(jié)節(jié)進行大小測量，測量指標包括生殖結(jié)節(jié)縱軸最大長度，生殖結(jié) 節(jié)表面積； 3)對72小時生長前后數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。 生殖結(jié)節(jié)激光共聚焦三維成像方法依次包括下列步驟 a、將培養(yǎng)后的生殖結(jié)節(jié)取出，PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌； b、用4%多聚甲醛4°〇下固定1小時。 c 、用PBS搖洗20分鐘X 5次； d、用含1% tritonX-100(非離子表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚)、2X脫脂奶
粉、5%羊血清的PBSMT(PBS+0. 1% Triton+2X脫脂牛奶)封閉，4。C下?lián)u動過夜； e、棄上清，標本投入PBS稀釋的鼠抗人CK (細胞角蛋白)，PBS與鼠抗人CK的質(zhì)量
比為150 : 1，4。C下?lián)u動過夜；； f 、棄上清，PBS搖洗1小時X 5次； g、加PBS稀釋的羊抗鼠IgG，PBS稀釋的羊抗鼠IgG的質(zhì)量比為100 : 1，4"下?lián)u 動過夜； h、棄上清，PBS搖洗1小時X 5次； i、激光共聚焦顯微掃描，三維成像488nm氬激光激發(fā)，40X物鏡，每個生殖結(jié)節(jié) 標本由腹側(cè)面向背側(cè)面逐層掃描，沿Z軸掃描150 ii m，層厚2 ii m，每個生殖結(jié)節(jié)標本掃描75 張，三維重建。 生殖結(jié)節(jié)冰凍切片HE染色法依次包括下列步驟
A、生殖結(jié)節(jié)定位和冰凍切片 1)先在冰凍切片切片平板上放上少量的OCT包埋劑，待稍凝固，然后再將生殖結(jié) 節(jié)放入OCT中包埋，切面向上，再噴上OCT包埋劑，放入冰凍切片機箱內(nèi)，繼續(xù)冰凍至切片溫 度達-19 -20°C ; 2)切片冰凍切片，切片切出后，利用組織切片與載片的溫差立即貼片； 3)切片厚度設為8ym，沿生殖結(jié)節(jié)冠狀面切片，含尿道全長的切片為有效片，即
為通過尿道長軸的冠狀面切片；所有切片用4X多聚甲醛4t:下固定30分鐘后浸于PBS中，
4t:下保存?zhèn)溆茫?B、HE染色 (1)冰凍切片固定10 30s，進入下面處理過程；(2)水洗1 2s ; (3)蘇木精液 60。C下染色30 60s ; (4)流水5 10s洗去蘇木精液；(5)用1%鹽酸乙醇洗1 3s ; (6) 水洗1 2s ; (7)促藍液返藍處理5 10s ; (8)流水沖洗15 30s ; (9)0. 5%曙紅液染色 30 60s ; (10)蒸餾水洗1 2s ; (11)80%乙醇處理1 2s ; (12)95%乙醇處理1 2s ; (13)無水乙醇處理l 2s ;(14)石炭酸二甲苯處理2 3s(15) 二甲苯第一次處理2 3s ; (16) 二甲苯第二次處理2 3s ;(17)中性樹膠封固。 本發(fā)明路線合理，易操作，為進一步研究陰莖尿道發(fā)育機制和外生殖器畸形的發(fā) 病機制提供了有效工具。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。 圖1是生殖結(jié)節(jié)的切取示圖。 圖2是胎鼠性別鑒定性腺解剖示圖。 圖3是胎鼠性別鑒定SRY基因PCR擴增示圖。 圖4是體外培養(yǎng)72小時前后生殖結(jié)節(jié)鏡下狀態(tài)圖。 圖5是培養(yǎng)基中不含DHT和含有10nM DHT生殖結(jié)節(jié)體外培養(yǎng)72小時前后長度和表面積的變化圖。 圖6是E14. 5天和E17. 5天生殖結(jié)節(jié)(雄)通過尿道縱軸的冠狀面冰凍切片HE染色圖。 圖7是體外培養(yǎng)72小時的生殖結(jié)節(jié)(雄)通過尿道縱軸的冠狀面冰凍切片HE染色圖。 圖8是培養(yǎng)72小時的生殖結(jié)節(jié)(10nM)三維激光共聚焦圖。 圖1中A :孕鼠；B :串珠樣排列的子宮；C :小鼠胚胎；D，E :生殖結(jié)節(jié)。圖2中A、B :
雌性；C、 D :雄性；t :卵巢；▲:睪丸。圖3中SRY、 GAPDH擴增陽性者為雄性($ ) ;GAPDH陽性SRY陰性者為雌性(早)。圖4中A1，A2 :含lOnM DHT培養(yǎng)72小時前后生殖結(jié)節(jié)解剖顯微鏡下所見；A3 A6 :含10nM DHT培養(yǎng)前(A3) 、24小時(A4) 、48小時(A5) 、72小時(A6)
后的生殖結(jié)節(jié)倒置相差顯微鏡下所見。Bl :培養(yǎng)前生殖結(jié)節(jié)解剖顯微鏡下所見；B2、 B3 :不
含DHT體外培養(yǎng)72小時前后生殖結(jié)節(jié)倒置相差顯微鏡下所見。圖6中A， B :E14. 5天生殖結(jié)節(jié)；C， D :E17. 5天生殖結(jié)節(jié).箭頭指的是尿道/尿道板。圖7中A， B :培養(yǎng)基中含10nMDHT培養(yǎng)72小時的生殖結(jié)節(jié)；C，D :培養(yǎng)基中不含10nM DHT培養(yǎng)72小時的生殖結(jié)節(jié)。圖8中箭頭尿道/尿道板；* :包皮隆起；三角形尿道外口 。
具體實施例方式 1材料 動物來源8-10周齡(^BL/6J近交系小鼠由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。
主要實驗材料 培養(yǎng)器具30mm Millicell -CM親水性PTFE膜器官型細胞培養(yǎng)皿，6孔細胞培養(yǎng)板。 實驗器材眼科剪、顯微剪、顯微鑷、16mm特長尖彎膜狀內(nèi)障剪、、無菌操作臺。純水系統(tǒng)Millipore， U. S. A ;5-45倍連續(xù)變倍解剖顯微鏡XTZ-E，上海彼愛姆光學儀器制造有限公司。恒溫C02培養(yǎng)箱:Forma Scientific, U. S. A 普通臺式離心機Heraeus， U. S. A
精密天平Mettler Toledo, Switzerland 恒溫搖床太倉市華美生化儀器廠 倒置相差顯微鏡尼康U. S. A. 高速恒溫冷凍離心機Heraeus， U. S. A 超凈工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司
