專利名稱：一種細菌篩選和鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌篩選和鑒定方法，屬于生化鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細菌篩選和鑒定應用最廣泛、最基礎的方法是生化鑒定方法。目前的細菌生化篩選和鑒 定方法所涵蓋的分類單元數(shù)量較少， 一般僅有幾十種，其中未囊括一些重要的細菌種類，如 大腸埃希氏菌0157:H7 、椰毒假單胞酵米面亞種(BwA/wWe〃'a cocoww"a附subsp. /"r/"o/er/^"to朋)等；而且，隨著細菌名稱的改變，有些篩選和鑒定方法對細菌的命名已經(jīng) 不夠準確；此外，多數(shù)篩選和鑒定方法都需要先進行繁瑣的染色、氧化酶等試驗。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述篩選和鑒定方法存在的缺點，本發(fā)明的目的是提出一種更全面、更準確、更便 捷的細菌篩選和鑒定方法。
本發(fā)明技術(shù)方案的步驟如下
(1) 確定細菌篩選和鑒定所需生化試驗項目。選用常用的、方便配制的生化試驗項目， 舍棄操作繁瑣的諸如硝酸鹽還原、苯丙氨酸脫氨酶等常用試驗。另外，考慮到鑒定時可以借 用商業(yè)化生化鑒定條，因此盡量使用商業(yè)化生化鑒定系統(tǒng)中包括的生化項目。最終確定如下
20項e-半乳糖苷酶(ONPG)、精氨酸雙水解酶(ADH)、賴氨酸脫羧酶(LDC)、鳥氨 酸脫羧酶(ODC)、檸檬酸鹽利用(CIT)、硫化氫產(chǎn)生(H2S)、尿素酶(URE)、噴哚(IND)、 伏普(VP)、明膠液化(GEL)、甘露醇(MAN)、肌醇(INO)、山梨醇(SOR)、鼠李 糖(RHA)、蔗糖(SAC)、蜜二糖(MEL)、苦杏仁苷(AMY)、阿拉伯糖(ARA)、乳 糖(LAC)、木糖(XYL)。
(2) 搜集各種菌株上述20項生化試驗項目的陽性概率。通過查閱權(quán)威的鑒定手冊和檢 測標準，如《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第九版)、《伯杰氏細菌系統(tǒng)手冊》(第二版)、
《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第三版)、《臨床微生物學手冊》(第七版)等，最終獲得288 個分類單元的20項生化試驗結(jié)果，該288個分類單元如下Jcz'"etoZ)a"er 6awma朋/i/A
5w/wowz'aWa subsp. ac/ 尸owoge"es' 乂ero附cwas sfl/ no"/cf(ia subsp. mflwowcz'c a' 4e "owo"ay*9r3Y/s>s/.y ica、 8tyscQ、 ^7e&5/Q//a sqysca ornithine P5sitivp A7e6.yz>//Q / /awn.co/a、
w《/5/7iser/、z/5、57va: iww0cwa、i/53r/a j*ee//gen.、.zi.y、57.a Ssra.y/、z/.s-、c5e//a <wwg^NY/arws、z/5-、ow。//a/ e/ag/w5, Moe//e,e〃a M^coweraz、, Morgawe//" worg"m7, Morga"e〃"附org"m7 subsp. ^owz7,
尸a"/oea Wew"廠ri/,尸fl"/oea wre^fovon7,尸a^ew/^〃a 尸as,ewre/Z" awaris，尸"Wewre〃a
Pa.stewre//" (ymp/^"g/"'c/z、, ^ay/ew/^//"附"z'r/Z, Pastew/^//" subsp. ^as^ewre//"
mw/foc/c/a subsp. ww/focz't/a' mw/foaW" subsp. se/ ric",尸ay/^wre,/" / wew附o/n9pic",
尸ay/^w/^Z/" 尸"欣,〃",e加^'"/s, 尸"5^wre〃" /V 欲wre〃" vo/"wrfw附,
subsp. d"奶5e/", 尸/;ofo6ac/^n'ww z7iq/ z、car/w/7 ， P/zo/^6ac/eriw附 /e/ogw"f/z/， 尸Aofo6""er/w附/7/w^/ /zorew附，尸Ao/or/ "6^/ws 尸/zo,wAa》dz^ /w附/"esre"i", /Vej/o/wo"ay j/z/ge/Zo/^fey,
