專利名稱：用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中外源蛋白質(zhì)表達(dá)的昆蟲(chóng)衍生啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明可以涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及源自昆蟲(chóng)中hexamerin家族基因的調(diào)控多核苷酸序列(如啟動(dòng)子)，和它們用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞和昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中外源蛋白質(zhì)表達(dá)的用途，例如使用桿狀病毒表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是通用的和廣泛地用來(lái)產(chǎn)生異源的(天然的和重組)蛋白質(zhì)。這個(gè)系統(tǒng)被普遍地接受作為最強(qiáng)的和通用的系統(tǒng)之一以生產(chǎn)任何尺寸的重組蛋白質(zhì)。它基于兩個(gè)主要的特性獲得高含量的蛋白質(zhì)表達(dá)和恰當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊以變得生物活性，同時(shí)出現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的重要的翻譯后修飾。另外，這個(gè)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)時(shí)間較短，重組病毒的遺傳穩(wěn)定性非常高。桿狀病毒基因組包含兩個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子，稱為多角體蛋白啟動(dòng)子(PL)和啟動(dòng)子ρ10(ρ10蛋白質(zhì))，其中多角體蛋白啟動(dòng)子(pL)是高等生物中已知的最強(qiáng)啟動(dòng)子。PL啟動(dòng)子可用于控制幾乎任何基因的表達(dá)。與基于轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的任何其他先進(jìn)生產(chǎn)系統(tǒng)相比，更快速和更便宜地設(shè)計(jì)桿狀病毒用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)。盡管如此，先前的市售可得的啟動(dòng)子具有一些缺點(diǎn)，如它們促進(jìn)基因表達(dá)的時(shí)期非常晚。那時(shí)， 細(xì)胞機(jī)制被大大影響，并且隨后在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)率可能被影響，由于不完全的加工和聚集。這些限制可以是由于寄主細(xì)胞因子隨著病毒感染進(jìn)行而惡化。為了解決那樣問(wèn)題，本發(fā)明建議使用具有穩(wěn)定的表達(dá)的早期啟動(dòng)子，其至少與多角體蛋白啟動(dòng)子一樣強(qiáng)，作為非常令人感興趣的選擇以抵消寄主細(xì)胞分解的影響，同時(shí)獲得異源蛋白質(zhì)的高表達(dá)水平。本發(fā)明希望強(qiáng)調(diào)這樣的事實(shí)幼蟲(chóng)(不成熟的)向成蟲(chóng)(成熟)形式的轉(zhuǎn)變是通過(guò)在各種組織(昆蟲(chóng)變形發(fā)育)中激活和抑制許多基因?qū)崿F(xiàn)的。在變形相關(guān)蛋白質(zhì)中，存在被稱為hexamerin的家族，其在最后的齡蟲(chóng)期間以非常高的水平表達(dá)。這些蛋白質(zhì)主要是血淋巴儲(chǔ)存蛋白質(zhì)，其在后幼蟲(chóng)發(fā)育期間被使用。在五齡期的最初48小時(shí)期間能夠觀察到hexamerin的最高水平，其為該時(shí)期后的大約4倍(圖1)。在本發(fā)明中已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于外源蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子家族，其脫離了編碼上述幼蟲(chóng)蛋白質(zhì)家族的序列。因此，本發(fā)明提供了啟動(dòng)子PBl (SEQ ID NO 1)和pB2 (SEQ ID NO :2)，其與現(xiàn)有技術(shù)中使用的啟動(dòng)子相比更早期和更強(qiáng)。在本發(fā)明中已經(jīng)分離了在特定的進(jìn)展幼蟲(chóng)階段驅(qū)動(dòng)重要昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子。它們來(lái)自編碼幼蟲(chóng)中蛋白質(zhì)hexamerin的序列，并且可以用于構(gòu)造任何表達(dá)載體(如桿狀病毒表達(dá)載體)以便在多種昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白質(zhì)，優(yōu)選來(lái)自草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda)的sf9或sf21細(xì)胞。與構(gòu)成這些新的啟動(dòng)子類似的調(diào)節(jié)序列已經(jīng)在鱗翅目幼蟲(chóng)中被鑒定，但之前還未曾用于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
