專利名稱：一種弱毒熒光假單胞菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫學領域，具體的說是一種弱毒熒光假單胞菌及其在病 害免疫防治中的應用。
背景技術：
微生物病害為阻礙我國及世界水產養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素。嗜水氣單胞
菌(yleroMMas力ydrop/]fh )、魯氏耳卩爾森氏菌(Fersim'a rucleri)以及 熒光假單胞菌(PseW側朋asn"oresce;^)為常見的養(yǎng)殖水產生物病原菌。 其中嗜水氣單胞菌能夠感染人類、動物(兩棲類、哺乳類等)、鳥類以及魚 類，是一種典型人/畜/魚共患性病原菌。魯氏耶爾森氏菌主要危害鮭魚、 鱒魚以及鰱魚和鏞魚，造成腸炎紅嘴病(Enteric Redmouth disease)。熒
光假單胞菌能夠感染多種淡水魚類，包括草魚、鯽魚、青魚、鯉魚等，造 成赤皮病。另外，該菌亦能感染蝦類，引起熒光病(Fluorescent disease)。 目前對于這些細菌病的免疫防治主要是運用單一性的滅活疫苗，即每種疫 苗針對一種病原，而同時針對這三種病原的交叉保護疫苗尚未有報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種弱毒熒光假單胞菌及其免疫應用方法。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術方案為
一種弱毒熒光假單胞菌所述弱毒熒光假單胞菌為熒光假單胞菌TSSM1, 其于2008年12月25日，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心CGMCC,保藏編號為2828。
所述所述弱毒熒光假單胞菌熒光假單胞菌TSSM1，具有對嗜水氣單胞菌 (4erofl'o;Ms /3ydrop/〗2 a )、魯氏耳卩爾森氏菌(Fem'iiia rt'ci:erj')以及熒 光假單胞菌(Pseudofflonas n"orescens)感染具有交叉保護效應。
將所述熒光假單胞菌TSSM1,于28。C在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD刷為1-1.2 后，離心收集菌體，在經PBS洗滌后直接注射魚類。
將所述熒光假單胞菌TSSM1于28。C在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD固為0. 8 -l后離心收集菌體，懸浮于海水中至終濃度為lxl08cfu/ml;而后將所要免 疫的魚類置于該含有熒光假單胞菌TSSM1的海水中浸泡15小時。 本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1. 交叉免疫保護性。本發(fā)明的弱毒熒光假單胞菌疫苗對鲆鰈類具有一 定的短期感染能力，但不能誘發(fā)產生疾病癥狀，因而可以作為活疫苗使用， 達到同時保護魚類抵御嗜水氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌以及熒光假單胞菌 三種菌的感染。
2. 高^護率。本發(fā)明的弱毒熒光假單胞菌疫苗對上述三種病原菌侵染的免疫保護效率為注射法，100%; 浸泡法，83 - 89 %。
3. 應用簡單。本發(fā)明的疫苗制備過程簡單，只需簡單、常規(guī)的細菌培 養(yǎng)，不涉及蛋白質提取、純化等。
4. 省時省力。本發(fā)明的疫苗只需一次免疫，不需加強免疫(boost )。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例 描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。 實施例1
疫苗的免疫應用-注射法
步驟1 )疫苗制備。將弱毒熒光假單胞菌TSSM1在LB液體培養(yǎng)基中過 夜培養(yǎng)；取0. lml過夜后的培養(yǎng)液，將其加入10ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基 中，于28。C下轉速160rpm搖動培養(yǎng)至OD6。。為1-I.2,而后將細菌培養(yǎng)液 離心(5000g， 4°C, 10min),收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為4xl08 cfu/ml，即為疫苗制備液。
所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0. 5%酵母粉，1.0% 氯化鈉，97. 5%蒸餾水；所述PBS組成成分按重量百分比計0.8% NaCl, 0. 02%KC1, 0. 35H Na2HP04. 12H20， 0. 024% NaH2P04;所述弱毒熒光假單胞 菌TSSM1其于2008年12月25日，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心CGMCC,保藏編號為2828,分類命名熒光假單胞菌
步驟2 )疫苗的免疫注射。將132條牙鲆(每條重約14g )隨機分為6 組，每組22條。將這4組分別命名為A, B, C， D， E和F。將A、 B和C 組的每條魚分別腹腔注射100 ul上述步驟1 )疫苗制備液。將D、 E和F 組的每條魚分別腹腔注射100 ul PBS。
步驟3)嗜水氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌和熒光假單胞菌懸液的制備。 在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)嗜水氣單胞菌AH1. 927、魯氏耶爾森氏菌YR29473 和熒光假單胞菌TSS1至OD,為0. 6,然后離心(5000g, 4°C) 10min。收 集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度分別為5xl07cfu/ml(AH1.927)、 3xl07 cfu/ml (YR29473 )和1 x 108 cfu/ml (TSS1),即為嗜水氣單胞菌、魯氏耶 爾森氏菌和熒光假單胞菌懸液。
