專利名稱：增強(qiáng)的產(chǎn)乙醇和丁醇微生物以及使用該微生物制備乙醇和丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的產(chǎn)乙醇和丁醇能力的重組微生物以及使用該微生物制備 乙醇和丁醇的方法，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的產(chǎn)乙醇和丁醇能力的重組微生物 以及使用該微生物制備乙醇和丁醇的方法，其中編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼乙醇/乙醛 脫氫酶的基因被引入到所述微生物中。
背景技術(shù)：
目前，乙醇和丁醇作為工業(yè)溶劑有著巨大的市場(chǎng)，并且使用它們作為用于運(yùn)輸工 具諸如汽車及類似物的燃料的可能性正被實(shí)現(xiàn)，因此預(yù)期，對(duì)于乙醇和丁醇的需要持續(xù)增 加。傳統(tǒng)上，乙醇(C2H5OH)通過(guò)發(fā)酵淀粉或者糖來(lái)制備，近來(lái)大多數(shù)酒精飲料通過(guò)這 種方法制備。但是，除了酒精飲料制備以外，目前正在通過(guò)合成方法制備乙醇，包括使用從 作為原材料的石油得到的乙烯(ethene)硫酸水解法，其中將乙烯吸收到硫酸中產(chǎn)生乙醇 的硫酸酯，然后水解產(chǎn)生乙醇與二乙醚；以及直接水解法，其中通過(guò)接觸使用固體磷酸催化 劑接觸允許氣相中的乙烯與水蒸氣反應(yīng)，由此導(dǎo)致直接合成乙醇。但是，這些方法具有的缺 點(diǎn)在于，其以石油作為基本原料，在硫酸水解法的情況下，需要大規(guī)模的廠房用于大量硫酸 的濃縮和循環(huán)。同時(shí)，丁醇(C4H9OH)的全世界產(chǎn)量被估計(jì)為大約110萬(wàn)噸/每年?，F(xiàn)全部可從市 場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的丁醇都通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生。與乙醇的情況相同，丁醇的化學(xué)合成也使用石油作 為原料產(chǎn)生丙烯，丙烯通過(guò)氧化步驟合成丁醇。這種使用石油作為原料的涉及高溫高壓的 方法在成本和能量方面都是不足的(Tsuchida等人，Ind. Eng. Chem. Res. ,45 =8634,2006)。 也就是說(shuō)，通過(guò)石油化學(xué)的乙醇和丁醇生產(chǎn)存在的問(wèn)題是生產(chǎn)過(guò)程中，排出了大量有害廢 物、廢水和廢氣(包括一氧化碳)，尤其是具有將化石燃料用作基本原料的限制。如上所述，迄今為止生產(chǎn)的大多數(shù)丁醇通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生。盡管由于油價(jià)升高以 及相關(guān)環(huán)境問(wèn)題，全世界范圍內(nèi)對(duì)生物乙醇和生物丁醇的興趣已經(jīng)迅速增加，但還沒(méi)有專 門(mén)有效生產(chǎn)生物乙醇和生物丁醇的例子。迄今為止，大多數(shù)通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和乙醇的方法使用梭菌(Clostridium)， 在一種情況下，通過(guò)引入3種基因以制備質(zhì)粒(pFNK6)將編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因 (adc)，編碼CoA轉(zhuǎn)移酶A的基因(ctfA)以及編碼CoA轉(zhuǎn)移酶B的基因(ctfB)引入到載 體中并使用abc啟動(dòng)子構(gòu)建人造操縱子，然后將質(zhì)粒引入到丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824中，從而與野生型相比將丙酮、丁醇和乙醇的產(chǎn)量分別增加 95%、37%和 90% (Mermelstein 等人，Biotechnol. Bioeng. ,42 :1053，1993)。存在另一種 情況，其中與野生型相比，aad(乙醇/乙醛脫氫酶)的克隆和過(guò)表達(dá)導(dǎo)致與丙酮產(chǎn)量相比 丁醇和乙醇產(chǎn)量相對(duì)提高(Nair等人，J. Bacteriol.，176 :871，1994)。另外，已經(jīng)嘗試將 buk(丁酸激酶)和pta(磷酸轉(zhuǎn)乙?；?失活作為基因功能失活的方式，并且報(bào)道了 pH5. 0以上其buk基因被失活的菌株(PJC4BK)發(fā)酵導(dǎo)致了丁醇產(chǎn)量的顯著增加，達(dá)到16. 7g/ l(Harris等人，Biotechnol. Bioeng.，67 1，2000)。但是，pta的失活被報(bào)道在溶劑生產(chǎn) 方面與野生型相比沒(méi)有顯示差別(Harris等人，Biotechnol. Bioeng. ,67 :1，2000)。此外， 將通過(guò)隨機(jī)突變得到的作為突變菌株的貝氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium bei jerinckii) BAlOl使用麥芽糊精(maltodextrin)作為碳源進(jìn)行發(fā)酵，并報(bào)道產(chǎn)生了 18. 6g/l的丁醇 (Ezeji 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. ,63 :653，2004)。但是，上述結(jié)果是生產(chǎn)丁醇和 乙醇以及作為副產(chǎn)品的丙酮的例子，具有的缺點(diǎn)在于在不除去丙酮的情況下，由于丙酮的 性質(zhì)，它們不能用作燃料。