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一種用gdf5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法

文檔序號(hào):571844閱讀:443來源:國知局

專利名稱::一種用gdf5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域,特別是涉及一種用GDF5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法,該方法能夠檢測秦川牛體長和腰角寬,為培育肉牛新品種提供了新的方法。
背景技術(shù)
:秦川牛產(chǎn)于陜西省渭河流域關(guān)中平原地區(qū),因"八百里秦川"而得名。以東起渭南、蒲城,西至扶風(fēng)、歧山等15個(gè)縣市為主產(chǎn)區(qū),為中國五大良種黃牛之一。秦川牛以其抗逆性強(qiáng)、耐粗飼、肉質(zhì)好而聞名于世,被譽(yù)為"國之瑰寶"。體尺大小是決定品種優(yōu)劣和生產(chǎn)性能高低的重要指標(biāo),而且研究牛體尺大小已經(jīng)成為一個(gè)突出的問題。在長期的選育過程中,隨著秦川牛從役用到現(xiàn)在的肉役兼用,一部分體形較小的個(gè)體已經(jīng)遭到淘汰,但選育較大體形秦〗11牛個(gè)體仍是秦j11牛肉用選育的重要目標(biāo)。生長分化因子5(Growthdifferentiatefactor5,GDF5),也被稱為軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(cartilage-derivedmorphogeneticprotein1,CDMP1),是轉(zhuǎn)化生長因子b(transforminggrowthfactor-b,TGF-b)基因家族中的一員,其作用與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMPs)緊密相關(guān)(Miyamoto等,2007)。在人和小鼠上許多研究證實(shí)(Luyten等,1997;Francis-West等,1999;Edwards等,2001;Mikic等,2004;Nickel等,2005;Harada等,2007;Asuya等,2007),GDF5主要作用于機(jī)體內(nèi)骨、軟骨、腱、關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶發(fā)生和生長及以后的維持,對(duì)于機(jī)體形態(tài)大小具有決定左右。、體尺大小是一個(gè)復(fù)雜的性狀,它受到基因和不同環(huán)境因素(包括日常進(jìn)食和出生前環(huán)境)共同影響,通過遺傳力估計(jì),大約80%以上在體尺大小的變異由遺傳學(xué)決定。GDF5基因被發(fā)現(xiàn)在人的身高、坐高及其他體形指標(biāo)方面有著明顯的作用(Weedon等2008;Sanna等,2008;Lettre等,2008;Southam等,2007),它與成人、幼兒、胚胎及組織的骨骼形成和生長有著緊密聯(lián)系(Chang等,1994;Chujo等,2006)。2006年,Chujo等研究發(fā)現(xiàn)通過增加臨時(shí)細(xì)胞基質(zhì)來保持和修復(fù)脊椎骨長度,從而在兔子上建立了脊椎骨長度退化模型。1994年,Chang等研究發(fā)現(xiàn)GDF5在長骨的原始軟骨中顯著表達(dá),而在椎骨和肋骨中很少表達(dá);少量的表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致四肢骨的生長受阻,影響機(jī)體的體形大?。贿M(jìn)而減少了GDF5基因的轉(zhuǎn)錄,影響脊椎骨、四肢骨及連接關(guān)節(jié)等的生長,造成身材變小。同年,Voight等研究報(bào)道GDF5和UQCC基因己經(jīng)被發(fā)現(xiàn)作為身高等體形指標(biāo)的重要候選基因。綜上所述,國內(nèi)外大量的研究報(bào)道都證實(shí)了GDF5基因可以用來預(yù)示和鑒定人的身高和坐高,鑒于此,申請(qǐng)人在GDF5基因作為預(yù)示和鑒定秦川牛體長和腰角寬的候選基因方面進(jìn)行了研究。以下是和本申請(qǐng)相關(guān)的參考文獻(xiàn)MiyamotoY.,MabuchilA.,ShiD.Q.,KuboT.,TakatoriY.,SaitoS.,F(xiàn)ujiokaM.,SudoA.,UchidaA.,YamamotoS.,OzakiK.,TakigawaM.,TanakaT.,NakamuraY.,JiangQ.,IkegawaS.(2007)Afunctionalpolymorphisminthe5,UTRofGDF5isassociatedwithsusceptibilitytoosteoarthritis.Nat.Genet.,39,529-533。LuytenF.P.(1997)Cartilage-derivedmorphogeneticprotein-1.Int.J.Biochem.CellBiol.,29,1241-1244。Francis-WestP.H.,AbdelfattahA.,ChenP.,AllenC.,ParishJ.,LadherR.,AllenS.,MacPhersonS.,LuytenF.P.,ArcherC.W.(1999)MechanismsofGDF-5actionduringskeletaldevelopment.Development.,126,1305-1315。EdwardsC丄,F(xiàn)rances-WestP.H.