/V"g7'" ybwn'wm,尸r0&wA' m&a6///51，尸rofew5附jKxoy^cfe/w, Pn^ew5 / e"we〃', iVo/ews vw/g"n、'尸n vkfewa'" a/ca/,ybc/e/iy， /Vov/tfe"".a Z^im6"c/zae, iVov/t/e"ci" re/fgen.，尸n9v/dewd" rwW/g/aw/z',/Vov/^fewc/a j/w"廠/i/, i^ewcfo附oway "erwg/was^/ /^ewdo/wowas1 T7wo尸^ycew5/P / wrtd", i^ewcfowowa 5fwfem'， 7 "/me〃" a《waf船，ASaZ/m'vz力n'o cayfeo/"， subsp. an'^ w"e,
Sa/mc^Z/a c/zo/erae纖、subsp. c/zo/era^t^, c/zo/era^w^y subsp. d/"r/z(9wae,
SW，we//(3 c/zo/eraes^ subsp. /zow加"e, c/20/erae，、 subsp. zW/ra'
c/zo/e/Y/eyw^ subsp. sa/"附ae, (Sa/mowe//" Ga///w"rww, iSa//wowe//a尸a廠a(y/ /// X, Sa/w^oweZ/a
ybwrtcc^", 5fe/r""》gr/附es//, 5fe 7Y7ria marcescews, 5fe/T"/ia ocfon)fer", S^/r"ria; fy/ww^u'c"， Se^7Y^/a
戸/;^ c/ews,幼扭〃at , iS7n'^〃a 6o>v&'，幼扭〃a咖e她r^， 57z扭/Za^Zexwr/,幼/ge/," so"腦'，iS/ /2/wgo6acfen'wm ww/rivo/*w/n, iSj7/n>igomo"as* 77awc/附oZ //^, iS^wofrcp/zo附oway wa/fo; / ///",
F 6n'o /oge/， 附edzYem3weZ， me"c/zm'A:ovz7, W6"'o附少"7〖'WZ rz'o附/wicws' F 6r^
w"/^egew51， WZ^/o "/gn》w/c7/r/rt^fo， W^7'o WZv/o t 〃'ew^r/", W力〃'oj^^她6ercw/m/5v lfera'm'" raMez', Ifera'm'" 1bfe脫〃a reg^m^w廣ge/。
(3) 收集288個分類單元名稱以及對應的20項生化試驗結(jié)果，建立細菌篩選和鑒定數(shù)據(jù)庫，計算各分類單元的若干項生化試驗陽性概率；
(4) 確定生化試驗項目的優(yōu)先順序。不同生化試驗的陽性率大多數(shù)情況下是不相同的，這就意味著每項生化試驗對鑒別細菌的分辨能力是有差異的。采用蒙特卡羅模擬
(Monte-Carlo simulations)方法來確定20項生化試驗項目的選取順序。具體步驟如下首先將288個分類單元的陽性概率為0和1的值全部分別取近似值0.01和0.99，然后將各分類單元對應的20項生化試驗項目陽性概率相乘，即為該分類單元的出現(xiàn)頻率，各生化試驗項目陽性概率對于出現(xiàn)頻率的重要性程度即近似反應了各生化試驗項目陽性概率分布對于鑒定結(jié)果可能性的重要性程度。20項生化試驗項目對于鑒定的重要性程度由高到低依次為SOR、ODC、ARA、 GEL、 RHA、 IND、 MEL、 VP、 SAC、 XYL、 LDC、 LAC、 ADH、 MAN、 URE、 H2S、INO、 ONPG、 CIT 、 AMY。這一順序僅是在本發(fā)明中各分類單元20項生化試驗項目陽性概率基礎上獲得的，僅適用于本發(fā)明。
(5) 選定待鑒定細菌的若干生化試驗項目，進行生化試驗。盡可能獲得較多的生化試驗項目的陽性概率可以使得細菌的篩選和鑒定結(jié)果更加準確?？梢允褂蒙虡I(yè)化鑒定條，也可以購買生化管或自行配制鑒別性培養(yǎng)基進行生化試驗。
(6) 在獲得待鑒定細菌生化試驗結(jié)果"陽性"、"陰性"和"未知"以后，開始比較288個分類單元與待鑒定細菌的可能性和相似性。首先將陽性概率轉(zhuǎn)化為生化符合率，即待鑒定細菌選定的生化試驗結(jié)果為陽性時，對應的分類單元的陽性概率予以保留，如果結(jié)果為陰性時，分類單元的陽性概率被1減去后予以保留。然后計算分類單元的可能性，即各分類單元各生化試驗的生化符合率相乘，得出各分類單元的出現(xiàn)頻率，也就是可能性。最后計算各分類單元的相似性，即各分類單元的出現(xiàn)頻率除以該分類單元生化全部符合時的出現(xiàn)頻率。相似性表明待鑒定細菌與數(shù)據(jù)庫中各分類單元的相似性程度，相似性越高(越接近1)表明與數(shù)據(jù)庫中分類單元越接近。相似性為1表明待鑒定菌株的生化結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分類單元最可能的結(jié)果一致。如果生化試驗結(jié)果"未知"時，不對分類單元該生化試驗項目陽性概率進行計算，從而不影響最終篩選和鑒定結(jié)果。
