專利名稱：與多重基因組獲得和丟失分析相關(guān)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文描述的技術(shù)大體涉及核酸檢測用方法和組合物。更具體而言，所描述的是基 因組獲得和丟失分析用方法和組合物。
背景技術(shù)：
通過對基因組獲得和丟失的檢測分析可以對構(gòu)成疾病、行為和認知病癥以及其他 遺傳病變的病因的遺傳性異常進行檢測和診斷。Array-CGH(aCGH)是一種多重分析方法，其中固定的DNA探針捕獲來自測試樣本 和參照樣本的經(jīng)標記的互補基因組DNA序列。每一個探針都會產(chǎn)生一個由探針序列界定的 組成序列中的一個序列的測試量/參照量的比值。在aCGH中，通常使用細菌人工染色體 (BAC)作為固定到陣列固體支持物上的探針材料。典型的BAC序列長度介于大約IOOkb至 大約250kb之間，通常的長度為175kb。這一長度的探針非常適合aCGH，原因在于它們長到 足以形成大的雜交信號，并且不會對小的突變?nèi)鏢NP產(chǎn)生響應(yīng)，然而又短到足以提供充分 的基因組解析力，從而較為精確地檢測基因組獲得或者丟失的斷點(break point)。例如， 一個設(shè)計精良的BAC陣列可以檢測微缺失綜合征如1ρ36缺失綜合征或DiGeorge綜合征中 不同大小的缺失區(qū)域，其中跨越疾病相關(guān)區(qū)域的不同部分的缺失可以對應(yīng)不同的表型。所謂組成型aCGH微陣列的設(shè)計正趨于使用多種單獨的探針，例如與先天DNA障礙 相關(guān)的每一個基因組區(qū)域中的BAC探針，從而以較高的解析力檢測基因組獲得和丟失的程 度。較高的解析力會揭示出更多有關(guān)獲得或丟失區(qū)域的確切大小和邊界的信息。但是，存 在可能并不需要對獲得或者丟失區(qū)域的確切大小和邊界進行高解析力檢測的情況。非整倍性是基因組獲得-丟失異常的實例，其中以高解析力檢測斷點不再可行。 非整倍性是一條完整的染色體(平均大小超過IOOmb)的獲得(最為典型，如三體性)或丟 失，這與微缺失障礙相反，在后者中，缺失區(qū)域的典型長度可能僅1至IOmb左右。在aCGH分 析中，非整倍性檢測(也稱為染色體計數(shù)法)可以使用少到一種BAC探針來進行，但是從所 述單種探針獲得的樣本/正常比值的噪音會使得結(jié)果不確切。使用靶向受試者染色體的多 種探針(其中大多數(shù)探針全都表現(xiàn)出相同的獲得或丟失)為采用aCGH分析的非整倍性檢 測結(jié)果提供了更多的可信度，并且這是CGH分析的常規(guī)構(gòu)建方法。在明確地“稱為”或確定 為獲得或者丟失之前，大部分陣列分析都需要某個區(qū)域中的至少兩種或三種或更多種BAC 探針的一致的比值信號。獲得或者丟失區(qū)域中額外的個體探針分子會增加獲得或者丟失檢測的可信度，這在分析信號比有噪音的情況下是有價值的。噪音因為多種原因而存在于分析之中。有時， 分析有噪音僅僅是因為探針固定或者樣本孵育條件不一致或者是因為標記、雜交、洗滌或 干燥中條件并非最佳。在其他情況下，噪音可能是由于使用全基因組擴增(WGA)如phi-29 或DOP PCR方法擴增的樣本所引起的，其中擴增樣本表現(xiàn)出序列特異性擴增偏好。在初始 的樣本量有限時，例如來自單個細胞或者來自僅幾個細胞的DNA時，使用WGA。這樣的擴增 樣本具有隨基因組的不同部分而改變的DNA產(chǎn)物產(chǎn)量(擴增偏好)，從而將基因組獲得_丟 失噪音疊加到通常會導(dǎo)致在多種分別排列或分析的BAC探針之間形成顯著的樣本/參照比 值反應(yīng)差異的分析上。補償這一噪音的標準方法是使用多種探針以跨越目的基因組序列區(qū) 域，并以某些方式，例如將貫穿基因組區(qū)域的比值反應(yīng)取平均值、利用多種探針的復(fù)合結(jié)果 來作出貫穿該區(qū)域的獲得_丟失結(jié)論。在寡核苷酸CGH陣列中，將多種分別排列或者分析 的探針之間的比值取平均值是特別常見的，這通常表現(xiàn)出比BAC陣列更大的探針與探針之 間的比值差異。遺憾的是，為了增加可信度而使用針對同一區(qū)域的多種分別排列或分析的探針可 能受到限制。例如，存在這樣的固定探針陣列的布局，其中使用多種分別排列或分析的探針 來檢測各非整倍性問題重重。一些CGH陣列形式局限于其能容納的探針數(shù)目。所述陣列的 一個實例是印在微量板孔底部的陣列，或者印在顯微鏡用載玻片基底上一個小區(qū)域上的陣 列，所述基底被構(gòu)造成可在單個基底上容納多個獨立的樣本。這些陣列通常使用9(3X3點 陣列矩陣)至100(10X10)種探針。在所述100重的例子中，最多能容納4種探針來對24 條染色體(1-22，X和Y)中的每一條進行計數(shù)，并且對于染色體計數(shù)法而言，陣列的整個容 量將被有效地用盡。除了平面微陣列之外，另一種同時使用多種探針來測量樣本中的基因組獲得和 丟失的方法是使用一系列固定有探針的編碼顆?；蛭⑶?。使用最為廣泛的顆粒平臺是 Luminex xMAP系統(tǒng)，所述系統(tǒng)使用熒光顏色編碼來區(qū)分一百個不同的微球或小球類型。在 基因組獲得-丟失分析中，該系統(tǒng)可以支持最多達100種不同的探針。同微陣列一樣，這一 編碼微球平臺并不支持對由競爭性雜交得到比值的雙染雙色讀數(shù)，但是通過對各測試樣本 和參照樣本進行獨立的并行分析、進行恰當(dāng)?shù)貥藴驶⒂嬎惚戎悼梢陨上嗤谋戎?。在最大探針?shù)受到局限的這些多重分析形式中，一直都需要對最多24條染色體 (1-22，加上X和Y)的非整倍性進行可靠地分析、但不為此目的而使用全部或者即使大部 分的可能的探針系列。例如，在先天性障礙分析系列中，通常最希望的是不僅要探測非整 倍性，還要探測幾種微缺失障礙。同樣地，使用一種或者兩種低分辨力的探針而非更多的 常規(guī)探針，可以穩(wěn)定地進行微缺失障礙分析(例如WoIf-Hirschhorn、Willams-Beuren, Cri-du-Chat等)，從而在探針受限的平臺上分析更多障礙。類似地，在癌癥細胞遺傳學(xué)中， 除了所需解析力為整條染色體或者染色體臂丟失的其他區(qū)域之外，通常還有幾個需要相當(dāng) 高解析力的獲得-丟失數(shù)據(jù)的區(qū)域。當(dāng)僅需要低解析力的基因組區(qū)域并不利用系列中相當(dāng) 數(shù)量的探針，從而為更多針對需要更高解析力的區(qū)域的探針騰出了分析平臺容量時，這些 系列將更為有用。因此，需要這樣的方法和組合物，其能可靠地分析染色體水平和染色體臂水平的 獲得和丟失，同時使得可以選擇用一種或者多種較高解析力的探針同時地分析其他的基因 組區(qū)域。
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發(fā)明內(nèi)容
本文描述了一種分析DNA樣本的方法，所述方法包括提供一種與基底相連的復(fù)合 核酸探針。所述復(fù)合核酸探針含有與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個或者更多個基因組座 位特異性雜交的核酸序列。所述基因組區(qū)域的特征在于具有第一末端和第二末端以及置于 所述末端之間的至少400kb的中間區(qū)域。所述復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述基因組 區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性地雜交的核酸序列，以及基本上與含有所述第 二末端的完整第二基因組座位特異性地雜交的核酸序列。所述第一基因組座位和第二基因 組座位通常各自含有至少約lOOkb。任選地，復(fù)合探針的核酸序列與所述基因組內(nèi)的其他座 位特異性地雜交。與基底相連的復(fù)合核酸探針在足以實現(xiàn)特異性雜交的嚴格度下與樣本基因組DNA 雜交。與基底相連的復(fù)合核酸探針也與參照基因組DNA雜交。檢測指示所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與所述樣本基因組DNA特異性雜交的 第一信號，同時檢測指示所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與所述參照基因組DNA特異性雜 交的第二信號。將所述第一信號與所述第二信號進行比較，從而檢測所述第一和第二信號 之間的差異，所述差異指示所述樣本DNA和所述參照DNA之間的差異。與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個或者更多個基因組座位特異性雜交的核酸 序列可以來源于兩個或者更多個大插入DNA載體。例如，所述核酸序列來源于兩個或者 更多個大插入DNA載體，例如細菌人工染色體、酵母人工染色體、人類人工染色體、黏粒、質(zhì) 粒、噬菌粒、噬菌體DNA和F黏粒。與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個或者更多個基因組 座位特異性雜交的核酸序列可以來源于分離的染色體和/或分離的染色體片段。在一個具體的可選方案中，與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個或者更多個基因 組座位特異性雜交的核酸序列為來源于兩個或者更多個大插入DNA載體、分離的染色體、 分離的染色體片段或者這些或者其他核酸來源的組合的擴增子。在一個具體的可選方案中，基底為多個顆粒如多個編碼顆粒。在另一個可選方案 中，所述基底為平面基底。與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個或者更多個基因組座位特異性雜交的核酸 序列各自的長度范圍為約20-250，000個核苷酸，包括端值。本文提供了一種分析樣本核酸的方法，所述方法包括提供包含兩個或者更多個編 碼顆粒系列的混合物的多重試劑，所述編碼顆粒系列被編碼，從而使得每一編碼顆粒系列 的各個顆粒均可檢測地區(qū)別于其他每一編碼顆粒系列的各個顆粒。所述編碼顆粒含有所連 接的與參照基因組的至少一個基因組座位特異性雜交的核酸序列，并且至少一個編碼顆粒 系列含有所連接的復(fù)合核酸探針。所述多重試劑可同時地或者平行地與樣本基因組核酸并與參照核酸雜交。檢測指示所述連接的核酸序列與可檢測地標記的樣本核酸特異性雜交的第一信 號以及指示所述連接的核酸序列與可檢測地標記的參照核酸特異性雜交的第二信號。然后 鑒定所述編碼顆粒，從而將顆粒編碼情況與所述第一信號或與所述第二信號聯(lián)系起來。然 后比較各個編碼顆粒系列的所述第一信號和所述第二信號，并且所述第一和第二信號的差 異指示所述樣本和所述參照核酸之間的差異。
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本文提供了一種用于分析核酸的試劑，所述試劑含有與固體基底相連的第一復(fù)合 核酸探針。所述第一復(fù)合核酸探針包含與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個或者更多個基因 組座位特異性雜交的核酸序列。所述基因組區(qū)域的特征在于具有第一末端和第二末端以及 置于所述第一末端和第二末端之間的至少400kb的中間區(qū)域。所述第一復(fù)合核酸探針包含 基本上與含有所述基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性雜交的核酸序列，以 及基本上與含有所述基因組區(qū)域第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的核酸序列。在一個具體的可選方案中，用于分析核酸的試劑含有至少兩種復(fù)合探針，并且可 以包括更多種復(fù)合探針。例如，與固體基底相連的第二復(fù)合核酸探針含有與參照基因組的 第二基因組區(qū)域中兩個或者更多個基因組座位特異性雜交的核酸序列。所述第二基因組區(qū) 域的特征是具有第一末端和第二末端，并且具有置于所述第一末端和第二末端之間的至少 400kb的中間區(qū)域。所述第二復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述第二基因組區(qū)域第一末 端的完整第一基因組座位、以及基本上與含有所述第二基因組區(qū)域第二末端的完整第二基 因組座位特異性雜交的核酸序列。在一個可選方案中，所述固體基底是平面基底。含有一種或者多種復(fù)合探針的陣 列可以包含在平面基底上。在另一個可選方案中，非復(fù)合探針也可以包含在該平面基底上， 從而提供一組復(fù)合探針和其他探針。在另一方面，所述固體基底為第一種多個顆粒。第二種復(fù)合探針或非復(fù)合探針可 以與第二種多個顆粒連接。所述第一種多個顆粒和所述第二種多個顆粒被可區(qū)別地編碼，用于某些分析類型 中。任選地，混合所述第一種多個和第二種多個可區(qū)別地編碼顆粒，從而提供一種多重分析 試劑。連接有額外探針的額外顆?？梢砸远嘀胤治鲂问交蛘擢毩⒎治鲂问接糜诒疚乃枋?的核酸分析中。本文提供了一種制備用于分析DNA的與基底相連的復(fù)合核酸探針試劑的方法，所 述方法包括分離基本上與含有參照基因組的基因組區(qū)域的第一末端的完整第一基因組座 位特異性雜交的第一核酸序列。所述方法包括分離基本上與含有參照基因組的基因組區(qū)域 的第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的第二核酸序列?；旌纤龅谝缓退龅诙?核酸序列，從而制備復(fù)合探針，并隨后將所述復(fù)合探針連接到固體基底，從而制備與基底相 連的復(fù)合核酸探針試劑，用于分析核酸如基因組DNA。在一個具體的可選方案中，所述第一核酸序列分離自第一種大插入載體，所述第 二核酸序列分離自第二種大插入載體。例如，所述第一核酸序列分離自第一種BAC，所述第 二核酸序列分離自第二種BAC。任選地，在混合之前或者之后擴增所述第一和所述第二核酸序列。具體實施方案提供了利用兩種或者多種參照樣本的方法。具體實施方案提供了分析DNA樣本的方法，所述方法包括提供與基底相連的核 酸探針；使所述與基底相連的核酸探針與獲自受試者的樣本基因組DNA雜交；使所述與基底相連的核酸探針與第一種參照基因組DNA雜交；并使所述與基底相 連的核酸探針與第二種參照基因組DNA雜交。隨后檢測指示所述與基底相連的核酸探針與 所述樣本基因組DNA特異性雜交的第一信號、指示所述與基底相連的核酸探針與所述第一 種參照基因組DNA特異性雜交的第二信號以及指示所述與基底相連的核酸探針與所述第二種參照基因組DNA特異性雜交的第三信號。