專利名稱：祖細(xì)胞的保護(hù)和它們的分化的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用多硫酸化多糖與祖細(xì)胞相組合以改進(jìn)祖細(xì)胞的活力(包括改進(jìn) 祖細(xì)胞的深冷保存)，并且提供新穎的組合物、方法和使用。本發(fā)明還涉及用多硫酸化多糖 調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的增殖和分化的用途。
背景技術(shù)：
人類祖細(xì)胞是未成熟的細(xì)胞，它們產(chǎn)生了所有不同類型的成熟細(xì)胞，這些成熟細(xì) 胞組成了成體的器官和組織。從祖細(xì)胞轉(zhuǎn)變至成熟的、專一性的成體細(xì)胞經(jīng)過了一個(gè)被稱 為分化的過程。體內(nèi)的祖細(xì)胞采用不同的分化途徑來對來自其環(huán)境的不同刺激物進(jìn)行應(yīng)答。類似 地，在實(shí)驗(yàn)室中祖細(xì)胞可以通過將它們暴露于不同的生化試劑組合而受到刺激從而沿著不 同的途徑分化。在適當(dāng)?shù)拇碳は?，除其他組織之外，祖細(xì)胞可以分化成血細(xì)胞、骨骼、軟骨、 脂肪、血管或心肌。由于這個(gè)原因，對祖細(xì)胞作為治療的基礎(chǔ)用于修復(fù)和再生一定范圍的組 織和器官的用途產(chǎn)生了極大的興趣。祖細(xì)胞存在于胚胎中，并且也存在于成體組織中例如骨髓、脂肪、皮膚和牙髓中， 盡管與在胚胎中相比數(shù)量少很多。這兩種類型的成體祖細(xì)胞是造血性的(它們生成新的骨 髓和血細(xì)胞)、以及非造血性的(它們生成實(shí)體器官和組織，例如骨，心臟和軟骨)。造血型 成體祖細(xì)胞可以從骨髓容易地獲得并且已經(jīng)用于臨床。然而，與非造血型成體細(xì)胞相關(guān)的 技術(shù)開發(fā)得相當(dāng)少，這是由于難以獲得足夠數(shù)目的這些細(xì)胞并且難以使這些細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室 中生長。為了在治療中使用祖細(xì)胞，必需的是能夠?qū)⒆婕?xì)胞在使用它們之前成功地儲藏。 祖細(xì)胞必須以一種方式儲藏，這樣使得它們被有效保藏并且它們的活力得以維持。大體上， 這些祖細(xì)胞被深冷保存用于存儲并且使用前解凍。細(xì)胞培養(yǎng)物的深冷保存(低于-100°C儲藏)被廣泛用于保持細(xì)胞的備份或儲備， 而無需與喂養(yǎng)和照顧它們相關(guān)聯(lián)的努力和開支。冷凍過程的成功取決于4個(gè)關(guān)鍵的方面 培養(yǎng)物的適當(dāng)處理、受控的冷凍、適當(dāng)?shù)膬Υ嬉约耙环N適當(dāng)?shù)纳罾浞雷o(hù)劑。最后這一點(diǎn)是特 別地重要，并且一種適當(dāng)?shù)脑噭┛梢杂兄诒３旨?xì)胞的活力。在臨床情況下，特別地重要的是在深冷保存之后，細(xì)胞仍然有活力并且細(xì)胞活力 的任何增加將提高治療的效果。此外，對于祖細(xì)胞而言為了治療有效，它們有必要分化成所要求的細(xì)胞類型。因 此，對于開發(fā)祖細(xì)胞分化的有效調(diào)節(jié)劑以確保這些祖細(xì)胞分化成所要求的細(xì)胞類型也存在
著一種需要。而且，對于開發(fā)祖細(xì)胞增殖的有效調(diào)節(jié)劑也存在著一種需要。通常令人希望的是 祖細(xì)胞在體外和體內(nèi)都增殖。所以，在深冷保存期間對于一種或多種可以保護(hù)祖細(xì)胞、增強(qiáng)它們的活力、調(diào)節(jié)它 們的分化和/或調(diào)節(jié)它們的增殖的試劑仍存在著一種需要。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述諸位本發(fā)明人目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性分子片段可以改 進(jìn)祖細(xì)胞的活力。特別地，諸位本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性分子 片段可以增強(qiáng)祖細(xì)胞的深冷保存。諸位本發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性分子片段可以調(diào)節(jié) 祖細(xì)胞的增殖。本發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性分子片段可以調(diào)節(jié)祖細(xì) 胞的分化。調(diào)節(jié)可以是向上調(diào)節(jié)或向下調(diào)節(jié)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性 分子片段可以調(diào)節(jié)分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、以及脂肪細(xì)胞。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多硫酸化 多糖或它們的生物學(xué)活性分子片段可以誘導(dǎo)軟骨形成。這些發(fā)現(xiàn)表明多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性分子片段可以與祖細(xì)胞進(jìn)行組 合使用以便在深冷保存之后改進(jìn)或增強(qiáng)祖細(xì)胞的活力，并且可以按照體外和體內(nèi)的方法和 用途與祖細(xì)胞進(jìn)行組合使用。所以，這些出乎意料的發(fā)現(xiàn)開啟了在許多新應(yīng)用中使用多硫酸化多糖或它們的一 種生物學(xué)活性分子片段的可能性。例如，通過調(diào)節(jié)分化，特別是軟骨形成，除其他事物之外 還有可能重建軟骨和椎間盤，防止關(guān)節(jié)退化并且增強(qiáng)無血管結(jié)締組織的修復(fù)。本發(fā)明之前， 并不知道多硫酸化多糖可以調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的分化，特別是軟骨形成。而且，通過調(diào)節(jié)增殖，有 可能在體外和體內(nèi)都控制祖細(xì)胞的生產(chǎn)。當(dāng)與骨關(guān)節(jié)炎(OA)治療本身相關(guān)的多硫酸化多 糖的使用公開時(shí)，以前并不知道多硫酸化多糖具有與祖細(xì)胞相關(guān)的有利的深冷保存特性、 或者并不知道它們可以調(diào)節(jié)所述細(xì)胞的分化和/或細(xì)胞增殖。所以，這開啟了以前沒有考 慮到的新的治療途徑。如在此所使用的，一種“生物學(xué)活性分子片段”是本發(fā)明的一種分子的一部分，它 保持全長分子的定義的活性，即在一個(gè)實(shí)施方案中能夠增強(qiáng)活力、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和/或調(diào) 節(jié)細(xì)胞增殖。相應(yīng)地，在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包括一種祖細(xì) 胞以及一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包括多個(gè)祖細(xì)胞、以及 一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段、以及一種載體介質(zhì)。該載體介質(zhì)可以是一種培養(yǎng)基、生物支架、深冷保存介質(zhì)、生理介質(zhì)、和/或一種 藥學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包括多個(gè)祖細(xì)胞以及 一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段，以及一種深冷保存介質(zhì)。該組合物在體外和體內(nèi)都可以使用。該組合物可以包含任何數(shù)量的祖細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含約1000 至約IxIOici個(gè)祖細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含約IxlO5至IxlO9個(gè)細(xì)胞。