存在使用重組微生物生產(chǎn)乙醇和丁醇而沒(méi)有丙酮產(chǎn)生的情況，所述微生物通過(guò)將 aad(乙醇/乙醛脫氫酶)引入到丙酮丁醇桿菌(Clostridium acetobutylicum)突變菌 株中來(lái)構(gòu)建，該突變菌株缺失所有adc (編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因)、CtfA(編碼CoA轉(zhuǎn) 移酶A的基因)、CtfB (編碼CoA轉(zhuǎn)移酶B的基因)和aad(編碼乙醇/乙醛脫氫酶的基 因)的功能；但是，該方法具有的問(wèn)題在于產(chǎn)量低，因?yàn)槎〈己鸵掖嫉慕K濃度分別為84mM 和8mM(Nair等人，J. Bacteriol.，176 :5843，1994)。含有另一種生產(chǎn)丁醇的情形，其通過(guò) 將攜帶了丙酮丁醇桿菌(Clostridium acetobutylicum)基因的重組載體引入到大腸桿菌 菌株中(Shota等人，Metab. Eng.，In Press，2007)，但產(chǎn)生的丁醇的最大濃度很低，濃度為 552mg/l，使其不可能工業(yè)應(yīng)用。因此，存在對(duì)于開(kāi)發(fā)可高效產(chǎn)生丁醇或者乙醇和丁醇混合物并且不產(chǎn)生副產(chǎn)物諸 如丙酮，使它們可直接作為燃料使用的微生物的迫切需要。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出了極大努力來(lái)開(kāi)發(fā)以乙醇和丁醇合成途徑為基礎(chǔ)的能 夠高產(chǎn)量生產(chǎn)乙醇和丁醇并且不產(chǎn)生副產(chǎn)物的微生物(圖1)，結(jié)果，通過(guò)克隆來(lái)自丙酮丁 醇桿菌ATCC 824的兩種酶(1)編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的ctfAB，所述轉(zhuǎn)移酶分別將乙酸和丁酸轉(zhuǎn) 化成乙酰CoA和丁酰CoA，以及(2)編碼乙醇/乙醛脫氫酶的adhEl，所述轉(zhuǎn)移酶分別將乙 酰CoA和丁酰CoA轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇，并將克隆的基因引入到不能產(chǎn)生有機(jī)溶劑的宿主微 生物中構(gòu)建了重組微生物，并確認(rèn)重組微生物在產(chǎn)生高濃度的乙醇和丁醇的同時(shí)不產(chǎn)生作 為副產(chǎn)物的丙酮，由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的主要目的在于提供高效產(chǎn)生丁醇或者乙醇/ 丁醇混合物并且不產(chǎn) 生副產(chǎn)物的重組微生物，以及構(gòu)建該重組微生物的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供使用所述重組微生物制備乙醇和丁醇的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微 生物的方法，所述方法包括將編碼將乙酸和丁酸分別轉(zhuǎn)化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶的基 因和/或編碼將乙酰CoA和丁酰CoA分別轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇的基因引入到宿主微生物中， 所述宿主微生物具有編碼在乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合成途徑中參與的酶的基因。本發(fā)明還提供了具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物，所述微生物具有 引入或擴(kuò)增到宿主微生物中的編碼將乙酸和丁酸分別轉(zhuǎn)化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶的基 因；和/或編碼將乙酰CoA和丁酰CoA分別轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇的基因，所述宿主微生物具有 編碼在乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合成途徑中參與的酶的基因。
另外，本發(fā)明提供了制備乙醇和/或丁醇的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述重組微 生物的步驟和從培養(yǎng)液中回收乙醇和/或丁醇的步驟。通過(guò)下列詳細(xì)描述和隨附的權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其他特征和方面將更加明確。


圖1是顯示沒(méi)有產(chǎn)生乙醇和丁醇的能力的丙酮丁醇桿菌退化菌株的代謝途徑 (A)，以及用于在通過(guò)將ctfAB和adhEl引入到退化菌株中構(gòu)建的重組菌株中合成乙醇和丁 醇的代謝途徑(B)的示意圖。圖2是含有CtfAB和adhEl的重組載體pIMPl adhEl. ctfAB的基因圖譜。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中，為了開(kāi)發(fā)以乙醇和丁醇合成途徑為基礎(chǔ)的能夠高產(chǎn)量產(chǎn)生乙醇/ 丁 醇并且不產(chǎn)生副產(chǎn)物諸如丙酮的微生物(圖1)，克隆了來(lái)自丙酮丁醇桿菌ATCC 824的下列 兩種酶(1)編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的ctfAB，所述轉(zhuǎn)移酶分別將乙酸和丁酸轉(zhuǎn)化成乙酰CoA和丁 酰CoA，以及(2)編碼乙醇/乙醛脫氫酶的adhEl，所述轉(zhuǎn)移酶分別將乙酰CoA和丁酰CoA 轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇，然后將克隆的基因引入到具有編碼在乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物 合成途徑中參與的酶的基因并且不具有產(chǎn)生有機(jī)溶劑諸如丙酮的能力的宿主微生物中，由 此構(gòu)建了重組微生物。