培養(yǎng)皿:FALCON Franklin Lakes NT， U. S. A 離心管:FALCON Franklin Lakes NT， U. S. A 普通PCR儀Biometra T3thermocycler PCR擴增儀，德國 實時定量PCR儀(QPCR儀):stratagene， MX3000P， U. S. A 培養(yǎng)液BGJB培養(yǎng)液(Gibco， USA)、雙氫睪酮(DHT， IL公司USA)。生殖結(jié)節(jié)培養(yǎng) 基由BGJB培養(yǎng)液加牛胰島素3U/ml、青霉素100U/ml、鏈霉素100 ii g/ml、Herps 20mmol/L、 L-抗壞血酸O. lmg/ml (Sigma-Aldrich USA)構(gòu)成。稱量適量雙氫睪酮粉末用無水乙醇溶解 至10 y M，然后再稀釋1000倍加入培養(yǎng)液使之濃度為10nM。 磷酸鹽緩沖液(PBS):每升液體含Nacl8g， KC1 0. 2g， Na2HP04. 12H2023 . 44g，
KH2P040. 2g，雙蒸水配制，等滲，ra值7. 2，分裝后高壓蒸汽滅菌，4t:保存。 固定液4%多聚甲醛組織固定液，4%多聚甲醛+10%蔗糖組織固定液，30%蔗糖液。 染色液蘇木精染液，伊紅染液，safranino染液。
2方法 E14. 5d雄性生殖結(jié)節(jié)的獲取和培養(yǎng)
精確孕期小鼠的獲取 8-10周齡C57BL/6J近交系小鼠，雌性小鼠40只，雄性小鼠10只，于晚上7點按雌 雄4 : l合籠，第二天早上7點分籠，觀察雌鼠陰道內(nèi)陰栓情況。以陰道口看見白色漿液性 栓子者為交配成功，予以分開飼養(yǎng)，定為孕0. 5d計算，交配未成功者可予以再交配。
胚胎性別鑒定
1)解剖法 小鼠胚胎腹部取大十字切口，切開后去除腹腔內(nèi)容物，顯示后腹腔，于腎臟下方， 膀胱外上方尋找性腺，睪丸為微小球形，邊緣有附睪附著，并與輸精管相連，下方有睪丸引 帶附著，卵巢為一細線形的組織。有睪丸者為雄性胚胎，未找到睪丸或找到卵巢者為雌性。
2) PCR法 ①PCR擴增對象小鼠胚胎肝臟；②基因組DNA提取試劑盒內(nèi)容緩沖液GA 15ml緩沖液GB 15ml緩沖液GD 13ml 漂洗液PW 15ml洗脫緩沖液TE 15ml蛋白酶K lml吸附柱CB350個收集管(2ml) 50個
DNA提取 1、動物組織應先打碎處理為細胞懸液，然后10， OOOrpm( 11， 200Xg)離心1分 鐘，倒盡上清，加200 ii 1緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。 2.加入20iil蛋白酶K溶液，在56t:放置，直至組織溶解，簡短離心以去除管蓋內(nèi) 壁的水珠。 3.加入200 ii 1緩沖液GB，充分顛倒混勻，7(TC放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短 離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。注意加入緩沖液GB時可能會產(chǎn)生白色沉淀，一般7(TC放置 時會消失，不會影響后續(xù)實驗。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹底，可能導致提取DNA 量少和提取出的DNA不純。 4.加人200 ii 1無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離 心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
5.將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm( 13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
6.向吸附柱CB3中加入500ii1緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12， OOOrpm( 13， 400 Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
7.向吸附柱CB3中加入700iil漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12， OOOrpm( 13， 400 Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
8.向吸附柱CB3中加入500ii l漂洗液PW，12，000rpm( 13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液。 9.將吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm( 13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。注意這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(酶切、PCR等)實驗。 10.將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 ii 1洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12， OOOrpm( 13， 400 Xg)離心2分鐘，將
溶液收集到離心管中。注意洗脫緩沖液體積不應少于50iU，體積過小影響回收效率。
為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2分鐘，
12，000rpm( 13，400Xg)離心2分鐘。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用
水做洗脫液應保證其pH值在7. 0-8. 5范圍內(nèi)(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)，pH
值低于7. 0會降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應保存在_20°C ，以防DNA降解。 11、 DNA定量在紫外分光光度劑上分別檢測260nm和280nm波長的吸光值，以