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含約100，000至約5xl08個(gè)祖細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明 包含約500，000至約2xl08個(gè)祖細(xì)胞、約IxlO6至約2xl08個(gè)祖細(xì)胞、或約IxlO6至約IxlO8個(gè)祖細(xì)胞。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包含約1x106、2X106、3X106、4X106、5X106、6X106、 7x106、8X106、9X106、1X107、2X107、3X107、4X107、5X107、6X107、7X107、8X107、9X107、1X108、 2x108、3X108、4X108、5X108、6X108、7X108、8X108、或 9xl08 個(gè)祖細(xì)胞。在又另一個(gè)實(shí)施方案中， 該組合物包含約IxlO8個(gè)祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在該組合物中該多硫酸化多糖的濃度將取決于該組合物中的 細(xì)胞的數(shù)量。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在該組合物中該多硫酸化多糖的濃度是從500ng/ ml/百萬個(gè)細(xì)胞至10mg/ml/百萬個(gè)細(xì)胞、或500ng/ml/百萬個(gè)細(xì)胞至2000 μ g/ml/百萬 個(gè)細(xì)胞、lyg/ml/百萬個(gè)細(xì)胞至ΙΟΟΟμ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞、或1 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞至 500 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖的濃度在以下范圍內(nèi)500ng至10μ g/ml/ 百萬個(gè)細(xì)胞；1 μ g至10 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；1 μ g至8 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；1 μ g至6 μ g/ ml/百萬個(gè)細(xì)胞；Iyg至5μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；Iyg至3μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；2yg至 6 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；2. 5 μ g至5 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；或3 μ g至5 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖的濃度在以下范圍內(nèi)1 μ g至100 μ g/ml/百萬個(gè) 細(xì)胞；1 μ g至50 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；1 μ g至20 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；1 μ g至15 μ g/ml/ 百萬個(gè)細(xì)胞；10 μ g至100 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；20 μ g至100 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；或50 μ g 至100 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖的濃度在以下范圍內(nèi) 1 μ g 至 1，000 μ g/ml/ 百萬個(gè)細(xì)胞；100 μ g 至 800 μ g/ml/ 百萬個(gè)細(xì)胞；100 μ g 至 600 μ g/ ml/百萬個(gè)細(xì)胞；100 μ g至500 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞；200 μ g至500 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖的濃度在250 μ g至500 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖的濃度包括500ng、ly g、2y g、2. 5μ g、5y g、 ομ g、15y g、20y g、30 μ g、40 μ g、50 μ g、60y g、70 μ g、80 μ g、90 μ g、100 μ g、150 μ g、 200 μ g>250μ g、300 μ g>350 μ g、400 μ g、450 μ g、500 μ g>550 μ g、600 μ g、650 μ g、700 μ g、 750 μ g、800y g、850y g、900y g、950y g、1000 μ g、1050 μ g、1100 μ g、1150 μ g、1200 μ g、 1250 μ g、1300 μ g、1350 μ g、1400 μ g、1450 μ g、1500 μ g、1550 μ g、1600 μ g、1650 μ g、 1700 μ g、1750 μ g、1800 μ g、1850 μ g、1900 μ g、1950 μ g、或 2000 μ g/ml/ 百萬個(gè)細(xì)胞。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖的濃度包括多硫酸化多糖的濃度包括200 μ g/ml/ 百萬個(gè)細(xì)胞、250 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞、300 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞、400 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞、或 500 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖的濃度包括250 μ g/ml/ 百萬個(gè)細(xì)胞或500 μ g/ml/百萬個(gè)細(xì)胞?？商娲兀摱嗔蛩峄嗵堑臐舛泉?dú)立于該組合物中細(xì)胞的數(shù)量。因此，在本發(fā) 明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在該組合物中該多硫酸化多糖的濃度是從500ng/ml至10mg/ml ； 500ng/ml 至 2000 μ g/ml ；1 μ g/ml 至 1000 μ g/ml ；或 1 μ g/ml 至 500 μ g/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖的濃度在以下范圍內(nèi)500ng至10μ g/ml ；
1μ g 至 10 μ g/ml ； 1 μ g 至 8 μ g/ml ； 1 μ g 至 6 μ g/ml ； 1 μ g 至 5 μ g/ml ； 1 μ g 至 3 μ g/ml ；