比較所述第一信號和所述第二信號，從而檢 測所述第一信號和第二信號之間的差異，所述第一和第二信號的差異指示所述樣本DNA和 所述第一種參照DNA之間的差異。還比較所述第一信號和所述第三信號，從而檢測所述第 一和第三信號之間的差異，所述第一和第三信號之間的差異指示所述樣本DNA和所述第二 種參照DNA之間的差異。任選地，根據(jù)分析所述DNA樣本的方法的實施方案，將所述樣本DNA和所述第一種 參照DNA之間的差異與所述樣本DNA和所述第二種參照DNA之間的差異進行比較。在又一個可選方案中，所述第一種參照基因組DNA包括男性特異的基因組DNA，所 述第二種參照基因組DNA包括女性特異的基因組DNA，從而使得對所述第一和第二信號的 差異的比較以及所述第一和第三信號的差異的比較可指示受試者的性別。在另一個可選方案中，所述第一種參照基因組DNA包括第一種病癥特異的基因組 DNA,所述第二種參照基因組DNA包括第二種病癥特異的基因組DNA。因此，對所述第一和第 二信號的差異的比較與所述第一和第三信號的差異的比較可指示所述受試者的疾病狀態(tài)?！嵤┓桨柑峁┝诉@樣的方法，其中所述第一種參照基因組DNA包括第一種病 癥特異的基因組DNA，所述第二種參照基因組DNA包括第二種病癥特異的基因組DNA，并且 對所述第一和第二信號之間的差異的比較以及對所述第一和第三信號之間的差異的比較 指示了所述受試者的新陳代謝年齡。所述與基底相連的核酸探針可以包含多個編碼顆粒和/或一個平面基底。任選 地，所述與基底相連的核酸探針包括多種寡核苷酸和/或多種擴增子。所述與基底相連的 核酸探針可以包括分離自大插入DNA載體和/或分離的染色體DNA的插入DNA。本發(fā)明的實施方案提供了分析DNA樣本的方法，所述方法包括提供含有連接有 擴增子的編碼顆粒的第一編碼顆粒系列。所述擴增子包含合在一起基本上代表完整第一模 板DNA序列的隨機核酸序列。使所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的樣本 DNA、可檢測地標記的第一種參照DNA以及可檢測地標記的第二種參照DNA雜交。檢測指示 所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的樣本DNA特異性雜交的第一信號。檢測 指示所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的第一種參照DNA特異性雜交的第 二信號。檢測指示所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的第二種參照DNA特異 性雜交的第三信號。比較所述第一信號和所述第二信號，以檢測所述第一和第二信號之間 的差異，所述第一和第二信號的差異指示所述樣本DNA和所述參照DNA之間的差異。比較 所述第一信號和所述第三信號，以檢測所述第一和第三信號之間的差異，所述第一和第三 信號的差異指示所述樣本DNA和所述第二種參照DNA之間的差異。在一個任選方案中，所述擴增子的長度范圍為大約500-1200個核苷酸，包括端 值。具體實施方案的方法還包括提供含有連接有擴增子的編碼顆粒的第二編碼顆粒 系列，其中所述擴增子包含合在一起基本上代表完整第二模板DNA序列的隨機核酸序列。 使所述第二編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的樣本DNA、可檢測地標記的第一種參 照DNA和可檢測地標記的第二種參照DNA雜交。檢測指示所述第二編碼顆粒系列的擴增子 與可檢測地標記的樣本DNA特異性雜交的第一信號。檢測指示所述第二編碼顆粒系列的擴 增子與可檢測地標記的第一種參照DNA特異性雜交的第二信號。檢測指示所述第二編碼顆
11粒系列的擴增子與可檢測地標記的第二種參照DNA特異性雜交的第三信號。比較所述指示 所述第二編碼顆粒系列的擴增子的特異性雜交的第一信號和所述指示所述第二編碼顆粒 系列的擴增子的特異性雜交的第二信號，以檢測所述第一信號和第二信號之間的差異，所 述第一和第二信號的差異指示所述樣本DNA和所述第一種參照DNA之間的差異。比較所述 指示所述第二編碼顆粒系列的擴增子的特異性雜交的第一信號和所述指示所述第二編碼 顆粒系列的擴增子的特異性雜交的第三信號，以檢測所述第一和第三信號之間的差異，所 述第一和第三信號的差異指示所述樣本DNA和所述第二種參照DNA之間的差異。任選地，所述第一和第二編碼顆粒系列以混合物的形式提供。檢測顆粒編碼情況， 從而將各顆粒系列的身份與通過樣本和參照DNA雜交獲得的具體信號聯(lián)系起來。


圖1是示出一個實施方案的流程圖，該實施方案包括使用兩個擴增反應(yīng)由模板 DNA制備擴增子，并將擴增子作為探針固定于一系列編碼小球上，其中該系列中的小球均具 有相同的ID代碼；圖IA是示出一個實施方案的流程圖，該實施方案包括由單個BAC克隆制備BAC擴 增子，并將該擴增子作為探針固定到一系列編碼小球上，從而形成一個小球系列，其中該系 列中的小球全都具有相同的ID代碼；圖2是示出一個實施方案的流程圖，所述實施方案包括混合m個不同的編碼小球 系列，各系列均具有其各自被固定的BAC-擴增子探針DNA，它們合在一起形成多重編碼小 球系列；圖3是示出一個實施方案的流程圖，所述實施方案包括使用多重編碼小球系列在 η個樣本上進行多重基因組獲得和丟失分析；圖3Α為示出一個實施方案的流程圖，所述實施方案包括使用多重編碼小球系列 在η個樣本上進行多重基因組獲得和丟失分析；圖4為SBS標準的96孔微孔板的模式圖，其示出了平行地對46份樣本運行分析 的兩份對照和兩份樣本的示例性位置；圖5為使用男性的13號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù) 的一個實例；圖6為使用男性的18號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù) 的一個實例；圖7為使用女性的21號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù) 的一個實例；圖8為使用具有X染色體5拷貝擴增的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個實 例；圖9為一張圖表，其示出了用于在示例性分析中形成固定到編碼小球上的擴增子 的BAC克隆、其染色體和CytoBand位置、陰性對照寡核苷酸的序列和固定有各擴增子探針 的小球系列的小球ID (Luminex小球區(qū))；圖IOA是示出根據(jù)本文所述方法的一個方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡化 流程圖IOB是示出根據(jù)本文所述方法的一個方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡化 流程圖；圖11是示出根據(jù)本文所述方法的一個方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡化流 程圖；圖12是由測試分析獲得的數(shù)據(jù)繪制的圖，示出了復(fù)合探針與DiGeorge綜合征參 照DNA樣本的使用；圖13是一幅示出由使用兩種參照基因組DNA樣本的Luminex小球陣列獲得-丟 失分析得到的比值數(shù)據(jù)的圖；和圖14是一幅示出由使用兩種參照基因組DNA樣本的Luminex小球陣列獲得-丟 失分析得到的比值數(shù)據(jù)的圖。
具體實施例方式本文提供了與染色體獲得和丟失分析相關(guān)的方法和組合物。泛泛的說，本文描述 了與使用與基底相連的核酸探針的基因組DNA獲得和丟失分析相關(guān)的方法和組合物。本文使用的科技術(shù)語旨在具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。這 些術(shù)語在多部權(quán)威的參考書中被定義和使用，所述參考書例如包括J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd Ed. ,2001 ；F. Μ. Ausubel, Ed. , Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed. , 2002 ；B.Alberts et al. , Molecular Biology of the Cell,4th Ed. , Garland,2002 ；D.L. Nelson and Μ. M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry,4th Ed. , W. H. Freeman & Company,2004 ； 禾口 Herdewijn, P. (Ed·), Oligonulceotide Synthesis :Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press，2004。本文所使用的術(shù)語“核酸”是指任何形式(包括單鏈、雙鏈的寡核苷酸或多核苷 酸)的具有多于1個核苷酸的RNA或DNA分子。泄本文所使用的術(shù)語“探針”是指用于識別靶核酸的核酸，所述靶核酸與所述探針特
異性結(jié)合。用于本文所述分析中的核酸探針可以包括細胞或者生物體的基因組的全部的或 者部分。所述核酸探針可以包括表現(xiàn)為一條或者多條染色體、染色體的一部分、基因座、基 因或基因的一部分的DNA。所述核酸探針可以為任何形式如載體中的插入物，所述載體例 如包括細菌人工染色體、酵母人工染色體、人類人工染色體、黏粒、質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體DNA 或F黏粒。所述核酸探針可以是顯微切割的染色體DNA形式。因此，盡管本文描述的具體 實例是作為核酸探針DNA來源的BAC，但是也可以使用其他類型的克隆，如PAC、YAC、黏粒、 F黏粒、cDNA等。在具體應(yīng)用中，核酸被用作用于擴增的模板材料，所得到的擴增子或其部分被用 作探針。用于形成核酸探針、樣本或者參照的核酸均通過本領(lǐng)域已知方法獲得，例如如 J.Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring
13Harbor Laboratory Press ；3rd Ed. ,2001 或 F. Μ. Ausubel, Ed. , Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed.，2002 所述。核酸還可以購買獲得和 / 或使用市售試劑盒獲得。復(fù)合探針具體實施方案提供了一種復(fù)合核酸探針，所述復(fù)合核酸探針含有與參照基因組中 目標基因組區(qū)域的兩個或者更多個基因組座位特異性雜交的核酸序列。所述基因組區(qū)域的 特征是具有第一末端和第二末端以及置于所述末端之間的至少400kb的中間區(qū)域。復(fù)合核 酸探針包含基本上與含有基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性雜交的核酸 序列，以及基本上與含有第二末端的完整第二基因組座位特異性地雜交的核酸序列。第一 基因組座位和第二基因組座位通常分別都含有至少大約lOOkb，并且可以更大。與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個或者更多個基因組座位特異性雜交的核酸序 列可以來源于兩個或者更多個大插入DNA載體。例如，所述核酸序列來源于兩個或者更多 個大插入DNA載體，如細菌人工染色體、酵母人工染色體、人類人工染色體、Pl來源的人工 染色體(PAC)、黏粒、質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體DNA和F黏粒。與參照基因組的基因組區(qū)域中兩 個或者更多個基因組座位特異性雜交的核酸序列也可以來源于分離的染色體和/或分離 的染色體片段。在一個具體的可選方案中，與參照基因組的基因組座位中兩個或者更多個基因組 座位特異性雜交的核酸序列為由來源于兩個或者更多個大插入DNA載體、分離的染色體、 分離的染色體片段或者這些或其他核酸來源的組合的模板擴增得到的擴增子。在具體實施方案中，與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個或者更多個基因組座位特 異性雜交的核酸序列以寡核苷酸和/或多核苷酸的形式提供，其各自的長度范圍為大約 20-250，000個核苷酸，包括端值，并且合在一起基本上可與含有所述基因組區(qū)域第一末端 的完整第一基因組座位特異性雜交，并基本上與含有所述基因組區(qū)域第二末端的完整第二 基因組座位特異性雜交。因此，復(fù)合探針可以含有2種或更多種BAC的匯集物(pool)，或者來源于2種或 更多種BAC的插入DNA。任選地，所述匯集物可以含有來源于4種至約100種BAC (包括端 值)的插入DNA。所述探針DNA可以提取自經(jīng)培養(yǎng)的BAC，或者在一個具體的實施方案中， 可以為利用例如簡并寡核苷酸引物(DOP)PCR或連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR由BAC DNA獲得的擴 增子?？梢允褂闷渌蟛迦胛锟寺∪鏟AC、YAC、黏粒、F黏粒等來替代BAC。也可以使用大 量寡核苷酸的匯集物。在一個具體的方面，固定的復(fù)合探針可以是來源于經(jīng)分選的染色體的DNA?？梢?使用分選細胞的流式細胞儀(也稱為熒光激活的細胞分選儀；FACS)來形成經(jīng)分選染色體 的匯集物，其中所述分選以對基因組的AT富集區(qū)和GC富集區(qū)特異的染料之間的信號比為 基礎(chǔ)。由所述經(jīng)分選染色體提取的DNA可以通過WGA擴增，并用熒光染料標記，以在中期染 色體FISH分析中用作染色體涂染探針。類似地，染色體臂涂染探針也可以通過以下方式制 備對利用激光捕獲顯微切割從中期染色體展片(metaphase spread)分離的經(jīng)分選染色 體臂的DNA進行擴增。以微點陣形式固定或者固定在編碼顆粒上的固定全染色體或染色體 臂探針產(chǎn)生分別代表跨越所述全染色體或臂的平均獲得或者丟失情況的雜交比信號，其方 式與跨越整個染色體或臂的頗為大量的BAC匯集物相似。