簡(jiǎn)要說(shuō)明由此，本發(fā)明提供了來(lái)自調(diào)節(jié)hexamerin家族基因表達(dá)的序列的調(diào)控多核苷酸序列，如pBl(SEQ ID NO 1)和/或pB2(SEQ ID NO 2)。這些蛋白質(zhì)在五齡期期間顯示出最高的表達(dá)，在該幼蟲(chóng)發(fā)育期的最初48小時(shí)候以非常高的百分比，呈現(xiàn)出在短時(shí)期內(nèi)非?？焖俚姆e聚(圖1)。這些特征暗示這些蛋白質(zhì)的表達(dá)是由強(qiáng)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，這些啟動(dòng)子可用于形成更有效率的桿狀病毒或任何其它表達(dá)載體，并且因此用于優(yōu)化異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。 在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)情況下，一旦蛋白質(zhì)集中在分泌途徑中，則啟動(dòng)子的早期活性是特別相關(guān)的，如果其他方式的話，則會(huì)受到細(xì)胞翻譯后機(jī)制和分泌機(jī)制在桿狀病毒感染的非常晚期改變的影響。本發(fā)明的啟動(dòng)子的序列來(lái)自調(diào)節(jié)hexamerin家族基因(BJHSP1和BJHSP2)表達(dá)的序列，但是具有一些不包含在所述hexamerin家族基因原始調(diào)控核苷酸序列中的突變。所述·分離自粉紋夜蛾(Trichoplusiani) (T. ni)幼蟲(chóng)并通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定為在SOKDa的帶中(圖2)。一旦蛋白質(zhì)被鑒定，則分離編碼它們的基因以及包含它們的各自啟動(dòng)子的上游序列。用于擴(kuò)增各原始的啟動(dòng)子的引物在該專利中被指定。特征為SEQ ID NO :3和4的引物用于擴(kuò)增原始的啟動(dòng)子，其最終起源于啟動(dòng)子PBl (SEQ ID NO :1)。特征為SEQ ID NO 3 和4的引物5和6的引物用于擴(kuò)增原始的啟動(dòng)子，其最終起源于啟動(dòng)子pB2。本發(fā)明的啟動(dòng)子的主要優(yōu)點(diǎn)，具體地pB2，是這樣的啟動(dòng)子，與現(xiàn)在在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中使用的已知的非常晚期啟動(dòng)子相比，它們產(chǎn)生更早和更強(qiáng)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括本發(fā)明的啟動(dòng)子pBl和pB2(優(yōu)選pB》與任何其它啟動(dòng)子例如PL或plO (優(yōu)選pL)的組合。令人驚訝地，當(dāng)進(jìn)行這樣的組合時(shí)，實(shí)現(xiàn)了協(xié)同作用。當(dāng)測(cè)試包括pLpB2啟動(dòng)子的桿狀病毒表達(dá)載體時(shí)，相對(duì)于僅僅使用pL啟動(dòng)子，目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平被提高最高達(dá)到61%-375% (取決于侵染時(shí)間)。這個(gè)實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)是非常重要的，因?yàn)楝F(xiàn)在啟動(dòng)子PL通常用于生物技術(shù)工業(yè)。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的啟動(dòng)子(pBl和pB2)的組合 ρΒ1-ρΒ1、ρΒ2-ρΒ2 禾口 ρΒ1_ρΒ2。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到本發(fā)明的啟動(dòng)子的活性。因而，本發(fā)明還提供了兩個(gè)安全的啟動(dòng)子用于開(kāi)發(fā)桿狀病毒重組體。因此，本發(fā)明闡明(參見(jiàn)發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明)調(diào)控多核苷酸序列(啟動(dòng)子)，比現(xiàn)有技術(shù)中所涉及的那些更有效，可以衍生自任何位于編碼hexamerin家族蛋白質(zhì)的基因可讀框上游的多核苷酸序列。