OD26。/OD28。 > 1. 8為標準檢驗提取DNA的純度，并按0D26。數(shù)值計算DNA濃度。 ③PCR檢測 PCR試劑盒10X緩沖液(KC1 500,1/L、 Tris-HCl 100,1/L(pH9. 0)、TritonX-1001. 0 % ) 750 ii 1 ;25mmol/L MgCl2750 ii 1 ;5u/L Taq酶100iU;dNTPs2. 5mmmol/L 1、引物設計SRY :上游引物5 ' -ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3 ' 下游引物5' -CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3'內(nèi)參GAPDH上游引物5' -GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3'下游引物5' -ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3'以上引物由上海生工生物工程有限公司提供。 2、反應體系 取PCR反應專用的0. 25ml薄壁EP管，按下列順序加入各試劑。操作中，裝酶的EP管始終置于冰浴中，以免活性破壞。10 X Reaction buttfer (反應緩沖液)2. 0 ;25,1/L MgCl22ii 1 ;2. 5,1/L d證s 0. 5 ii 1 ;25pmo1/ii Lprimer-SRYIO. 8 ii ;25pmo1/ii L primer_SRY20. 8 ii 1 ;25pmo1/ ii Lprimer-GAPDH1 0. 8 ii 1 ;25pmo1/ ii L primer-GAPDH20. 8iU ;5u/ii 1 Taq酶O. 25 ii 1 ;模板DNA liU。加無菌去離子水11. 05 至20 iU，手指輕彈EP管底部，使溶液混合均勻。4°C lOOOrpm離心30sec，使溶液沉于管底。
3、擴增程序按下列程序在PCR擴增儀(Perkin Elmer cetus2400)上操作，94°C 4min預變性，然后94。C變性30sec， 63。C退火30sec， 72。C延伸15sec，共35次循環(huán)，最后72t:延伸5min后終止擴增。
4、稱取瓊脂糖1. 2g，加入10倍電泳緩沖液10ml，再加入蒸餾水90ml，在電爐上加 熱溶解，配制成1. 2%瓊脂糖凝膠；稍涼后加入配好的EB溶液2滴。 5、將電泳模板兩端密封，倒入瓊脂糖凝膠溶液，插入梳子，冷凝后將梳子撥出，電 泳膠放入電泳槽中。 6、加樣取樣品溶液10 yl，加入1/5體積加樣緩沖液，混勻后，將溶液加到樣品孔 中，同時在另一樣品孔中加入標準分子量DNA。 一般DNA樣品最好控制在0. 5 1. 0 ii g之間。 7電泳加入1XTAE緩沖液，通電維持80V，電泳至溴酚藍走到膠中后1/3處停止 電泳。 8、染色及觀察電泳完畢，取出凝膠模具，將其推到一塊干凈的玻璃板上，于 254nm或300nm波長紫外燈下觀察，DNA存在的位置呈現(xiàn)橙黃色熒光，即時拍照。
④結(jié)果的判定 170bp為內(nèi)參GAPDH， 122bp為SRY基因，內(nèi)參陽性者為擴增有效，SRY陽性為雄性， 陰性為雌性。 生殖結(jié)節(jié)切取和培養(yǎng) 1)斷頸處死孕鼠，將其固定于取材板上，75%酒精消毒皮膚。剖開腹部及子宮，取 出胎鼠放入培養(yǎng)皿中。 2)解剖顯微鏡下尋找到生殖結(jié)節(jié)，于其根部用膜狀內(nèi)障剪迅速剪下，將離體生殖 結(jié)節(jié)迅速轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中。 3) Millicell _CM插入式細胞培養(yǎng)皿預先放入BGJB培養(yǎng)液中37t:浸泡30分鐘，
然后在6孔板中每孔加培養(yǎng)液1. lml，放入Millice1^ -CM板。
4)將待培養(yǎng)的生殖結(jié)節(jié)放置于Millkelf -CM板的微孔膜上，注意保留生殖結(jié)節(jié)
表面的液膜。
5)每塊Millice11⑧-CM板的微孔膜上可放置4 5枚生殖結(jié)節(jié)，注意均勻分布。 6)將6孔板放入C02培養(yǎng)箱中，24小時換液一次，每次換液注意調(diào)節(jié)液面，使得生
殖結(jié)節(jié)一直處于氣液相交界處。 7)培養(yǎng)分組加生理濃度的10nM DHT組20枚，無DHT組18枚。培養(yǎng)生殖結(jié)節(jié)的 鑒定 生殖結(jié)節(jié)培養(yǎng)前后形態(tài)和大小測量 1)將6孔板直接放于解剖顯微鏡下觀察，調(diào)節(jié)至同一放大倍數(shù)，以細胞計數(shù)板刻 度為刻度標準，解剖顯微鏡連接尼康Coolpix s100數(shù)碼相機對每個生殖結(jié)節(jié)拍照。
2)運用IPP軟件對每個生殖結(jié)節(jié)進行大小測量，測量指標包括生殖結(jié)節(jié)縱軸最大 長度(P m)，生殖結(jié)節(jié)表面積(mm2)。 3)所有測量數(shù)據(jù)直接導入excel表格，建立數(shù)據(jù)庫，測量數(shù)據(jù)以x 士s，表示，對72
小時生長前后數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行配對t(時間)檢驗的統(tǒng)計分析和作圖。 生殖結(jié)節(jié)CK14(角蛋白14)整體免疫熒光染色，激光共聚焦三維成像 1、生殖結(jié)節(jié)9枚(E14. 5dGT體外培養(yǎng)72小時，10nM DHT誘導)，取出后PBS洗3
遍，每遍3分鐘。 2、4%多聚甲醛固定1小時(4°C )。
3、 PBS搖洗20分鐘X5次。4、PBSMT(1% tritonX-100， 2%脫脂奶粉，5%羊血清)封閉，4。C搖動過夜。
5、棄上清，標本投入用PBS稀釋的鼠抗人CK，PBS與鼠抗人CK的質(zhì)量比為150 : 1，
4t:下?lián)u動過夜； 6、棄上清，PBS搖洗1小時X5次； 7、加PBS稀釋的羊抗鼠IgG，PBS稀釋的羊抗鼠IgG的質(zhì)量比為100 : 1，4"下?lián)u動過夜； 8、棄上清，PBS搖洗1小時X5次。9、激光共聚焦顯微掃描，三維成像。氬激光(488nm)激發(fā)，物鏡X40，每個模型由腹側(cè)面向背側(cè)面逐層掃描(沿Z軸掃描150um，層厚2um)，每個標本掃描75張，三維重建。
生殖結(jié)節(jié)冰凍切片HE染色
1、生殖結(jié)節(jié)定位和冰凍切片 1)先在冰凍切片切片平板上放上少量的OCT包埋劑，待稍凝固，然后再將生殖結(jié)節(jié)放入OCT中包埋，切面向上，再噴上OCT包埋劑適量，放入冰凍切片機箱內(nèi)，繼續(xù)冰凍5min左右，切片溫度達-19 -2(TC為最適宜。 2)切片冰凍切片時，將防巻板調(diào)整到與切片刀為5°左右，且防巻板上方與刀刃在同一水平線上較理想。切片切出后，利用該組織切片與載片的溫差立即貼片。
3)切片厚度設為8 ii m，沿生殖結(jié)節(jié)冠狀面切片，含尿道全長的切片為有效片，即為通過尿道長軸的冠狀面切片。所有切片用4%多聚甲醛4t:固定30分鐘后浸于PBS中，