因此，本發(fā)明涉及構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)乙醇和丁醇能力的重組微生物的方法，所述 方法包括將編碼將乙酸和丁酸分別轉(zhuǎn)化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶的基因，和/或編碼將 乙酰CoA和丁酰CoA分別轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇的酶的基因引入或者擴(kuò)增到宿主微生物中，所 述宿主微生物具有編碼在乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合成途徑中參與的酶的基因。本發(fā)明還涉及構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)乙醇和丁醇能力的重組微生物，其具有被引入或 者擴(kuò)增到宿主微生物中的編碼將乙酸和丁酸分別轉(zhuǎn)化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶的基因， 和/或編碼將乙酰CoA和丁酰CoA分別轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇的酶的基因，所述宿主微生物具 有編碼在乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合成途徑中參與的酶的基因。在本發(fā)明中，這里使用的術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”廣義上指的是如下過(guò)程相關(guān)基因的一些堿 基的突變、替換或者缺失，和插入；或者引入來(lái)自其他微生物的編碼相同酶的基因以增加相 應(yīng)酶的活性。在本發(fā)明中，所述用于將乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合成途徑優(yōu)選[乙酰 CoA —乙酰乙酰CoA — 3-羥基丁酰CoA — 丁烯酰CoA —丁酰CoA]。在本發(fā)明中，宿主微生物優(yōu)選具有被阻斷的丙酮生物合成途徑，因此丙酮產(chǎn)量低 于有機(jī)溶劑總產(chǎn)量的10%。在所述丙酮生物合成途徑中adc (編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因) 可被缺失，但不限于此。并且所述宿主微生物優(yōu)選得自梭菌屬，但不限于此，只要其具有將 乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合成途徑即可。在本發(fā)明中，將乙酸和丙酮酸分別轉(zhuǎn)化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶優(yōu)選為CoA轉(zhuǎn) 移酶；并且編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的基因?yàn)閏tfAB。而且，分別將乙酰CoA和丁酰CoA轉(zhuǎn)化成乙醇 和丁醇的酶優(yōu)選為乙醇/乙醛脫氫酶；并且編碼乙醇/乙醛脫氫酶的基因?yàn)閍dhEl。本發(fā) 明僅僅使用來(lái)自丙酮丁醇桿菌ATCC 824的ctfAB和adhEl作為例子，但來(lái)自其他微生物的基因也可被使用而沒(méi)有限制，只要它們?cè)趯⑺鼈円肫渲械乃拗骷?xì)胞中表達(dá)并具有相同活 性即可。在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用的宿主微生物為缺少巨大質(zhì)粒(megaplasmid，攜帶127 個(gè)基因，包括編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因，編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼乙醇/乙醛脫氫酶 的基因)的丙酮丁醇桿菌的突變株M5。丙酮丁醇桿菌的突變株M5是其丙酮生物合成途徑 被阻斷的微生物(圖1)。在本發(fā)明中，僅僅丙酮丁醇桿菌M5被用作其丙酮生物合成途徑被 阻斷的梭菌屬宿主微生物的例子，但丙酮丁醇桿菌1NYG、4NYG、5NYG和DGl (Stim-Herndon, K. P.等人，Biotechnol./Food Microbiol.，2 :11，1996)、丙酮丁醇桿菌 ATCC 824 型 IV、M3、 M5、2-BB R、2-BB D、RifB12、RifDIO、RifF7 以及丁酸梭菌(C. butyricum) ATCC 860 (Clark, S. W.等人，Appl. Environ. Microbiol.，55 :970，1989)也可被使用。在本發(fā)明中，可以確定 當(dāng)通過(guò)將攜帶所述ctfAB和adhEl的重組載體(pIMPl: :adhEl. ctfAB)引入到所述宿主微 生物中構(gòu)建重組微生物M5(pIMPl: :adhEl. ctfAB)并進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其在產(chǎn)生了高濃度的丁 醇/乙醇的同時(shí)幾乎不產(chǎn)生丙酮。