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復(fù)合探針在多重基因組獲得_丟失分析(例如本文所述的多重基因組獲得_丟失 分析)中起到多種作用。它們包括染色體計數(shù)(非整倍性檢測)、微缺失或其他綜合征的檢 測或者作為對照。將復(fù)合探針用作對照來確定正常的常染色體應(yīng)答(當(dāng)前樣本/參照比值 的水平=1.0)可以對較大跨度的基因組上的應(yīng)答取平均，從而可以降低個體之間的正常 拷貝數(shù)差異所引起的比值噪音。制備復(fù)合探針的方法本文提供了一種制備與基底相連的用于分析DNA的復(fù)合核酸探針試劑的方法。分 離基本上與含有參照基因組的基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性雜交的 第一核酸序列。另外，分離至少一種基本上與含有所述參照基因組DNA的所述基因組區(qū)域 第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的第二核酸序列。術(shù)語“分離”在用于核酸時是 指核酸與同其天然一起存在的其他物質(zhì)(如細胞、蛋白和其他核酸)基本分離?；旌纤?第一和所述第二核酸序列，從而制備復(fù)合探針，并在隨后將所述復(fù)合探針連接到固體基底， 從而制備與基底相連的復(fù)合核酸探針試劑，用于分析核酸如基因組DNA。在一個具體的可選方案中，所述第一核酸序列分離自第一種大插入載體，所述第 二核酸序列分離自第二種大插入載體。例如，所述第一核酸序列為分離自第一種BAC的DNA 插入物，所述第二核酸序列為分離自第二種BAC的DNA插入物。在又一個可選方案中，所述第一核酸序列為分離自第一種BAC的人類基因組DNA 插入物，所述第二核酸序列為分離自第二種BAC的人類基因組DNA插入物。任選地，在混合之前或者之后擴增所述核酸序列。例如，在混合之前或者之后擴增 所述第一和所述第二或者更多的核酸序列。由復(fù)合探針中核酸序列靶向的基因組座位的數(shù)目并不局限于兩種，可以為三種、 四種或更多種，如大約4-100種或更多種。因此，同樣地，與基因組座位特異性雜交的具體 核酸序列的數(shù)目也不局限于兩種，可以為三種、四種或更多種，如大約4-100種或更多種。復(fù)合探針的一個實例是使用來自五種BAC的插入DNA制備的復(fù)合探針，所述插入 DNA被定位到與DiGeorge微缺失綜合征相對應(yīng)的CytoBand 22pll. 2。所用五種BAC的中 心座位跨越大約0. 45mb (445kb)，對于175kb的典型BAC長度，所述總跨度略高于600kb。 對從所述五種BAC中每一種分離的插入DNA進行擴增，并將所得到的擴增子匯集起來制備 復(fù)合探針。隨后將所述復(fù)合探針連接到一個系列的Luminex編碼多重微球，所述微球全都 具有相同的小球編碼身份，用于在多重基因組獲得-丟失分析中用作22pll. 2 CytoBand探 針。因此，在一個具體的實例中，2種、3種、4種、5種或更多種，(如6_100種或更多種) 來自BAC或其他大插入載體的插入物，可以用作與確定基因組區(qū)域中具體基因組座位特異 性雜交的核酸序列。用于連接探針(包括復(fù)合探針)的固體基底(包括半固體基底)，可以為多種材料 中的任何一種，如玻璃；塑料，如聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍；紙；硅；硝酸纖維素；或核酸可以 與之連接以用于進行分析的任何其他材料。所述基底可以為多種形式或者形狀中的任何一 種，包括平面的(如硅片和玻璃板)和三維的(如顆粒、微量滴定板、微量滴定孔、針、纖維
寸J ο
在具體的方面，與探針相連的固體基底為顆粒。與探針相連的顆?？梢詾槿魏翁结樋膳c之相連的固體或半固體顆粒，該顆粒適合 核酸雜交分析，并且在雜交和檢測條件下是穩(wěn)定的且不溶的。所述顆?？梢詾槿魏涡螤?(如圓柱形、球形等)、尺寸、組成或具有任何理化特征?？梢詫α６然蚪M成進行選擇，從而 使得顆?？梢栽诶缇哂刑囟讖降倪^濾器上或者通過一些其他的物理性質(zhì)(如磁性)與 流體相分離。所使用的微粒如微球的直徑可以小于一毫米，例如，直徑的尺寸范圍為約0. 1 至約1，000微米(包括端值)，如直徑為約3-25微米(包括端值)，或者直徑為約5-10 微米(包括端值)。所使用的納米顆粒如納米小球的直徑可為約1納米(nm)至約 100, OOOnm(包括端值)，例如，尺寸范圍為約10-1，OOOnm(包括端值)，或者例如，尺寸范圍 為200-500nm (包括端值)。在某些實施方案中，所使用的顆粒為小球，特別是微球和納米小 球。舉例來說，顆粒為有機或無機顆粒，如玻璃或金屬顆粒，并且可以為合成的或者天 然的聚合物的顆粒，所述聚合物如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚硅酮(silicon)、尼龍、纖維素、瓊 脂糖、葡聚糖和聚丙烯酰胺。在具體的實施方案中，顆粒為乳膠小球。在具體的實施方案中，所使用的顆粒含有用于連接核酸的官能團。例如，顆粒可 以含有羰基、胺、氨基、羧酸基團、鹵素、酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、一氧化氮、環(huán)氧基和 /或甲苯磺?；倌軋F。顆粒的官能團、對其的修飾及其與化學(xué)部分(如核酸)的連接為 本領(lǐng)域所熟知，例如如 Fitch, R. Μ. , Polymer Colloids :A Comprehensive Introduction, Academic Press, 1997中所述。美國專利No. 6，048, 695描述了一種用于將核酸探針如擴增 子連接到基底如顆粒上的示例性方法。在另一個具體的實例中，1-乙基-3_[3-二甲基氨丙 基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC或EDAC化學(xué)品)可以用來將核酸連接到編碼顆粒。編碼顆粒為基于某個特征可以與其他顆粒區(qū)分開的顆粒，所述特征例如包括光學(xué) 性質(zhì)如顏色、反射指數(shù)和/或壓印圖案或光學(xué)可檢測的圖案。例如，可以使用光學(xué)標簽、化 學(xué)標簽、物理標簽或者電學(xué)標簽來編碼顆粒。編碼顆粒可以含有一個或者多個熒光團或與 之相連，所述熒光團可以通過例如激發(fā)和/或發(fā)射波長、發(fā)射強度、激發(fā)態(tài)壽命或這些的組 合、或者其他光學(xué)特征進行區(qū)分?？梢允褂霉鈱W(xué)條形碼來對顆粒進行編碼。在具體的實施方案中，一個顆粒系列的各顆粒均用相同的代碼進行編碼，從而使 得一個顆粒系列的各顆粒都可以與另一個顆粒系列的各顆粒區(qū)分開。在其他實施方案中， 可以對單個顆粒系列使用兩種或者多種代碼。例如，各顆粒都可以含有獨特的代碼。在某 些實施方案中，顆粒編碼包含一個代碼，但不包含顆粒與對基因組DNA特異的核酸探針之 間的聯(lián)系，或者兼而有之。在具體的實施方案中，代碼鑲嵌在例如顆粒內(nèi)部，或者以在雜交和分析期間穩(wěn)定 存在的方式與顆粒相連?？赏ㄟ^任何可檢測的方式提供代碼，如通過全息編碼，通過熒光性 質(zhì)、顏色、形狀、尺寸、光發(fā)射、量子點發(fā)射等，以鑒定顆粒，并由此鑒定固定于其上的捕獲探 針。在一些實施方案中，代碼不是由核酸提供。一個示例性平臺利用浸漬于聚合物顆粒內(nèi)的熒光染料的混合物，作為鑒定固定有 特定俘獲探針的顆粒系列的每個成員的工具。另一個示例性平臺使用全息條碼來鑒定圓 柱形玻璃顆粒。例如，Chandler等人(美國專利No. 5，981，180)描述了一種基于顆粒的系統(tǒng)，其中不同的顆粒類型由不同比例的兩種或更多種浸漬于聚合物顆粒內(nèi)的熒光染料的 混合物編碼。Soini (美國專利No. 5，028，545)描述了一種基于顆粒的多重分析系統(tǒng)，該系 統(tǒng)采用時間分辨熒光進行顆粒鑒定。Fulwyler(美國專利No. 4，499，052)描述了一種使 用通過顏色和/或尺寸區(qū)分的顆粒的示例性方法。美國專利申請公開文本20040179267、 20040132205、20040130786、20040130761、20040126875、20040125424 和 20040075907 描述 了由全息條碼編碼的示例性顆粒。美國專利No. 6，916，661描述了與納米顆粒有關(guān)的聚合 物微粒，所述納米顆粒具有為顆粒提供代碼的染料。盡管本文詳細描述的一個實施方案利用的是Luminex編碼小球平臺，但是也可以 使用其他類型的編碼顆粒分析平臺，如VeraCode小球和BeadXpress系統(tǒng)(Illumina Inc.， San Diego CA)、xMAP 3D (Luminex)等?？梢允褂么判訪uminex小球，該小球使得可以使用 板狀磁鐵和移液管而不使用過濾板和多頭抽真空裝置進行洗滌步驟。這其中的每一個平臺 通常都以羰基小球的形式提供，但是也可以對其進行構(gòu)建，從而使其含有不同的偶聯(lián)化學(xué) 組成，如氨基-硅烷。與基底的連接核酸探針與基底的連接可以通過將核酸有效地鍵合到固體或半固體基底的多種 方法中的任何一種實現(xiàn)，舉例說來，所述方法包括吸附和化學(xué)鍵合。核酸可以直接地鍵合至 所述編碼顆粒的材料，或者間接地(例如通過鍵合至分布于顆粒之上的包衣或接頭)鍵合 至所述編碼顆粒。可以合成核酸，并且/或者在合成后對其進行修飾，從而使其含有用于將 所述核酸鍵合至顆粒的官能團。例如，用作探針的核酸序列可以含有羰基、胺、氨基、羧酸基 團、鹵素、酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、一氧化氮、環(huán)氧基和/或甲苯磺酰基官能團。與基底相連的探針(包括復(fù)合探針)可以為單鏈的和/或雙鏈的核酸。在具體實 施方案中，在雙鏈核酸被連接時，在將其固定于基底之后使其變性成為單鏈以進行制備，從 而用于分析方法的某些實施方案中。任選地，在固定之前使雙鏈核酸探針變性，然后將單鏈 的核酸連接至基底。擴增子試劑組合物在具體實施方案中，提供了一種用于分析核酸的試劑，所述試劑包含連接有作為 探針的擴增子的多個編碼顆粒。在其他具體實施方案中，所連接的擴增子由多于一種模板擴增得到，從而形成了 復(fù)合探針。在某些實施方案中，與多個編碼顆粒連接的擴增子每一個都含有與模板基因組核 酸的一部分相同或者完全互補的核酸序列，并且所述擴增子合在一起基本上代表完整的模 板基因組核酸。圖1示出一種制備用于分析基因組DNA的試劑的方法的一個實施方案。如圖1所 示，提供了一個模板核酸(1)。使用筒并寡核苷酸引物(DOP)在第一擴增反應(yīng)中擴增所述模 板(2)，從而產(chǎn)生第一擴增產(chǎn)物。所述模板核酸可以是能夠使用核酸擴增方法被復(fù)制的任何核酸。用于所述第一擴增反應(yīng)的模板DNA任選地為基因組DNA，其大小范圍通常為約 20-300kb，但是該模板也可以更小或者更大。術(shù)語“基因組的”指細胞或者生物體的基因 組的DNA，其不僅包括由細胞或者生物體的基因組的DNA復(fù)制得到的DNA(如克隆得到的
17DNA)，還包括從細胞或生物體直接分離得到的DNA (如顯微切割的染色體DNA)。模板DNA可 以包括細胞或者生物體的全部的或者部分的基因組。模板DNA可以包括表現(xiàn)為一種或者多 種染色體、染色體的一部分、基因座、基因或基因的一部分的DNA。模板DNA可以為任何形 式，如載體中的插入物，所述載體例如包括細菌人工染色體、酵母人工染色體、人類人工染 色體、黏粒、質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體DNA或F黏粒。模板DNA可以是顯微切割的染色體DNA形 式。因此，盡管本文描述的具體實例是以BAC作為模板DNA來源，但是也可以使用其他類型 的克隆，如PAC、YAC、黏粒、F黏粒、cDNA等。根據(jù)具體的實施方案，可以一起或者分別地擴增來自于這些或者其他來源中任何 一種的多個模板，合并得到的來自所述多個模板的擴增子為復(fù)合探針。模板基因組DNA通過本領(lǐng)域已知的方法獲得，例如描述于以下文獻中的方法 J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd Ed. , 2001,或者 F. M. Ausubel, Ed. , Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed. ,2002。模板 DNA 還可以購買獲得和 / 或 使用分離基因組DNA的商用試劑盒獲得。使用體外擴增方法可以實現(xiàn)對模板DNA的擴增。術(shù)語“擴增方法”指這樣一種方 法或技術(shù)，即所述方法或技術(shù)用于復(fù)制模板核酸，由此產(chǎn)生包括所述模板核酸的全部或者 部分的多個拷貝的核酸，所產(chǎn)生的核酸也稱為擴增子。擴增子任選地含有存在于引物中且不存在于原始DNA模板中的核酸序列。所述引 物來源的核酸增加了功能性，例如用于其他擴增反應(yīng)的引物結(jié)合位點，和/或與基底進行 化學(xué)鍵合的官能團。舉例而言，擴增方法包括PCR、連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR(LM-PCR)、phi_29PCR和其他核 酸擴增方法，例如如 C. W. Dieffenbach et al. , PCR Primer :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2003 ；禾口 V. Demidov et al. , DNA Amplification Current Technologies and Applications, Taylor & Francis, 2004 中所述?？梢允褂镁唧w的DNA模板來源和核酸擴增方法的多種結(jié)合。術(shù)語“寡核苷酸引物”指能夠在合適的反應(yīng)條件下?lián)?dāng)引物延伸產(chǎn)物的合成起始 位點的核酸。寡核苷酸引物的長度通常為約10-30個連續(xù)的核苷酸。寡核苷酸引物與模板 核酸的一個區(qū)域完全互補或者基本互補，因而在雜交條件下，所述寡核苷酸引物與模板核 酸的所述互補區(qū)域退火。引物延伸產(chǎn)物合成的合適反應(yīng)條件包括存在合適的反應(yīng)組分(包 括但不限于聚合酶和核苷三磷酸)。對于適合用于擴增反應(yīng)中的寡核苷酸引物的設(shè)計為本 領(lǐng)域所熟知，例如如 A. Yuryev et al. , PCR Primer Design, Humana Press, 2007 中所述。術(shù)語“簡并寡核苷酸引物”指含有具有隨機或者半隨機核苷酸序列的核酸的引 物。對于適合用于具體核酸擴增反應(yīng)的簡并寡核苷酸引物的設(shè)計為本領(lǐng)域所熟知，例如如 A. Yuryev et al.，PCR Primer Design, Humana Press，2007 中所述?？梢允褂镁哂写蠹s 5-8個核苷酸的隨機或半隨機核苷酸序列。在其他實施方案中，隨機或半隨機核苷酸六聚體 包含在用于第一擴增反應(yīng)的簡并寡核苷酸引物中。在具體的實施方案中所使用的簡并寡核苷酸引物每一個均包含一個5'恒定 DNA區(qū)段、一個中間隨機DNA區(qū)段和一個3'錨定區(qū)段，例如如Fiegler et al.，Genes Chromosomes Cancer,36(4) :361_74,2003 ；禾口 Telenius, et al. , Genomics 13:718—25,