4t:保存?zhèn)溆谩?2、HE染色 (1)冰凍切片固定10 30s ; (2)稍水洗1 2s ; (3)蘇木精液染色(60°C )30
60s ; (4)流水洗去蘇木精液5 10s ; (5) 1 %鹽酸乙醇1 3s ; (6)稍水洗1 2s ; (7)促
藍液返藍5 10s ; (8)流水沖洗15 30s ; (9)0. 5%曙紅液染色30 60s ; (10)蒸餾水稍
洗1 2s ; (11)80%乙醇1 2s ; (12)95%乙醇1 2s ; (13)無水乙醇1 2s ;(14)石炭
酸二甲苯2 3s(15) 二甲苯第一次處理2 3s;(16) 二甲苯第二次處理2 3s ; (17)中
性樹膠封固。 結(jié)果與討論 生殖結(jié)節(jié)在體外培養(yǎng)72小時后，DHT組發(fā)生了明顯的形態(tài)變化，培養(yǎng)前原始的包皮隆起位于生殖結(jié)節(jié)基底部，培養(yǎng)72小時后生殖結(jié)節(jié)變長，還可以看到明顯的包皮分化發(fā)育，向上逐漸包繞生殖結(jié)節(jié)干。而無DHT組的生殖結(jié)節(jié)生長明顯受到抑制，體積的增大和包皮的發(fā)育均明顯延遲于DHT組。 生殖結(jié)節(jié)在體外培養(yǎng)72小時后，生殖結(jié)節(jié)明顯生長，DHT組的生長明顯大于無DHT組，以生殖結(jié)節(jié)縱軸最大長度和表面積為生長指標，DHT組由培養(yǎng)前的1132. 58±61. 27 y m，1. 020±0. 037mm2增長至培養(yǎng)后的1607. 60±102. 19 ii m， 1. 485±0. 077mm2，縱軸長度和表面積的增加度分別為42.0%，45.6%。而無DHT組雖然比培養(yǎng)前體積有明顯增加，但相比DHT組，其生長明顯受到影響，其縱軸長度和表面積分別由培養(yǎng)前的1136. 95±57. 35 y m，1. 024±0. 041mm2增加到了 1471. 22±68. 46 ii m， 1. 413±0. 053mm2，增加率分別為29. 4%，38. 1X，按照配對t檢驗，DHT組的生殖結(jié)節(jié)生長速度高于無DHT組，兩者統(tǒng)計學有顯著差異(t = 9. 0513，6. 0567， P < 0. 05)。 從通過尿道縱軸的生殖結(jié)節(jié)冠狀面冰凍切片的HE染色，觀察生殖結(jié)節(jié)中的尿道 發(fā)育，培養(yǎng)前的E14. 5d，尿道為位于生殖結(jié)節(jié)中心偏腹側(cè)的單層實性上皮細胞索，E17. 5天 生殖結(jié)節(jié)中尿道近端出現(xiàn)明顯的管化趨勢，尿道上皮細胞增生明顯，形成分層的復層上皮 結(jié)構(gòu)，細胞呈現(xiàn)立方形的成熟分化表現(xiàn)。在10nM DHT生理劑量的睪酮存在下，體外培養(yǎng)3 天后，生殖結(jié)節(jié)中尿道的發(fā)育形態(tài)學變化與體內(nèi)同期生殖結(jié)節(jié)中的尿道變化(E17. 5d))是 一致的。而無DHT組中，我們發(fā)現(xiàn)尿道上皮盡管增生明顯，但上皮細胞形態(tài)較圓，近端管化 不全。 對生殖結(jié)節(jié)在10nM DHT條件下培養(yǎng)72小時的生殖結(jié)節(jié)進行CK14熒光染色，再進 行激光共聚焦三維重建，我們可以看到生殖結(jié)節(jié)基底部有明顯的包皮隆起，尿道中心出現(xiàn) 管化，生殖結(jié)節(jié)頂端尿道外口正在形成。 器官培養(yǎng)是一種優(yōu)于細胞培養(yǎng)的體外技術(shù)，其主要理由是保持結(jié)構(gòu)的完整性。雖 然細胞培養(yǎng)是利用機械分離或酶消化分離的細胞，或者是自發(fā)遷移的細胞，但器官培養(yǎng)是 以維持見于正常組織的細胞聯(lián)系為目的。最初，選擇器官培養(yǎng)以促進組織學特征形成，但最 后發(fā)現(xiàn)某些表型成分的表達僅見于維持細胞密切結(jié)合時?，F(xiàn)在認識到，相互聯(lián)系的細胞經(jīng) 連接通訊(縫隙連接)、旁分泌因子和細胞粘附分子交換信息。細胞之間發(fā)放信號是器官形 成中最引人注目的，或許也是維持完全成熟的組織所需要的。因此，維持原有組織結(jié)構(gòu)的完 整性，可保存存在于原有組織中正確的同種和異種細胞的相互作用和維持細胞外基質(zhì)的正 確構(gòu)型。 生殖結(jié)節(jié)是哺乳動物外生殖器發(fā)育的原基，在哺乳類外生殖器形成的初期，即外 生殖器的衍化胚胎發(fā)育的第三周末，后腸末端膨大，形成泄殖腔。約在胚胎的第四周，由于 中胚層增殖，在尿生殖口 (尿生殖竇)的頭端形成的小突起，稱為生殖結(jié)節(jié)。雄性發(fā)展成陰 莖，雌性則形成陰蒂。被生殖結(jié)節(jié)的尾側(cè)正中線的溝(尿道溝)隔開的皮皺，為尿道褶，它 向后延伸，從兩側(cè)夾住尿生殖口。進而包圍生殖結(jié)節(jié)和尿道褶，其外側(cè)有不太明顯的隆起， 為生殖隆起。在雄性的尿道褶左右融合形成陰莖的尿道，還形成包皮。雌性的尿道褶夾住 由尿生殖竇分化來的陰道前庭，形成小陰唇。在雄性的生殖隆起左右，在正中線融合形成陰 囊，雌性的生殖隆起變化不大，人及其它高等哺乳動物中形成大陰唇。 小鼠生殖結(jié)節(jié)的發(fā)育和人類相似，由于發(fā)育周期較人類等哺乳動物短，因此便于 研究和觀察。在小鼠，交配后第10. 5天，胚胎生殖結(jié)節(jié)開始隆起，小鼠生殖結(jié)節(jié)的發(fā)育可以 分為二個階段，從E10. 5天發(fā)生至E14. 5d為GT外生(outgrowth)階段，該階段的生長是雄 激素信號非依賴性的，原始尿道上皮為生殖結(jié)節(jié)極性向外生長提供信號，其中shh、hoxa13、 fgf8是誘導生殖結(jié)節(jié)生長的關(guān)鍵信號因子，通過控制細胞增殖和凋亡維持結(jié)節(jié)的極性外 生，任何一種因子的異常都將導致生殖結(jié)節(jié)生長延遲甚至缺如。從E14. 5d起生殖結(jié)節(jié)的發(fā) 育進入到以分化為主的階段，外部出現(xiàn)包皮的生長，內(nèi)部有尿道的管化延伸。在這個階段 中最重要的就是雄激素信號對生殖結(jié)節(jié)的誘導分化，包括睪丸分泌睪酮，經(jīng)5a還原酶轉(zhuǎn)