2μ g M 6 μ g/ml ；2. 5μ g至5μ g/ml ；或3yg至5yg/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫 酸化多糖的濃度在以下范圍內(nèi)1μ g至100μ g/ml ；1μ g至50 μ g/ml ；1μ g至20 μ g/ml ； 1 μ g 至 15 μ g/ml ； 10 μ g 至 100 μ g/ml ； 20 μ g 至 100 μ g/ml ；或 50 μ g 至 100 μ g/ml。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖的濃度在以下范圍內(nèi)lyg至1000yg/ml ； IOOyg至800 μ g/ml ； 100μ gM 600 μ g/ml ；ΙΟΟμ gM 500 μ g/ml ；200μ gM 500 μ g/ml。$另一^^$ 施方案中，該多硫酸化多糖的濃度在以下范圍內(nèi)Img至I1OOOygAil ；100 μ g至800 μ g/ ml ； 100μ g 至 600μ g/ml ； 100 μ g 至 500 μ g/ml ；200 μ g 至 500 μ g/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，該多硫酸化多糖的濃度在250 μ g至500 μ g/ml的范圍內(nèi)。進(jìn)一步，多硫酸化多糖的濃度包括500ng、ly g、2y g、2. 5μ g、5y g、10y g、15y g、 20μ g、30y g、40y g、50y g、60y g、70y g、80y g、90y g、100y g、150y g、200y g、250 y g、 300 μ g>350μ g、400 μ g、450 μ g、500 μ g>550μ g、600 μ g、650 μ g、700 μ g>750μ g、800 μg、 850 μ g、900y g、950y g、1000y g、1050 μ g、1100 μ g、1150 μ g、1200 μ g、1250 μ g、1300 μ g、 1350 μ g、1400 μ g、1450 μ g、1500 μ g、1550 μ g、1600 μ g、1650 μ g、1700 μ g、1750 μ g、 1800 μ g、1850 μ g、1900 μ g、1950 μ g、或2000 μ g/ml。進(jìn)一步，多硫酸化多糖的濃度包括 200 μ g/ml、250 μ g/ml、300 μ g/ml、400 μ g/ml、或500 μ g/ml。進(jìn)一步，多硫酸化多糖的濃度 包括 250 μ g/ml 和 500 μ g/ml。進(jìn)一步，組合物包含的總多硫酸化多糖含量為Img、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、 8mg、9mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、70mg、80mg、 90mg、或100mg。進(jìn)一步，組合物包含的總多硫酸化多糖含量為15至70mg、20至60mg、或 25 至 50mg。另一個(gè)實(shí)施方案包括約IxlO6至IxlO8個(gè)祖細(xì)胞以及25至50mg多硫酸化多糖。 另一個(gè)實(shí)施方案包含IxlO8個(gè)祖細(xì)胞以及25至50mg/ml多硫酸化多糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該硫酸化多糖可以按照一個(gè)量值進(jìn)行施用，從而在該生物 學(xué)區(qū)室中產(chǎn)生0. 01至100微克/ml生物介質(zhì)濃度的多硫酸化多糖，例如0. 1至50微克/ml 生物學(xué)介質(zhì)、0. 1至50微克/ml生物學(xué)介質(zhì)、0. 1至10微克/ml生物學(xué)介質(zhì)、1至10微克/ ml生物學(xué)介質(zhì)、2至8微克/ml生物學(xué)介質(zhì)、4至6微克/ml生物學(xué)介質(zhì)、或4、5、或6微克 /ml生物學(xué)介質(zhì)。提及生物學(xué)區(qū)室，它是指身體的一個(gè)區(qū)域，例如椎間盤、肌肉、滑膜關(guān)節(jié)、內(nèi)滑膜組 織(半月板、滑膜)、外滑膜組織(關(guān)節(jié)囊(capsule))、內(nèi)腱、外腱、賁門、心包、心肌、和/或 內(nèi)脂肪組織、內(nèi)韌帶、外韌帶、內(nèi)真皮、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)。該生物學(xué)介質(zhì)將取決 于這種生物區(qū)室。生物學(xué)介質(zhì)包括血液、血清、血漿、滑液、腹膜液、漿液、或脂肪組織。因 此，例如在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖可以按照一個(gè)量值進(jìn)行施用，從而在滑膜關(guān) 節(jié)中產(chǎn)生1至10微克/ml滑液濃度的多硫酸化多糖。載體介質(zhì)該組合物可以包含一種載體介質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)是一種水性溶 液。該介質(zhì)可以可任選地含有其他組分，這些組分保持了這些細(xì)胞的正常生理結(jié)構(gòu)和功能， 特別地與維持它們的環(huán)境滲透壓、PH、它的質(zhì)膜和胞內(nèi)細(xì)胞器的完整性和流動(dòng)性相關(guān)。適合于本發(fā)明的載體包括常規(guī)單獨(dú)地以及組合使用的那些，例如水、鹽水、含水 葡萄糖(aqueous dextrose)、乳糖、格林氏溶液、哺乳動(dòng)物克-林二氏溶液、厄爾氏溶液 (Earles' s solution)、蓋氏溶液(Gey，s solution)、西蒙氏溶液(Simm' s solution)、臺 羅德溶液(Tyrode solution)、透明質(zhì)酸物(hyaluronan)、生理緩沖鹽水(PBS)、洛克氏溶 液(Locke，s solution)、漢克斯氏溶液(Hank，s solution)、克-路二氏緩沖劑、緩沖劑； 由以下構(gòu)成的緩沖劑MES-Na0H、HEPES-NaOH, TRICINE-NaOH, EPPS-NaOH, BICINE-NaOH,Tris (羥甲基)氨基甲烷-HC1、甘氨酸-NaOH、碳酸氫鈉-CO2、碳酸鈉-碳酸氫鈉、二甲基 胂酸鈉、馬來酸氫鈉-NaOH;培養(yǎng)基例如伊格爾培養(yǎng)基(Eagle’ s medium)、杜伯科氏培養(yǎng) 基或緩沖劑(Dulbecco，smedium orbuffer)、麥科伊氏培養(yǎng)基(McCoy，s medium)、克里克 氏培養(yǎng)基(Click，s medium)、埃姆斯氏培養(yǎng)基(Ames，medium)、α MEM、DMEM、Ham，s F12、 Ham，s F10、RPMI-1640CMRL 1066和1415 NCTC 135 ；商購的專門的細(xì)胞系培養(yǎng)基例如 Stemline 和 Megacell 、或商購的深冷保存試劑例如 profreeze(g^nCryoStor 。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)是一種水性介質(zhì)，它可以任選地進(jìn)一步包括 以下組分中的一種或多種-有機(jī)鹽和/或無機(jī)鹽；-緩沖劑類-蛋白類，如BSA或轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferin)；-生長因子類和細(xì)胞因子類，包括胰島素樣生長因子、胰島素、成纖維細(xì)胞樣生長 因子、BMP-TGF- β超級家族(例如，ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-7、ΒΜΡ-8、TGF β )以及成纖維細(xì)胞生長因 子家族、IGF、FGF、EGF、PDGF, VEGF ；-動(dòng)物血清，包括FBS、新生胎牛/小牛、所有其他哺乳動(dòng)物物種；-深冷保存劑類，如Profreeze 和 CryoStor ；-深冷保護(hù)劑類，包括二甲亞砜(DMSO)、甘油、海藻糖、蔗糖和其他糖類、或二甲基 乙酰胺；-碳水化合物類；-維生素類/輔因子類；-激素類-抗生素類-附著因子類；-氨基酸類；-血漿增容劑，如葡聚糖；-人類和其他哺乳動(dòng)物物種的血漿；_血漿代用品；-透明質(zhì)酸物(hyaluronan)和/或透明質(zhì)酸，包括自然的或交聯(lián)的兩者。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)包括一種水性介質(zhì)，該介質(zhì)水、鹽水、含水 葡萄糖、乳糖、一種緩沖溶液、透明質(zhì)酸物和乙二醇類、生理緩沖鹽水(PBS)、格林氏溶液、洛 克氏溶液、漢克斯氏溶液、最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基，最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基α (0|^11)，或01^11。在一個(gè)實(shí) 施方案中，該載體介質(zhì)包括α MEM。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)包括DMEM。在 一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)包括HAMS 12。