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及制備乙醇和/或丁醇的方法，所述方法包括培養(yǎng)所 述重組微生物并從培養(yǎng)液中回收乙醇和/或丁醇的步驟。在本發(fā)明中，培養(yǎng)重組微生物和回收乙醇和丁醇的過(guò)程可使用常規(guī)培養(yǎng)方法以 及發(fā)酵領(lǐng)域已知的用于乙醇/丁醇分離和純化的常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。另外，雖然乙醇和丁 醇的回收常常在完成培養(yǎng)之后進(jìn)行，但其可在培養(yǎng)過(guò)程中使用正確方法諸如氣體剝離法 (gas-stripping method) (Thaddeus 等人，Bioprocess Biosyst. Eng.，27 :207，2005)來(lái)進(jìn) 行以便提高產(chǎn)量。也就是說(shuō)，在連續(xù)培養(yǎng)的同時(shí)在培養(yǎng)過(guò)程中回收產(chǎn)生的乙醇和丁醇也落 入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。相反，雖然本發(fā)明僅僅示出了其中丁醇生物合成途徑被阻斷的情形，但存在有 關(guān)通過(guò)在丙酮丁醇桿菌ATCC 824菌株中阻斷丁酸生物合成途徑來(lái)提高丁醇產(chǎn)生的報(bào)告 (Harris等人，Biotechnol. Bioeng. ,67 1,2000)；因此可以推斷乙醇和丁醇的生產(chǎn)可通過(guò) 阻斷在圖1的新陳代謝途徑中將丁酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酸的生物合成途徑來(lái)提高。作為替代方 法，能夠利用乙酸的基因諸如acs和atoDA的引入也可增加乙醇和丁醇的產(chǎn)量。
實(shí)施例此后，將參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)描述。但是應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施 例僅用于說(shuō)明的目的，而不解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。尤其是，下列實(shí)施例示出了特定突變株丙酮丁醇桿菌M5作為能夠產(chǎn)生有機(jī)溶劑 的宿主菌株，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到的是，具有將乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合 成途徑并且其有機(jī)溶劑生物合成途徑被阻斷的梭菌屬或者其他屬的其他微生物也可用作 宿主菌株，并且相同的基因可被引入到用于乙醇和丁醇生產(chǎn)的宿主菌株中。實(shí)施例1 含有編碼乙醇/乙醛脫氫酶的adhEl基因和編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的ctfAB基 因的重組載體的制備將分別具有序列號(hào)3、序列號(hào)4和序列號(hào)5堿基順序的丙酮丁醇桿菌ATCC 824 的adhEl、ctfA和CtfB基因使用啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄終止序列一起克隆。首先使用丙酮丁醇桿 菌ATCC 824的染色體DNA作為模板，使用序列1和序列2作為引物進(jìn)行PCR(表1)，然后將、ctfA和CtfB使用限制酶SalI切割并插入到使用相同限制酶切割的梭菌/ 大腸桿菌穿梭載體 PIMPl (MermeIstein, L. D.等人，Bio/Technol.，10 :190，1992)中，由此 制備重組載體pIMPl::adhEl.CtfAB (表2)。來(lái)自丙酮丁醇桿菌ATCC 824的編碼乙醇/乙 醛脫氫酶和CoA轉(zhuǎn)移酶的基因(adhEl、ctfAB)由此被克隆。表1 :PCR 條件
權(quán)利要求
一種構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物的方法，所述方法包括將編碼將乙酸和丁酸分別轉(zhuǎn)化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶的基因和/或編碼將乙酰CoA和丁酰CoA分別轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇的基因引入到宿主微生物中，所述宿主微生物具有編碼在乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合成途徑中參與的酶的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物的方法， 其特征在于，所述用于將乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合成途徑是[乙酰CoA—乙酰乙 酰 CoA — 3-羥基丁酰 CoA — 丁烯酰 CoA —丁酰 CoA]。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物的方法， 其特征在于，所述宿主微生物具有被阻斷的丙酮生物合成途徑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物的方法， 其特征在于，所述宿主微生物具有缺失的adc(編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物的方法， 其特征在于，所述宿主微生物來(lái)自梭菌屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物的方法， 其特征在于，所述將乙酸和丁酸分別轉(zhuǎn)化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶是CoA轉(zhuǎn)移酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物的方法， 其特征在于，所述編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的基因是ctfAB。