因此，源自位于編碼hexamerin家族蛋白質(zhì)的基因的可讀框上游任何多核苷酸序列的任何調(diào)控多核苷酸序列都包括在本發(fā)明的目標(biāo)中。僅用于本發(fā)明的目的，定義下列術(shù)語(yǔ)-調(diào)控多核苷酸序列是通常位于允許基因轉(zhuǎn)錄的基因上游(朝有義鏈5'區(qū)域) 的DNA區(qū)域。-載體表汰:“載體"用于在細(xì)胞內(nèi)部傳遞外源的遺傳物質(zhì)。這個(gè)載體包含必要的調(diào)節(jié)序列以驅(qū)動(dòng)克隆基因或基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，由此轉(zhuǎn)錄和克隆DNA。桿狀病毒表達(dá)載體優(yōu)選用于本發(fā)明。-桿狀病毒是傳染性的病毒家族用于無(wú)脊椎動(dòng)物，主要地感染昆蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物。-重組DNA它是一種人造的DNA形式，通過(guò)組合或插入一個(gè)或多個(gè)DNA鏈被構(gòu)建， 由此組合通常不會(huì)出現(xiàn)在一起的DNA。重組DNA是通過(guò)添加相應(yīng)的DNA入現(xiàn)有生物基因組內(nèi)而產(chǎn)生的。重組蛋白質(zhì)通過(guò)重組DNA編碼的蛋白質(zhì)。-早期表汰這個(gè)術(shù)語(yǔ)是指啟動(dòng)子開(kāi)始表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的時(shí)間。在本發(fā)明中，該時(shí)間起始于感染后16小時(shí)。-^imii:這個(gè)術(shù)語(yǔ)是指任何目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，其水平與通過(guò)常規(guī)的桿狀病毒啟動(dòng)子PlO或pL所實(shí)現(xiàn)的表達(dá)水平相當(dāng)或者更高。-目標(biāo)蛋白質(zhì)可以用于人和動(dòng)物的蛋白質(zhì),其可以具有工業(yè)的、商業(yè)的或治療的應(yīng)用。-牛物工廠遺傳修飾或未遺傳修飾的細(xì)胞或牛物，其可以產(chǎn)牛工業(yè)規(guī)樽比例的蛋白質(zhì)，具有許多應(yīng)用包括治療目的(抑制劑、酶、抗體、抗原等)或商業(yè)用途的主要或次級(jí)
女口
廣 PFt ο-部分片段這個(gè)表達(dá)是指任何源自本發(fā)明的調(diào)控多核苷酸序列的部分片段，具有相同改進(jìn)的性質(zhì)與現(xiàn)有技術(shù)的那些相比更早或者更強(qiáng)。


圖1 在粉紋夜蛾的首先四個(gè)進(jìn)展階段顯示缺少SOkDa帶，其在后面被稱為 heXamerin(A)，在第五幼蟲(chóng)齡中的2天后出現(xiàn)了該帶(B)。圖C顯示在第五幼蟲(chóng)齡的最初6 天，密度測(cè)定法量化這個(gè)帶。圖2 質(zhì)譜分析鑒定SOKDa帶的方案。圖3 產(chǎn)生的表達(dá)載體，其僅攜帶啟動(dòng)子pBl序列或pB2結(jié)合pL序列(pLpB2)。圖4 昆蟲(chóng)sf21細(xì)胞和昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，其在不同的時(shí)期感染重組體桿狀病毒后，表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)在不同的啟動(dòng)子控制下(pBl、pB2、pL和pLpB2)。在該圖中，描述了感染 72小時(shí)后的幼蟲(chóng)。圖5 通過(guò)利用不同的啟動(dòng)子插入桿狀病毒載體(pBl、pB2、pL和pLpB2)在不同的感染后時(shí)間表達(dá)GFP(16-72h)和通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)(A)。通過(guò)GFP帶密度測(cè)定法⑶或通過(guò)細(xì)胞提取物的熒光(C)量化重組蛋白質(zhì)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供調(diào)控多核苷酸序列如啟動(dòng)子序言和pBl和pB2，其特征分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，且來(lái)源于位于昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中編碼hexamerin家族蛋白質(zhì)的基因可讀框上游的多核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)計(jì)使用這樣的調(diào)控多核苷酸序列用于構(gòu)造昆蟲(chóng)表達(dá)載體如桿狀病毒和用于在細(xì)胞中優(yōu)選昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)異源蛋白質(zhì)。