該載體介質(zhì)可以額外地包括深冷保存劑類，例如專有制備品，像Profreeze 或 CryoStor ο在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)可以包括深冷保存劑類，例如像 Profreeze 或CryoStor 這樣的專有制備品作為水性溶液。在該實(shí)施方案中，該組合 物不包含以下載體如，水、鹽水、含水葡萄糖、乳糖、格林氏溶液、一種緩沖溶液、透明質(zhì)酸 物、生理緩沖鹽水(PBS)、洛克氏溶液、漢克斯氏溶液、α MEM ;DMEM;或HAMS F12，并且相反，包括一種深冷保存劑，例如像Profreeze 或CryoStor 這樣的專有制備品，可任選地 與一種或多種以下的深冷保護(hù)劑相組合例如二甲亞砜(DMSO)、甘油、海藻糖、蔗糖和其他 糖類、或二甲基乙酰胺。作為一個(gè)例子，該載體介質(zhì)可以包括Profreeze 和DMSO或由其 組成。該載體介質(zhì)可以作為一種培養(yǎng)基，并且可以添加有機(jī)鹽和/或無機(jī)鹽、碳水化合 物類、維生素類、氨基酸類和/或其他實(shí)體，它們滿足了細(xì)胞的營養(yǎng)要求，允許它們在體 外正常地分裂并且發(fā)揮作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)進(jìn)一步包括血清和/或蛋 白添加物。因此，該培養(yǎng)基可以添加蛋白，包括但不限于BSA或轉(zhuǎn)鐵蛋白。除此之外，或 作為替代，該培養(yǎng)基可以添加血清，例如胎兒或新生兒血清，它們含有生長因子，例如胎 牛血清。這種制備品的配方以及使用這些介質(zhì)的方法對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言 是熟知的。適合的介質(zhì)可見于 Adams RLP. Cell culture for Biochemists. Elsevier/ North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, New York, Oxford. 1980, pp 84—97 and pp 246-260. (ISBN 0-444-80199-5)，和 Dawson RMC, Elliott DC, Elliott WH and Jones KM,Data forBiochemical Research(Third Edition),Clarendon Press,Oxford,2002,pp 417-448 (ISBN 0-19-855299-8)，其內(nèi)容以其全文進(jìn)行結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)作為一種深冷保存介質(zhì)。用于凍融細(xì)胞的的深冷 保存介質(zhì)包括使用通常已知的載體和/或培養(yǎng)基，包括在此說明的水性介質(zhì)(單獨(dú)使用 或與血清蛋白添加物相組合)?？商娲?，該載體介質(zhì)可以包括或包含專有制備品，例如 Profreeze 和CryoStor 。為了作為一種載體介質(zhì)發(fā)揮作用，通常加入了保護(hù)細(xì)胞膜和 細(xì)胞器免于在凍融過程中形成由冰晶損傷的化合物。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)進(jìn)一步包括一種或多種深冷保護(hù) 劑。適當(dāng)?shù)脑噭┗蛏罾浔Ｗo(hù)劑包括二甲亞砜(DMS0)、甘油、蔗糖以及其他糖類。適當(dāng) 的試劑的例子可以見于 Brudder S, Jaiswal N, Hainsworth S, W09739104 ；Farrant, J. 1980.Generalobservations on cell preservation. In :M. J. Ashwood-Smith and J.Farrant, Eds. Low Temperature Preservation in Medicine and Biology, Pitman Medical Limited, Kent, England, p.1-18 ；Frederick V, et al. Recovery, survival and functional evaluation by transplantation offrozen-thawed mouse germ cells. Human Reprod. 2004,19 :948-53, Pegg DE, Principles of Cryopreservation. Methods Mol Biol. 2007 ;368 :39-57，其內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，該 載體介質(zhì)進(jìn)一步包括一種試劑或深冷保護(hù)劑，它選自以下各項(xiàng)中的一種或多種二甲亞砜 (DMSO)、甘油、蔗糖和其他糖類?？商娲纳罾浔Ｗo(hù)劑包括二甲基乙酰胺(作為甘油的一種 替代)、海藻糖和/或蔗糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)包括常規(guī)的深冷保護(hù)劑，可任 選地與生長因子類和/或分化因子類相組合。適合的載體介質(zhì)的例子可見于W09832333、 W09739104 或 W01997/039104。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)進(jìn)一步包括一種專有配制品，例如 Pro freeze 和 CryoStor 。Profreeze 由 Lonza-BioWhittaker 作為含有無動(dòng)物來源組 分的冷凍介質(zhì)而出售。該載體介質(zhì)可以添加有在此中討論的試劑或保護(hù)劑，特別是DMS0、甘油、蔗 糖和其他糖類，并且進(jìn)一步特別是DMS0。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)包括Profreeze TM⑶NAO冷凍介質(zhì)，可任選地與DMSO相組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體 介質(zhì)包括α MEM、Profreeze TM⑶NAO冷凍介質(zhì)和DMSO。本發(fā)明考慮并包括了該載體介質(zhì)實(shí)現(xiàn)多種要求的可能性。因此，該載體介質(zhì)既可 以作為一種培養(yǎng)基也可以作為一種深冷保存介質(zhì)發(fā)揮作用。同樣地，該載體介質(zhì)既可以作 為一種深冷保存介質(zhì)也可以作為一種藥學(xué)上可接受的載體發(fā)揮作用。該載體介質(zhì)可以包括二甲亞砜(DMSO)和/或甘油。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介 質(zhì)包括二甲亞砜(DMSO)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括至20% DMS0。在又另一 個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括 -15% DMS0,5% -15% DMSOU % -10% DMS0,5% DMSO, 7. 5% DMSOUO% DMS0U5% DMSO或20% DMSO。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該DMSO是高純度 等級的DMSO。一些細(xì)胞可能會通過延長與DMSO的接觸而受到不利影響。這可以通過在4°C下向 該細(xì)胞懸液加入DMSO并且在剛剛?cè)诨瘯r(shí)將它除去而被降低少或消除。可替代地，可以使用 更低濃度的DMSO。作為一種另外的可能性，該載體介質(zhì)可以包括甘油而不是DMS0。因此，在一個(gè)可替 代的實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)可以包括甘油。在一個(gè)實(shí)施方案中，甘油按照以下濃度存在 1% ~30%Λ% -20%,5% -20%U% -15%,5% -15%U% -10%或 5% -10%。在一個(gè)實(shí)施方案中，該介質(zhì)包含DMSO或甘油與DMEM、HETA-淀粉和/或人血清組 分和/或其他增量劑相組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)對于注射液是可接受的，并且不影響這些細(xì)胞的 功能性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體包含血清。