專利名稱：微生物的高效培養(yǎng)分選方法和培養(yǎng)裝置的制作方法
敝物的i^fc^艦旅和^^g
駄領(lǐng)域
本發(fā)明掛共了一種敫生物的高效i^^^方法和ig^fi，以獲^^生物的鄉(xiāng)咅養(yǎng). 背景獄
自然環(huán)境中包含著大量未能獲得純培養(yǎng)的敝麵中。1認(rèn)為目前能被分離、線和鑒定的敝 物種類僅占自然蹄在量的5%左右。絕大多謝Ml物不能被目前的純培^^:戶;fi歸， 為*^#微 生物(unculturablemicroorganism),如海洋^^頓9%以上的種^*被士歸。m±2003^IU，鄉(xiāng)菌域 的53個(gè)門(按照環(huán)境16S rDNA序列劃分)中，只有27個(gè)門中含有巳被i歸的微生物，而另外的26個(gè)門僅 知道其16SrDNA序列。在已線的細(xì)菌中，iX^現(xiàn)5個(gè)門，即麟菌門、鵬菌門、翻菌門、^^菌門 和 菌門中的一些種類會(huì),產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，而這5個(gè)門中已ig^和發(fā)表的種類占所有已ig^和發(fā)表 的細(xì)薪中類的95%。據(jù)統(tǒng)計(jì)(iS2008年7月)，目前僅有約8500種細(xì)菌被:^§#和1^^^:表。因此，開l新 盼海消t^微歸技術(shù)，盡可能多的得到m^物純i歸，然后篩選天然，是非常必要的。
敏去的十幾年間，許多研究^M3i^t環(huán)辦品的16S rDNA克隆測j^l5確定自然鄉(xiāng)生物的多樣性。 海洋、土壤、淡水、動(dòng)植物術(shù)卩&,等自然環(huán)境中者|5 豐富的 物。Ji^卜，肖們還用宏基因組 學(xué)(Metagenomics)的方絲獲^i咅養(yǎng)微生物的基因資源，極^#石展了人們^#^物多樣性的認(rèn)識(shí)， 并且推動(dòng)了對(duì)自然界中f^物資源的開^ffi。然而，已有的S^K術(shù)并沒有擺脫^fe物未被培養(yǎng)所帶 來的弊崙，因?yàn)檫@些方齒又僅能獲取一定的微生劍言息，但卻無S^得足夠量時(shí)lt^物細(xì)胞，從而也就 無&^面了解tt^物細(xì)胞的生命g以及m^物之間的互作規(guī)律。因此，要)^#4物的生理特14^^^深 入了解，赫要了解基因組中^S因^i^物的^i射謝S，必須獲f^Ml物純i歸。
同樣，研織明土壤、銜K、辦直物體^^種環(huán)境下戶膽的絕大多數(shù)附ll^頓中類沒有被i線出來， 艦切需要粒能鵬高效分離蹄而獲fWtl物單克隆，特別是鵬辦麻中脅法。
自然環(huán)境中，^ini物通常與很多不同種屬的其他^^物共同生長。為了充^Kim^Ht^物的特性，
必M^徵敖生物的純培養(yǎng)。傳統(tǒng)的平板涂布法是實(shí)驗(yàn)室微生物分離it^方法，雖然也能獲得一定量的微 生物菌株，fi^6時(shí)費(fèi)力且獲得的微生物多樣性很低。其**原因概括有以下方面
1) 經(jīng)典i^方法阻礙了^k物之間的交流
自然環(huán)境中很多m^物者驟集生長，它們之間有共生、互生、寄生、賺等多種s^^f、，許多微
生物的生長都魏圍環(huán)境敝物怖射;^以及其它生長因子的影響，離開原生態(tài)環(huán)境則難以生長。實(shí)驗(yàn) ^典^^J往往破壞了^fe物之間的這種共生拔態(tài)，^^物之間的信息交流被阻斷，生長必需的信號(hào) 針和生長因WS。
2) ig^f牛與原生態(tài)環(huán)境的差別
自然界中i^物可利用的營^t/質(zhì)匱乏，多數(shù)處于"寡營養(yǎng)"拔態(tài)，而常規(guī)實(shí)^^14鄉(xiāng)§#基的 營微鵬繊高于敝物生長的自然職。常搬屯培養(yǎng)方^m種認(rèn)識(shí)不充分，高鵬的營繊質(zhì)可 能比^S^^那^fe^iM^M高濃度營^^質(zhì)有繊能力的微生物，fi^j"那輕^g較漫的微生物可能有抑制乍用，對(duì)鵬鮏綱共營養(yǎng)成分豐富的蹄基反而會(huì)成為阻礙其復(fù)蘇^fi^因素， 甚至?xí)鯥鵬4她卩速死亡(Substrate accelerated death)王嫁。