181992中所述。5'恒定DNA區(qū)段任選地具有在所有DOP中均相同的核苷酸序列。3'錨定區(qū)段 任選地具有經(jīng)測定在模板核酸中具有所需出現(xiàn)頻率的核苷酸序列。對具體的核酸序列出現(xiàn) 頻率的分析為本領(lǐng)域所熟知，例如如 Milosavljic,A. and Jurka，J.，1993，Comput. Applic. Biosci. ,9 407-411 ；Pesole, G. et al.，1992，Nucleic acids, Res. ,20 2871-2875 ；和 Hutchinson, G. B.，1996，Comput. Appl. Biosci.，12 :391_398 中所述。在具體的實施方案中，DOP含有約17-25個連續(xù)的核苷酸，其中約7_12個連續(xù)的 核苷酸包含于5'恒定DNA區(qū)段之中，約5-8個連續(xù)的核苷酸包含于隨機DNA區(qū)段之中，約 5-8個連續(xù)的核苷酸包含于3'錨定區(qū)段之中。第一擴增反應(yīng)產(chǎn)生含有多個擴增子的第一反應(yīng)產(chǎn)物。第一反應(yīng)產(chǎn)物中的各擴增子 均含有與DNA模板的一個隨機部分相同或者完全互補的一段DNA序列以及與第一種反應(yīng)弓I 物的5'恒定DNA序列相同的一段DNA序列。本文中使用的術(shù)語“互補的”是指核苷酸之間的沃森-克里克堿基配對，具體地 指核苷酸通過氫鍵彼此鍵合，胸腺嘧啶或尿嘧啶殘基通過兩個氫鍵與腺嘌呤殘基相連，而 胞嘧啶和鳥嘌呤殘基通過三個氫鍵相連。通常，核酸所包含的核苷酸序列被描述為與指定 的第二核苷酸序列具有某一“百分比的互補度”。例如，一段核苷酸序列可以與指定的第二 核苷酸序列具有80%、90%或100%的互補度，這表明一段10個核苷酸的序列中有8個、 9個或者10個核苷酸與指定的第二核苷酸序列互補。例如，核苷酸序列3' -TCGA-5' 與核苷酸序列5' -AGCT-3 ‘ 100%互補。另外，核苷酸序列3' -TCGA-與核苷酸序列 5' -TTAGCTGG-3'的一個區(qū)域100%互補或完全互補。參照圖1，使用第一反應(yīng)產(chǎn)物擴增子作為模板DNA進行第二擴增反應(yīng)(3)。第二擴 增反應(yīng)⑶包括“通用”寡核苷酸引物，之所以這樣稱謂是因為該通用引物與在第一擴增反 應(yīng)中使用的DOP的5'恒定DNA區(qū)段相同或者完全互補。通用寡核苷酸引物包含在第一擴 增反應(yīng)中使用的DOP的5'恒定DNA區(qū)段，所述5'恒定DNA區(qū)段位于該通用引物的3'末 端。通用寡核苷酸引物任選地在其5’末端含有其他連續(xù)的核苷酸。在一個具體的可選方案中，在通用寡核苷酸引物的5’端含有一個官能團，用于將 由第二擴增反應(yīng)產(chǎn)生的擴增子連接至編碼固體或半固體基底如編碼顆粒。例如，在通用寡 核苷酸引物的5’端含有一個胺基基。在另一個可選方案中，可以對由第二擴增反應(yīng)產(chǎn)生的 擴增子進行修飾，從而使其含有用于鍵合至固體或者半固體基底的官能團。修飾核酸從而 使其含有能夠鍵合至固體或者半固體基底的官能團為本領(lǐng)域所熟知。在一個具體的實施方案中，與顆粒相連的每一個單獨的擴增子均含有與模板DNA 序列的一個隨機部分相同的一個DNA區(qū)段。每一個單獨的擴增子均還含有一個恒定DNA區(qū) 段，所述恒定DNA區(qū)段同與模板DNA序列的一個隨機部分相同的DNA區(qū)段毗鄰。擴增子的 恒定DNA區(qū)段任選地含有一個末端官能團，用于將擴增子連接到編碼顆粒。在一個具體的 實施方案中，所述擴增子的恒定DNA區(qū)段含有一個5'末端胺基團，用于將擴增子連接到編 碼顆粒。如圖1所示，將第二反應(yīng)產(chǎn)物的擴增子固定于第一種多個編碼顆粒上(4)。第二擴 增反應(yīng)的擴增子與所述編碼顆粒的連接可通過多種可有效地鍵合核酸與固體或者半固定 基底的方法之一實現(xiàn)，所述方法例如包括吸附和化學(xué)鍵合。擴增子可以與編碼顆粒的材料 直接鍵合，或者與編碼顆粒間接鍵合，例如，通過鍵合至分布于顆粒上的包衣或接頭?？梢院铣蓴U增子，并且/或者在合成后對其進行修飾，從而使其含有一個用于將擴增子鍵合到 顆粒上的官能團。例如，擴增子可以含有羰基、胺、氨基、羧酸基團、商素、酯、醇、脲、醛、氯甲 基、氧化硫、一氧化氮、環(huán)氧基和/或甲苯磺酰基官能團。通常，作為第二擴增反應(yīng)的產(chǎn)物的擴增子是雙鏈的，并且該雙鏈的擴增子與顆粒 相連。因此，所述雙鏈擴增子的兩條鏈都呈現(xiàn)于每一個顆粒之上。在將擴增子固定于顆粒 之后使其變性成為單鏈，以進行制備，從而用于分析方法的具體實施方案中。任選地，在固 定之前使雙鏈擴增子變性，然后將單鏈的擴增子與顆粒相連。如所述，第一和第二擴增反應(yīng)兩者中的每一個擴增子均含有與模板DNA序列的一 個隨機部分相同的一段核酸序列，從而使由第一擴增反應(yīng)產(chǎn)生的擴增子合在一起基本上代 表完整的模板DNA序列，由第二擴增反應(yīng)產(chǎn)生的擴增子合在一起基本上代表完整的模板 DNA序列。用于分析基因組DNA的第一顆粒系列和第一試劑為連接有擴增子的編碼顆粒，所 述擴增子是第二擴增反應(yīng)的產(chǎn)物，其合在一起基本上代表在第一擴增反應(yīng)中用作模板的完 整基因組DNA序列。在具體的實施方案中，與顆粒相連的每一個單獨的擴增子的長度范圍為約 500-1200個核苷酸(包括端值)。因此，通過所連接的由所述模板擴增得到的相對較小的 擴增子，相對較大的模板核酸基本完整地呈現(xiàn)于一個系列的編碼顆粒之上。如上文所述，各顆粒系列均含有連接有擴增子的編碼顆粒，所述擴增子是第二擴 增反應(yīng)的產(chǎn)物，其合在一起基本上代表在第一擴增反應(yīng)中用作模板的完整基因組DNA序 列。含有擴增子的顆粒數(shù)目取決于諸多因素如模板尺寸、擴增子尺寸以及可用于將擴增 子連接到顆粒之上的結(jié)合位點的數(shù)目，所述含有擴增子的顆粒數(shù)目足以使得合在一起基 本上代表在第一擴增反應(yīng)中用作模板的完整基因組DNA序列。通常，足以使得合在一起 基本上代表在第一擴增反應(yīng)中用作模板的完整基因組DNA序列的顆粒數(shù)目的范圍為約 1-10，000 (包括端值)。使用第二種基因組DNA模板進行擴增并將作為第二擴增反應(yīng)的產(chǎn)物的擴增子(如 上所述)連接至第二種多個編碼顆粒，形成了另外的顆粒系列。所述第二種多個編碼顆粒 可檢測地不同于所述第一種多個編碼顆粒，從而形成用于分析基因組DNA的第二編碼顆粒 系列和第二試劑。類似地，將第三種或后續(xù)的基因組DNA模板用于形成擴增反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物，并將 該反應(yīng)產(chǎn)物連接至第三種或后續(xù)的多個編碼顆粒。所述第三種或后續(xù)的多個編碼顆粒中的 每一種均可檢測地不同于其他的每一種多個編碼顆粒，從而獲得用于分析基因組DNA的第 三或后續(xù)的編碼顆粒系列和第三或后續(xù)的試劑。多重試劑某些實施方案提供了一種用于分析基因組DNA的多重試劑，所述多重試劑包含兩 個或更多個顆粒系列的混合物。在具體的實施方案中，每一編碼顆粒系列的各個編碼顆粒 均可檢測地區(qū)別于其他每一編碼顆粒系列的各個編碼顆粒。在具體的實施方案中，至少一個顆粒系列包含復(fù)合探針。任選地，多于一個顆粒系 列包含復(fù)合探針。在具體的實施方案中，每一編碼顆粒系列均連接有擴增子，所述擴增子為如本文
20所述的第二擴增反應(yīng)的產(chǎn)物，并且合在一起基本上代表在第一擴增反應(yīng)中用作模板的完整 基因組DNA序列，其中不同的基因組模板由與其他各編碼顆粒系列相連的擴增子所代表。一個具體實施方案的一種多重試劑包括連接有擴增子的第一編碼顆粒系列和連 接有擴增子的第二編碼顆粒系列，所述與第一編碼顆粒系列相連的擴增子合在一起基本上 代表插入第一細菌人工染色體中的完整模板DNA序列，而所述與第二編碼顆粒系列相連的 擴增子合在一起基本上代表插入第二細菌人工染色體中的完整模板DNA序列。例如，與第一編碼顆粒系列相連的擴增子含有與人13號染色體DNA的一部分相同 的核酸序列，而與第二編碼顆粒系列相連的擴增子含有與人18號染色體DNA的一部分相同 的核酸序列。與第三或后續(xù)的編碼顆粒系列相連的擴增子含有與人的另一染色體或染色體 的另一非重疊區(qū)域的DNA相同的核酸序列。本文所描述的多重試劑可以在單個分析中同時分析多個靶標，如多個基因組座位 (genomic loci)0通過至少混合第一編碼顆粒系列和第二編碼顆粒系列形成了用于分析基因組DNA 的多重試劑。圖2示出了一種形成多重試劑的方法的一個實施方案。如圖所示，任何數(shù)目“m” 的編碼顆粒系列均可以包含在所述多重試劑中。因此，例如，“m”可以為至少2、3、4、5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或 200 個不同的編碼顆粒
系列。一個系列的連接有擴增子的編碼顆粒與一個或者多個其他系列的連接有擴增子的編 碼顆粒聯(lián)合形成用于分析樣本中基因組獲得和丟失的多重試劑。在一個具體的實施方案中，包含結(jié)合的復(fù)合探針的一個編碼顆粒系列與具有結(jié)合 的復(fù)合探針或非復(fù)合探針的一個或多個其他編碼顆粒系列相聯(lián)合，形成用于分析樣本中基 因組獲得和丟失的多重試劑。分析方法具體實施方案提供了一種分析DNA樣本的方法，所述方法包括提供一種與基底相 連的復(fù)合核酸探針。所述復(fù)合核酸探針含有與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個或者更多個 基因組座位特異性雜交的核酸序列。所述基因組區(qū)域的特征在于具有第一末端和第二末端 以及介于所述末端之間的至少400kb的中間區(qū)域。所述復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所 述基因組區(qū)域第一末端的完整第一基因組座位特異性雜交的核酸序列，以及基本上與含有 第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的核酸序列。所述第一基因組座位和第二基因 組座位各自通常含有至少大約lOOkb。任選地，復(fù)合探針的核酸序列與所述基因組區(qū)域中的 其他座位特異性雜交。在又一個可選方案中，參照基因組為一個或者多個人類基因組。與所述基底相連的復(fù)合核酸探針在足以實現(xiàn)特異性雜交的嚴格度下與樣本基因 組DNA雜交。所述與基底相連的復(fù)合核酸探針還在相同或者相似的條件下與參照基因組 DNA雜交，從而可以進行比較。檢測指示所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與所述樣本基因組DNA特異性雜交的 第一信號，以及指示所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與所述參照基因組DNA特異性雜交的 第二信號。比較所述第一信號和第二信號，從而檢測所述第一和第二信號之間的差異，該差 異指示所述樣本DNA和所述參照DNA之間的差異。分析樣本核酸的方法的具體實施方案包括提供含有兩個或者更多個編碼顆粒系
21列的混合物的多重試劑，所述編碼顆粒系列被編碼，從而使每一編碼顆粒系列的各顆粒可 檢測地區(qū)別于其他每一編碼顆粒系列的各顆粒。所述編碼顆粒包含所連接的與參照基因組 的至少一個基因組座位特異性雜交的核酸序列，并且至少一個編碼顆粒系列含有連接的復(fù) 合核酸探針。所述多重試劑同時地或者平行地與樣本基因組核酸和參照核酸雜交。檢測指示所連接的核酸序列與可檢測地標記的樣本核酸特異性雜交的第一信號， 并檢測指示所連接的核酸序列與可檢測地標記的參照核酸特異性雜交的第二信號。然后鑒 定所述編碼顆粒，從而將顆粒編碼情況與所述第一信號或者與所述第二信號聯(lián)系起來。隨 后比較各個編碼顆粒系列的第一信號和第二信號，所述第一和第二信號的差異指示所述樣 本和參照核酸之間的差異。在具體的實施方案中，分析基因組DNA的方法包括提供連接有擴增子的編碼顆 粒，所述擴增子合在一起基本上代表完整的模板基因組核酸。在具體的實施方案中，提供了 連接有擴增子的編碼顆粒，所述擴增子合在一起基本上代表不止一個拷貝的完整的模板基 因組核酸。在具體的實施方案中，準備用于分析基因組獲得和/或丟失的基因組DNA樣本用 可檢測標記進行標記。參照DNA也用可檢測標記進行標記，用于與樣本DNA進行比較。樣 本和參照DNA可以用相同的或者不同的可檢測標記進行標記，這取決于所使用的分析安 排。例如，在具體的實施方案中，用不同的可檢測標記所標記的樣本和參照DNA可以在同一 容器中一起使用，用于同與編碼顆粒相連的擴增子雜交。在其他實施方案中，用相同的可檢