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體是一種無血清 的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)包含血清，在一個(gè)實(shí)施方案中是人血清組分。在一 個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)進(jìn)一步包括胎牛血清(FBS)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括 1%-50% FBS0在另一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括1 % -20% FBS、1% -10% FBS,5% FBS、 7. 5% FBSUO% FBSU5% FBS或20% FBS?？商娲?，適合的血清包括在同樣可能的濃度 下的BSA、轉(zhuǎn)鐵蛋白和/或卵黃蛋白。一種基于血清的深冷保存介質(zhì)的例子可以是一種載體介質(zhì)，該載體介質(zhì)包括一 種水性溶液(例如，格林氏溶液、生理緩沖鹽水(PBS)、洛克氏溶液、漢克斯氏溶液、α MEM、 DMEM或HAMSF12)以及一種深冷保護(hù)劑(例如，二甲亞砜(DMSO)、甘油、海藻糖、蔗糖和其他 糖類、或二甲基乙酰胺)以及血清(例如，F(xiàn)BS)。因此，一個(gè)示例性的基于血清的深冷保存介質(zhì)可以是一種載體介質(zhì)，它包括DMEM 或α MEM、DMSO以及血清(例如，使用胎牛血清)。該載體介質(zhì)也可以是無血清的和/或無蛋白的，并且可以是一種化學(xué)確定成 分的介質(zhì)。無血清介質(zhì)的例子包括KnockOut SerumReplacement, KnockOut D-MEM、 StemPro -34SFM。一種無血清介質(zhì)的例子可以是一種載體介質(zhì)，它包括一種水性溶液(例如，格林 氏溶液、生理緩沖鹽水(PBS)、洛克氏溶液、漢克斯氏溶液、aMEM、DMEM或HAMS F12)以及一 種深冷保護(hù)劑(例如，二甲亞砜(DMSO)、甘油、海藻糖、蔗糖和其他糖類、或二甲基乙酰胺) 以及一種深冷保護(hù)介質(zhì)(例如，像Profreeze 或CryoStor 這樣的專有制備品)。
因此，一種示例性的基于血清的深冷保存介質(zhì)可以是一種載體介質(zhì)，該載體介質(zhì) 包括 α MEM、DMSO 以及Profreeze 、或僅僅是 DMSO 禾PProfreeze 。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)包括Pro freeze 。Pro freeze 是一種無血清
的冷凍介質(zhì)，并且專門被配制為用于深冷保存已經(jīng)在無血清的介質(zhì)中繁殖的細(xì)胞。這種無 蛋白、無動(dòng)物組分的介質(zhì)是不含自然的動(dòng)物蛋白的，并且當(dāng)從冷凍存儲復(fù)蘇時(shí)保持著高細(xì) 胞活力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)包括Profreeze 以及DMS0，其中該DMSO可任 選地是7. 5%或15%?？商娲?，該載體介質(zhì)可以包括CRYOSTOR CryoStor 。在一個(gè)實(shí)施方案中，該介質(zhì)可以包括緩沖劑類。緩沖劑類包括DMEM、磷酸鹽緩沖 液、或CMF-PBS。本發(fā)明涵蓋了通常使用的生理緩沖劑類。示例性的緩沖劑可見于文獻(xiàn)中，例 如Lelong IH andRebel G. pH drift of"physiological buffers"and culture media used forcell incubation during in vitro studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 1998 ； 39 203-210 ；John A Bontempo. Development ofBiopharmaceutical Parenteral Dosage Forms, in Drugs and thePharmaceutical Sciences.Marcel Dekker Inc, NY(ISBN 0-8247-9981-X) :pp 91-108，其內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。該介質(zhì)可以任選地進(jìn)一步包括糖類(包括葡聚糖、海藻糖、蔗糖)或二甲基乙酰 胺(DMA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括多個(gè)祖細(xì)胞；多硫酸化多糖以及一種載體介質(zhì)， 該載體介質(zhì)包括_ 一種水性介質(zhì)，選自水、鹽水、含水葡萄糖、乳糖、格林氏溶液、一種緩沖溶液、 透明質(zhì)酸物、乙二醇類、生理緩沖鹽水(PBS)、洛克氏溶液、漢克斯氏溶液、aMEM、DMEM、或 HAMSF12 ；-一種深冷保存介質(zhì)，包括卩1*0&6626(1)或CryoStor ；以及-一種深冷保護(hù)劑，選自二甲亞砜(DMSO)和/或甘油。-在一個(gè)實(shí)施方案中，該深冷保存介質(zhì)是Profreeze 。在一個(gè)實(shí)施方案中，該水性介質(zhì)是a MEM或DMEM。在一個(gè)實(shí)施方案中，該深冷保護(hù)劑是DMSO。在一個(gè)實(shí)施方案中，該水性介質(zhì)以-99%、約10%、約20%、約30%、約40%、 約50%、約60%、約70%、約80%、或約90%存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，該深冷保存介質(zhì)以-99%，約10%、約20%、約30%、約 40%、約50%、約60%、約70%、約80%、或約90%存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，該深冷保護(hù)劑以-50%、1% -30%、1% _15%、1% -10%、 1% -7. 5%,2. 5%,5%,7. 5%,10%,12. 5%,15%,17. 5%或 20%的量存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了多個(gè)祖細(xì)胞與一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性 分子片段，深冷保存于約5mL的Profreeze TMO)NA0冷凍介質(zhì)、7. 5% DMSOjP 50% a MEM 中。在深冷保存的那個(gè)時(shí)間細(xì)胞濃度可以是在5mL冷凍介質(zhì)中90xl06個(gè)細(xì)胞/深冷袋至 180x106個(gè)細(xì)胞/深冷袋。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體介質(zhì)包括一種支持基質(zhì)。該支持基質(zhì)另外可以指 生物基質(zhì)或生物支架。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)祖細(xì)胞的深冷保存的方法，包括將這些祖細(xì)胞暴露于一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片 段用于增強(qiáng)祖細(xì)胞的深冷保存的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)祖細(xì)胞的活力的方法，包括將這些 祖細(xì)胞暴露于一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片 段用于改進(jìn)祖細(xì)胞的活力的用途。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種多硫酸化多糖作為一種深冷保存劑的用 途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種如在此所定義的組合物用于增強(qiáng)祖細(xì)胞 的深冷保存的用途。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)祖細(xì)胞活力的方法，包括深 冷凍存如在此所定義的一種組合物并且隨后融化該組合物。