啟動(dòng)子pBl和pB2的序列分別來(lái)自T.ni hexamerin BJHSPl和BJHSP2，其在五齡期以高水平表達(dá)，并且在該時(shí)期的最初48小時(shí)期間以非常高的轉(zhuǎn)錄活性表達(dá)(圖1)。pBl序列包括1057個(gè)核苷酸(SEQ ID NO 1)，且源自編碼BJHSPl蛋白質(zhì)起始密碼子的基因上游的5'區(qū)，BJHSPl是可以由保幼激素抑制的堿性蛋白1。通過(guò)使用兩個(gè)特定的引物從T.ni基因組DNA擴(kuò)增該序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。然后，將該片段克隆在pGEM-Teasy商業(yè)載體中(Promega)。pB2序列包括1041個(gè)核苷酸(SEQ ID NO 2)，且源自編碼B JHSP2蛋白質(zhì)起始密碼子的基因上游的5'區(qū)，B JHSP2是可以由保幼激素抑制的堿性蛋白2。通過(guò)使用兩個(gè)特定的引物從T.ni基因組DNA擴(kuò)增該序列SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6。然后，將該片段克隆在pGEM-Teasy商業(yè)載體中(Promega)。
用BamHl和Sphl酶從pGEM-Teasy提取pBl和pB2序列，并且克隆至pFasTBac雙向商業(yè)質(zhì)粒(INVITR0GEN)的那些位點(diǎn)中。這個(gè)pFasTBac雙向載體被所提到的酶打開(kāi)，其除去了桿狀病毒啟動(dòng)子序列(獲得的載體被命名為PFBpBl和pFBpB》。所有它們都呈現(xiàn)出了克隆位點(diǎn)以引入目標(biāo)cDNA。這些用于形成重組體桿狀病毒，其能夠感染和在昆蟲(chóng)細(xì)胞和昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中復(fù)制。另外，通過(guò)用限制性內(nèi)切酶Notl和Pstl (兩個(gè)限制性位點(diǎn)來(lái)自pGemT easy載體)消化來(lái)提取pB2序列，并且克隆至pFasTBacl商業(yè)載體(INVITR0GEN)相同的位點(diǎn)內(nèi)，并且在PL啟動(dòng)子序列之后。獲得的載體被命名為pFBpLpB2。因此，本發(fā)明的第一實(shí)施方案是指用于產(chǎn)生表達(dá)調(diào)控多核苷酸序列的方法SEQ ID NO :1(ρΒ1)和SEQ ID N0:2(pB2)。所述方法包括分離位于編碼hexamerin家族蛋白質(zhì)的基因的可讀框上游任何多核苷酸序列的任何調(diào)控多核苷酸序列。一旦調(diào)控多核苷酸序列被測(cè)序，則它們通過(guò)傳統(tǒng)手段被擴(kuò)增。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，hexamerin可讀框的上游多核苷酸序列屬于昆蟲(chóng)，優(yōu)選粉紋夜蛾。本發(fā)明的第二實(shí)施方案是指調(diào)控多核苷酸序列SEQ ID NO :1(ρΒ1)、SEQ ID NO 2 (pB2)，或其任何部分片段，其特征為包含源自位于編碼hexamerin家族蛋白質(zhì)的基因的可讀框上游的任何調(diào)控核苷酸區(qū)域的任何序列。這些啟動(dòng)子序列呈遞調(diào)控DNA基序，涉及轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)。因此，這些序列可以通過(guò)激素在幼蟲(chóng)發(fā)育期間調(diào)節(jié)，但其他信號(hào)也可能潛在地在細(xì)胞培養(yǎng)以及在表達(dá)載體上下文中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的調(diào)控多核苷酸序列SEQ ID NO 1 (pBl)和SEQ ID NO :2(pB2)與任何其它調(diào)控多核苷酸序列組合，優(yōu)選啟動(dòng)子pL(蛋白質(zhì)polyedrin的啟動(dòng)子)或Pl0(蛋白質(zhì)plO的啟動(dòng)子)，得到不同的組合:pLpB2、pLpBl、pl0pB2和plOpBl。本發(fā)明提供了非常強(qiáng)的啟動(dòng)子序列，當(dāng)PL序列(polyedrin啟動(dòng)子)與pB2序列組合時(shí)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的調(diào)控多核苷酸序列SEQ ID NO 1 (pBl)和SEQ ID NO :2(pB2)被組合得到不同的組合:pBlpB2、pBlpBl (至少重復(fù)兩次)和pB2pB2 (至少重復(fù)兩次)。已經(jīng)顯示，串聯(lián)定位的啟動(dòng)子提高了重組蛋白表達(dá)在細(xì)菌和植物中的效率 (H ‘ ichev AA 等人，Genetika. 