測標記所標記的樣本和參照DNA可以在分開的容器中使用，用于同與顆粒相連的擴增子雜 、-父。術(shù)語“可檢測標記”指可提供可檢測信號并且可以與核酸連接的任何原子或部分 (moiety)。所述可檢測標記的實例包括熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、生物發(fā)光部分、配體、磁性 顆粒、酶、酶底物、放射性同位素和生色團。多種標記樣本和參照核酸如DNA的方法中的任何一種方法均可以用于本分析中， 如核酸的缺口平移或化學(xué)標記。例如，通過使用如下的核苷酸進行聚合反應(yīng)可以引入可檢 測標記，所述核苷酸包括至少一些經(jīng)修飾的核苷酸，如經(jīng)修飾后含有生物素、地高辛、熒光 素或花菁的核苷酸。在一些實施方案中，通過隨機弓I物法和聚合反應(yīng)弓I入可檢測標記。其他 實例包括缺□平移(Roche Applied Science, Indianapolis Ind. ；Invitrogen, Carlsbad Calif.)和化學(xué)標記(Kreatech ULS，Amsterdam NL)。對核酸的可檢測標記為本領(lǐng)域所熟 知，并且可以使用適合標記核酸(例如基因組DNA)的任何標記方法。在又另一個實施方案中，避免用可檢測標記對樣本和參照核酸例如DNA單獨地進 行共價標記。例如，未標記的基因組DNA樣本與固定至編碼顆粒的擴增子雜交。事先標記的 報告序列也在與所述擴增子的俘獲探針序列相鄰但不重疊的序列處與該擴增子_樣本DNA 復(fù)合物和擴增子_參照DNA復(fù)合物雜交。所述經(jīng)標記的報告序列可以在同一或者不同的雜 交反應(yīng)中被雜交。通過這種方式，所述經(jīng)標記的報告序列可以在更大規(guī)模的環(huán)境中被大量 生產(chǎn)，與在分析時單獨地標記每一個樣本相比，降低了每個分析的成本。“樣本”和“參照”核酸例如基因組DNA可以獲自任何適合的來源。本文描述的具體 方法包括使用受試個體的樣本基因組DNA。基因組樣本和/或參照DNA可以從幾乎任何的組織中提取，所述組織包括但不限于血液、羊水、實體瘤、活檢器官、頰部拭子、絨毛膜絨毛、 胚泡和卵裂球、妊娠物、唾液、尿液等。從經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的病理學(xué)樣本 提取的留存樣本同樣也是利用此方法分析的樣本基因組DNA的來源。樣本和/或參照基因 組DNA還可以獲自體外來源如細胞系。從這些來源或其他來源獲得基因組DNA的方法為本 領(lǐng)域所熟知。在具體的實施方案中，就待分析的樣本DNA的具體特征來對參照DNA進行表征。例 如，如果打算對樣本DNA進行分析以檢測具體基因或染色體座位的復(fù)制情況，則對參照DNA 進行表征，從而獲知有多少個拷貝的該基因或者座位包含在參照DNA中。通常，使用來自相 同物種的樣本和參照DNA。參照DNA可以是來源于性別相同的多個正常受試者，特別是人類受試者的基因組 DNA的匯集混合物。匯集自多個正常受試者的DNA可以商購獲得。在一些實施方案中，使用了不止一種參照DNA，并在使用其他參照DNA的方法中獲 得其他的信息。因此，例如，在一個具體的實施方案中，將兩種參照基因組DNA樣本與測試基因組 DNA樣本進行比較。將獲自男性受試者的第一種參照基因組DNA和獲自女性受試者的第二 種參照基因組DNA與獲自性別有待確定的受試者如產(chǎn)前胎兒的測試基因組DNA樣本進行比 較。本發(fā)明分析包括將至少兩種參照基因組DNA樣本與測試基因組DNA樣本相比較， 所述分析的一個具體特征是減少了分析結(jié)果的模糊度，并增加了其可信度。例如，如圖14 所示，在使用男性特異參照和女性特異參照進行分析時，僅用男性特異參照獲得的模糊結(jié) 果被弄清楚?？梢允褂帽疚乃龅姆治鰜頇z測或者表征與染色體獲得或丟失相關(guān)的障礙。先天 的或者天生的障礙包括全部染色體的三體性、較小基因組座位(大約200kb至20mb)的擴 增或缺失以及亞端粒區(qū)域或著絲粒區(qū)域的擴增或缺失。許多癌癥的特征也在于可能與類 型、階段、藥物抗性或治療響應(yīng)有聯(lián)系的染色體獲得和丟失。可以使用本方法就染色體穩(wěn)定 性對實驗室細胞系(包括干細胞系)進行表征。因此，可以使用兩種或者更多種參照基因組DNA樣本，所述樣本代表影響到基因 組DNA的進行性疾病、病癥或障礙的不同階段，并且將所述兩種或者更多種參照與一個基 因組DNA測試樣本進行比較，所述測試樣本來自欲相對于所述參照來確定其病癥的受試個 體。例如，將各種癌癥、其他障礙和/或年齡與基因組DNA的進行性缺失聯(lián)系起來，例如線 粒體DNA缺失與端粒變短。盡管本文所描述的方法和組合物主要涉及來源于人的核酸，但是可以理解的是， 也可以將本文所述的方法和組合物用于分析來源自許多生物體中的任一種的分析樣本基 因組DNA，所述生物體包括但不限于非人類的靈長類、嚙齒動物、兔、狗、貓、馬、牛、豬、山羊 和綿羊。還可以分析非哺乳動物來源的樣本DNA，舉例來說，包括魚和其他水生生物、鳥類、 禽類、細菌、病毒、植物、昆蟲、爬行類、兩棲類、真菌和分支桿菌。同樣地，參照DNA也可以為 人類DNA或者來自于各種生物體中的任何一種的DNA，所述生物體包括但不限于非人類的 靈長類、嚙齒類、兔、狗、貓、馬、牛、豬、山羊、綿羊以及非哺乳動物來源，舉例而言，所述非哺 乳動物來源包括魚和其他水生生物、鳥類、禽類、細菌、病毒、植物、昆蟲、爬行類、兩棲類、真
23菌和分歧桿菌。所述與基底相連的核酸探針與受試個體的可檢測地標記的樣本基因組DNA雜交， 從而實現(xiàn)所述與基底相連的核酸探針與所述樣本和/或參照核酸的特異性雜交。在本文描述的分析的具體實施方案中，與編碼顆粒相連的擴增子與受試個體的可 檢測地標記的樣本基因組DNA雜交，從而實現(xiàn)所述擴增子DNA與所述可檢測地標記的樣本 基因組DNA的特異性雜交。此外，與編碼顆粒相連的DNA序列與可檢測地標記的參照基因
組DNA雜交，由此實現(xiàn)所述擴增子DNA和所述可檢測地標記的參照基因組DNA的特異性雜交。術(shù)語“雜交”是指互補核酸的配對和結(jié)合。出現(xiàn)在兩個核酸之間的雜交程度因諸 如核酸的互補程度、核酸的解鏈溫度Tm和雜交條件的嚴格度等因素而異，正如本領(lǐng)域所熟 知的那樣。術(shù)語“雜交條件的嚴格度”指與具體的常用添加劑如甲酰胺和Denhart’ s溶 液相關(guān)的雜交介質(zhì)的溫度、離子濃度和組成條件。與特定的核酸相關(guān)的具體雜交條件的 確定是常規(guī)的，并且為本領(lǐng)域所熟知，例如如J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd Ed. ,2001 ； 和 F. Μ· Ausube1, Ed. , Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed.，2002中所述。高嚴格度的雜交條件為僅允許基本互補的核酸進行雜交的那些雜交條 件。通常，互補度為約85-100%的核酸被認為是高度互補的，會在高嚴格度條件下雜交。中 嚴格度條件的實例有互補度居中(互補度為約50-84%)的核酸以及互補度高的核酸進行 雜交的條件。相反，低嚴格度的雜交條件為互補度低的核酸進行雜交的那些雜交條件。術(shù) 語“特異性雜交”和“特異性地雜交”是指一具體的核酸與樣本中的目標核酸進行雜交，但 基本不與目標核酸之外的核酸雜交。所述分析可以在任何合適的容器中進行。在具體的實施方案中，例如，在準備分析 多個樣本時，可以使用多室容器。舉例說來，多室容器包括多坑基底，如載玻片、硅片或硅盤 (silicon tray) 0在一些實施方案中，將每個樣本放于多孔板不同的孔之中。例如，多孔板 可以是96-孔、384-孔、1024-孔或者1536-孔分析板。還包括對第一信號的檢測和對第二信號的檢測，所述第一信號指示所連接DNA序 列與受試個體的可檢測地標記的基因組DNA的特異性雜交，所述第二信號指示所連接DNA 序列與可檢測地標記的參照基因組DNA的特異性雜交。使用任何合適的方法來在本文所述的分析中檢測信號，舉例說來，所述方法包括 光譜法、光學(xué)法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、酶學(xué)法、電學(xué)法和/或免疫化學(xué)法。通過評估一個或者多個可檢測標記的信號，可以檢測每一顆粒指示雜交程度的信 號。通常對各顆粒逐一進行評估。例如，可以使顆粒通過流式細胞儀。示例性流式細胞儀 包括 Beckman Coulter 公司(Fullerton Calif.)的 Coulter Elite-ESP 流式細胞儀或 FACScan. TM.流式細胞儀，以及Cytomation，Inc.，F(xiàn)ort Collins，Colo 的M0FL0. TM.流式細 胞儀。除了流式細胞術(shù)之外，還可以將離心機用作顆粒分離和歸類的工具。一個合適的系統(tǒng) 為描述于美國專利No. 5，926，387中的系統(tǒng)。除了流式細胞術(shù)和離心之外，還可以將自由流 動電泳裝置用作顆粒分離和歸類的工具。一個合適的系統(tǒng)為描述于美國專利No. 4，310，408 中的系統(tǒng)。還可以將顆粒置于表面上，并進行掃描或成像。在某些實施方案中，檢測指示所述與基底相連的核酸序列與可檢測地標記的樣本核酸(如受試個體的基因組DNA)特異性雜交的第一信號。還檢測指示所述與基底相連的 核酸探針與可檢測地標記的參照基因組DNA特異性雜交的第二信號。在其他實施方案中，檢測指示所述與編碼顆粒相連的DNA序列與受試個體的可檢 測地標記的基因組DNA特異性雜交的第一信號。同時，檢測指示所述與編碼顆粒相連的DNA 序列與可檢測地標記的參照基因組DNA特異性雜交的第二信號。比較所述第一信號和所述第二信號，從而獲得有關(guān)所述樣本和參照核酸的信息。 在某些實施方案中，比較所述第一信號和所述第二信號，從而獲得有關(guān)受試個體的基因組 DNA與參照基因組DNA相比較的信息。在具體的實施方案中，將與一個或者多個顆粒系列的擴增子雜交的參照DNA和樣 本DNA的可檢測標記的信號比用來評估該樣本和參照DNA之間的差異，所述差異指示例如 基因組獲得和/或丟失。在某些實施方案中，參照DNA和樣本DNA與一個或者多個顆粒系列的探針例如擴 增子在同一個容器(如多孔板的一個孔)中雜交。雜交之后，兩個標記在一起分析，即在雜 交物中同時檢測到兩個可檢測標記，或者，將雜交物分成兩個(或者更多個)部分，分別地 對每一個部分進行評估，從而對可檢測標記進行檢測。可以將評估結(jié)果用來提供所述兩個 可檢測標記的信號比。這種方法使得可以使用競爭性雜交來對各分析之間的任何變異進行 標準化在加入有相同顆粒的同一容器中同時分析參照和實驗樣本。任選地，可檢測地標記的參照DNA和可檢測地標記的樣本DNA與一個或多個顆粒 系列在不同的容器(例如，多孔板的不同孔)中雜交。在另一個實例中，可檢測地標記的參 照DNA和可檢測地標記的樣本DNA與連接在平面陣列不同位置處的一個或者多個探針雜 交?？梢垣@得這兩個可檢測標記的信號比，以評估所述樣本DNA和參照DNA之間的差異。在 使用這種方法時，幾個或者多個實驗樣本可以共用一個參照樣本。對于每天涉及多個樣本 的實驗，通過避免對多個雙份正常樣本進行標記，可以節(jié)約試劑和人工成本。同時，也沒有 必要對樣本進行處理，從而獲得不同的部分以便分別進行分析。每個樣本都可以僅評價一 次。在具體的實施方案中，通過其編碼信息來對編碼顆粒進行鑒定，從而將顆粒編碼 情況與第一信號和第二信號聯(lián)系起來。因此，例如，將第一和第二信號與含有人13號染色 體DNA的第一編碼顆粒系列的編碼顆粒關(guān)聯(lián)。對所述與第一編碼顆粒系列關(guān)聯(lián)的第一信號 和第二信號進行比較，從而獲得受試個體13號染色體DNA與13號染色體參照DNA相比較的 信息。類似地，將第一和第二信號與含有人18號染色體DNA的第二編碼顆粒系列關(guān)聯(lián)。對 所述與第二編碼顆粒系列關(guān)聯(lián)的第一信號和第二信號進行比較，從而獲得受試個體18號 染色體DNA與18號染色體參照DNA相比較的信息。本文的附圖和描述對最佳方式進行了闡釋，但是可以用許多備選材料和方法進行 替代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到合適的備選材料和方法，并且無需進行過多試驗即可制 備和使用所述的組合物和方法。多種緩沖液和其他分析組分的組成均可被替代。用于培養(yǎng)、純化、擴增、變性、偶聯(lián)、雜交、報告物連接、洗滌和小球處理的條件全都 可以由使用者來改變，從而適合具體類型的細胞、模板基因組DNA、樣本、所選報告物等。使用少到30ng的樣本DNA也可以很好地進行本文實施例部分的分析。在生物學(xué)來
25源產(chǎn)生的用于所述分析的DNA不足的情況下，可以通過許多全基因組擴增(WGA)方法(如 DOP PCR或phi-29PCR)對樣本進行擴增。使用WGA處理的樣本時，可以以同樣的方法對參 照DNA進行處理，從而使任何序列特異性擴增的偏差均可以基本由樣本/參照的信號比來 校正。提供了用于分析DNA的試劑盒。在具體的實施方案中，提供了一種試劑盒，其含有 編碼顆粒系列和/或兩個或更多個編碼顆粒系列的混合物。任選地，試劑盒含有使用編碼 顆粒系列和/或含有兩個或者更多個編碼顆粒系列的多重試劑的說明材料。任選地，還含 有輔助試劑，如緩沖液、酶、洗滌溶液、雜交溶液、可檢測標記、檢測試劑等。下文的實施例對用于分析的組合物和方法的實施方案進行了闡釋。提供這些實施 例的目的是進行說明，不能將其看作是對組合物和方法的范圍進行限制。實施例實施例1用于基因組DNA分析的小球系列試劑的制備圖IA示出了由單個BAC克隆制備BAC擴增子并將該擴增子作為探針固定到一個 系列的編碼小球上的流程圖。在此實施例中，該系列中的小球全都具有相同的ID代碼。原料為活的BAC克隆材料(10)，即一段插入到大腸桿菌細菌細胞基因組內(nèi)的長 (通常為100-200kb)的人DNA序列。取出一小片冷凍的BAC甘油儲液材料，并將其用作標 準細菌細胞培養(yǎng)方法的原料(11)。根據(jù)標準的BAC培養(yǎng)方案，在37°C下于裝有35ml培養(yǎng) 基的50ml管中過夜培養(yǎng)細胞，并用抗生素進行選擇。然后在4°C將培養(yǎng)得到的細胞離心20 分鐘，使其離心到管底，取出并棄去上清液。將細胞沉淀重懸于含有RNase的緩沖液中，然 后使用LyseBlue (Qiagen，Valencia CA)和SDS裂解。以大約20，OOOg將裂解液(12)離心 (13) 30分鐘，并收集上清(溶液中含有DNA)，棄去沉淀。將上清液重復(fù)離心15分鐘。收集 含有溶解的BAC DNA的澄清上清液，同時棄去離心到管底的細胞碎片、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。 使用Qiagen基因組-Tip 20/G柱純化試劑盒，從上清液中提取和提純BAC DNA (17)。此試 劑盒含有純化柱(15)，以及洗滌和洗脫緩沖液(16)。洗脫之后，通過異丙醇(19)沉淀法將 現(xiàn)已高度純化的BAC DNA進行沉淀并成為沉淀團塊。產(chǎn)量通常是20至200ng的純化BAC DNA(18)?？梢詫⒋薆AC DNA以干燥沉淀物形式儲存，或者重懸于水中，直接用于隨后的步 驟中。然后，使用兩輪聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增，制備基本上代表各BAC DNA的完整序 列物的大量PCR擴增子。第一輪PCR(20)是非特異性簡并寡核苷酸引物(DOP)的PCR，其 使用DOP引物混合物(21) ,DOP PCR聚合酶(22)和DOP PCR緩沖液(23)，并將上面制備的 BAC DNA(IS)用作模板。第二輪PCR擴增(25)，利用針對DOP引物的已知序列基序的單個引 物。使用兩輪PCR來產(chǎn)生產(chǎn)量為大約20 μ g的擴增子終產(chǎn)物(29)，用于隨后將擴增子(29) 偶聯(lián)(32)至編碼小球(30)。如下制備擴增子。制備50 μ 1各BAC DNA的第一 DOP PCR混合物，其含有10 X DOP PCR 緩沖液5. 0 μ 1IOmMdNTP' s (每一種)Ι.ΟμΙ50mM MgCl5. 0 μ 1