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物的方法，其特 征在于，所述將乙酰CoA和丁酰CoA分別轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇的酶是乙醇/乙醛脫氫酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的構(gòu)建具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物的方法， 其特征在于，所述編碼乙醇/乙醛脫氫酶的基因是adhEl。
10.一種具有增強(qiáng)的產(chǎn)乙醇和丁醇能力的重組微生物，所述微生物具有引入或擴(kuò)增到 宿主微生物中的編碼將乙酸和丁酸分別轉(zhuǎn)化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶的基因；和/或編 碼將乙酰CoA和丁酰CoA分別轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇的基因，所述宿主微生物具有編碼在乙酰 CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合成途徑中參與的酶的基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物，其特征在 于，所述將乙酰CoA轉(zhuǎn)化成丁酰CoA的生物合成途徑是[乙酰CoA —乙酰乙酰CoA — 3-羥 基丁酰 CoA — 丁烯酰 CoA —丁酰 CoA]。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物，其特征在 于，所述宿主微生物具有被阻斷的丙酮生物合成途徑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物，其特征在 于，所述宿主微生物具有缺失的adc(編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物，其特征在 于，所述宿主微生物來(lái)自梭菌屬。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物，其特征在 于，所述將乙酸和丁酸分別轉(zhuǎn)化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶是CoA轉(zhuǎn)移酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物，其特征在 于，所述編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的基因是ctfAB。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物，其特征在于，所述將乙酰CoA和丁酰CoA分別轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇的酶是乙醇/乙醛脫氫酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物，其特征在于， 所述編碼乙醇/乙醛脫氫酶的基因是adhEl。
19.根據(jù)權(quán)利要求10的具有增強(qiáng)的產(chǎn)生乙醇和丁醇能力的重組微生物，其特征在于， 丙酮產(chǎn)量低于有機(jī)溶劑總產(chǎn)量的10%。
20.一種重組丙酮丁醇桿菌M5(pIMPl: :adhEl. ctfAB)，其具有增強(qiáng)的產(chǎn)乙醇和丁醇能力。
21.一種制備乙醇和/或丁醇的方法，所述方法包括下列步驟培養(yǎng)權(quán)利要求10-19中 任意一項(xiàng)所述的重組微生物，并從培養(yǎng)液中回收乙醇和/或丁醇。
22.—種制備乙醇和/或丁醇的方法，所述方法包括下列步驟培養(yǎng)權(quán)利要求20所述 的重組微生物，并從培養(yǎng)液中回收乙醇和/或丁醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的產(chǎn)乙醇和丁醇能力的重組微生物以及使用該微生物制備乙醇和丁醇的方法，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的產(chǎn)乙醇和丁醇能力的重組微生物以及使用該微生物制備乙醇和丁醇的方法，其中編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼乙醇/乙醛脫氫酶的基因被引入到所述微生物中。根據(jù)本發(fā)明的通過(guò)代謝途徑的操作得到的重組微生物能夠?qū)ｉT(mén)產(chǎn)生丁醇和乙醇而不產(chǎn)生任何副產(chǎn)物，因此作為生產(chǎn)工業(yè)溶劑和運(yùn)輸燃料的微生物是有用的。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101952430SQ200880126368
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者張俞信, 李相燁, 李真英, 鄭光燮, 金宰賢 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院;生物普爾肯株式會(huì)社;佳施加德士公司