因此，將多硫酸化多糖加入到深冷介質(zhì)中對祖細(xì)胞沒有不良作用、并且對它們的 活力沒有有害的作用已經(jīng)第一次得到證明。事實(shí)上，將多硫酸化多糖加入到深冷介質(zhì)中已 經(jīng)顯示出增強(qiáng)了祖細(xì)胞的活力。此外，已經(jīng)顯示出將多硫酸化多糖加入到祖細(xì)胞中保持或改進(jìn)了祖細(xì)胞本身的活 力。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了多硫酸化多糖用于保持或改進(jìn)祖細(xì)胞的活力的用 途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種保持或改進(jìn)祖細(xì)胞活力的方法，該方法包含將一種多 硫酸化多糖與該祖細(xì)胞進(jìn)行接觸。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性分子片段可以調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的增殖。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)祖細(xì)胞增殖的方法，該方法包 括將一種祖細(xì)胞暴露于一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片 段用于調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的增殖的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種如在此定義的組合物用于增加增殖的用 途。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)祖細(xì)胞增殖的方法，該方法包括使 用一種如在此定義的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種如在此定義的組合 物用于調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的增殖的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，增殖是增加的或向上調(diào)節(jié)的。因此，將多硫酸化多糖與祖細(xì)胞一起使用可以改進(jìn)這些祖細(xì)胞的增殖已經(jīng)第一次 得到證明。這些多硫酸化多糖以一種濃度依賴的方式刺激祖細(xì)胞增殖。所以，多硫酸化多 糖可以用于其中增殖這些細(xì)胞是令人希望的應(yīng)用中。例如，祖細(xì)胞的體外增殖將用于集落 的擴(kuò)展用于生物工程領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。作為一個(gè)例子，一種生物支架可以用祖細(xì)胞的集落浸 漬，并且在37°C下由含有一種或多種多硫酸化多糖的培養(yǎng)基灌注。這將促進(jìn)增殖從而進(jìn) 一步移入并填充該支架，從而提供一種更加功能化的替代組織。作為另一個(gè)例子，一種預(yù) 先成型的(管狀或半球形)生物支架可以與自體的或異體的祖細(xì)胞一起種下，并且用含有 一種或多種多硫酸化多糖的介質(zhì)灌注，從而最終生成一種在宿主中(其中這些軟骨是缺損 的)用于移植的氣管或關(guān)節(jié)表面。關(guān)于這些用途的進(jìn)一步信息可見于在Chen FH andTuan RS. Mesenchymal cells in rhematic diseases. Arthritis researchand Therapy. 2008 ；10 :223-239。體內(nèi)多硫酸化多糖刺激增殖將利于促進(jìn)移植物進(jìn)入到大的缺陷處(例如，在關(guān) 節(jié)軟骨中)或剝奪了活性的內(nèi)源駐留細(xì)胞的隔區(qū)中(例如，椎間盤的中心)，由此減少了 修復(fù)和重建這種缺損所要求的時(shí)間。因?yàn)樽婕?xì)胞也是抗炎細(xì)胞因子和免疫抑制因子的 一禾中豐富的來源(參見，例如 Aggarwal S and Pittenger A, Human progenitorcells modulate allogeneic immune cell responses. Blood. 2005 ;105 :1815—1822、Tyndale A, et al. Immunomodulatory properties ofprogenitor cells :a review based on an interdisciplinary meeting held atthe Kennedy Institute of Rheumatology Division, London, UK, 310ctober 2005. Arthritis Res Ther. 2007 ；9 :301_15 ； Jorgensen C,et al. Multipotent mesenchymal stromal cells in articular disease. BestPractice and Research Clinical Rheumatology. 2008 ;22 :269284)，它們在炎癥部位的增殖或注射 之后的抗原應(yīng)答將增加對抑制這些不想要的細(xì)胞加工的潛力。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多硫酸化多糖可以調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的分化。該分化可以是向上調(diào)節(jié)或向下 調(diào)節(jié)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的分化的方法，這是通過將一種祖 細(xì)胞暴露于一種多硫酸化多糖或它的一種生物學(xué)活性分子片段來進(jìn)行的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段用于 調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的分化的用途。本發(fā)明調(diào)節(jié)了祖細(xì)胞的分化。本發(fā)明的細(xì)胞可以分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、以及 脂肪細(xì)胞譜系，并且在一個(gè)實(shí)施方案中可以分化成不同譜系的細(xì)胞類型，包括骨骼、軟骨、 脂肪、肌肉、腱、以及間質(zhì)(stroma)。具體地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這些多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性分 子片段可以調(diào)控分化成軟骨細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些多硫酸化多糖或它們的生物 學(xué)活性分子片段可以調(diào)節(jié)分化為成骨細(xì)胞。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，這些多硫酸化多糖或 它們的生物學(xué)活性分子片段可以調(diào)節(jié)分化成脂肪細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些多硫酸 化多糖或它們的生物學(xué)活性分子片段可以調(diào)節(jié)分化成纖維軟骨細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，這些多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性分子片段可以調(diào)節(jié)分化成腱細(xì)胞(tenocyte)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性分子片段可以調(diào)節(jié)分化成心 臟細(xì)胞(cardiocyte)。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多硫酸化多糖或它們的生物學(xué)活性分子片段可以調(diào)節(jié)并誘導(dǎo)軟 骨形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明調(diào)節(jié)了祖細(xì)胞中軟骨形成，這些祖細(xì)胞支持軟骨細(xì) 胞表現(xiàn)型的分化和存活率。