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10 μ M DOP 引物混合物(每一種) 10. 0 μ 120 至 50ng BAC DNA 模板2. 0 μ 1Platinum Taq 聚合酶0. 5 μ 1/K21. 5μ 1總體積50. Ομ DOP PCR 緩沖液(23)含有 20mM Tris HCL(ρΗ8· 4)、50mMKCl 和 5mM MgCl0 dNTP (Amersham Biosciences, Piscataway NJ)白勺&貞力 200 μ Μ。 Platinum TAQ (Applied BioSystems)的濃度為 5 單位/μ 。DOP 引物混合物(21)，參見 Fiegler et al. 2003, Genes Chromosomes Cancer, 36 (4) :361_74，包括三個系列具有以下 22-mer 序列 的簡并寡核苷酸(Operon Biotechnologies, Huntsville AL)，其中N代表隨機的核苷酸:5' CCGACTCGAGNNNNNNCTAGAA 3‘ SEQ ID No. 15' CCGACTCGAGNNNNNNTAGGAG 3‘ SEQ ID No. 25' CCGACTCGAGNNNNNNTTCTAG 3‘ SEQ ID No. 3其中N表示隨機的核苷酸。使用Qiagen基因組-Tip 20/G柱純化試劑盒，將溶于水的BACDNA模板(18)通過 柱純化法(17)純化。Platinum Taq 聚合酶(22) (Invitrogen, Carlsbad CA)的濃度為 5 單 位 / μ 1 ο根據(jù)以下溫度/時間條件，在GeneAmp 9700熱循環(huán)儀(Applied BioSystems, Foster City CA)中進行第一輪擴增(20)3. 0 分鐘 94°C1. 5 分鐘 94 °C2. 5分鐘30°C，9個循環(huán)0. 10C/ 秒 72 "C (斜率)3. 0 分鐘 72 °C1. 0 分鐘 94 °C1. 5 分鐘 62 °C，30 個循環(huán)2.0 分鐘 72 °C8.0 分鐘 72 °C4.0°C (穩(wěn)定狀態(tài))然后，將第一輪DOP PCR(20)的擴增子產(chǎn)物(24)用作第二輪PCR(25)的模板。第 二輪中的單一引物(26)具有針對第一輪(20)中使用的DOP引物的共有序列部分的特異 性。此引物(26)經(jīng)胺修飾，從而使所得擴增子(29)還在一個末端具有胺基團，以有助于在 下一步中簡單地偶聯(lián)至編碼小球(32)。如下進行第二輪PCR。制備100μ 1各BAC擴增子模板的第二 PCR混合物，其含有10 X PCR 緩沖液10. Ομ IOmMdNTP' s (每一種)2. 0 μ 150mM MgCl10. 0 μ 110 μ M 胺引物15. Ομ
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模板(來自PCR#1)Platinum Taq水總體積
2. 0μ 1 0. 5μ 1 58. 5μ 1 100. O μ 1PCR 2 緩沖液(28)含有 20mM Tris HCL(ρΗ8· 4)、50mM KCl 禾口 5mM MgCl。 dNTP (Amersham Biosciences, Piscataway NJ)白勺&it 力 200 μ Μ。 Platinum TAQ (Applied BioSystems)的濃度為 5 單位 / μ 1。與胺相連的引物(Operon)具有以下序列。5 ‘ -GGAAACAGCCCGACTCGAG-3 ‘ SEQ ID NO. 4反應(yīng)(25)中的模板為來自上一輪DOP PCR(20)的DOP擴增子。根據(jù)以下溫度/ 時間條件，在GeneAmp 9700熱循環(huán)儀(Applied BioSystems)上進行第二輪擴增(25)10 分鐘 95 °C1. 0 分鐘 95 °C1. 5 分鐘 60°C，35 個循環(huán)7.0 分鐘 72 °C10 分鐘 72 °C4.0°C (穩(wěn)定狀態(tài))然后，使用基于磁性小球的試劑盒(9)(PCR Clean Beads, Agencourt Bioscience Corp. , Beverley ΜΑ)，根據(jù)制造商的方案，純化此第二 PCR產(chǎn)物(29)。隨后將經(jīng)純化的擴 增子(29)，重懸于40 μ 1水中，并于-20°C下儲存，直至用于下文所述的小球偶聯(lián)步驟中。以50 μ 1的標準小球濃度的規(guī)模，在Luminex羧基小球(30) (Luminex，Austin TX)，上進行編碼小球偶聯(lián)過程(32)，以將所述擴增子產(chǎn)物(29)作為探針DNA固定到編碼小 球的表面之上，得到大約650，000個小球。所述小球由聚苯乙烯制備，直徑大約為5. 6 μ m， 并由受控量的兩種或者多種熒光染料編碼，從而有助于在專用流式細胞儀讀取裝置上檢 測其小球ID。將50 μ 1的懸浮小球(30)(全都具有一個小球ID或區(qū)域)，從送遞它們的 Luminex管中轉(zhuǎn)移到一個1. 5ml Eppendorf管進行偶聯(lián)(32)，并通過渦旋和超聲處理來確 保懸浮。然后，以12，000RPM將小球離心3分鐘，并在不干擾小球沉淀物的情況下除去小球 緩沖上清液。將25μ1 MES緩沖液加入各小球管，然后進行渦旋和超聲處理。另外地，將 10 μ g各BAC的PCR 2擴增子(29)加入第二系列的1. 5ml離心管中，隨后將各管中的DNA 在 SpeedVac (ThermoFisher Scientific, Waltham ΜΑ)中徹底干燥。然后，將一份小球懸液 轉(zhuǎn)移到各DNA管中，并將各管渦旋和超聲處理5秒鐘進行混合，仔細地跟蹤與各BAC有聯(lián)系 的小球ID (區(qū)域)。接下來，將1. 5 μ 1剛?cè)芙獾腅DC (31) (1_乙基_3_ [ 二甲基氨丙基]_碳二亞胺鹽酸 鹽，Pierce，Rockford IL)以10mg/ml的濃度加入各管中，立即渦旋，并在室溫下避光(目 的是保留Luminex小球的熒光編碼)孵育30分鐘。在15分鐘時再次混合。然后再一次地 重復(fù)EDC添加、孵育和再次混合。然后，將500 μ 1 TNT 緩沖液(0. IM Tris ρΗ 7. 5,0. 15Μ NaCl, 0. 02% Tween 20) 加入各管中并進行渦旋。然后在微型離心機上以12，000RPM將所述管離心4分鐘，使小球 分布到底部，并小心地除去上清液。接下來，加入500 μ 1 0. 1% SDS，并且再以12，000RPM
28將小球離心4分鐘，小心地除去上清液。最后，將50μ 1 IXTE緩沖液(IOmM Tris ρΗ 7.5， ImM EDTA)加至各管，并進行渦旋。該小球系列(33)——固定有擴增子探針(29)——可以作為用于基因組DNA分析 的多重小球系列的一個組分納入。實施例2DNA分析用多重編碼小球系列試劑的制備圖2是示出將m個不同的編碼小球系列(各自具有各自的固定的BAC-擴增子探 針DNA)混合在一起來制備多重編碼小球系列的流程圖。通過超聲處理、旋轉(zhuǎn)管容器、渦旋或類似方法，將編碼小球系列34、35、36和37制 成懸液。然后，使用移液管將各小球系列的整分試樣轉(zhuǎn)移到另一個容器中，各個小球系列在 該容器中合并和混合，然后變性(38)，從而有助于隨后在分析中與固定在所述小球上的探 針DNA的雜交。在一個詳盡的實施例中，將各50 μ 1的2個或多個小球系列——每一系列在一個 單獨的管子里，每一編碼小球系列均固定有探針DNA(33)——分批地合并到一個1. 5ml離 心管內(nèi)。在合并大約10個小球系列之后，將管離心，并小心除去上清液，目的是減少體積。 再次重復(fù)，直至合并所有的小球系列(例如，Luminex 200系統(tǒng)至多支持100個編碼小球ID 或區(qū)域)。在將所有的小球系列合并成為一個多重小球系列之后，將固定的探針DNA變性。 在對小球進行離心并除去上清之后，加入500 μ 1 0. INNaOH，并在室溫下孵育2分鐘。然后 對小球進行離心，并小心地除去上清。加入500 μ 1 IOmM Tris、15mM NaCL.O. 2% Tween 20， 渦旋該管，然后對小球進行離心，并除去上清液。然后重復(fù)進行此洗滌步驟。最后，用IXTE 緩沖液將體積調(diào)整為500 μ 1，并將此多重小球系列(39)在4°C下避光保存，直至用于分析 中。實施例3多重基因組獲得和丟失分析圖3是展示一個實施方案的流程圖，所述實施方案包括使用多重編碼小球系列在 η個樣本上進行多重基因組獲得和丟失分析。該流程圖示出了方法的實施方案，包括提供經(jīng) 標記的樣本和參照DNA (5)，所述樣本和參照DNA與兩個或者更多個編碼小球系列雜交(6)， 檢測所述標記樣本和參照DNA與所述編碼小球系列雜交的信號(7)，和比較所述信號以確 定所述樣本和參照DNA之間的差異(8)。圖3Α為展示一個實施方案的流程圖，所述實施方案包括使用多重編碼小球系列 對η個樣本進行多重基因組獲得和丟失分析。在此實施例中，平行分析了兩個DNA樣本和兩個參照。事實上，可以同時地以微量 板形式平行分析幾十個樣本。也可以平行分析比此數(shù)目更多或者更少的樣本和參照。在此實施例中，將四個DNA樣本(40和41代表兩個參照，而42和43代表兩個分析 樣本)用生物素進行酶學(xué)標記并純化。參照樣本通常為正常男性和女性的合并樣本，如人 類女性基因組DNA和人類男性基因組DNA (Promega，Madison WI)。將各DNA樣本和參照與 生物素標記的核苷酸(45) (PerkinElmer，Boston ΜΑ)、非標記核苷酸(49) (PerkinElmer)、 隨機引物(47) (Operon, Biotechnologies, Huntsville AL)和 Klenow 片段聚合酶(46)(Epicentre Biotechnologies,Madison WI)合并起來。孵育(44)之后，使用 DNA 柱純化試 劑盒(49)(如 Purelink DNA Mini Kit(Invitrogen))純化(50)反應(yīng)產(chǎn)物。大約 5 μ 1 的 約200ng/y 1經(jīng)標記的樣本用于此分析隨后的雜交。然后，使各生物素標記的樣本或參照(51-54)與固定在多重編碼小球系列(56)的 小球上的探針雜交(55)使用了每個小球系列(各探針類型)的大約500個小球；在此55 重實施例中，使用了總共大約55X500 = 27，500個小球/雜交。因為編碼情況，各編碼小球系列的小球可以區(qū)別于其他編碼小球系列每一系列的 小球。此55個小球系列中的每一系列均含有多個編碼小球，與所述編碼小球相連的擴增子 基本上代表完整的模板基因組DNA片段。各小球系列的模板DNA代表圖9所列的一個基因 組座位。雜交反應(yīng)中包括含有Cot-IDNA、甲酰胺、硫酸葡聚糖和1.9XSSC的雜交緩沖 液?？傮w積大約為15 μ 1，且反應(yīng)在硬的PCR型硬質(zhì)微量板如Bio-Rad HSP 9631 (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)的孔中進行。使用鋁箔封口機(MSF 1001，Bio-Rad)嚴密地 封住該板，將蒸發(fā)降至最低。在1150rpm的微量板振蕩培養(yǎng)箱(Wallac NCS Incubator, PerkinElmer)中于50°C過夜進行雜交孵育(55)。在雜交孵育(55)之后，與四個樣本雜交的四個多重小球系列(58-61)，就可以進 行雜交洗滌(63)，然后與熒光報告物(65) —起孵育，再進行報告物洗滌(67)。首先，將 100 μ 1洗滌緩沖液a (2 X SSC，50 %甲酰胺)加入各孔之中，然后重新封閉該板，并在振蕩培 養(yǎng)箱(轉(zhuǎn)動速率為1150rpm)于50°C下孵育20分鐘。然后將各孔內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到Millipore 0. 46 μ m HT 過濾板(Millipore,Billerica MA)。之后，使用 Millipore MSVMHTS00 多頭抽 真空裝置從各孔中真空除去液體。接下來，將100 μ 1洗滌緩沖液b(2XSSC，0. 1% Igepal 清潔劑)加入各孔，然后在50°C下再進行一次為期20分鐘的振蕩孵育，并進行真空抽吸。 隨后，將100 μ 1洗滌緩沖液c (0. 2 X SSC)加入各孔，并在50°C下重復(fù)為期20分鐘的振蕩孵 育，然后進行真空抽吸。然后，將100 μ 1 IXPhycoLink SA溶液(鏈親和素-藻紅蛋白報告物)，64，加入 各孔。此報告物溶液是通過將 2 μ 1 500 XPhycoLink SAPJ13S (Prozyme, San Leandro CA) 混合到Iml報告物稀釋液中形成，其中所述稀釋液為1XPBS、0. 1% BSA和0. 05% Tween 20。將此報告物溶液與多重小球系列在1050RPM的振蕩培養(yǎng)箱中于25°C下孵育30分鐘。 孵育之后，使用如前面的洗滌步驟中的多頭抽真空裝置從過濾板的孔中吸出溶液。然后用洗滌緩沖液d(66)將小球洗滌兩次(67)，所述洗滌緩沖液d為含0.01% Tween 20的1XPBS。將100 μ 1加入過濾板的各孔中，然后通過板孔底部的過濾器真空抽 吸掉液體。再一次加入100 μ 1，并在1050RPM的振蕩培養(yǎng)箱中于25°C下孵育2分鐘。所述 第二次洗滌并不進行抽吸，而是用來懸浮小球以進行讀數(shù)。之后，本實施例中的四個小球系列(68-71)即可在Luminex 200系統(tǒng)(Luminex Corporation, Austin TX)上讀數(shù)(72)。依次讀取各孔中的小球的信號和小球ID，并記錄 下各孔或樣本的各小球ID (小球區(qū)域)的前50個小球的熒光強度中值，并輸出到在一個數(shù) 據(jù)文件(73)中。沒有發(fā)現(xiàn)小球交聯(lián)；設(shè)定Luminex讀數(shù)儀，使其分析各區(qū)域的50個小球， 并且并未記錄到失敗。圖4是96孔SBS標準微量板(80)的示意圖，其示出用于平行地對46個樣本進行