化為雙氫睪酮，雄激素受體以及下游基因的表達，任何一個環(huán)節(jié)的異常都可將導致陰莖尿 道發(fā)育異常，尿道下裂就是最常見的生殖結(jié)節(jié)先天性發(fā)育異常之一，發(fā)病率約占存活人群 1/250至1/300。嚴重尿道下裂患兒在出生時其外生殖器外觀異常，導致其父母在對他們的 性別取向上形成感情和心理上的矛盾，并伴隨一系列問題。70年代和80年代在歐洲尿道下
13裂的發(fā)病率呈不明原因的增長。來自美國兩個先天性畸形監(jiān)測系統(tǒng)的資料亦顯示尿道下裂 的發(fā)病率不明原因的成倍增長，美國疾病控制中心的研究特別注意到嚴重的、而不僅是中 等度的尿道下裂發(fā)病比率在整個尿道下裂發(fā)病比率中增高，而這一比率的增高不是由于監(jiān) 測與報告數(shù)量的增加。 研究生殖結(jié)節(jié)的發(fā)育機制以及由于生殖結(jié)節(jié)發(fā)育異常引起的陰莖尿道發(fā)育異常 的機制一直是胚胎學家和泌尿外科學家努力的目標，比如在研究尿道下裂發(fā)生機制時，有 學者取尿道下裂組織或者包皮組織作為研究對象，也有取尿道下裂患者局部的成纖維細胞 在體外進行基因調(diào)控方面的研究，研究雖然探討了尿道陰莖發(fā)育中的一些機制，但一個問 題沒有得到重視，即陰莖尿道的發(fā)育分化是生殖結(jié)節(jié)中多種細胞相互作用的結(jié)果。生殖結(jié) 節(jié)由中心的來自內(nèi)胚層的原始尿道上皮索，兩側(cè)的間充質(zhì)細胞，外表披覆的來自外胚層的 上皮細胞組成，上皮細胞與間充質(zhì)細胞間的相互影響在正常的陰莖生長分化中起著關(guān)鍵性 作用。把各種不同類型的上皮組織與其相應的間充質(zhì)組織分離開來，再重新以不同的重組 以觀察上皮細胞與間質(zhì)細胞之間信息傳遞的重要性。當正常的細胞信息傳遞存在時，小鼠 的泌尿生殖結(jié)節(jié)呈現(xiàn)正常的生長和分化(以小鼠的陰莖軟骨存在為指標)，而相對應的當 把正在發(fā)育中的上皮組織去除時(如外胚層源的表皮組織和內(nèi)胚層源的尿道上皮組織)， 則嚴重影響小鼠泌尿生殖結(jié)節(jié)的生長，因此在研究陰莖尿道發(fā)育時要充分考慮到多種細胞 之間的相互作用以及它們存在的空間關(guān)系，單單就某一類細胞進行研究很難得出科學的結(jié) 論。 我們在研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠生殖結(jié)節(jié)在胚胎14. 5天時體積大約在0. 6-0. 8mm3，位于 會陰部臍血管根部的下方，胎尾根部的前方，生殖結(jié)節(jié)與胎尾之間可見原始肛門。生殖結(jié)節(jié) 基底部可見原始的待發(fā)育的包皮隆起，生殖結(jié)節(jié)腹側(cè)面可見尚未閉合的裂縫狀尿道溝。就 生殖結(jié)節(jié)的體積而言無疑是很適合器官培養(yǎng)的。器官培養(yǎng)有利于維持生殖結(jié)節(jié)內(nèi)部細胞的 三維結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上研究陰莖尿道分化更具科學性和可信度。 一般來講，要維持器官型植 塊正常的三維結(jié)構(gòu)，使之按照近似于在體時的生長發(fā)育規(guī)律進行生長和分化，在培養(yǎng)過程 中必須注意兩個基本原則第一，提供充足的營養(yǎng)和02，并及時排除代謝廢物。這是維持器 官型植塊生存和正常生長的首要條件。否則，失去了在體時循環(huán)系統(tǒng)供應的器官型植塊將 發(fā)生內(nèi)部壞死。第二，要抑制細胞從植塊向外遷移。盡可能防止器官型植塊內(nèi)的細胞在培 養(yǎng)過程中發(fā)生遷移，這是維持器官型植塊三維結(jié)構(gòu)的重要條件。胚胎器官培養(yǎng)與成體器官 培養(yǎng)存在著明顯的差異。胚胎器官的能量主要來源是糖酵解，故培養(yǎng)時可不必另外補充02。 另外，由于胚胎早期的器官原基體積都比較小，故可將整個器官進行培養(yǎng)。因此，在合適的 條件下， 一方面胚胎器官能存活幾個月，器官體積可以增大，器官原基在體外生長都會發(fā)生 類似于體內(nèi)的生長發(fā)育過程，表現(xiàn)出相似的自主分化特征；另一方面胚胎器官的細胞生長 活躍，遷移能力強，體外培養(yǎng)時，細胞極易從植塊遷移出來。為維持植塊的三維結(jié)構(gòu)，應盡量 減少細胞遷移。 離體器官失去了體循環(huán)供應養(yǎng)分后，其營養(yǎng)的獲取不同于體內(nèi)，它是通過培養(yǎng)液 中營養(yǎng)物質(zhì)的滲透和氣體擴散實現(xiàn)的，植塊器官過大，氣體營養(yǎng)無法彌散至器官內(nèi)部可 導致植塊組織內(nèi)部缺氧壞死，因此對于較大的器官只能取一小塊植塊進行培養(yǎng)，如體外 進行前列腺、睪丸、腦組織、腸道的器官型培養(yǎng)，只能將待培養(yǎng)組織切成小塊進行培養(yǎng)。一 般來講要使器官型植塊在體外培養(yǎng)時獲得充足的氣體交換和營養(yǎng)滲透，植塊體積須小于2mmX2mmX2mm， E14. 5天的生殖結(jié)節(jié)體積遠小于此，屬于胚胎器官，其代謝以無氧酵解為 主，對氧氣的要求不高，因此我們將切下的生殖結(jié)節(jié)完整放入37°C C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。生殖 結(jié)節(jié)的取材非常重要，操作時要盡可能將損傷降低到最小。取材的刀剪應十分鋒利，通常采 用眼科手術(shù)中的白內(nèi)障刀來切取植塊。切取時植塊須放入培養(yǎng)液中，動作要既迅速又輕柔。 唯有迅速切下的生殖結(jié)節(jié)其創(chuàng)面才最平整，組織結(jié)構(gòu)才最完整。體外培養(yǎng)時營養(yǎng)成分和氣 體易于彌散，代謝產(chǎn)物容易清除，從而保證生殖結(jié)節(jié)的正常存活。 我們在培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)生殖結(jié)節(jié)在生長過程中不斷有細胞從基底部向外彌散，這種細 胞的向外遷移其實是器官培養(yǎng)的一個共同生長特征，就是在培養(yǎng)過程中，器官內(nèi)部的細胞 能夠向外遷移。 一般來講使用不同的培養(yǎng)方法和條件，培養(yǎng)不同來源的植塊，所遷移出來的 細胞數(shù)量有很大差異。胚胎組織基于其發(fā)育分化特性，細胞的遷移要比成體組織的細胞彌 散得多。如果這種遷移太甚，植塊就有可能失去其特定的三維結(jié)構(gòu)和功能。