因此，一方面，本發(fā)明涉及軟骨細(xì)胞或纖維軟骨細(xì)胞的形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多硫酸化多糖向上調(diào)節(jié)了分化。在一個(gè)可替代的實(shí)施方 案中，該多硫酸化多糖向下調(diào)節(jié)了分化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在祖細(xì)胞中調(diào)節(jié)軟骨形成的方法，該方 法包括將一種多硫酸化多糖施用一種祖細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種多硫酸化多糖用于調(diào)節(jié)祖細(xì)胞中軟骨形成的用 途。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種多硫酸化多糖用于向下調(diào)節(jié)祖細(xì)胞中成骨作用 的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種多硫酸化多糖用于阻止祖細(xì)胞中成骨作用的用 途。本方法或用途可以用于其中骨骼的生成對于宿主將是有害的應(yīng)用中，例如在軟組織部 位，這些部位要求靈活性以及活動(dòng)用于正常的功能，例如肌肉(心臟)、間質(zhì)、支持性結(jié)締組 織、等等，或在以下部位，其中骨骼可能碰撞或纏繞神經(jīng)纖維/神經(jīng)根或血管，導(dǎo)致感覺異 常、麻痹、局部缺血以及潛在的不可逆的組織損傷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種處理細(xì)胞來經(jīng)歷軟骨形成的方法，該方法包括 將一種祖細(xì)胞與有效量的一種多硫酸化多糖或它的一種生物學(xué)活性分子片段進(jìn)行接觸，持 續(xù)一段時(shí)間，并且在刺激該細(xì)胞分化的條件下。祖細(xì)胞術(shù)語“祖細(xì)胞”是指包括任何多能(multipotent)細(xì)胞。因此，術(shù)語祖細(xì)胞涵蓋了 成體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該祖細(xì)胞是一種間充質(zhì)祖細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該祖細(xì)胞是一種內(nèi)源性或外源性的胚胎的、或成體間充質(zhì) 的、或間充質(zhì)的祖細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，祖細(xì)胞是一種多能的間質(zhì)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，該細(xì)胞是一種成體未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，祖細(xì)胞是一種軟骨祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些祖細(xì)胞 是從骨髓衍生的?？商娲兀@些祖細(xì)胞從軟骨、滑膜組織、肌肉、脂肪組織、皮膚、臍帶、牙 髓、或其他可獲得的來源衍生的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該祖細(xì)胞是一種體細(xì)胞，例如被內(nèi)源性因子抑制分化的結(jié)締 組織細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些祖細(xì)胞是富集Stro-Itoi的細(xì)胞、或同質(zhì)的Stro-Itoi細(xì) 胞、或Stro-Itoi子代細(xì)胞的群體。多硫酸化多糖該多硫酸化多糖家族可以被認(rèn)為是任何天然發(fā)生的或半合成/合成的多硫酸化 多糖或它的一種生物學(xué)活性片段，它包含兩個(gè)或多個(gè)糖環(huán)或碳水化合物結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)或 多個(gè)硫酸酯基團(tuán)共價(jià)連接到該環(huán)或該結(jié)構(gòu)上，正如通過肝素和多硫酸戊聚糖例證。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該多硫酸多糖或它的生物學(xué)活性片段可以是選自(但不限 于)自然發(fā)生的高分子量肝素、低分子量肝素、硫酸乙酰肝素、多硫酸戊聚糖、多硫酸軟骨 素、多硫酸殼聚糖、多硫酸皮膚素舒洛地昔、多硫酸葡聚糖、多硫酸化胰島素、硫酸化乳糖酸 酰胺、硫酸化雙醛糖酸酰胺、八硫酸蔗糖、墨角藻聚糖-1、墨角藻聚糖-2、硫酸化β-環(huán)糊 精、硫酸化Y-環(huán)糊精以及小的硫酸化的化合物，包括但不限于肌醇六硫酸酯。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些多硫酸化多糖包括多硫酸戊聚糖、多硫酸軟骨素、多 硫酸殼聚糖、多硫酸葡聚糖以及肝素(高和低分子量)。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，這些多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖、多硫酸葡聚糖以及 肝素。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，這些多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖的鈉 鹽(NaPPS)、戊聚糖多硫酸酯的鎂鹽(MgPPS)、和/或戊聚糖多硫酸酯的鈣鹽(CaPPS)。
一種具體的多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖(PPS)或它的鈉鹽。多硫酸戊聚糖已經(jīng) 顯示出改進(jìn)祖細(xì)胞的活力、增強(qiáng)祖細(xì)胞的深冷保持、調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的增殖和/或調(diào)節(jié)祖細(xì)胞 的分化。多硫酸戊聚糖已經(jīng)顯示出向上調(diào)節(jié)分化，并且特別是誘導(dǎo)軟骨形成。一種可替代的多硫酸化多糖是多硫酸葡聚糖。多硫酸葡聚糖已經(jīng)顯示出向下調(diào)節(jié) 或抑制分化，并且特別是向下調(diào)節(jié)或抑制軟骨形成。用途本發(fā)明的祖細(xì)胞可以分化成許多細(xì)胞類型，包括軟骨細(xì)胞、纖維軟骨細(xì)胞、成骨 細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞。因?yàn)樽婕?xì)胞可以分化成軟骨細(xì)胞或纖維軟骨細(xì)胞，這些細(xì)胞在生成細(xì)胞外基質(zhì)中 是有用的。細(xì)胞外基質(zhì)可以適用于移入到需要這種治療的患者體內(nèi)的結(jié)締組織缺損中。本發(fā)明可用于誘導(dǎo)軟骨修復(fù)、再生或基質(zhì)新生并且減緩其分解代謝，這是通過將 一種多硫酸化多糖或它的一種生物學(xué)活性分子片段與多個(gè)祖細(xì)胞相組合來進(jìn)行的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物也可以用作一種免疫抑制劑、抗代謝分解 或抗炎劑。作為一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明的組合物可以用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在此所討論的方法可以在體內(nèi)或體外使用。在體內(nèi)，除了其他事項(xiàng)之外，所插入的 祖細(xì)胞還可以在原位重建軟骨。此外，也可以刺激在關(guān)節(jié)中駐留的祖細(xì)胞來原位重建軟骨， 由此形成一種有效的指向性的治療。在體外，本發(fā)明允許在一種生物基質(zhì)中生成軟骨，它可以隨后被移植到患者體內(nèi)。 這可以用來生成軟骨以便部分地或全部替換活動(dòng)關(guān)節(jié)的表面，用于替換軟骨的/纖維軟骨 的組織或可以從該過程受益的任何其他組織，它們已經(jīng)受到損傷或由遺傳異常產(chǎn)生，這些 異常需要外科矯治。