30分析的兩份參照和兩份樣本的示例性位置。各標記樣本的兩份重復(fù)雜交可用于確?？酌芊?失敗情況下的數(shù)據(jù)形成，所述孔密封失敗會導(dǎo)致試劑從單個孔蒸發(fā)。在雙份重復(fù)沒有受到 影響時，該樣本仍然形成數(shù)據(jù)。使用此微量板和編碼小球方法，實驗員單人即可同時分析例 如46個樣本和2個參照，并且全都雙份重復(fù)進行，在第一天進行標記，雜交過夜，并在第二 天進行洗滌和讀數(shù)?；蛘撸治隹梢圆恢貜?fù)進行或者不止兩個重復(fù)地進行。所示出的是雙 份的兩個參照(81和82)以及雙份的樣本，樣本的一個實例在83處標示出。圖5是使用男性的13號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本形成數(shù)據(jù)的一 個實例；此數(shù)據(jù)由通過Luminex讀數(shù)儀獲得的各小球區(qū)域的中間熒光值計算得到。從所有 其他信號中減去陰性對照小球29、54和56的平均值(參見圖9)。然后，求出來自九個常染 色體克隆的信號與來自男性和女性參照DNA的相應(yīng)克隆信號的比值。計算標準化因子，從 而在將該因子應(yīng)用到所有的常染色體克隆信號之時，其會使得平均的常染色體比值為數(shù)值 1。然后，將此標準化因子應(yīng)用到所有的樣本信號。將所得比值作圖，并示于圖5。請注意，13號染色體的克隆的比值全都在范圍1.3 至1. 6之間，而18和21號染色體的克隆以及其他常染色體克隆除了有一個之外全都低于 1.2。13號染色體中的三體性很容易顯現(xiàn)。同樣地，樣本與男性參照相比的比值圖(方塊數(shù) 據(jù)點)對于X和Y性染色體實際上都是平坦的。此乃男性樣本所應(yīng)有的反應(yīng)。樣本與女性 參照相比較的圖(菱形數(shù)據(jù)點)，對于X而言下移，而對于Y而言上升，這同樣也是男性樣本 應(yīng)有的反應(yīng)。圖6是使用男性的18號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù) 的一個實例。如針對圖5所述的那樣，形成數(shù)據(jù)并作圖。圖7是使用女性的21號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù) 的一個實例。如針對圖5所述的那樣，形成數(shù)據(jù)并作圖。圖8是使用X染色體5-拷貝擴增的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個實例。 如針對圖5所述的那樣，形成數(shù)據(jù)并作圖。圖9為一張圖表，其示出具有用于在示例性分析中形成擴增子的人基因組DNA插 入物的BAC克隆、其染色體和cyto條帶位置、陰性對照寡核苷酸的序列以及各擴增子探針 所固定的小球系列的小球ID(Luminex小球區(qū)域)。將圖5-8中χ軸上順序編號的作圖點與 圖9中自上而下列出的BAC關(guān)聯(lián)。BAC RP11-186J16被固定到兩個不同的小球區(qū)域(42和 86)。與人基因組沒有序列同源性的一個寡核苷酸被選擇作為陰性對照。所使用的具體 陰性對照寡核苷酸為5 ‘ GTCACATGCGATGGATCGAGCTC 3 ‘ SEQ ID No. 5 ；5 ‘ CTTTATCATCGTTCCCACCTTAAT 3 ‘ SEQ ID No. 6 ；5' GCACGGACGAGGCCGGTATGTT 3' SEQ ID No. 7。將與陰性對照寡核苷酸相連的三個小球區(qū)域29、54和56所形成的信號取平均值， 并從所有其他小球信號中減去，然后再計算比值。實施例4圖IOA是示出根據(jù)本文所述一個方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡化流程圖。來自于一個來源的探針DNA (92)和來自于另一個來源的探針DNA (93)任選地通過PCR分別 被擴增(94和95)，從而得到擴增子探針，隨后混合所述擴增子探針形成復(fù)合探針(96)。將 所述復(fù)合探針連接至基底(97)形成與基底相連的復(fù)合探針(98)。圖IOB是示出根據(jù)本文所述一個方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡化流程圖， 其中可以將探針DNA(92和93)匯集形成復(fù)合混合物99，然后進行任選的PCR擴增(100)， 從而制備復(fù)合探針材料(96)，所述復(fù)合探針材料連接至基底(97)形成與基底相連的復(fù)合 探針(98)。圖11是示出根據(jù)本文所述方法一個方面的一種制備復(fù)合探針的方法的簡化流程 圖。示出了一幅染色體模式圖(101)，該模式圖示出所關(guān)注的染色體(在本實施方案中，是 22號染色體)的CytoBand (102)。示出用于分析的具有目的區(qū)域中基因組座位的一個五種 BAC的系列(103)，且各BAC基因組座位大致被擱置于所述染色體模式圖上。在本實施方案 中，來自五種BAC且被定位到與DiGeorge微缺失綜合征相對應(yīng)的CytoBand 22pll. 2的DNA 被用于制備所述復(fù)合探針。該圖中的所述染色體模式圖示意性地示出選自一個CytoBand 的五種示例性BAC的基因組鄰近關(guān)系；在此方法中，所述BAC DNA并非從人染色體提取。利用常規(guī)方案從所述五種培養(yǎng)的BAC中的每一種中提取和純化DNA。將所培養(yǎng)的 細菌細胞裂解，并通過離心和柱純化(Qiagen，Valencia CA)來沉淀并隨后純化DNA (104)。 隨后，將從各BAC中純化的DNA(105)用作簡并寡核苷酸引物(DOP)PCR擴增(106)的模板。 接下來，將DOP引物序列用作特異性PCR引物，對所述DOP產(chǎn)物進行特異性PCR擴增。這 一方法得到了五種單獨的擴增子探針(107)。接下來，將這些單獨的探針(107)匯集起來 (108)，形成復(fù)合探針(109)。然后，將所述復(fù)合探針固定到一個系列的Luminex編碼多重微 球(全都具有一個小球“區(qū)域”，即具有相同的小球編碼身份)(110)，用于在多重基因組獲 得-丟失分析中用作22pll.2Cytoband探針。所述單獨的探針(107)的每一種也被單獨地 固定，每一種被固定到具有一個獨特身份的小球系列上，從而使得其反應(yīng)可以與所述復(fù)合 探針的反應(yīng)相比較。圖12是測試分析的數(shù)據(jù)曲線圖，示出了復(fù)合探針與DiGeorge綜合征參照DNA樣 本(Coriell Institute for Medical Research, Camden NJ)的使用。使用固定在 Luminex 編碼微球上的PCR產(chǎn)物探針在Luminex xMAP平臺上進行分析。使用DOP PCR由BAC DNA制 備所述PCR產(chǎn)物探針。固定所述探針，微球系列上的每一種探針都可以被Luminex系統(tǒng)分 別鑒定，并如本文所述進行測試分析。所述多重探針組包括八種來自基因組座位的常染色 體探針，所述常染色體探針預(yù)計在DNA樣本與男性和女性DNA參照之間沒有表現(xiàn)出獲得或 者丟失。所述多重探針組還包括六種X染色體探針和五種Y染色體探針作為陽性對照，從 而在將測試樣本與相反性別的參照進行比較時，可以觀察到性染色體中已知的獲得或者丟 失的比值反應(yīng)。所述多重探針組還包括位于DiGeorge綜合征缺失的座位處的五種22qll. 2 探針(123)，參見下表I。所述五種BAC的中心座位跨越大約0. 45mb (445kb)，并且對于其 175kb的典型長度，總跨度略高于600kb。表I. BAC及其中心的Chr 22線性定位位置(mb)BACpterF517. 7765040M5117. 8000000
32
RP11-16CRP11-316L10RPl 1-18608
1017. 9469780 18.1740250 18.2284550參照圖12，此為DiGeorge綜合征樣本與男性和女性正常參照DNA兩者相比較的 兩個數(shù)據(jù)系列的比值圖。數(shù)據(jù)系列120是DiGeorge樣本與男性參照DNA相比較的比值反 應(yīng)；其表明所有X染色體探針中均有相對的獲得(125)，而在所有Y染色體探針中均有丟失 (126)。該反應(yīng)表明，所述樣本來自于女性。數(shù)據(jù)系列121是同一樣本與女性參照DNA的比 較，其表明，對于X和Y性染色體探針，比值反應(yīng)均接近1. 0，這確認了該樣本來自于女性。 圖中1.0的比值線(122)指示在樣本與正常參照相比沒有基因組獲得或者丟失時，對于任 何給定探針而言，樣本/參照比值的預(yù)期結(jié)果。將常染色體探針(127)加入到此組，作為預(yù) 期會產(chǎn)生大約1.0比值的對照，它們的確如此。來自于22q. 11. 2座位的五種探針(123)均包含在此組中。這五種探針與男性和 女性參照DNA相比，全都表現(xiàn)出比值小于1，這與所述樣本中在該座位處的已知基因組缺失 相一致。最后，將一個類型的多重小球偶聯(lián)到含有所述五種22qll. 2探針的混合物或匯集 物的復(fù)合探針(123)。所述復(fù)合探針的比值反應(yīng)(124)也指示缺失，其與所匯集的所述五種 組成型探針的平均反應(yīng)相當(dāng)一致。實施例5圖13是根據(jù)本發(fā)明的一個方面由Luminex小球陣列獲得_丟失分析得到的比值 數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)來自于從產(chǎn)前羊水樣本提取的胎兒DNA，所述胎兒的性別并不明確知曉。進行 分析，并且男性和女性參照在同一 96-孔微量板的不同孔中同時進行分析。圖例(136)標 識出兩個數(shù)據(jù)標記，表示參比女性的(菱形作圖點)和參比男性的(方形作圖點)。比值 =1.0的水平線(132)位于該圖的中心。所述比值標尺(133)為該圖的縱軸。示出了具有 針對女性參照形成的樣本/參照比值的第一數(shù)據(jù)圖(130)。對于該圖，針對X染色體探針 的數(shù)據(jù)(134)表現(xiàn)出比值小于1，針對Y染色體探針的數(shù)據(jù)(135)與女性相比表現(xiàn)出獲得。 這與男性樣本是一致的。第二數(shù)據(jù)圖(131)利用接近比值等于1.0的線的男性參照群，也 與男性樣本一致。兩個數(shù)據(jù)系列都顯示出陣列中的其他探針并沒有明顯地偏向X探針的左 側(cè)，表明是一個正常樣本。表II示出與圖13和14中X軸上順序編號的作圖點有關(guān)的BAC身份。表IL
3權(quán)利要求
一種分析DNA樣本的方法，包括提供一種與基底相連的復(fù)合核酸探針，所述復(fù)合核酸探針含有與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個或者更多個基因組座位特異性雜交的核酸序列，所述基因組區(qū)域的特征在于具有第一末端和第二末端以及置于所述第一末端和第二末端之間的至少400kb的中間區(qū)域，其中所述復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述第一末端的完整第一基因組座位以及基本上與含有所述第二末端的完整第二基因組座位特異性地雜交的核酸序列；使所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與樣本基因組DNA雜交；使所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與參照基因組DNA雜交；檢測指示所述與基底連接的復(fù)合核酸探針與所述樣本基因組DNA特異性雜交的第一信號，以及指示所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與所述參照基因組DNA特異性雜交的第二信號；并且比較所述第一信號和所述第二信號，從而檢測所述第一信號和第二信號之間的差異，所述第一信號和第二信號之間的差異指示所述樣本DNA和所述參照DNA之間的差異，由此分析所述DNA樣本。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述基底為多個顆粒。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述基底為多個編碼顆粒。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述基底為平面基底。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一基因組座位和第二基因組座位各自含有至少約 IOOkb。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個或者更多個基因 組座位特異性雜交的核酸序列來源于兩個或者更多個大插入DNA載體。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述兩個或者更多個大插入DNA載體選自細菌人工染色體、 酵母人工染色體、人類人工染色體、黏粒、質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體DNA和F黏粒。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個或者更多個基 因組座位特異性雜交的核酸序列從選自如下的來源獲得分離的染色體和分離的染色體片 段。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個或者更多個基因 組座位特異性雜交的核酸序列為從選自如下的來源獲得的擴增子兩個或者更多個的大插 入DNA載體、分離的染色體、分離的染色體片段，一個大插入DNA載體和分離的染色體，以及 一個大插入DNA載體和分離的染色體片段。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本基因組DNA被可檢測地標記。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述參照基因組DNA被可檢測地標記。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個或者更多個基 因組座位特異性雜交的核酸序列各自具有的長度范圍為約20-250，000個核苷酸，包括端 值。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本DNA為獲自受試個體的DNA。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述樣本DNA為獲自受試個體的基因組DNA。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本DNA為人類DNA。