3) 氧做辦迫引繊胞損傷
當(dāng)自然環(huán)境中的微生物突然轉(zhuǎn)入人為環(huán)境時(shí)，一^]f Jf^giS能力較3賊生長較決的m^物很決
形成卿艮可見的克隆，S^:長決的^^t^產(chǎn)生大M:氧化物、自由凝n超氧化物，S^ti質(zhì)的產(chǎn)生 l數(shù)P^S^能力體或生長較漫附^fe物細(xì)胞穀躓傷，從而3^J^能生長。
4) 生機(jī)慢的敝辦媳視
在平板:@#基上， 一個(gè)離中細(xì)胞的數(shù)目至少為105個(gè)才倉調(diào)卿歐見察到，而那^^^Ig^侵、其 生^ii不到高密度的細(xì)薪中類，在培養(yǎng)基iffl肉眼是看不到離的，從而導(dǎo)m^^fe物的生長^l跌 覺，彭見為"碑歸，，。
5) 活的非可i歸(viable but nonculturable state, VBNC) ^bt態(tài)細(xì)菌的雜 細(xì)菌的VBNC狀態(tài)，是指，細(xì)菌處于不良環(huán)境劍牛下，其^h細(xì)胞?？s小^^形，用常挪^#
常規(guī)餅下蹄時(shí)不能使其繁殖，但它們臓具有微活性。
針對(duì)S^fe物不能被線的原因，很多研究者提出了一蝶高^fe物可培養(yǎng)性6^J^法，如向培 養(yǎng)基中力口入微生物相互作用的信號(hào)好(如鵬高絲氨酸內(nèi)酯、c鮮^AT縛)簡單i魁對(duì)以1t^物間的喜 女f^流，滿足tt^物生長繁殖的需泉在i^^基中添加)^ft14^分具有,能力的物質(zhì)，如MIWft、超 氧化物樹機(jī)(S0D)和過氧媳麟，斷氐優(yōu)勢薪Wti射所產(chǎn)生的過氧化物、自由辭卩一^M勿J^對(duì)
其他敝物細(xì)胞的毒割乍用；鵬 ^繊# 至驢，斷氐少數(shù)幾禾帷^mi物對(duì)主要雜的寡
營養(yǎng)m^物的競f^T擾，而4姓體寡營養(yǎng)m^物可:t錄性大娥高，即^#土^￡(Dilutionculture); 將常規(guī)M物歸基進(jìn)橘釋，使?fàn)I賴效農(nóng)度斷氐，增加可歸微生物的M^。雖然不同禾號(hào)提高 了微生物的可i緣性，ffi^它們只慰寸傳統(tǒng)i^S形式上的M， 4M不倉鵬免傳鄉(xiāng)^^去本身的弊崙， 如微生物之間的交流、i鎌斜牛的巨媳別、m^物活的非可i^lt態(tài)不能l^頂，以及生釤愛漫的微 生辦惚視錄
自然餅下 物所處的寡營養(yǎng)斜牛及其生存環(huán)境的驗(yàn)性，使敝物御糊一種方法M^St錄 出來。所以現(xiàn)代1t^物i識(shí)中，提出了自燃^#^去和近自然剝牛:^#^的 :，并出現(xiàn)了一^if的:t歸 方法，如擴(kuò)t5^i^fe這種方法樹以了1[^物生長的自然環(huán)趟。Kaeberlein等設(shè)計(jì)了一種培^g名 為擴(kuò)散盒(diffusion chamber)。該擴(kuò)散盒由一^h5f艱的不鏃岡墊圈和兩側(cè)，的0.1 nn^慮膜纟賊。 將海洋1[4 品加^^閉的擴(kuò)1^中，齒對(duì)^^樣點(diǎn)環(huán)境斜牛的^^缸中進(jìn)@^。擴(kuò)t^的膜可使 化學(xué)物m盒內(nèi)和環(huán)^間進(jìn)行，，《S^H胞卻不能自由移動(dòng)。盡管用這種方法沒有i歸出新的m^ 物種類，(fi^在擴(kuò)t^中培養(yǎng)一周后卻得至lJ;W^各異的皿。獲得的菌株在AI合成的固體^^基 中不能生長，f踐在其他微生物的雜下卻倉膨成麟。這種歸方法倉^^gii^擬^^物所處的 自然環(huán)境，由于化學(xué)物質(zhì)可以自由穿過薄膜，可^^證^:tJ^落間作用的,，提高了^^物的可@# 性。