(2001)Bonemorphogeneticproteinsinthedevelopmentandhealingofsynovialjoints.SeminArthritisRheu.,31,33-42。MikicB.(2004)MultipleeffectsofGDF5deficiencyonskeletaltissues,implicationsfortherapeuticbioengineering.Ann.Biomed.Eng.,32,466-476。NickelJ.,KotzschA.,Se固W.,MuellerT.D.(2005)AsingleresidueofGDF5definesbindingspecificitytoBMPreceptorIB.J.Mol.Biol.,349,933-947。HaradaM.,TakaharaM.,ZheP.,OtsujiM.,IuchiY.,TakagiM.,OginoT.(2007)Developmentalfailureoftheintra-articularligamentsinmicewithabsenceofgrowthdifferentiationfactor5.OsteoarthrilisCartilage,j_J^468-474。MasuyaH.,NishidaK.,F(xiàn)uruichiT.,TokiH.,NishimuraG.,KawabataH.,YokoyamaH.,YoshidaA.,TominagaS.,NaganoJ.(2007)Anoveldominant-negativemutationinGdf5generatedbyENUmutagenesisimpairsjointformationandcausesosteoarthritisinmice.HumMolGenet.,16,2366-2375。WeedonM.N.,LangoH.,LindgrenC.M.,WallaceC.,EvansD.M.,ManginoM.,F(xiàn)reathyR.M.,PerryJ.R.B.,StevensS.,HallA.S.,SamaniN.J.,ShieldsB.,ProkopenkoI.,F(xiàn)arrallM.,DominiczakA.,JohnsonT.,BergmannS.,BeckmannJ.S.,VollenweiderP.,WaterworthD.M.,MooserV.,PalmerC.N.A.,MorrisA.D.,OuwehandW.H.,CaulfieldM.,MunroeP.B.,HattersleyA.T.,McCarthyM丄,F(xiàn)raylingT.M.(2008)Genome-wideassociationanalysisidentifies20locithatinfluenceadultheight.Nat.Genet.,40,575-583。SannaS.,JacksonA.U.,NagarajaR.,WilierC.J.,ChenW.M,BonnycastleL丄.,ShenH.Q.,TimpsonN.,LettreG.,UsalaG.,ChinesP.S.,StringhamH.M.,ScottL.J.,DeiM.,LaiS.,AlbaiG.,CrisponiL.,NaitzaS.,DohenyK.F.,PughE.W.,ShlomoY.B.,EbrahimS.,LawlorD.A.,BergmanR.N.,WatanabeR.M.,UdaM.,TuomilehtoJ.,CoreshJ.,HirschhomJ.N.,ShuldinerA.R.,SchlessingerD.,CollinsF.S.,SmithG.D.,BoerwinkleE.,CaoA.,BoehnkeM.,AbecasisG.R.,MohlkeK丄.(2008)CommonvariantsintheGDF5-UQCCregionareassociatedwithvariationinhumanheight.Nat.Genet.,40,198-203。[11]LettreG.A.,JacksonA.U.,GiegerC.,SchumacherF.R.,BemdtS丄,SannaS.,EyheramendyS.,VoightB.F.,ButlerJ丄.,GuiducciC.,IlligT.,HackettR.,HeidI.M.,JacobsK.B.,LyssenkoV.,UdaM.,BoehnkeM.,ChanockS丄,GroopL.C,,HuF.B.,IsomaaB.,KraftP.,PeltonenL,SalomaaV.,SchlessingerD.,HunterD丄,HayesR.B.,AbecasisG.R.,WichmannH.E.,MohlkeK.L.,HirschhomJ.N.(2008)Identificationoftenlociassociatedwithheighthighlightsnewbiologicalpathwaysinhumangrowth.Nat.Genet.,40,584-591。SouthamL.,Rodriguez-lopezJ.,WilkinsJ.M.,Pombo-suarezM.,SnellingS.,Gomez-reinoJ丄,CharpmanK.,GonzalezA.,LoughlinJ.(2007)AnSNPinthe5-UTRofGDF5isassociatedwithosteoarthritissusceptibilityinEuropeansandwithinvivodifferencesinallelicexpressioninarticularcartilage.Hum.Mol,Genet.,16,2226~2232。ChangS.C.,HoangB.,ThomasJ.T.,VukicevicS.,LuytenF.P.,RybaN丄,KozakC.A.,ReddiA.H,,MoosM.