所述嗜水氣單胞菌AH1. 927購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心CGMCC (編號1. 927 );熒光假單胞菌TSS1保存于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No.2329;魯 氏耶爾森氏菌YR29473購于美國標準生物品收藏中心(編號ATCC29473)。 步驟4)疫苗的免疫保護效應檢測。在步驟2)免疫注射后的第30天， 用上述步驟3)的嗜水氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌和熒光假單胞菌懸液分別 腹腔注射步驟2)的A和D、 B和E、 C和F組魚，每條魚的注射量為100ul。 在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目A組，0條；B組，0條；C組，0條，D組，14條，E組， 18條，F(xiàn)組，18條。故TSSM1疫苗通過注射法傳遞時，其針對嗜水氣單胞 菌、魯氏耶爾森氏菌和熒光假單胞菌感染的免疫保護效率為100%。 實施例2 疫苗的免疫應用-浸泡法
步驟1 )疫苗浸泡液的制備。在LB培養(yǎng)基中于28°C培養(yǎng)TSSM1至0D6。
為0.8-1,然后離心(5000g, 4°C) 10 min。 收集菌體，將其懸浮于普 通海水中至終濃度為lx108 cfu/ml，即為疫苗浸泡液。
步驟2)疫苗的免疫浸泡。將132條牙鲆(同實施例1)隨機分為6組， 每組22條。將這4組分別命名為A, B, C, D, E和F。將A、 B和C組的魚 在步驟l)疫苗浸泡液中浸泡15小時；將D、 E和F組魚于普通海水中浸泡 15小時。
步驟3)嗜水氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌和熒光假單胞菌懸液的制備。 同上述實施例l步驟3)。
步驟4)疫苗的免疫保護效應檢測。在步驟2)免疫浸泡后的第30天， 用上述步驟3)的嗜水氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌和熒光假單胞菌懸液分別 腹腔注射步驟2)的A和D、 B和E、 C和F組魚，每條魚的注射量為100ul。 在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組 魚的總死亡數(shù)目A組，2條；B組，3條；C組，2條，D組，14條，E組， 18條，F(xiàn)組，18條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS):
RPS = 100x (1 -免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比) 由此得出TSSM1疫苗通過浸泡法傳遞時，其針對嗜水氣單胞菌、魯氏耶 爾森氏菌和熒光假單胞菌的免疫保護效率為分別為85. 7% ， 83. 3%和88. 9 %。
權利要求
1. 一種弱毒熒光假單胞菌，其特征在于所述弱毒熒光假單胞菌為熒光假單胞菌TSSM1，其于2008年12月25日，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為2828。
2. —種按權利要求1所述的弱毒熒光假單胞菌的應用，其特征在于 所述所述弱毒熒光假單胞菌熒光假單胞菌TSSM1，具有對嗜水氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌以及熒光假單胞菌感染具有交叉保護效應。
3. 按權利要求2所述的弱毒熒光假單胞菌的應用，其特征在于將所 述熒光假單胞菌TSSM1,于2rC在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD,為1 - 1. 2后， 離心收集菌體，在經PBS洗滌后直接注射魚類。
4.按權利要求2所述的弱毒熒光假單胞菌的應用，其特征在于將 所述熒光假單胞菌TSSM1于28'C在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD,為0. 8 - 1后離 心收集菌體，懸浮于海水中至終濃度為1x10s cfu/ml;而后將所要免疫的 魚類置于該含有熒光假單胞菌TSSM1的海水中浸泡15小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學領域，具體地說是一種弱毒熒光假單胞菌及其免疫應用方法。具體為所述弱毒熒光假單胞菌對嗜水氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌以及熒光假單胞菌感染具有交叉免疫保護效應；其免疫應用方法包括注射法和浸泡法；其中注射法為將在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的弱毒熒光假單胞菌直接腹腔注射魚類，浸泡法為將魚類于含有弱毒熒光假單胞菌的疫苗浸泡液中浸泡一定時間。本發(fā)明所得疫苗不但同時對三種不同的病原菌有高效交叉保護效應，而且制備及免疫操作簡單，不需要任何純化過程。
文檔編號C12N1/20GK101475921SQ20091001387
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月16日 優(yōu)先權日2009年1月16日
發(fā)明者黎 孫, 王煥然 申請人:中國科學院海洋研究所