鵬^i和體，鵬一定禾M^h模擬了自然蹄，提高了敝物的可賺性，但臓無法避免 獲取膽簡勿鄉(xiāng)歸所需的熟員步驟，如敝鵬離糊陬和劃線純化等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是ii^一幹微生物的i^^^^^方法和if^S，以^B艮已有M的不足。 本發(fā)明麟了一禾種鄉(xiāng)自然斜柳敝鵬^g。 i^S包括用B隹^t^物生長離盼鵬咅 ^!、其內(nèi)^M^t有多個(gè)i^^纖，下擱fei:有相應(yīng)個(gè)數(shù)的層析柱，其間憑借^ 1,在體上設(shè) 有控制ii^^il的^^^帝職，腿析柱的出口端覆以25m^孔徑的雕昌，并經(jīng)由體接Ai^液收 。本發(fā)明il^的^gffl于微生物高效士^^，方法中~~^埋^^物的近自^^#這一步驟中。
本發(fā)明中微生物^&培養(yǎng)維方法的基本工藝如下1) 1t^物的采集和繊；2) ^!物的包埋； 3)包埋微生物的近自然餅培泰4)長有單克隆麟的^f叻口富蹄。詳細(xì)具體的實(shí)順案如下
1) 敝物的采集和鄉(xiāng)
細(xì)常規(guī)敝物樣品采集方賊餅辦品，并l繊^MS少為106個(gè)/ml的敝tftffl雅埋。
2) 敝物的包埋
將±^歉鄉(xiāng)導(dǎo)到時(shí)#^物樣品 說^^行包埋，以實(shí)5j^t單個(gè)微生tia行包埋。
微生物包埋的具體工藝如下
a) 用生 7乂配制無菌天然高聚,埋材料溶液(如1%至5%盼海 ^溶液，或1%至5%的低凝固 點(diǎn)瓊月離溶液，或O. 5%至5%的結(jié)冷膠溶液)；
b) 將 后的'#^細(xì)[]入包埋材料溶液中，_@^入^^物的量為包埋材料所形成^ *的
1/10~1/100，并混合均勻得到敝物和聚恤溶瓶 C)將J^tt^物和聚^tr溶液按小于i: 5比例加入含司細(xì)0的石蠟油虛直物油中，IP^均勻，用 麟L化法，制備成包含粒徑均一微商的乳瓶
d)細(xì)相應(yīng)的固化方法，將乳液中的微滴固化成麟，用無菌^7k洗滌微球，趕將油完全洗去，
得到包埋有單個(gè)敝物的微球。
3) 將戰(zhàn)包埋有單個(gè)敝頓敖球(包埋微生物)進(jìn)瓶自然娜歸，線的具體工藝是
a) 將上一步驟中包埋有單個(gè)tt^物的微^A^析柱中，層析柱出口端覆以25^K離昌，防止微 球沖出，且能使長出微球的i^物隨i歸翻咄層析法
b) 將層析ti&j(A^S箱中，^Ai^^^f瓦中的無菌寡營^^^基^析，口^mA;
c) ffiig生長M^T培^m趕包埋有單個(gè)敝物的微球內(nèi)有單克隆形成，然后進(jìn)行下j。
4) 長有單克隆微球的她和加富培養(yǎng)
翻Al^^就細(xì)胞儀維的方法將上1驟中;fel^導(dǎo)到的長有單克隆的微球維出來，進(jìn)一 步加富歸，獲得爐微生物克隆。
±^包埋有單個(gè)微生斷微球的近自然劍牛培養(yǎng)是在本發(fā)明專門設(shè)計(jì)辦莫擬自然劍牛的微生辦§^
置中來進(jìn)行的。
本方法倉^高效的培養(yǎng)和^t微生物，為獲徵敖生物純i^m寺別是m^物新種Jti共了if^fe并且
大量 了傳統(tǒng)方激取微生物純培養(yǎng)所需的工作量和勞動(dòng)力。將單克隆,^M96孑鵬鵬默 力歸變得更加容易，并為獲微生辦屯織后下游的研繊共了方便，如對(duì)獲f魏蹄的敝物腳A 測序，確定期中屬；研究m^物生理和基因功能；研究m^物的^i射^t)^。


圖i本發(fā)明的高Sfc^，:^法^^呈圖。
6圖2本發(fā)明的^K自然劍牛妳微生物^^a。
其中1-^^^#筋2-i^^afc 3-嫩；4-體；5-^^S帝螺；6-層析法7-下擱板；
如圖2，本發(fā)明包括用于維謝t^物生長離盼^St^tl、其內(nèi) 板3上有多個(gè):)^#超瓶2， 下擱板7上有相應(yīng)個(gè)數(shù)的層析柱6，其間憑借作為輸徴§#基的1^的體4翻，在體4上設(shè)有控 制培養(yǎng)基的箭遞的潦鵬審徵5，腿析柱6的出口端覆以25 的縦昌8，并經(jīng)由體接AJt液雌 瓶9。本發(fā)明Jli共的^gffl于tt^物高效:t歸^^方法中^^埋1t^物的近自然i^l^這一步驟。
本發(fā)明中微生物高敏^#^^方法的基本工藝如下:1)微生物的^^f口繊:2)^^物的包埋:3)包 埋m^物的近自然斜弁歸4)長有單克隆 的^^和加富土歸。詳細(xì)具體的 ^案如下