(1994)Cartilage-derivedmorphogeneticproteins.Newmembersofthetransforminggrowthfactor-bsuperfamilypredominantlyexpressedinlongbonesduringhumanembryonicdevelopment.J.Biol.Chem.,269,28227-28234。ChujoT.,AnhowardS.,AkedaK.,MiyamotoK.,MuehlemanC.,AttawiaM.,AnderssonG.,MasudaK.(2006)Effectsofgrowthdifferentiationfactor-5ontheintervertebraldisc—invitrobovinestudyandinvivorabbitdiscdegenerationmodelstudy-Spine.,31,2909-2917。VoightB.F.,KudaravalliS.,WenX.,PritchardJ.K.(2006)Amapofrecentpositiveselectioninthehumangenome,PLoSBioL,4,1-12。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是提供一種分子生物學(xué)技術(shù),即采用PCR-RFLP方法來檢測秦川牛基因型,從而預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明的目的是按照以下步驟實(shí)現(xiàn)的步驟一,根據(jù)牛GDF5基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物GDFF和GDFR:GDFF:5TGTCCGATGCTGACAGAAAGG3,(如序列表中序列2所示)GDFR:5'GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA3,(如序列表中序列3所示)步驟二,利用該引物對(duì)牛的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到由GDFF和GDFR表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)和第一內(nèi)含子區(qū)的擴(kuò)增片段,該擴(kuò)增片段的長度為235bp;步驟三,利用限制性內(nèi)切酶MvaI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;步驟四,使用2.5%的瓊脂糖凝膠對(duì)消化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離,檢測出GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的T/C變異位點(diǎn);步驟五,通過T/C變異位點(diǎn)檢測堿基的突變,并根據(jù)基因多態(tài)性部位分成以下3種基因型當(dāng)牛GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的變異位點(diǎn)為C堿基時(shí),會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶MvaI的酶切位點(diǎn)(CCATGG),MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生的2個(gè)片段(181bp和54bp),將其命名為CC基因型;當(dāng)牛GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的變異位點(diǎn)為T堿基(CTTGG)時(shí),則不存在MvaI酶切位點(diǎn),MvaI消化PCR產(chǎn)物后只有1個(gè)片段(235bp),將其命名為TT基因型或野生型;當(dāng)牛GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的變異位點(diǎn)為T/C雜合時(shí),MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(235bp、181bp和54bp),將其命名為TC基因型。本發(fā)明分析基因多態(tài)性的方法所帶來的技術(shù)效果是1、通過檢測堿基的突變而分類的基因型。2、其中用于分析基因多態(tài)性的部位是外顯子。3、其中用于分析基因多態(tài)性的序列片段是由GDFF和GDFR表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)和第一內(nèi)含子區(qū)。4、其中分析多態(tài)性的位點(diǎn)選擇已知的牛GDF5基因如下序列中第54位的T-C的堿基突變GGCGGGGTGGCTGGGGCACGGCTCAGAGGGAGGGGCATCTGCATGCATGG150AGGGGGCTTTAGAGCCCAGACACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC5、秦川牛的體尺大小包括體長和腰角寬。6、用于消化PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶是MvaI。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明,具有TT基因型個(gè)體的體長和腰角寬明顯低于具有CC基因型個(gè)體的體尺大小(P<0.05)。