198723 :197-201 ；Kay R 等人，Science. 1987 Jun 5 ； 236(4806) :1299-1302.)。本發(fā)明的第三實(shí)施方案是指使用任何上述的調(diào)控多核苷酸序列用于構(gòu)造表達(dá)載體，優(yōu)選桿狀病毒或質(zhì)粒。本發(fā)明的第四實(shí)施方案是指表達(dá)載體，其特征在于包括任何上述說(shuō)明的調(diào)控多核苷酸序列和至少編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在載體是桿狀病毒或質(zhì)粒。本發(fā)明的第五實(shí)施方案是指被表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或者被重組病毒感染用作前一段落所述的載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞，優(yōu)選來(lái)自草地夜蛾的sf9或 sf21。本發(fā)明的第六實(shí)施方案是指昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，其被上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染。本發(fā)明的第七實(shí)施方案是指用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞或昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中利用上述的表達(dá)載體產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，以及通過(guò)傳統(tǒng)手段提取和純化目標(biāo)重組蛋白質(zhì)。 本發(fā)明的第八實(shí)施方案是指使用所述表達(dá)載體用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的第九實(shí)施方案是指使用所述細(xì)胞用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明的最后的實(shí)施方案是指使用所述昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)作為生物工廠用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的微生物保存在2008年7月2日，這些質(zhì)粒被保藏在西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT)； University of Valencia, Spain,其保藏號(hào)CECT 7431。實(shí)施例通過(guò)以下實(shí)施例充分闡明本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)該被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。相反地，必須清楚地理解其它實(shí)施方案、改變和其等同可以被使用，這是本說(shuō)明書(shū)可以暗示本領(lǐng)域技術(shù)人員的，而且不會(huì)離開(kāi)本發(fā)明的主旨和/或所附權(quán)利要求的范圍。本發(fā)明的實(shí)施例表明與使用常規(guī)的啟動(dòng)子相比，蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生在感染后的更早期時(shí)間。此外，對(duì)于PB2和pLpB2啟動(dòng)子序列，與現(xiàn)有技術(shù)中獲得的那些啟動(dòng)子(啟動(dòng)子 PL)相比，表達(dá)水平在感染后時(shí)間早期和晚期都更高。實(shí)施例1 通過(guò)本發(fā)明的昆蟲(chóng)啟動(dòng)子表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)克隆GFP通過(guò)Sphl限制性內(nèi)切酶從pFBpLGFP質(zhì)粒提取GFP，并克隆入pFBpBl或pFBpB2質(zhì)粒的Sphl限制性位點(diǎn)內(nèi)。獲得的供體-表達(dá)質(zhì)粒分別被命名為pFBpBIGFP和pFBpB2GFP。 在所有情況中，都除去PL序列，因而GFP表達(dá)僅僅由于不同昆蟲(chóng)啟動(dòng)子自身的活性(圖3)。另一方面，兩側(cè)為Not I和I^stI限制性位點(diǎn)的pB2啟動(dòng)子被連接至也被相同限制性內(nèi)切酶打開(kāi)的pFBpLGFP。所獲得的供體-表達(dá)質(zhì)粒被命名為pFBpLpB2GFP，并且所包含的GFP編碼基因在雙重啟動(dòng)子pL和pB2的控制下(圖3)。