要抑制培養(yǎng)器官 植塊內(nèi)細胞向外遷移，其措施有三項①將器官植塊置于難以牢固私附的支持物(如瓊脂) 表面，或利用網(wǎng)格狀支持物減少植塊的附著面，從而抑制或減少細胞的遷移；②利用瓊脂能 限制植塊內(nèi)細胞外遷，又不影響營養(yǎng)物質(zhì)供應的特性，將器官型植塊置于瓊脂溶液中片刻 取出或向植塊上滴加瓊脂液，待瓊脂凝固后即形成包裹植塊的表面瓊脂薄膜。不過此法較 少應用；③經(jīng)常移動植塊到新鮮的支持物上面，更換附著面，也能限制細胞遷移。我們在本 研究中選用了 Millicell-CM型Biopore插入式組織培養(yǎng)皿作為生殖結(jié)節(jié)體外器官培養(yǎng)的 支持物，該裝置是近年來新出現(xiàn)的專門用于三維組織結(jié)構(gòu)精密研究的一個特殊器具。又名 組織培養(yǎng)小室，Transwell小室等。其中的PICM0RG50又名親水性PTFE膜器官型組織培養(yǎng) 皿，含有透明的Biopore膜，該膜具有高度的親水性和生物相容性，孔徑0. 4 y m，氣體和營 養(yǎng)物質(zhì)可自由交換和擴散，該插入式培養(yǎng)皿呈類圓柱形，上小下大，上部外徑30mm，底部外 徑31. 5mm，內(nèi)徑27mm，膜面積4. 2cm2，高5mm，插入板為站立式，底部有3個支撐底座，因此當 置于6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)孔中時，Biopore微孔膜與6孔板底面有一段距離，當培養(yǎng)孔中加 培養(yǎng)液1. lml，培養(yǎng)液液面與微孔膜持平，此時培養(yǎng)于微孔膜上的生殖結(jié)節(jié)正好處于培養(yǎng)液 和富含C02氣體的交界處，利于氣體交換和營養(yǎng)擴散。我們在研究中注意到當生殖結(jié)節(jié)放置 于微孔膜上后，由于表面張力的作用，培養(yǎng)液迅速在生殖結(jié)節(jié)周圍形成一層液膜，這樣使得 營養(yǎng)的擴散更加均勻，Biopore微孔膜具有高度的生物相容性，為避免細胞過分向外遷移， 取材尤為重要，光滑的切面細胞很少遷移，而切面毛糙很容易導致細胞大量遷移，影響培養(yǎng) 生殖結(jié)節(jié)形態(tài)。 器官培養(yǎng)一般都采用無血清的合成培養(yǎng)基，它除了含有基本營養(yǎng)成分外還可以根 據(jù)體外培養(yǎng)物的生長特性添加多種有關(guān)的上漲因子和其它成分，營養(yǎng)物質(zhì)全面而成分清 楚，既能維持體外培養(yǎng)物的正常生存和生長，有可以消除由于添加天然培養(yǎng)基所造成的不 確定因素對培養(yǎng)結(jié)果的干擾。本研究我們選擇了BGJb(Fitton-Jackson改良型)無血清培 養(yǎng)基，去除了血清中激素等復雜成分對生殖結(jié)節(jié)的影響，可有效的觀察實驗條件下生殖結(jié) 節(jié)離體培養(yǎng)的生長狀況。BGJb無血清培養(yǎng)基中富含氨基酸、維生素和微量元素，不含碳酸 氫鈉，含L-谷氨酰胺，是一種專門用于胚胎軟骨細胞培養(yǎng)的改良型培養(yǎng)液，我們考慮到小 鼠陰莖含有軟骨的特點，因此有助于生殖結(jié)節(jié)的生長。在培養(yǎng)基中加入L-抗壞血酸和牛胰 島素，有助于生殖結(jié)節(jié)的生長和形態(tài)的維持。胰島素能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸，利于 體外培養(yǎng)的胚胎器官的存活、生長和發(fā)育。根據(jù)培養(yǎng)器官的不同，在培養(yǎng)基中加入一定量相應的激素能更好地維持體外培養(yǎng)器官植塊的生長發(fā)育及器官功能。激素依賴性器官在體外 仍保持對激素的敏感性和反應性，例如前列腺、子宮和睪丸等。糖皮質(zhì)激素能夠促進乳腺上 皮細胞生長與增殖，維持體外培養(yǎng)的乳腺腺泡結(jié)構(gòu)及其分化。催乳素和生長激素可使體外 培養(yǎng)的靜止期乳腺產(chǎn)生和分泌乳汁。此外，垂體激素(生長激素、催乳激素等)、雌激素、孕 激素、前列腺素等對體外生長的器官組織都有不同的效應。我們在培養(yǎng)基中加入了生理劑 量的雄激素-10nM雙氫睪酮(DHT)，研究表明，在存在生理劑量雄激素條件下，生殖結(jié)節(jié)的 生長分化要明顯優(yōu)于不含雄激素的培養(yǎng)組。生殖結(jié)節(jié)在體外培養(yǎng)72小時后，DHT組發(fā)生了 明顯的形態(tài)變化，培養(yǎng)前原始的包皮隆起位于生殖結(jié)節(jié)基底部，培養(yǎng)72小時后生殖結(jié)節(jié)變 長，還可以看到明顯的包皮分化發(fā)育，向上逐漸包繞生殖結(jié)節(jié)干。而無DHT組的生殖結(jié)節(jié) 生長明顯受到抑制，體積的增大和包皮的發(fā)育均明顯延遲于DHT組。這與體內(nèi)生殖結(jié)節(jié)發(fā) 育的雄激素依賴性是一致的。我們在顯微鏡下對生殖結(jié)節(jié)的生長進行了監(jiān)控，顯微攝影后 測量其培養(yǎng)前后的大小，對其生長進行量化比較。生殖結(jié)節(jié)在體外培養(yǎng)72小時后，生殖結(jié) 節(jié)明顯生長，DHT組的生長明顯大于無DHT組，以生殖結(jié)節(jié)縱軸最大長度和表面積為生長指 標，DHT組生殖結(jié)節(jié)縱軸長度和表面積的增加度分別為42. 0%，45. 6%。而無DHT組增加率 分別為29. 4% ， 38. 1 % ，按照配對t檢驗，DHT組的生殖結(jié)節(jié)生長速度高于無DHT組，兩者統(tǒng) 計學有顯著差異。 對于一個器官培養(yǎng)的成功與否，我們觀察的指標包括形態(tài)和功能的變化。生殖結(jié) 節(jié)在雄激素誘導下形態(tài)發(fā)生了明顯變化，體積明顯增大，另外一個重要的觀察評價指標就 是生殖結(jié)節(jié)內(nèi)部尿道發(fā)育情況。在體內(nèi)，尿道的發(fā)育經(jīng)歷了實性原始尿道上皮索到管化空 腔尿道的變化。在體外，我們對培養(yǎng)前后的生殖結(jié)節(jié)進行了冰凍切片以期觀察尿道管化、上 皮增生的情況。經(jīng)尿道長軸的含尿道全長的冠狀面切片是唯一能同時觀察全長尿道發(fā)育情 況的手段，由于生殖結(jié)節(jié)體積微小，質(zhì)地極脆，尿道位于生殖結(jié)節(jié)中心靠近腹側(cè)面，尿道的 厚度只有40-80 iim，因此切片需要精確的定位，在本實驗中我們制作了離體生殖結(jié)節(jié)的冰 凍切片使用進口包埋劑OCT包埋標本，預凍部分OCT于載物臺，用刀削平，有利于生殖結(jié) 節(jié)放置與方向控制；要求標本溫度恰當，包埋后迅速將標本置于液氮蒸氣上，在30秒內(nèi)將 包埋標本固化，然后在冰凍切片室低溫箱內(nèi)復溫約3min，使標本的溫度與低溫箱的溫度相 同(標本溫度過熱切片組織易被擠壓，組織結(jié)構(gòu)重疊溫度太低時，切片組織易脆裂)；選擇 適當?shù)那衅嵌?