在申請(qǐng)人所研究的2個(gè)群體中,具有TT基因型個(gè)體的體長比CC基因型個(gè)體的體長低5.64cm6.87cm;具有TT基因型個(gè)體的腰角寬比CC基因型個(gè)體的腰角寬低3.46cm4.00cm。本發(fā)明巧妙地采用PCR—RFLP的方法檢測秦川牛GDF5基因外顯子1中T/C變異位點(diǎn)。本發(fā)明操作簡單、費(fèi)用低、精確度高,可進(jìn)行快速檢測。使用本發(fā)明的標(biāo)記基因型對(duì)秦〗11牛體尺進(jìn)行選擇時(shí),將使決定秦711牛胴體大小最主要兩個(gè)性狀體長和腰角寬分別提高6.2cm和3.7cm左右。我國現(xiàn)有150多萬頭秦川牛及其改良牛,如果每頭牛體長和腰角寬分別提高57cm和34cm,則每頭牛將會(huì)增加體積約1500cm3,秦川??傮w增加2000多噸的牛肉,對(duì)于培育肉用秦川牛來說無疑是一個(gè)極大的優(yōu)勢,而且可以帶來顯著的經(jīng)濟(jì)效益。如果將其推廣至其他中國良種黃牛,將為中國養(yǎng)牛業(yè)帶來廣闊的發(fā)展前景和利潤空間??傊?,該研究發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記可以用于秦川牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇,有著重要的生產(chǎn)意義,為培育肉牛新品種提供了新的方法。圖1是牛GDF5基因MvaI酶切位點(diǎn)的凝膠電泳分析圖,圖中,TT基因型僅表現(xiàn)235bp條帶;TC基因型,表現(xiàn)235bp、181bp和54bp條帶;CC基因型表現(xiàn)181bp和54bp條帶。54bp條帶在2.5X凝膠中沒有表現(xiàn),但不影響整個(gè)分型。以下結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)和發(fā)明人給出的具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述。具體實(shí)施例方式一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和性狀測定本實(shí)驗(yàn)選取陜西省秦川肉牛良種繁育中心、陜西渭南山川集團(tuán)秦川牛良種養(yǎng)殖場和陜西秦寶牧業(yè)有限公司秦川牛養(yǎng)殖場提供的成年秦川牛393頭和秦川改良牛240頭,共計(jì)633頭個(gè)體實(shí)驗(yàn)牛。實(shí)驗(yàn)牛均由頸靜脈采血10mL,加ACD搖勻抗凝(血液:ACD-6:1),-20°C凍存,并測定實(shí)驗(yàn)牛體長和腰角寬指標(biāo)。牛體長指牛肩端前緣到臀端后緣的直線距離。牛腰角寬指牛兩腰角外緣的距離。2.藥品和酶三羥甲基氨基甲垸(Tris),Tris飽和酚和十二烷基磺酸鈉(SDS)均為北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心產(chǎn)品;蛋白酶K(ProteinaseK)、10xPCRbuffer、dNTPs、100bpmarker和TaqDNA聚合酶為大連寶生物公司產(chǎn)品;瓊脂糖購自北京普博生物技術(shù)有限公司;內(nèi)切酶MvaI為美國MBI公司產(chǎn)品。3.主要儀器GradientCyclerPTC-200基因擴(kuò)增儀、TFM-40紫外可見光成像系統(tǒng)、SZX-ZP超凈工作臺(tái)、DYY-m型電泳儀及配套電泳槽、Eppendorf5810R臺(tái)式高速室溫離心機(jī)(德國)、BECKMAN冷凍離心機(jī)、AB204-E型電子天平、MiLLi-Q超純水儀和、日本松下微波爐及Eppendorf移液器等。二、實(shí)驗(yàn)方法1、緩沖液與常規(guī)試劑的配制(1)10%SDS:10gSDS溶入90mL水中,加熱至60。C助溶,加幾滴濃HCl調(diào)節(jié)pH至7.2,定容至100mL。(2)1mol/LTris'HCl(pH8.0):12.114gTris溶入80mL水中,用濃HCl調(diào)pH至8.0,加水定容至100mL,高壓滅菌。(3)0.5mol/LEDTA(pH8,0):18.61gNa2EDTA'2H20溶入80mL水中,加NaOH2g左右調(diào)pH至8.0,定容至100mL,高壓滅菌。(4)2mol/L的NaCl:11.688g溶于水,定容至100mL,高壓滅菌。(5)DNA提取液(100mL):1mol/LTris'Cl(pH8.0)lmL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,2mol/L的NaCl5mL,定容至100mL。(6)20mg/mL蛋白酶K:20mg蛋白酶K溶入1mL滅菌超純水中,按200nL分裝儲(chǔ)存于-20'C。(7)3mol/L乙酸鈉40.81g三水乙酸鈉(NaAc'3H20)溶于70mL水中用冰乙酸調(diào)pH至5.2,加水定容至100mL,高壓滅菌。(8)50xTAE(忙存液)242gTris堿,57.1mL冰醋酸,100mL0.5mol/LEDTA(pH=8.0),加雙蒸水定容至1L。工作液為"TAE。(9)抗凝劑ACD:檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g,定容100mL水中,高壓滅菌。每6mL的血液中加入lmL的ACD液。(10)PBS:在800mL蒸餾水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gKH2PO4,用HCl調(diào)節(jié)pH值到7.4,加水定容到1000mL,高壓滅菌20min,室溫保存。