GFP-桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建通過(guò)自動(dòng)測(cè)序?qū)λ玫降馁|(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并且用于產(chǎn)生重組桿狀病毒、 BocpB2GFP，BacpBlGFP 和 BacpLpB2GFP，使用 Bac-tO-Bac 桿狀病毒表達(dá)載體 (Invitrogen, USA)，按照制造商的指導(dǎo)。簡(jiǎn)言之，將所得到的供體表達(dá)-質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化 DHlOBac 大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞以易位進(jìn)入重組桿粒。將1 μ g的每種桿粒用于轉(zhuǎn)染Ix IO6 Spodoptera fnigiperda sf21 細(xì)胞，使用Cellfectin Reagent。在 27 攝氏度接種 72小時(shí)后，獲得Pl病毒儲(chǔ)液。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，擴(kuò)增桿狀病毒。將sf21昆蟲(chóng)細(xì)胞在BD BaculoGold TNM-FH Insect Medium(BD Biosciences)上進(jìn)行培養(yǎng)，其中BD BacuIoGoId TNM-FH Insect Medium(BD Biosciences)補(bǔ)充了 50mg/mL慶大霉素。根據(jù)相同的規(guī)程使用 pFBpLGFP質(zhì)粒獲得了之前在我們實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的桿狀病毒BacpLGFP。昆蟲(chóng)接種隨后以0. Icfu的感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞，并將細(xì)胞在感染后16、24、48或72小時(shí)通過(guò)在2000rpm下離心5分鐘進(jìn)行沉淀。并且在感染后不痛時(shí)間在熒光顯微鏡中對(duì)感染的細(xì)胞進(jìn)行拍照，照片顯示在圖4 中。顯著的是，與PL啟動(dòng)子相比，pB2和pLpB2啟動(dòng)子序列的早期(感染后16小時(shí)開(kāi)始) 活性以及二者的強(qiáng)度要更高，甚至在感染的后期(感染后4 和72小時(shí))。pBl啟動(dòng)子還呈現(xiàn)出活性，盡管不如PB2或pL啟動(dòng)子強(qiáng)。昆蟲(chóng)生長(zhǎng)條件和接種
將五齡期粉紋夜蛾幼蟲(chóng)在腹足附近(朝向體腔)注射重組體桿狀病毒，使用 IO4-IO5Pfu/幼蟲(chóng)劑量。感染的幼蟲(chóng)被保持在觀攝氏度的生長(zhǎng)箱中，并在72小時(shí)時(shí)收集。 圖4的下圖顯示pBl (低)、pB2和pL和pB2啟動(dòng)子的組合呈現(xiàn)出在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中的活性，通過(guò)在幼蟲(chóng)組織中表達(dá)GFP蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)提取物的制備將來(lái)自P6孔板的沉淀細(xì)胞OxlO6細(xì)胞/孔以0. Ipfu/孔感染)重懸浮在30 μ 1 150mM NaCl, 1 % NP-40,0,1 % SDS, 50rnM Tris pH 8，蛋白酶抑制劑(COmplete ,Roche)， 2-巰基乙醇(RIPA緩沖液)中，在冰上保持30分鐘，并且通過(guò)在4攝氏度，2000g下離心5 分鐘以除去細(xì)胞碎片。蛋白質(zhì)提取物的分析在12%SDS(W/v)聚丙烯酰胺凝膠上分離40 μ g全部可溶性蛋白(TSP)。將蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍(lán)G-250 (BioRad)染色，或者轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜上(Hybond C, GE Healthcare), 在PBS中用0. 1 % (ν/ν)吐溫20 (PBS-T)和4 %脫脂乳(PBS-TM)封閉過(guò)夜，且與稀釋 1 1000的GFP—抗(Chemicon)和在PBS-TM中稀釋1 500的肌動(dòng)蛋白一抗(Sigma)孵育1小時(shí)。在PBS-T中清洗10分鐘兩次后，將膜與在PBS-TM中1 2000稀釋的過(guò)氧化物酶-偶聯(lián)抗小鼠IgG或抗兔IgG(GE Healthcare)孵育1小時(shí)。在洗滌之后，使用Advanced ECL系統(tǒng)(GE Healthcare)根據(jù)制造商的知道檢測(cè)特定的信號(hào)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析，得到圖5的結(jié)果。再次證實(shí)pB2和pLpB2啟動(dòng)子顯示了比PL啟動(dòng)子更早和更強(qiáng)的活性(圖5)。