與其他細菌篩選和鑒定方法相比較，本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)本發(fā)明收集整理了 288個分類單元的20項生化試驗項目的陽性概率數(shù)據(jù)，可以對288種細菌進行鑒定或篩選，是目前手工生化鑒定系統(tǒng)中包括細菌種類最多的。本細菌篩選
6和鑒定方法包括288個分類單元，分類單元數(shù)量遠多于API 20E、 Enterotube II、 Micro-ID、Oxi-Ferm II等常見的手工商業(yè)化生化鑒定條的數(shù)據(jù)庫種類，且多于API20E和API20NE數(shù)據(jù)
庫包括分類單元數(shù)之和。囊括了國家標準和檢驗檢疫行業(yè)標準涉及的大部分細菌檢測項目，本細菌篩選和鑒定方法比手工商業(yè)化方法豐富了各屬內(nèi)細菌的種類，特別是增加了很多腸桿菌科和弧菌科種類。
(2) 本發(fā)明在進行細菌篩選和鑒定時，不需要提前對待鑒定微生物做染色、氧化酶、TSI等粗篩試驗，而可以直接選取生化項目對純培養(yǎng)物做篩選和鑒定， 一般就能獲得較理想的鑒定結(jié)果。當結(jié)果中的幾個分類單元歸屬不同大類時，如鑒定結(jié)果為埃希氏菌和芽孢桿菌，再對待鑒定菌株補充革蘭氏染色、氧化酶等粗篩試驗，判斷其歸屬。多數(shù)情況下，鑒定結(jié)果里的菌都是同一大類的菌，不需要補充染色、氧化酶等測試，這樣就省略了前期繁瑣的染色等工作。
(3) 本發(fā)明在某些生化試驗結(jié)果"未知"時不對該項目進行計算，使生化項目"未知"時的取值不影響最終訃算，這樣，當缺少某項生化試驗或無法辨別此項的結(jié)果是陽性還是陰性時，仍可以對細菌進行篩選和鑒定。所以本發(fā)明可以任選幾項生化試驗項目自由組合完成細菌鑒定或篩選，給使用者提供了靈活的使用方式和自由發(fā)揮的空間。
(4) 本發(fā)明不但可任選生化反應組合，而且根據(jù)蒙特卡羅模擬靈敏度分析結(jié)果推薦了20項生化選取的優(yōu)先順序。這一獨創(chuàng)的優(yōu)先順序可以科學的指導檢測人員選用生化項目，避免檢測人員盲目選用生化項目。
具體實施例方式
下面通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明。
實施例待鑒定細菌A的篩選和鑒定1、生化試驗
首先確定待鑒定細菌A的生化試驗項目。在本實施例中隨機選定鳥氨酸脫羧酶(ODC)、尿素酶(URE) 、 H引哚(IND)和伏普(VP)四項生化試驗舉例說明。獲得生化試驗結(jié)果后，計算288個分類單元與待鑒定細菌A的可能性和相似性，由于無法將288個分類單元的陽性
概率--列出，所以選定分類單元中的A7e6力e〃a ow/// '"o/>^'ca、 A^fc/e/Za ojcjfoai、
a/g/w /聲/cws三種細菌為例來進行說明。
待鑒定細菌A生化試驗結(jié)果禾B A7e&Ze//a on^7W"o/j"co、 X/e&wW/fl c 7tocfl、 FifZWo
fl/g/"0fyrtO^三種細菌陽性概率結(jié)果如表1所示表1生化試驗結(jié)果和陽性概率
菌名ODCUREINDVP
待鑒定菌A+—+—
0.990.840.600.99
0.010.700.980.90
0.810.010.930.67
2、結(jié)果計算
(1)陽性概率轉(zhuǎn)化為生化符合率對陽性結(jié)果對應的生化結(jié)果陽性概率予以保留，對陰性結(jié)果對應的生化結(jié)果陽性概率被
l.O減去后予以保留，生化符合率結(jié)果如表2所示
表2生化符合率
菌名ODCUREINDVP
0.990.160.600.01
0.010.300.980.10
0.810.990.930.33
(2)計算鑒定結(jié)果可能性值
上表中每行中數(shù)字相乘，計算每種菌的出現(xiàn)頻率。wmA/"o/Wca、 K/efczW/aoxWoca、 F/^/ofl/gi"o/j^OAy的出現(xiàn)頻率分別為0.0009504、 0.0002904、 0.2461031。每種菌的出現(xiàn)頻率除以全部菌的出現(xiàn)頻率，獲得每種菌的鑒定可能性值?；胑ZmW/a om"/n'"o/,'ca: 0.0009504/ (0.0009504+0.0002904+0.2461031) =0.4%K/efc/e〃aoxytoc": 0.0002904/ (0.0009504+0.0002904+0.2461031) =0.1 %P76n'o a/g/"o/,'a^: 0.2461031 / (0.0009504+0.0002904+0.2461031) =99.5%鑒定結(jié)果按可能性由高到低排列為^力n'o "/gz7w(y"cw、尺/efc/e〃a or""W"o/少rica、