2、引物的設(shè)計(jì)與合成以下引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成GDFF:5'TGTCCGATGCTGACAGAAAGG3,GDFR:5,GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA3'3、?;蚪MDNA的小量提取(1)冷凍血樣室溫解凍,吸取lmL血液于2mL滅菌離心管中,加入等體積的磷酸緩沖液(PBS)混勻,溫和搖動(dòng)10min,4°C,12000r/min離心10min,棄上清液,重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈透明色。(2)離心管中加入DNA抽提緩沖液lmL,輕輕吹打使血細(xì)胞沉淀脫離離心管壁。(3)加蛋白酶K至終濃度為60pg/mL,混勻,55X:水浴中消化過夜(12-16h)至絮狀沉淀不見,溶液澄清。(4)反應(yīng)液冷卻至室溫,加入等體積Tris飽和酚,溫和搖動(dòng)10min,使其充分混勻,4°C,12000r/min離心10min,將上層水相轉(zhuǎn)入另一滅菌離心管,重復(fù)上述步驟l次。(5)加入等體積Tris飽和酚氯仿異戊醇(25:24:1),溫和搖動(dòng)10min,使其充分混勻,4°C,12000r/min離心10min,將上層水相轉(zhuǎn)入另一滅菌離心管。(6)加入等體積氯仿,溫和搖動(dòng)10min,使其充分混勻,4°C,12000r/min離心10min,將上層水相轉(zhuǎn)入另一滅菌離心管。(7)加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇(-20。C),在-20。C放置30min后,輕輕顛倒試管使DNA呈絮狀沉淀。4°C,12000r/min離心8min,棄去乙醇。(8)加入預(yù)冷的70%乙醇lmL,溫和搖動(dòng)10min,4°C,12000r/min離心5min漂洗DNA沉淀,4°C,12000r/min離心10min,棄上清液,重復(fù)該步驟2次。室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)加入200nLTE溶解DNA,4。C保存直至DNA完全溶解。4、PCR反應(yīng)(1)以牛DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,15pL反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑10xPCRbuffer1.5dNTPMixture(各2.5mM)0.8pL引物1(20pM)0.5nL引物2(20pM)0.5nLTaqDNA聚合酶(5U爾L)0.15基因組DNA(100ng/pL)1.0pL加滅菌蒸餾水至15(2)將上述溶液混合并按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。95°C,預(yù)變性5min;94°C,變性30sec,60°C,復(fù)性30sec,72。C延伸30sec,32個(gè)循環(huán);72。C延伸10min。(3)反應(yīng)結(jié)束后,取PCR反應(yīng)液(5nL)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,檢測PCR產(chǎn)物。5、PCR-RFLP反應(yīng)體系及條件酶切體系如下Mval內(nèi)切酶(lOU/pL)0.4pL10xbuffer0.6PCR產(chǎn)物4.0pL加滅菌蒸餾水至10)LiL將上述反應(yīng)混合液混勻,于37"C培養(yǎng)箱中消化810小時(shí)。6、瓊脂糖凝膠電泳檢測將消化之后的全部反應(yīng)液進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳,檢測PCR產(chǎn)物酶切片段多態(tài)性。7.統(tǒng)計(jì)模型建立根據(jù)群體特點(diǎn),構(gòu)建線性模型如下Y=//+G;+S/+Bp*+Ma,+s碑,Y^—性狀觀察值,//一群體平均值,G,—基因型固定效應(yīng),S,—性別固定效應(yīng),BpA—種場群固定效應(yīng),Ma,—測量年齡效應(yīng),e^—隨機(jī)誤差。使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS中的GLM程序,使用最小二乘方法檢驗(yàn)基因型與性狀間的相關(guān)程度。以下是發(fā)明人給出的實(shí)施例。實(shí)施實(shí)例1:牛GDF5基因多態(tài)性與秦川牛群體體尺性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(GDFF和GDFR)對(duì)秦川牛群體393個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并利用MvaI限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,然后進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。