通過(guò)使用TINA 2.0程序和使用肌動(dòng)蛋白帶歸一化結(jié)果，測(cè)量GFP的特定帶的密度。熒光測(cè)定法檢驗(yàn)在485nm激發(fā)后使用GENIOS熒光計(jì)測(cè)量在535nm的40 μ gTSP的發(fā)射光。每個(gè)提取物通過(guò)測(cè)量3次，獲得每個(gè)數(shù)值。結(jié)果顯示在圖5C中。再次明確觀察到了 pL序列置于 PB2啟動(dòng)子5 ‘上游的協(xié)同效應(yīng)，與僅pL啟動(dòng)子相比，蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高61 %至375 %，依賴于感染后時(shí)間(圖5)。
權(quán)利要求
1.用于開(kāi)發(fā)表達(dá)調(diào)控多核苷酸序列的方法，其包括a)分離任何包括它們的相應(yīng)調(diào)控多核苷酸序列的多核苷酸序列，其位于編碼 hexamerin家族蛋白質(zhì)的基因的可讀框上游；和b)通過(guò)傳統(tǒng)手段擴(kuò)增步驟a)的調(diào)控多核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征為最終開(kāi)發(fā)的調(diào)控多核苷酸序列特征為SEQID NO KpBl)和 SEQ ID NO :2(pB2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述擴(kuò)增是通過(guò)使用引物SEQID NO :3和SEQ ID NO :4用于開(kāi)發(fā)pBl和通過(guò)使用引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6用于開(kāi)發(fā)pB2而進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征為所述調(diào)控多核苷酸序列屬于昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征為所述昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)是粉紋夜蛾。
6.調(diào)控多核苷酸序列，其來(lái)源于位于編碼hexamerin家族蛋白質(zhì)的基因可讀框上游的任何多核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的調(diào)控多核苷酸序列，其特征為其為啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的調(diào)控多核苷酸序列，其選自SEQID NO 1 (pBl)、SEQ ID NO: 2 (pB》，或其任何部分片段，其來(lái)源于位于編碼hexamerin家族蛋白質(zhì)的基因的可讀框上游的任何調(diào)控核苷酸區(qū)域的任何序列。
9.調(diào)控多核苷酸序列，其特征為包括權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的調(diào)控多核苷酸序列以及任何其它調(diào)控多核苷酸序列的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的調(diào)控多核苷酸序列，其中所述其他調(diào)控多核苷酸序列是蛋白質(zhì)多角體蛋白的啟動(dòng)子或蛋白質(zhì)Pio的啟動(dòng)子。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的調(diào)控多核苷酸序列，其特征為包括pB2序列(SEQID NO 2)及蛋白質(zhì)多角體蛋白的啟動(dòng)子序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10的調(diào)控多核苷酸序列，其特征為包括pBl序列(SEQID NO 1)及蛋白質(zhì)多角體蛋白的啟動(dòng)子序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求9或10的調(diào)控多核苷酸序列，其特征為包括pB2序列(SEQID NO 2)及蛋白質(zhì)PlO的啟動(dòng)子序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求9或10的調(diào)控多核苷酸序列，其特征為包括pBl序列(SEQID NO 1)及蛋白質(zhì)PlO的啟動(dòng)子序列。
15.調(diào)控多核苷酸序列，其特征為包括權(quán)利要求8中其任何序列的組合。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的調(diào)控多核苷酸序列，其特征為包括pBl序列(SEQID NO=D及 pB2 序列(SEQ ID NO :2)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的調(diào)控多核苷酸序列，其特征為包括pBl序列(SEQID N0:1)，所述PBl序列至少重復(fù)兩次。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的調(diào)控多核苷酸序列，其特征為包括pB2序列(SEQID N0:2)，所述PB2序列至少重復(fù)兩次。