1) 微生物的采集和鄉(xiāng)
在自然環(huán)境，絕大多1^#^物都生長^*營養(yǎng)的環(huán)境中，所以m^物的4t離少，必需將環(huán)境樣品 的敝物進(jìn)敏銀獲得濃輕少為106個(gè)/ml飾鮏物翻于包埋。
微生物的鵬翻離心和濾鵬激目結(jié)合的方法。鵬環(huán)境樣品直接用濾MM媳時(shí)，很容易將
濾膜堵塞直接用離心的方法，獲得的樣品中雜質(zhì)^i^高，影響包埋。用離心的方S5fe將樣品鵬， 然后再用濾ra—步^M粗濾，去除樣品中的雜質(zhì)，再進(jìn)一步用離心^t膜的效去鄉(xiāng)，蔬獲得雜崩 艦鵬較高的菌體，雜不僅育號(hào)高包埋的鵬率也提高了、鵬的效糊織。
2) 微生物的包埋
將戰(zhàn)繊尋到的鵬腦口口翻麟L化法偉^W進(jìn)行包埋。
用麟L化跑埋敝物可用的包埋材料廣泛，如海^Ml，低凝固點(diǎn)瓊月識(shí)，結(jié)冷膠，卡繊等。
s^然高肝材料來源廣泛，具有簡單可控的^^性育猁良好的生物相容性。材料膠 形成的網(wǎng)格
結(jié)構(gòu)可以作為物鵬障，對(duì)生物體起劍雜作用；材料所具有的一定的網(wǎng)粉L徑，可以允許氧氣、營養(yǎng) 物和f^ff^勿的出入，以及微生物間小信號(hào)肝的交換，雜就可以保iBH胞在包埋基質(zhì)中自由生長； 另外，材料所具有的t/tM性能鄉(xiāng)蹄'Jf魏生長微生物的生長。
麟L化法制織球的過驗(yàn)將一定比例的分散相和驗(yàn)相混合均勻，抽濾，使混^ia孔徑均 一 ，鄉(xiāng)另H則形戯L(fēng)化微滴，液滴扁表面剝離后形離徑均一的乳液。麟到的乳鵬一
步固化，形j^立徑在30 70lc^間的單分散性微球。
本效去是將單個(gè)時(shí)1M1物經(jīng)行包埋，并ffl3lg帝e^物和制^W的數(shù)量，使其比例小于等于l: 10，
保證絕大多,微生辦皮單^h&埋，且一個(gè)微球中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的菌體的幾對(duì)及低。
敝物包埋的具體工藝如下
a) 配制無菌天然高聚ltS埋材料溶液，如海M^I溶液，低凝固點(diǎn)瓊月^g溶液，結(jié)冷膠溶瓶
b) 將繊后的^fe働隊(duì)包埋材料溶液中，保働n入m^物的量為包埋材料所形成微^fi的
1/10~1/100 (比如500微升生^^料溶^1以制^￥均粒徑為60 的 約108個(gè)，這樣加入 100微升l(f個(gè)/ml的菌液，即可使#^物和,的比，1: 10)，混合均勻得至(lt^物和聚合 物溶液；
c) 將±^#4物和聚^#溶液按小于1: 5比例加入飼激0的石蠟油^i物油中，^P^均勻，用 麟L化法，鵬成包含粒徑均一微商的乳瓶d)將形成的乳^ffl相應(yīng)的固化方法，將乳液中微滴固化成1W，用無菌船]<^^^ ， SS將
油完全洗去，得到包埋有單個(gè)微生物時(shí)麟。
3) 包埋有單個(gè)微生^ (包埋敝物)的近自然餅線 自然IWfe物生長的環(huán)境一般^^營養(yǎng)的，fflM^^fe物自然原位生長環(huán)境6^對(duì)以，可以aih優(yōu)勢
菌株的生長，M^3寸其4也^^的生^:抑制，使衞專統(tǒng)ig^:S^下不倉^:長的菌株得以生長。
包埋微生tJ^對(duì)以自然剝牛附Ml物i^^g中迸衍^。豐熟乂的原位生長環(huán)^^指在i^i程
中，盡t^敝物細(xì)胞被對(duì)蟲包埋，但魏自環(huán)境的所微包埋的細(xì)胞鵬,歸，飽一定禾號(hào) 上模擬了自然環(huán)境，而且由于TO的孔45駄，仿射^I和一些其他好(如信號(hào)^T)可以互相鄉(xiāng)，
保證不同1t^物之間信號(hào)的交流包埋tMl物是在一個(gè)開放的、遊對(duì)卜充營養(yǎng)的系統(tǒng)中，而不是在一個(gè)
封閉的系統(tǒng)中，樹以了大多數(shù)自然開放環(huán)境；培養(yǎng)中的寡營^^牛模擬了原位^^態(tài)環(huán)境。
敝物培養(yǎng)的具體工藝是-