在秦川牛群體中共檢測到3種基因型,當(dāng)牛GDF5基因外顯子1中變異位點(diǎn)為C堿基時(shí),會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶MvaI的酶切位點(diǎn)(CCATGG),MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段(181bp和54bp),將其命名為CC基因型;該位點(diǎn)為T堿基(CTTGG)時(shí),則不存在MvaI酶切位點(diǎn),MvaI消化PCR產(chǎn)物后只有l(wèi)個(gè)片段(235bp),將其命名為TT基因型(野生型);該位點(diǎn)為T/C雜合時(shí),MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(235bp、181bp和54bp),將其命名為TC基因型(附圖)。分析多態(tài)性的位點(diǎn)選擇己知的牛GDF5基因如下序列中第54位的T-C的堿基突變GGCGGGGTGGCTGGGGCACGGCTCAGAGGGAGGGGCATCTGCATGCATGG150CACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC235對(duì)GDF5基因T/C變異位點(diǎn)產(chǎn)生的3種基因型與秦川牛群體393個(gè)個(gè)體的體長和腰角寬進(jìn)行分析,結(jié)果表明基因型對(duì)秦川牛群體的體長和腰角寬有顯著影響(P<0.05),TT基因型個(gè)體的體長和腰角寬顯著低于TC和CC基因型個(gè)體的體長和腰角寬(P<0.05),具有TT基因型個(gè)體的的體長和腰角寬比CC基因型個(gè)體的體長和腰角寬分別低6.87cm和4.00cm(表1)。表1GDF5基因不同基因型對(duì)秦川牛群體體長和腰角寬性狀的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>均值比較時(shí)同一列無相同字母者差異顯著(abP<0.05)a=(TT—CC)/2;d=TC—(TT+CC)/2;D:顯性度,D=d/a實(shí)施實(shí)例2:牛GDF5基因多態(tài)性與秦川牛改良群體體尺性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(GDFF和GDFR)對(duì)秦川牛改良群體240個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并利用MvaI限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,然后進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。在秦川牛改良群體中共檢測到3種基因型,當(dāng)牛GDF5基因外顯子1中變異位點(diǎn)為C堿基時(shí),會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶MvaI的酶切位點(diǎn)(CCATGG),MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段(181bp和54bp),將其命名為CC基因型;該位點(diǎn)為T堿基時(shí)(CTTGG),則不存在MvaI酶切位點(diǎn),MvaI消化PCR產(chǎn)物后只有l(wèi)個(gè)片段(235bp),將其命名為TT基因型(野生型);該位點(diǎn)為T/C雜合時(shí),MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(235bp、181bp和54bp),將其命名為TC基因型(附圖)對(duì)GDF5基因T/C變異位點(diǎn)產(chǎn)生的3種基因型與秦川牛改良群體240個(gè)個(gè)體的體長和腰角寬進(jìn)行分析,結(jié)果表明基因型對(duì)秦川牛改良群體的體長和腰角寬有顯著影響(P<0.05),TT基因型個(gè)體的體長和腰角寬顯著低于TC和CC基因型個(gè)體的體長和腰角寬(P<0.05),具有TT基因型個(gè)體的體長和腰角寬比CC基因型個(gè)體的體長和腰角寬分別低5.64cm和3.46cm(表2)。表2GDF5基因不同基因型對(duì)秦川牛改良群體體長和腰角寬性狀的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>核苷酸序列表<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)<120>—種用GDF5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法<140><141><160>3<210>1<211>235<212>DNA<213>家牛屬普通牛(BostaurusdomesticusGmelin)<220><221〉misc一feature<222>(54)<223>N=T或C<400>1TGTCCGATGCTGACAGAAAGGGAGGCAACAGCAGCGTGAAGTTGGAGGCT50GGCNTGGCCAACACCATCACCAGCTTTATTGACAAAGGGCAAGGTGAGGG100GGCGGGGTGGCTGGGGCACGGCTCAGAGGGAGGGGCATCTGCATGCATGG150AGGGGGCTTTAGAGCCCAGACACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC235<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2TGTCCGATGCTGACAGAAAGG21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA2權(quán)利要求1、一種用GDF5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法,其特征在于,包括