19.權(quán)利要求6-18的調(diào)控多核苷酸序列用于構(gòu)造表達(dá)載體的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其中所述表達(dá)載體是病毒，優(yōu)選桿狀病毒。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其中所述表達(dá)載體是質(zhì)粒。
22.表達(dá)載體，其特征為包括權(quán)利要求6-18的任何調(diào)控多核苷酸序列及至少編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的表達(dá)載體，其特征為其為病毒，優(yōu)選桿狀病毒。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的表達(dá)載體，其特征為其為質(zhì)粒。
25.由權(quán)利要求22-24的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的細(xì)胞，其特征為它們是昆蟲(chóng)細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自Spodoptera frugiperda 的 sf9 或 sf21。
27.昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，其被權(quán)利要求22-24的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染、感染或轉(zhuǎn)化。
28.用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包括用權(quán)利要求22-24的表達(dá)載體接種或轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞或昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，以及通過(guò)傳統(tǒng)手段提取和純化目標(biāo)重組蛋白質(zhì)。
29.權(quán)利要求22-M用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的用途。
30.權(quán)利要求25或沈的細(xì)胞用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的用途。
31.權(quán)利要求27的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)作為生物工廠用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的用途。
全文摘要
用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中外源蛋白質(zhì)表達(dá)的昆蟲(chóng)衍生啟動(dòng)子。在本發(fā)明中已經(jīng)從昆蟲(chóng)(粉紋夜蛾)分離了調(diào)控多核苷酸序列，其驅(qū)動(dòng)重要的昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)(hexamerin)在幼蟲(chóng)特定的演化階段表達(dá)。所述調(diào)控多核苷酸序列促進(jìn)外源基因在桿狀病毒系統(tǒng)中比常規(guī)的多角體蛋白啟動(dòng)子更強(qiáng)的表達(dá)。另外，相對(duì)于生物技術(shù)工業(yè)中使用的常規(guī)桿狀病毒，本發(fā)明的新的幼蟲(chóng)起源啟動(dòng)子與pL啟動(dòng)子的組合提高桿狀病毒表達(dá)水平最高達(dá)到61％-375％(取決于侵染時(shí)間)。啟動(dòng)子pB2還驅(qū)動(dòng)基因比多角體蛋白啟動(dòng)子更早表達(dá)，該特征對(duì)于正確的蛋白質(zhì)折疊及翻譯后修飾而言是重大優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/866GK102203264SQ200880131742
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2008年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日
發(fā)明者拉莫斯 伊斯梅爾·桑切斯, 埃斯克里瓦諾 何塞·安赫爾·馬丁內(nèi)斯, 馬蒂 科瓦東加·阿隆索, 薩巴斯蒂安 西爾維婭·戈麥斯, 維達(dá)爾 賈維爾·洛佩茲 申請(qǐng)人:替代基因表達(dá)有限公司(艾爾基尼克斯)