，包埋前標好生殖結(jié)節(jié)縱軸方向，使切片方向與生殖結(jié)節(jié)縱軸方向一致，切 片刀要求鋒利，太鈍容易造成組織破碎，高速切削可能會取得良好結(jié)果，但對含尿道上皮部 分，仍需要低速，速度太快，切片厚度不均勻(我們采用8um)，還會造成上皮間充質(zhì)分離，這 一方法簡單易行，但對冰凍切片機要求較高。為了防止脫片，除了預先在載片上涂上粘附劑 (鉻明礬液)或硅化玻片外，用吹風機常溫下立即將切片吹干。我們在切片中最長碰到的問 題就是組織中的冰晶造成組織破碎或者組合字結(jié)構(gòu)不清。常用的防冰晶法有3種(1)高 滲透壓脫水法將新鮮取材的組織固定后迅速置于20% 30%的蔗糖溶液中，置4t:冰箱 過夜，待組織塊沉底后，取出，PBS沖洗后用0CT膠包埋切片；經(jīng)高滲蔗糖脫水后去除了組織 中的大部分水分，可有效減少冰晶的形成。(3)低溫驟冷法將組織塊置人低溫環(huán)境中，使 組織驟然降溫。本實驗室采用的是液氮驟冷，即將新鮮取材的組織或培養(yǎng)后的新鮮標本迅 速置于液氮罐內(nèi)10 30S，取出，0CT膠包埋后置于低溫切片機內(nèi)待其復溫至-2(TC左右即 可切片。
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我們從通過尿道縱軸的生殖結(jié)節(jié)冠狀面冰凍切片的HE染色可以觀察到生殖結(jié)節(jié) 中全長的尿道發(fā)育，在培養(yǎng)前，即E14. 5d生殖結(jié)節(jié)中，尿道呈單層實性上皮細胞索，在基底 部有開始管化的分叉跡象，培養(yǎng)72小時后DHT組中尿道近端出現(xiàn)明顯的管化趨勢，尿道上 皮細胞增生明顯，形成分層的復層上皮結(jié)構(gòu)，細胞呈現(xiàn)立方形的成熟分化表現(xiàn)，該變化與體 內(nèi)同期發(fā)育即E17. 5d的生殖結(jié)節(jié)中的尿道變化是一致的。而無DHT組中，我們發(fā)現(xiàn)尿道上 皮盡管增生明顯，但近端管化不全，上皮細胞成熟性差，形態(tài)較圓。研究表明在體外，尿道發(fā) 育也保留了體內(nèi)的雄激素依賴性的特征。 近年來，尿道下裂等男性外生殖器發(fā)育畸形的發(fā)病率在逐漸上升，環(huán)境中有毒污 染物質(zhì)特別是一些內(nèi)分泌干擾化學物質(zhì)(EDCs)的增多被認為是罪魁禍首，一些能干擾內(nèi) 分泌的化學物質(zhì)導致尿道下裂的動物模型已經(jīng)構(gòu)建成功，進一步闡明其機制對于尿道下裂 等外生殖器發(fā)育畸形的防治至關(guān)重要，但陰莖和尿道的發(fā)育深藏于子宮內(nèi)，不易觀察，另外 機體復雜的內(nèi)分泌環(huán)境也很難闡明其機制，特別在臨床研究中，陰莖尿道發(fā)育對一些物質(zhì) 短期毒性暴露的影響很難評估，而生殖結(jié)節(jié)體外器官培養(yǎng)就為這些研究提供了一個方便的 工具，沒有下丘腦垂體腎上腺軸的影響，體外環(huán)境相對簡單，這就為研究一些可疑致畸物質(zhì) 的短期毒性作用提供了方便，也利于闡明一些內(nèi)分泌干擾物質(zhì)對陰莖尿道發(fā)育的直接影 響。
1權(quán)利要求
一種構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外發(fā)育模型的方法，其特征是依次包括下列步驟(1)精確孕期小鼠的獲取取8-10周齡近交系小鼠，于晚上按雌雄4∶1合籠，第二天早上分籠，分籠時觀察雌鼠陰道內(nèi)陰栓情況，以陰道口看見白色漿液性栓子者為交配成功，予以分開飼養(yǎng)，定為孕0.5d計算，交配未成功者可予以再交配；(2)胚胎性別鑒定采用解剖法或PCR法進行性別鑒定；(3)生殖結(jié)節(jié)的切取和培養(yǎng)①斷頸處死孕鼠，將其固定于取材板上，75％酒精消毒皮膚，剖開腹部及子宮，取出胎鼠放入培養(yǎng)皿中；②解剖顯微鏡下尋找到生殖結(jié)節(jié)，于其根部用膜狀內(nèi)障剪迅速剪下，將離體生殖結(jié)節(jié)迅速轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中；③將 -CM插入式細胞培養(yǎng)皿預先放入BGJB培養(yǎng)液中37℃浸泡30分鐘，然后在6孔板中每孔加培養(yǎng)液1.1m1，放入 -CM板；④將待培養(yǎng)的生殖結(jié)節(jié)放置于 -CM板的微孔膜上，保留生殖結(jié)節(jié)表面的液膜；⑤每塊 -CM板的微孔膜上均勻放置4～5枚生殖結(jié)節(jié)；⑥將6孔板放入CO2培養(yǎng)箱中，24小時換液一次，每次換液注意調(diào)節(jié)液面，使得生殖結(jié)節(jié)一直處于氣液相交界處；⑦培養(yǎng)分組將生殖結(jié)節(jié)分成加生理濃度10nM DHT的DHT組及不加DHT的無DHT組；(4)培養(yǎng)生殖結(jié)節(jié)的鑒定采用生殖結(jié)節(jié)培養(yǎng)前后形態(tài)和大小測量方 法、生殖結(jié)節(jié)激光共聚焦三維成像方法、生殖結(jié)節(jié)冰凍切片HE染色法中至少一種進行鑒定。F2009100355898C00011.tif,F2009100355898C00012.tif,F2009100355898C00013.tif,F2009100355898C00014.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外發(fā)育模型的方法，其特征是步驟(2)中的解剖法包括下列步驟小鼠胚胎腹部取大十字切口，切開后去除腹腔內(nèi)容物，顯示后腹腔，于腎臟下方，膀胱外上方尋找性腺，睪丸為微小球形，邊緣有附睪附著，并與輸精管相連，下方有睪丸引帶附著，卵巢為一細線形的組織；有睪丸者為雄性胚胎，未找 到睪丸或找到卵巢者為雌性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外發(fā)育模型的方法，其特征是步驟(2)中的PCR法包括下列步驟① PCR擴增對象小鼠胚胎肝臟；② 常規(guī)提取基因組DNA③ PCR檢測a、 弓|物設計SRY:上游弓|物5 ' -ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3 '， 下 游弓l 物5 ' -CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3 '， 內(nèi)參GAPDH， 上游弓| 物 5' -GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3'，下游引5' -ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3'。