下列步驟步驟一,根據(jù)牛GDF5基因(GenBank登錄號(hào)NC_007311)序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物GDFF和GDFRGDFF5’TGTCCGATGCTGACAGAAAGG3’(如序列表中序列2所示)GDFR5’GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA3’(如序列表中序列3所示)步驟二,利用該對(duì)引物GDFF和GDFR對(duì)牛的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到由GDFF和GDFR表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)和第一內(nèi)含子區(qū)的擴(kuò)增片段,該擴(kuò)增片段的長度為235bp;步驟三,利用限制性內(nèi)切酶MvaI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;步驟四,用濃度為2.5%的瓊脂糖凝膠對(duì)消化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離,檢測出GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的T/C變異位點(diǎn);步驟五,通過T/C變異位點(diǎn)檢測堿基的突變,并根據(jù)基因多態(tài)性部位分成下面3種基因型當(dāng)T/C變異位點(diǎn)為C堿基時(shí),會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶MvaI的酶切位點(diǎn)即CC^TGG,MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生的2個(gè)片段即181bp和54bp,將其命名為CC基因型;當(dāng)T/C變異位點(diǎn)為T堿基即CTTGG時(shí),則不存在MvaI酶切位點(diǎn),MvaI消化PCR產(chǎn)物后只有1個(gè)片段即235bp,將其命名為TT基因型或野生型;當(dāng)T/C變異位點(diǎn)為T/C雜合時(shí),MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段即235bp、181bp和54bp,將其命名為TC基因型。2、如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的GDF5基因外顯子的序列片段是由GDFF和GDFR表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)和第一內(nèi)含子區(qū)。3、如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的基因多態(tài)性部位的位點(diǎn)為己知的牛GDF5基因如下序列中第54位的T-C的堿基突變TGTCCGATGCTGACAGAAAGGGAGGCAACAGCAGCGTGAAGTTGGAGGCT50AGGGGGCTTTAGAGCCCAGACACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC。4、如權(quán)利要求1-3所述的方法,其特征在于,其中秦川牛的體尺大小包括體長和腰角寬。全文摘要本發(fā)明公開了一種用GDF5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法,該方法根據(jù)牛GDF5基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物;利用該引物對(duì)牛的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;并利用限制性內(nèi)切酶MvaI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;然后使用2.5%的瓊脂糖凝膠對(duì)消化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離,檢測出GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的T/C變異位點(diǎn);分別對(duì)牛GDF5基因外顯子1中變異位點(diǎn)為C堿基、T堿基及T/C雜合堿基進(jìn)行命名。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,具有TT基因型個(gè)體的體長比CC基因型個(gè)體的體長低5.64~6.87cm;具有TT基因型個(gè)體的腰角寬比CC基因型個(gè)體的腰角寬低3.46~4.00cm。該方法操作簡單、費(fèi)用低、精確度高,可進(jìn)行快速檢測。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101525662SQ20091002182公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2009年4月2日優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日發(fā)明者劉永峰,昝林森,楚秋霞申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)
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