a) 將上一步驟中包埋有微生物的^^A層析柱中，層析柱出口驢以25m^離昌，防止^^沖 出，且能使長出tt球Wl^fe物隨培^^f出層析柱；
b) 將層析根認(rèn)鵬歸箱中，親歸繊的滅菌寡營養(yǎng)線基(如天繊K、絲、土驗(yàn) 提液)腦斤概口WA;
c) ffisi:生長鵬下歸綱，趕包埋有單個(gè)敝物的微球內(nèi)有單克隆形成，然后進(jìn)行下1 實(shí)驗(yàn)。
4) 長有單克隆微球的^f叻口富培養(yǎng) 這一步的目的是艦出上一步驟中@##到的長有單克隆時(shí)微球，進(jìn)一步加富i歸，使其長出微球
獲得大量微生物鄉(xiāng)鎌。左lt^物的包埋步驟中，Miffl5帶ME物和制翻斂球的M，使其比例小拷 于l- 10,從而保證了絕大多數(shù)敝辦皮單怖埋，力口富i^^后獲得的是一株微生物的單克隆。
可以翻AX娜鵬細(xì)胞儀m AX繊可,免熒光她等步驟，保證了微生物的活性， 臓斜瞎戯細(xì)胞儀維效斜及高，缺點(diǎn)是熒5^fe會(huì)對(duì)敝物活性不利。 AX她辦如下
a) 將近自然斜牛3##后的微 #至103~104個(gè)/1111，使吸取1艦的^#液時(shí)，其中僅含一^:有 單克隆的微球；用封敞將Jd^稀釋讞瞎iJ96孑版中；
b) 96孑版中力B入100 200微升的加富it^基，使單克mS"^生長，獲得^ffi^fe物鄉(xiāng)嫌。
弒細(xì)胞儀鄉(xiāng)鋼口下
a) 用LIVE/DEAEH^搶中的SYT0"9^fe將長有克隆^m^經(jīng)行^jS,用'賦細(xì)鵬^4行維，將 長有克隆飾敖球^^(J96孔板中；
b) 96孑版中加入100 200微升的加富Jf^基，使單克ma"^生長，獲得媳的^^l^fet錄。 說的加富歸基是指用于培養(yǎng)^ 物的特定土歸基，如海洋細(xì)駒用2216E鵬7歸線基，
陸^ffl05J用R2A:tl^凝口胰蛋白膨^^基，鵬^I用高氏l號(hào)i^^基。 鄉(xiāng)例l
以低凝固點(diǎn)瓊月iH為材料配制無菌包埋材料溶液，包埋海7jC樣品為例詳細(xì)說明本方法的具體步驟。 1)簡勿的采集和,
a)采集青島近海海7K聰?shù)臉悠泛?，首知?冊(cè)數(shù)，獲得糊始鵬為2.7乂105個(gè)/1111;b) 用媳辯且濾^7K樣進(jìn)fima去除樣品中狡大的固^^驟拉；
c) 取4004 Hffi濾過的7K樣10000rpm離心iB^菌體，用10^f的滅菌海7jCfif ^浮，用5 的濾 麟腿，去除微駄的麟繊生繊(如纖德鞭獨(dú)等)；
d) 進(jìn)"^以鵬Orpm離心鵬菌體，倒掉iJl海水后，用400微的滅菌海^t懸浮菌體； 這# 后獲得菌鵬為2. 7X Kf個(gè)/nd的菌液。
2) 敝物的包埋
a) 用生Sin卜7K配帶膿度為戰(zhàn)低凝固點(diǎn)瓊月醣(凝固點(diǎn)27 29°C)溶液，115T頓30胸
b) 取100微升的^li后菌液，力虛頓0微升的船疑固點(diǎn)潮^^液中，充分混勻，37。C孵育(保證 瓊月^PR嫩)。(500微州氐凝固點(diǎn)瓊月|^溶 以制^^均粒徑為60 附微球約108個(gè)， 雜加入訓(xùn)微升108個(gè)/1111的菌液，即可使IM:物和微球的比働i: 10);
c) 將混合均勻的混^處溶働口A20t^W司激0的石蠟油中混合，微片刻后，將其倒A^L
寸4^S中，掛濾，使溶 ^孔徑均—m懇，^raHi形戯L(fēng)化微滴，從而形成包糊 一粒徑微滴的乳濁瓶
d) 將,啲乳濁體于冰浴中15倂中，固鄉(xiāng)j^l定的微球。離心iMt球，并用滅菌海水充 分離心洗滌，將石蠟油完全te，獲得粒徑在30 70m^間的包埋有海^^i物的單分散微 球。
3) 包埋海^fe物的近自然餅土薪 包埋海洋微生t^模擬模擬海洋環(huán)境劍牛的微生鄉(xiāng)"g^S中進(jìn)衍"^。 M的原位生長環(huán)境是指:
在:llf^a程中，盡t^海洋微生物細(xì)胞被判蟲包埋，(S^自海洋環(huán)境的所有被包埋附敝物者降一 起i^，保證不同微生物之間信號(hào)的交流，在一定S^i:樹以了m^物生長的原位環(huán)境；包埋海# 物是在一個(gè)開放的、纖卜充海水作為培養(yǎng)基的系統(tǒng)中，模擬了海洋開放環(huán)場海擬咅養(yǎng)魏自微生物 生長的原位環(huán)境也模擬自然環(huán)境。 敝物蹄的具體工藝是
a) 將包埋有海洋微生物的微^A層析柱中，層析柱出口端覆以25^*嫩昌，防止i^沖出，且 能使長出微球階海消^1物隨^$# #出層析法
b) 將層析tt^ASSi^^箱中，^Ait^^f瓦的滅菌海水膽析豐斑口^MA，做為海^^fe物 生長所需的賺基;
c) 在16。C下^^t^5周，定H^樣觀^W內(nèi)微生物的生長狀況，微球內(nèi)有單克隆S^形鵬， 進(jìn)行讎。
4) 長有單克隆離微球的 ^ 加富蹄
a) 用LIVE/DEAD^!j盒中的SYT0"9^fe將長有克隆的^^經(jīng)行^jS，用 賦細(xì)胞t^S行，，將 長有克隆W1^^I恢 版中；
b) 96孔板中力口入150微升盼海7爐八^:§#基，使單克離一步生長，獲得膽的微生t^fii歸。 織例2
以海M^為材料配制無菌包埋材I^^液，包Si:壤樣品為例詳細(xì)說明本方法的具體步驟。 1)敝物的采集和繊a) 稱艱4g環(huán)，品土^g泡^2004^滅菌的生afe7K中，充分震蕩Wf吏泥樣中的微生物分，lJ StK中；
b) 用繊且濾對(duì)識(shí)鵬斑濾，去除樣品中駄的土翻粒；
c) 10000rpm離心粗濾過盼Sii液M菌體，用10，的滅菌4SS7Kafhi:浮，用5 的濾^& 慮，去除較小顆f4^質(zhì)；
d) 以10000rpm離心iB^菌體，倒掉上清后，用200 的，生3^水懸浮菌體。 獲得土壤M物的濃度約為10'個(gè)/ml 。
2) 微生物的包埋
a) 用生鵬爐帶膿度為3%的海藻働溶液，115。C滅菌30艦
b) 取100微升的繊后菌液，力瞎U500微升的海il^r溶液中，充分混勻(500微升海Wfl溶W 以制 均粒徑為60 繊球約108個(gè)，雜加入腦微升ltf個(gè)織菌液，即可使敝物和微 球的比值為l: 100);
c) 將混合均勻的混^r溶働nA20^ma 08%司齠0的植物油中，^^均勻后倒AJHL4I^S 中，鵬，使溶M31孔徑均一,懇！鄉(xiāng)另HP!膨戯L(fēng)化微滴，纖表面剝離后形礎(chǔ)立
徑均一的乳濁液；
d) 孕L濁液(含海Wft微滴的石蠟油)經(jīng)B的氯化韓溶液固tt2小時(shí)后，形礙急定的微球。離心收 求，用生鵬K充分離雄滌，趕將油完全絲，獲得包埋有土Wfe物^m
3) 包肚壤微生物的近自然餅培養(yǎng)
包埋MWWi:鵬境餅的:l^l中進(jìn)根歸。模擬的土鵬位生長環(huán)境是提在i^i程
中，盡11^土壤微生物細(xì)胞被與蟲鵬，但絲自土斷境的所有被包埋的1t4物者降一超歸，保
證不同微生物之間信號(hào)的交流，在一定禾SM細(xì)了敝物生長的原位職包肚壤M物是在一個(gè) 開放的、遊斜卜紅^SJi液作為培養(yǎng)基的系統(tǒng)中，^K了土壤開放環(huán)場土^m提液取自m^物生長
的原位環(huán)境也樹以自然環(huán)境。
鵬勿培養(yǎng)的具體工藝是
a) 將鵬的包埋有土麟生物的^^A層析柱中，層析柱出口端覆以25lt^濾膜，防止微球沖 出，且能4吏長出^t球6^t^物隨ii^t出層析柱；
b) 將層析啦j(A,咅鎌中，,歸魏的滅菌土聽提^AM析腿口^MA，做為土壤
敝物生頓需的培養(yǎng)基；
c) 在28。C下鄉(xiāng)離周，定艦樣觀^W內(nèi)敝物的生長狀況，麟內(nèi)有單克隆離形鵬， 進(jìn)行維。
4) 長有單克隆離微球的AI鄉(xiāng)叻瞎蹄
a) 將近自然餅歸后的微^^至l()4個(gè)/ml，娜取10微升的繊液時(shí)，含有齡鵬但其 中僅含一^^有單克隆的 ;用擁嫩將±^##働瞎股6孔板中；
b) 96 版中加入150微升的R2A:t&^基，使單克Hai生長，獲得^M微生鵬i歸。 鄉(xiāng)例3
以結(jié)冷膠為材料配制無菌，材豐4^液，以包埋fifeK樣品為例詳細(xì)說明本^t去的具體步驟。 1)微生物的采集和繊