(3)計算鑒定結(jié)果相似性值每種菌的出現(xiàn)頻率除以該菌生化全部符合時的出現(xiàn)頻率即為相似性。相似性表明待鑒定細菌與數(shù)據(jù)庫中分類單元的相似性程度，相似性越高(越接近1)表明與數(shù)據(jù)庫中分類單元越接近。相似性為1表明待鑒定菌株的生化結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分類單元最可能的結(jié)果一致。相似
性計算如下
待鑒定細菌A與K/eZwW/a ow油/"ofyfe"的相似性0.0009504 / (0.99x0.84x0.60x0.99)=0.19%
待鑒定細菌A與/:/eZM7W/a 的相似性0.0002904 / (0.99x0.70x0.98x0.90) =0.05
%
待鑒定細菌A與F/6r" a/g/"o/,'cm的相似性0.2461031 / (0.81x0.99x0.93x0.67)二49.25
%
3、結(jié)果顯示
在EXCEL表格數(shù)據(jù)庫的結(jié)果列表中分別列出分類單元名稱、可能性值及其對應的相似 性值結(jié)果列表，可以自動顯示可能性值大于0.05的最多8個分類單元名稱和其相似性值。待 鑒定細菌A與A7efe7Wto or""fe力ofyrica、 A7efes7'e//a ar_ytoc"、 a/g7力o(yrtcw三禾中細菌的可
能性及相似性結(jié)果如表3所示
表3可能性及相似性結(jié)果
分類單元(菌學名)可能性相似性
99.549.25
0.40.19
0.10.0權(quán)利要求
1. 一種細菌篩選和鑒定方法，其特征在于它包括如下步驟(1)確定細菌篩選和鑒定所需生化試驗項目；(2)搜集各種菌株生化試驗項目的陽性概率；(3)建立細菌篩選和鑒定數(shù)據(jù)庫，計算各分類單元的若干項生化試驗陽性概率；(4)確定生化試驗項目的優(yōu)先順序；(5)選定待鑒定細菌的若干生化試驗項目，進行生化試驗；(6)在獲得待鑒定細菌生化試驗結(jié)果后，比較各分類單元與待鑒定細菌的可能性和相似性，從而獲得鑒定或篩選結(jié)果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌篩選和鑒定方法，其特征在于步驟(1)中所述的生化試驗項 目包括e-半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、檸檬酸鹽利用、 硫化氫產(chǎn)生、尿素酶、吲哚、伏普、明膠液化、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、 蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、乳糖、木糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌篩選和鑒定方法，其特征在于步驟(4)中所述的確定生化試 驗項目的優(yōu)先順序的方法是采用蒙特卡羅模擬來確定生化試驗項目的選取順序。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細菌篩選和鑒定方法，屬于生化鑒定技術(shù)領(lǐng)域。它包括如下步驟(1)確定細菌篩選和鑒定所需生化試驗項目；(2)搜集各種菌株生化試驗項目的陽性概率；(3)建立細菌篩選和鑒定數(shù)據(jù)庫，計算各分類單元的若干項生化試驗陽性概率；(4)確定生化試驗項目的優(yōu)先順序；(5)選定待鑒定細菌的若干生化試驗項目，進行生化試驗；(6)在獲得待鑒定細菌生化試驗結(jié)果后，比較各分類單元與待鑒定細菌的可能性和相似性，從而獲得鑒定或篩選結(jié)果。本發(fā)明在進行細菌篩選和鑒定時，不需要提前對待鑒定微生物做染色、氧化酶、TSI等粗篩試驗，而可以直接選取生化項目對純培養(yǎng)物做篩選和鑒定，一般就能獲得較理想的鑒定結(jié)果。
文檔編號C12Q1/04GK101487039SQ20091001399
公開日2009年7月22日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者劉云國, 吳振興, 岳志芹, 房保海, 丹 王, 濤 袁, 賈俊濤, 趙麗青 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心