b、 反應體系取PCR反應專用的0. 25ml薄壁管，按下列順序加入各試劑10X反應緩沖液2. 0 yl ; 25mmol/L MgC122 ii 1 ;2. 5mmol/L dNTPs 0. 5 ii 1 ;25pmo1/ ii L SRY基因上下游引物各 0.8iU ;25pmol/iiL甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因上下游引物各0.8ii1 ;5u/iU Taq酶·0. 25iU ;模板DNA liU ;加無菌去離子水11.05iU至20iU，，溶液混合均勻，4。C下離心， 使溶液沉于管底；c、 擴增程序按下列程序在PCR擴增儀上操作，94t: 4min預變性，然后94t:變性30秒， 63t:退火30秒，72t:延伸15秒，共35次循環(huán)，最后72。C延伸5min后終止擴增；d、 稱取瓊脂糖1. 2g，加入10倍電泳緩沖液10ml，再加入蒸餾水90ml，在電爐上加熱溶 解，配制成1. 2%瓊脂糖凝膠；稍涼后加入配好的EB溶液2滴；e、 將電泳模板兩端密封，倒入瓊脂糖凝膠溶液，插入梳子，冷凝后將梳子撥出，電泳膠 放入電泳槽中；f、 加樣取樣品溶液lOiU，加入1/5體積加樣緩沖液，混勻后，將溶液加到樣品孔中， 同時在另一樣品孔中加入標準分子量DNA。 一般DNA樣品最好控制在0. 5 1. 0 ii g之間。g、 電泳加入lXTris-乙酸緩沖液，通電維持80V，電泳至溴酚藍走到膠中后1/3處停 止電泳；h、 染色及觀察電泳完畢，取出凝膠模具，將其推到一塊干凈的玻璃板上，于254nm或 300nm波長紫外燈下觀察，DNA存在的位置呈現(xiàn)橙黃色熒光，即時拍照；④結(jié)果的判定170bp為內(nèi)參GAPDH， 122bp為SRY基因，內(nèi)參陽性者為擴增有效，SRY陽性為雄性，陰性 為雌性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外發(fā)育模型的方法，其特征是生殖結(jié)節(jié)培養(yǎng)前后形態(tài)和大小測量方法包括下列步驟1) 將6孔板直接放于解剖顯微鏡下觀察，調(diào)節(jié)至同一放大倍數(shù)，以細胞計數(shù)板刻度為刻度標準，解剖顯微鏡連接相機對每個生殖結(jié)節(jié)拍照；2) 對每個生殖結(jié)節(jié)進行大小測量，測量指標包括生殖結(jié)節(jié)縱軸最大長度，生殖結(jié)節(jié)表 面積；3) 對72小時生長前后數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外發(fā)育模型的方法，其特征是生殖結(jié)節(jié)激光共聚焦三維成像方法依次包括下列步驟a、 將培養(yǎng)后的生殖結(jié)節(jié)取出，PBS洗滌；b、 用4%多聚甲醛4°〇下固定1小時。c、 用PBS搖洗20分鐘X5次；d、 用含1% tritonX-100、2X脫脂奶粉、5X羊血清的PBSMT封閉，4t:下?lián)u動過夜；e、 棄上清，標本投入用PBS稀釋的鼠抗人CK，PBS與鼠抗人CK的質(zhì)量比為150 : 1，4°C 下?lián)u動過夜；f、 棄上清，PBS搖洗1小時X5次；g、 加PBS稀釋的羊抗鼠IgG，PBS稀釋的羊抗鼠IgG的質(zhì)量比為100 : 1，4t:下?lián)u動過夜；h、 棄上清，PBS搖洗1小時X5次；i、 激光共聚焦顯微掃描，三維成像488nm氬激光激發(fā)，40X物鏡，每個生殖結(jié)節(jié)標本 由腹側(cè)面向背側(cè)面逐層掃描，沿Z軸掃描150 ii m，層厚2 ii m，每個生殖結(jié)節(jié)標本掃描75張，三維重建。
6、根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外發(fā)育模型的方法，其 特征是生殖結(jié)節(jié)冰凍切片HE染色法依次包括下列步驟A、 生殖結(jié)節(jié)定位和冰凍切片1) 先在冰凍切片切片平板上放上少量的OCT包埋劑，待稍凝固，然后再將生殖結(jié)節(jié)放 入0CT( —種冷凍包埋劑)中包埋，切面向上，再噴上OCT包埋劑，放入冰凍切片機箱內(nèi)，繼 續(xù)冰凍至切片溫度達-19 -20°C ;2) 切片冰凍切片，切片切出后，利用組織切片與載片的溫差立即貼片；3) 切片厚度設為8ym，沿生殖結(jié)節(jié)冠狀面切片，含尿道全長的切片為有效片，即為通 過尿道長軸的冠狀面切片；所有切片用4X多聚甲醛4t:下固定30分鐘后浸于PBS中，4t: 下保存?zhèn)溆?；B、 HE染色:(1)冰凍切片固定10 30s，進入下面處理過程；(2)水洗1 2s ; (3)蘇木精液60°C 下染色30 60s ; (4)流水5 10s洗去蘇木精液；(5)用1 %鹽酸乙醇洗1 3s ; (6)水洗 1 2s ; (7)促藍液返藍處理5 10s ; (8)流水沖洗15 30s ; (9)0. 5%曙紅液染色30 60s ;(10)蒸餾水洗l 2s ;(ll)80X乙醇處理l 2s ;(12)95X乙醇處理l 2s ;(13)無 水乙醇處理1 2s ; (14)石炭酸二甲苯處理2 3s (15) 二甲苯第一次處理2 3s ; (16) 二甲苯第二次處理2 3s ; (17)中性樹膠封固。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種構(gòu)建生殖結(jié)節(jié)器官培養(yǎng)尿道體外發(fā)育模型的方法，包括精確孕期小鼠的獲取、胚胎性別鑒定、生殖結(jié)節(jié)的切取和培養(yǎng)、培養(yǎng)生殖結(jié)節(jié)的鑒定等步驟。本發(fā)明路線合理，易操作，為進一步研究陰莖尿道發(fā)育機制和外生殖器畸形的發(fā)病機制提供了有效工具。
文檔編號C12N5/071GK101712946SQ200910035589
公開日2010年5月26日 申請日期2009年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月27日
發(fā)明者農(nóng)紹軍, 吳優(yōu), 周樹軍, 張躍平, 成兵, 李文光, 沈維東, 王 忠, 蔡波, 陸鳳英, 馬利民 申請人:南通大學附屬醫(yī)院