10a) 采激勤JC湖環(huán)境樣品后，首規(guī)微生繊冊(cè)數(shù)，獲得娜嫌度為104個(gè)/ml;
b) 用濾iKfflM^Jc樣進(jìn)fffMbm去除樣品中較大的固體顆粒；
c) 取50(X ffl濾過的水樣10000卬m離心,菌體，用10，的滅菌湖水Mlfti:浮，用5 的濾 臌fijt，去除術(shù)只^:的^mil生動(dòng)物(如纖M、鞭^A等)；
d) 進(jìn)一步以10000rpm離心i!5^菌體，倒掉J^水后，用100微升的滅菌海水懸浮菌體； 這^^后獲ff^嫩度為5X 107個(gè)/譜敝物菌液。
2) 敝物的鵬
a) 用含O. 0漲氯化f丐的蒸餾水配第M為m結(jié)冷膠溶液，115。Cg^菌30^H中；
b) 取100微升盼^^f后菌液，力口到500微升的結(jié)冷膠溶液中，充分混勻，37T孵育(保證結(jié)冷膠不 繊)。(500微升結(jié)冷膠溶M"以制^F均粒徑為60m^Wm^約108個(gè)，,加入100微升5X 107個(gè)/ml的菌液，即可使 物和 的比11^1: 50);
c) 將混合均勻的混^tr溶働nA204fhtao5免司激o的石蠟油中混合，,片刻后，將其倒AM 乳^^fi中，抽濾，使溶M31孔徑均一的微孑鵬，娜另Hi形戯L(fēng)化徽商，從而形成包含
均一粒徑微滴的乳濁液；
d) 將收穀啲乳濁體于冰浴中15倂中，固化形礙急定的微球。離心if^W，并用滅菌湖7X充
分離樣滌，將石蠟油完全絲，獲得粒徑在3(h70^t間的包埋有駄敝物的單分散麟。
3) 包埋銜JC敝物的近自然餅線 包埋銜乂m^tl^莫擬^7K湖環(huán)境剝牛的i歸，中進(jìn)份^。 ^的原^^長環(huán)^^指在i^
過程中，盡t^、淑x敝物細(xì)胞被與蟲包埋， ^*自環(huán)境的所裕皮包埋的^^物 —超歸，保
證不同微生物之間信號(hào)的交流，在一定禾ijgi:微了微生物生長的原位環(huán)場包埋淑微生物是在一個(gè) 開放的、遊斜卜充^7K作為培養(yǎng)基的系統(tǒng)中，豐對(duì)以了^;K湖開放環(huán)場銜Ki咅養(yǎng)魏自1t^物生長的原
位環(huán)鴻也模擬自然環(huán)境。
簡妙歸的具體工藝是
a) 將包埋有^7W^fe物的微球^A層析柱中，層析柱出口端覆以25g[^離昌，防止微球沖出，且 能使長出微球的敝物隨:t^^f出層析法
b) 將層析根^A鵬薪箱中，，薪勘瓦的滅菌湖7jC腦斤腿口^A，働敏物生長 所需的培養(yǎng)基；
c) 在28T:下遊彭歸5周，定MSi樣觀^W內(nèi)m^物的生長狀況，鵬內(nèi)有單克隆 :形鵬，
4) 長有單克隆麟微球的AI娜助噹麟
a) 將近自然餅歸后繊繊釋至5X103個(gè)/ml，使吸取l嫩升的離液時(shí)，含有5葉W，但 其中僅含一^:有單克隆的 ;用掃啦將J^^^働瞎IJ96孑版中；
b) 96孑版中加入150微升的R2A培養(yǎng)基，使單克,1生長，獲得大量^^辦屯i識(shí)。
權(quán)利要求
1、一種微生物的高效培養(yǎng)裝置，其特征在于包括用于維持微生物生長溫度的溫控培養(yǎng)箱(1)、其內(nèi)的擱板(3)上有多個(gè)培養(yǎng)基瓶(2)，下擱板(7)上有相應(yīng)個(gè)數(shù)的層析柱(6)，其間憑借作為輸送培養(yǎng)基的管道的軟管(4)連通，在軟管(4)上設(shè)有控制培養(yǎng)基流速的流速控制器(5)，且層析柱(6)的出口端覆以25微米的篩絹(8)，并經(jīng)由軟管(4)接入廢液收集瓶(9)上。
2、微生物的高效培養(yǎng)分選方法，其基本工藝如下1) 微生物的采集和濃縮運(yùn)用離心和濾膜過濾相結(jié)合的方法將采于自然環(huán) 境的微生物濃縮后，獲得濃度至少為10e個(gè)/ml的微生物用于包埋；2) 微生物的包埋將上述濃縮得到的微生物樣品采用膜乳化法制備微球， 以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)微生物進(jìn)行包埋；3) 包埋微生物的近自然條件培養(yǎng)將上述微球包埋的單個(gè)微生物在模擬微 生物原位生長環(huán)境的培養(yǎng)裝置中進(jìn)行培養(yǎng)，得到長有單克隆的微球；4) 長有單克隆微球的分選和加富培養(yǎng)采用人工分選或流式細(xì)胞儀分選出上一步驟中培養(yǎng)得到的長有單克隆的微球，并進(jìn)一步加富培養(yǎng)以獲得大 量微生物純培養(yǎng)。