16.權(quán)利要求1的方法，還包括使所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與第二種參照基因組DNA雜交；檢測指示所述與基底相連的復(fù)合核酸探針與所述第二種參照基因組DNA特異性雜交 的第三信號；并且比較所述第一信號和所述第三信號，從而檢測所述第一和第三信號之間的差異，所述 第一和第三信號之間的差異指示所述樣本DNA與所述第二種參照DNA之間的差異，由此分 析所述DNA樣本。
17.一種分析樣本DNA的方法，包括提供包含兩個或者更多個編碼顆粒系列的混合物的多重試劑，所述編碼顆粒系列被編 碼，從而使得每一編碼顆粒系列的各個顆粒均可檢測地區(qū)別于其他每一編碼顆粒系列的各 個顆粒，所述編碼顆粒含有所連接的與參照基因組的至少一個基因組座位特異性雜交的核 酸序列，其中至少一個編碼顆粒系列含有所連接的復(fù)合核酸探針，所述復(fù)合核酸探針包含 與參照基因組的基因組區(qū)域中兩個或者更多個基因組座位特異性雜交的核酸序列，所述基 因組區(qū)域的特征在于具有第一末端和第二末端以及置于所述第一末端和第二末端之間的 至少400kb的中間區(qū)域，其中所述復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述第一末端的完整第 一基因組座位、以及基本上與含有所述第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的核酸 序列；使所述多重試劑與樣本基因組DNA雜交；使所述多重試劑與參照基因組DNA雜交；檢測指示所述連接的核酸序列與可檢測地標記的DNA特異性雜交的第一信號；檢測指示所述連接的核酸序列與可檢測地標記的參照DNA特異性雜交的第二信號；鑒定所述編碼顆粒，從而將顆粒編碼情況與所述第一信號聯(lián)系起來；鑒定所述編碼顆粒，從而將顆粒編碼情況與所述第二信號聯(lián)系起來；并且比較各個編碼顆粒系列的所述第一信號和第二信號，其中所述第一和第二信號之間的 差異指示所述樣本和參照DNA之間的差異，由此分析DNA。
18.一種用于分析DNA的試劑，包含與固體基底相連的第一復(fù)合核酸探針，所述第一復(fù)合核酸探針包含與參照基因組的 基因組區(qū)域中兩個或者更多個基因組座位特異性雜交的核酸序列，所述基因組區(qū)域的特征 在于具有第一末端和第二末端以及置于所述第一末端和第二末端之間的至少400kb的中 間區(qū)域，其中所述第一復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述第一末端的完整第一基因組座 位、以及基本上與含有所述第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的核酸序列。
19.權(quán)利要求18的用于分析DNA的試劑，還包含與固體基底相連的第二復(fù)合核酸探針，所述第二復(fù)合核酸探針包含與參照基因組的 第二基因組區(qū)域中兩個或者更多個基因組座位特異性雜交的核酸序列，所述第二基因組區(qū) 域的特征是具有第一末端和第二末端，并且具有置于所述第一末端和第二末端之間的至少 400kb的中間區(qū)域，其中所述第二復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述第二基因組區(qū)域第 一末端的完整第一基因組座位、以及基本上與含有所述第二基因組區(qū)域第二末端的完整第 二基因組座位基本上特異性雜交的核酸序列。
20.權(quán)利要求18的試劑，其中所述固體基底為平面基底。
21.權(quán)利要求19的試劑，其中所述固體基底為進一步包含所述第一復(fù)合核酸探針的平面基底。
22.權(quán)利要求18的試劑，其中所述固體基底為第一種多個顆粒。
23.權(quán)利要求19的試劑，其中所述固體基底為第二種多個顆粒。
24.權(quán)利要求23的試劑，其中所述第一種多個顆粒和第二種多個顆粒被可區(qū)別地編碼。
25.一種制備用于分析DNA的與基底相連的復(fù)合核酸探針的方法，包括分離基本上與含有參照基因組的基因組區(qū)域的第一末端的完整第一基因組座位特異 性雜交的第一核酸序列；分離基本上與含有參照基因組的基因組區(qū)域的第二末端的完整第二基因組座位特異 性雜交的第二核酸序列；混合所述第一和所述第二核酸序列，從而制備復(fù)合探針；將所述復(fù)合探針連接到固體基底，從而制備用于分析DNA的與基底相連的復(fù)合核酸探 針試劑。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述第一和所述第二核酸序列含有用于與所述固體基底 反應(yīng)的官能團。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述第一核酸序列分離自第一大插入載體，并且所述第 二核酸序列分離自第二大插入載體。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述第一和所述第二核酸序列在混合之前進行擴增。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述第一和所述第二核酸序列在混合之后進行擴增。
30.一種分析DNA樣本的方法，包括 提供與基底相連的核酸探針；使所述與基底相連的核酸探針與獲自受試者的樣本基因組DNA雜交； 使所述與基底相連的核酸探針與第一種參照基因組DNA雜交； 使所述與基底相連的核酸探針與第二種參照基因組DNA雜交； 檢測指示所述與基底相連的核酸探針與所述樣本基因組DNA特異性雜交的第一信號、 指示所述與基底相連的核酸探針與所述第一種參照基因組DNA特異性雜交的第二信號以 及指示所述與基底相連的核酸探針與所述第二種參照基因組DNA特異性雜交的第三信號； 比較所述第一信號和所述第二信號，從而檢測所述第一和第二信號之間的差異，所述 第一和第二信號的差異指示所述樣本DNA和所述第一種參照DNA之間的差異；并且比較所述第一信號和所述第三信號，從而檢測所述第一和第三信號之間的差異，所述 第一和第三信號之間的差異指示所述樣本DNA和所述第二種參照DNA之間的差異，由此分 析所述DNA樣本。
31.權(quán)利要求30的方法，還包括將所述樣本DNA和所述第一種參照DNA之間的差異與所述樣本DNA和所述第二種參照 DNA之間的差異進行比較。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述第一種參照基因組DNA包括男性特異的基因組DNA， 其中所述第二種參照基因組DNA包括女性特異的基因組DNA，并且其中對所述第一和第二 信號的差異的比較以及對所述第一和第三信號的差異的比較指示了受試者的性別。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述第一種參照基因組DNA包括第一種病癥特異的基因組DNA，其中所述第二種參照基因組DNA包括第二種病癥特異的基因組DNA，并且其中對所 述第一和第二信號的差異的比較以及對所述第一和第三信號的差異的比較指示了所述受 試者的疾病狀態(tài)。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述第一種參照基因組DNA包括第一種病癥特異的基因 組DNA，其中所述第二種參照基因組DNA包括第二種病癥特異的基因組DNA，并且其中對所 述第一和第二信號的差異的比較以及對所述第一和第三信號的差異的比較指示了受試者 的新陳代謝年齡。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所述與基底相連的核酸探針包含多個編碼顆粒。
36.權(quán)利要求30的方法，其中所述與基底相連的核酸探針包含平面基底。
37.權(quán)利要求30的方法，其中所述與基底相連的核酸探針包含多種寡核苷酸。
38.權(quán)利要求30的方法，其中所述與基底相連的核酸探針包含多種擴增子。
39.權(quán)利要求30的方法，其中所述與基底相連的核酸探針包含分離自大插入DNA載體 的插入DNA。
40.權(quán)利要求30的方法，其中所述與基底相連的核酸探針包含分離的染色體DNA。
41.一種分析DNA樣本的方法，包括提供含有連接有擴增子的編碼顆粒的第一編碼顆粒系列，所述擴增子包含合在一起基 本上代表完整第一模板DNA序列的隨機核酸序列；使所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的樣本DNA雜交；使所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的第一種參照DNA雜交；使所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的第二種參照DNA雜交；檢測指示所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的樣本DNA特異性雜交的 第一信號、指示所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的第一種參照DNA特異性 雜交的第二信號、以及指示所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的第二種參照 DNA特異性雜交的第三信號；比較所述第一信號和所述第二信號，以檢測所述第一和第二信號之間的差異，所述第 一和第二信號的差異指示所述樣本DNA和所述參照DNA之間的差異；并且比較所述第一信號和所述第三信號，以檢測所述第一和第三信號之間的差異，所述第 一和第三信號的差異指示所述樣本DNA和所述第二種參照DNA之間的差異，由此分析所述 DNA樣本。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述擴增子的長度范圍為大約500-1200個核苷酸，包括端值。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述可檢測地標記的樣本DNA是獲自受試個體的可檢測 地標記的DNA。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述可檢測地標記的樣本DNA是獲自受試個體的可檢測 地標記的基因組DNA。
45.權(quán)利要求41的方法，其中所述可檢測地標記的樣本DNA是人類DNA。
46.權(quán)利要求41的方法，還包括提供含有連接有擴增子的編碼顆粒的第二編碼顆粒系列，所述擴增子包含合在一起基 本上代表完整第二模板DNA序列的隨機核酸序列；使所述第二編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的樣本DNA雜交； 使所述第二編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的第一種參照DNA雜交； 使所述第二編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的第二種參照DNA雜交； 檢測指示所述第二編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的樣本DNA特異性雜交的 第一信號、指示所述第二編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的第一種參照DNA特異性 雜交的第二信號、以及指示所述第二編碼顆粒系列的擴增子與可檢測地標記的第二種參照 DNA特異性雜交的第三信號；比較所述指示所述第二編碼顆粒系列的擴增子的特異性雜交的第一信號和所述指示 所述第二編碼顆粒系列的擴增子的特異性雜交的第二信號，以檢測所述第一和第二信號之 間的差異，所述第一和第二信號的差異指示所述樣本DNA和所述第一種參照DNA之間的差 異；并且比較所述指示所述第二編碼顆粒系列的擴增子的特異性雜交的第一信號和所述指示 所述第二編碼顆粒系列的擴增子的特異性雜交的第三信號，以檢測所述第一和第三信號之 間的差異，所述第一和第三信號的差異指示所述樣本DNA和所述第二種參照DNA之間的差已
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述第一和第二編碼顆粒系列以混合物的形式提供，并 且還包括將所述第一編碼顆粒系列的編碼情況與指示所述第一編碼顆粒系列的擴增子與可檢 測地標記的樣本DNA特異性雜交的第一信號和指示所述第一編碼顆粒系列的擴增子的特 異性雜交的第二信號聯(lián)系起來；并且將所述第二編碼顆粒系列的編碼情況與指示所述第二編碼顆粒系列的擴增子與可檢 測地標記的樣本DNA特異性雜交的第一信號和指示所述第二編碼顆粒系列的擴增子的特 異性雜交的第二信號聯(lián)系起來。
48.一種基本上如本文中所述的DNA分析方法。
49.一種基本上如本文中所述的DNA分析用試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測基因組DNA獲得和丟失的組合物和方法。本發(fā)明的分析的實施方案包括使用一種與基底相連的復(fù)合核酸探針，所述復(fù)合核酸探針與參照基因組的基因組區(qū)域中的兩個或者更多個基因組座位特異性雜交。所述基因組區(qū)域的特征在于具有第一末端和第二末端以及置于所述第一末端和第二末端之間的至少400kb的中間區(qū)域。所述復(fù)合核酸探針包含基本上與含有所述第一末端的完整第一基因組座位以及基本上與含有所述第二末端的完整第二基因組座位特異性雜交的核酸序列。本發(fā)明提供了包括對兩個或者更多個基因組DNA參照進行評估的方法和組合物。
文檔編號C12Q1/68GK101939448SQ200880126212
公開日2011年1月5日 申請日期2008年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者K·E·阿得勒 申請人:珀金埃爾默·拉斯公司