3、如權(quán)利要求2所述的微生物的高效培養(yǎng)分選方法，其特征在于微生物包埋的具體工藝步驟如下a) 用生理鹽水配制無菌天然高聚糖包埋材料溶液一一1%至5%的海藻 酸鈉溶液或1%至5%的低凝固點(diǎn)瓊脂糖溶液或0.5%至5%的結(jié)冷膠溶液；b) 將濃縮后的微生物加入上述包埋材料溶液中，且加入微生物的量為 包埋材料所形成微球數(shù)量的1/10 1/100，混合均勻，得到微生物和聚合物 混合溶液；c) 將微生物和聚合物混合溶液按小于1: 5比例加入含司盤80的石蠟油 或植物油中，攪拌均勻，再用膜乳化法制備成包含粒徑均一微滴的乳液；d) 再采用相應(yīng)的固化方法，將上述乳液中的微滴固化成微球，用無菌 鹽水洗滌微球，直至將石蠟油或植物油中的油完全洗去，即得到包埋有單 個(gè)微生物的微球。
4、 如權(quán)利要求2所述的微生物的高效培養(yǎng)分選方法，其特征在于微球包埋的單個(gè)微生物近自然條件培養(yǎng)的具體工藝步驟是a) 將得到的包埋有單個(gè)微生物的微球裝入層析柱；b) 將層析柱放入溫控箱中，培養(yǎng)基瓶內(nèi)裝入的無菌寡營養(yǎng)培養(yǎng)基從層 析柱進(jìn)口端通入，出口端覆以25微米濾膜以防止微球流出，并使長出微球的微生物隨培養(yǎng)液排除層析柱；c) 在近自然寡營養(yǎng)條件培養(yǎng)直至包埋有單個(gè)微生物的微球內(nèi)有單克隆形成。
5、 如權(quán)利要求2所述的微生物的高效分選方法，其特征在于所述的長有單克隆微球的人工分選方法a) 將近自然條件培養(yǎng)后的微球稀釋至103~104個(gè)/巾1，使吸取10微升的 稀釋液時(shí)，其中僅含一個(gè)長有單菌落的微球，用排槍將上述稀釋液加到96孔 板中；b) 96孔板中加入100 200微升的加富培養(yǎng)基，使單克隆進(jìn)一步生長， 獲得大量微生物純培養(yǎng)。
6、 如權(quán)利要求2所述的微生物的高效分選方法，其特征在于所述的長有單克隆微球的流式細(xì)胞儀分選方法如下-a) 用LIVE/DEAD試劑盒中的SYTO-9染料將長有菌落的微球經(jīng)行染色 后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，將長有單克隆的微球分選到96孔板中；
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物的高效培養(yǎng)分選方法和培養(yǎng)裝置。其特征是它包括溫控培養(yǎng)箱，其內(nèi)的上擱板有多個(gè)培養(yǎng)基瓶，下擱板上有相應(yīng)個(gè)數(shù)的層析柱，其間有軟管連通，在軟管上設(shè)有流速控制器，且層析柱的出口端覆以25μm篩絹，并經(jīng)由軟管接入廢液收集瓶。高效培養(yǎng)分選方法如下1)微生物的采集和濃縮；2)微生物的包埋；3)包埋微生物的近自然條件培養(yǎng)；4)長有單克隆微球的分選和加富培養(yǎng)。本方法能夠高效的培養(yǎng)和分選微生物，為獲得微生物純培養(yǎng)特別是微生物新種提供了新途徑，并大大減少了傳統(tǒng)方法獲取微生物純培養(yǎng)的工作量，為微生物的16rDNA測序，確定其種屬以及研究微生物的基因功能和代謝產(chǎn)物等下游研究奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12M1/00GK101629136SQ20091001748
公開日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月6日
發(fā)明者冀世奇, 劉晨光, 張曉華, 張秀明, 天 肖, 苑 趙 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)