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)用于可能未從目前可獲得的內(nèi)科或外科治療受益的患者。例如，已 經(jīng)遭受由外傷引起的急性損傷痛苦的許多運(yùn)動(dòng)員或個(gè)體可能具有軟骨/纖維軟骨缺損，這 些缺損是具有癥狀的。本發(fā)明提供了一種可以用于刺激新軟骨生長來替換該缺損組織的方 法。這可以在體內(nèi)通過刺激祖細(xì)胞在關(guān)節(jié)原位生長或在體外通過一種適當(dāng)?shù)纳镏Ъ軄硗?成，該生物支架是成型的從而適合放入該缺損中并且隨后插入該缺損中；或者通過體內(nèi)和 體外兩種方法來完成?？商娲兀梢杂糜诰哂写_定的關(guān)節(jié)退化的老年患者，例如在外周 關(guān)節(jié)和脊柱的骨性關(guān)節(jié)炎中，其中本發(fā)明可以用于刺激新軟骨的生長從而替換該缺損組織 并阻止骨贅的進(jìn)展并且降低炎癥，這種炎癥通常是這些障礙的癥狀的原因。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明已經(jīng)鑒定了一種或多種化合物，這種或這些化合物可 以充當(dāng)一種深冷保存劑以及可以調(diào)節(jié)分化的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明已經(jīng)鑒定 了一種或多種化合物，這種或這些化合物可以充當(dāng)一種深冷保存劑以及可以調(diào)節(jié)增殖的試 劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明已經(jīng)鑒定了一種或多種化合物，這種或這些化合物可以調(diào) 節(jié)增殖并調(diào)節(jié)分化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明已經(jīng)鑒定了一種或多種化合物，這種或這 些化合物可以充當(dāng)一種深冷保存劑、充當(dāng)一種調(diào)節(jié)增殖的試劑、并充當(dāng)一種可以調(diào)節(jié)增殖 的試劑。此類多用途的化合物以前沒有發(fā)現(xiàn)與祖細(xì)胞相關(guān)。本發(fā)明已經(jīng)鑒別出多個(gè)分子家族或它們的生物學(xué)活性片段，它們可以獨(dú)立地或彼 此相組合增強(qiáng)祖細(xì)胞的深冷保存、調(diào)節(jié)它們的細(xì)胞增殖和/或調(diào)節(jié)它們的分化；由此，這些 分子在治療處理時(shí)可以與祖細(xì)胞進(jìn)行組合使用。
具體地，本發(fā)明允許祖細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞/成纖維細(xì)胞，由此允許形成軟骨或 纖維軟骨。所以，使用祖細(xì)胞和多硫酸化多糖可以用于治療退行性疾病、治療軟骨/纖維軟 骨缺損、和/或阻止退行性疾病和軟骨缺損的進(jìn)展或?qū)⑵渥钚』?。本發(fā)明已經(jīng)鑒別出一種新穎的組合物。這種組合物具有治療用途，并且可以有利 地在體內(nèi)或體外使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法是在體內(nèi)進(jìn)行的?？商娲兀摲椒ㄊ窃?體外進(jìn)行的。所以，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種如在此所說明的用作藥物的組合 物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種如在此所說明的組合物，用于治療由 軟骨斷裂或減小所影響的任何疾病，包括肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨 性關(guān)節(jié)炎(OA)、以及椎間盤退行性變(DD)、退行性疾??；以及誘導(dǎo)軟骨修復(fù)、再生或基質(zhì)新 生的方法。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種如在此所說明的組合物，用于治療由 軟骨斷裂或減小所影響的任何疾病，包括肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨 性關(guān)節(jié)炎(OA)、以及椎間盤退行性變(DD)、退行性疾?。灰约罢T導(dǎo)軟骨修復(fù)、再生或基質(zhì)新 生的方法。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種如在此所說明的組合物，用于治療以 下任何疾病，其中經(jīng)由成骨作用的祖細(xì)胞分化是不想要的。例如，骨形成通常對于軟組織修 復(fù)(例如，盤內(nèi)注射)是不想要的。細(xì)胞從椎間盤進(jìn)入到脊椎管中或到鄰近器官上(例如， 食管)的滲漏可能是災(zāi)難性的。這樣的一個(gè)例子可以在將BMP-2置于椎間盤隔間中來促進(jìn) 脊柱融合(新骨)時(shí)看到。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用重組骨形成蛋白導(dǎo)致了威脅生命的并發(fā)癥，因?yàn)?鄰近該椎盤隔間形成的異位性骨，它造成氣道和神經(jīng)壓迫。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種如在此所說明的組合物，用于治療被 脂肪組織的斷裂或減少所影響的疾病。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在此提供了 一種如在此所說明的組合物用于制 造對由軟骨斷裂或減小所影響的任何疾病進(jìn)行治療的藥物的用途，這些疾病包括肌肉骨骼 系統(tǒng)疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨性關(guān)節(jié)炎(OA)、以及椎間盤退行性變(DD)、退行性 疾??；以及誘導(dǎo)軟骨修復(fù)、再生或基質(zhì)新生的方法。所以，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在此提供了 一種治療、減輕、減少或預(yù)防由軟 骨斷裂或減少所影響的任何疾病的方法，這些疾病例如肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，包括類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎(RA)、骨性關(guān)節(jié)炎(OA)、以及椎間盤退行性變(DD)、退行性疾?。灰约罢T導(dǎo)軟骨修 復(fù)、再生或基質(zhì)新生的多種方法，包括給予治療有效量的如在此定義的一種組合物。這種應(yīng)用的例子可以是將本發(fā)明的組合物注入具有軟骨或椎間盤損傷的個(gè)體的 關(guān)節(jié)中、或全身地用于其他較難達(dá)到的位點(diǎn)，允許該制備品灌注該組織和細(xì)胞從而發(fā)揮其 獨(dú)特的生物效應(yīng)。施用可以包括治療以下個(gè)體，這些個(gè)體可能不具有臨床定義的疾病(通 常是OA或相關(guān)障礙)、但已經(jīng)持續(xù)一種由(例如)運(yùn)動(dòng)或工作有關(guān)的活動(dòng)所造成的對關(guān)節(jié) 組織的外傷損害。本發(fā)明的方法和用途還可以充當(dāng)關(guān)節(jié)鏡或開放手術(shù)后的一種預(yù)防方法，其中軟骨 或半月板切除/清創(chuàng)是必需的。已經(jīng)完全確定的是隨著時(shí)間推移此類術(shù)后患者將普遍地發(fā)展到表現(xiàn)出要求內(nèi)科治療的癥狀的OA。通過減少軟骨退化使得多種癥狀得以改進(jìn)也不是不 可能，這是由于促進(jìn)炎癥的抗原產(chǎn)生減少的緣故。由此，使用在此討論的本發(fā)明的組合物來調(diào)節(jié)引入到患者體內(nèi)的祖細(xì)胞的分化和 /或細(xì)胞增殖，能夠用于治療、減輕、減少或防止由軟骨斷裂或減少所影響的任何疾病。特定 的疾病包括肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨性關(guān)節(jié)炎(OA)、以及椎間盤 退行性變(DD)、退行性疾??；以及誘導(dǎo)軟骨修復(fù)、再生或基質(zhì)新生的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物是通過靜脈內(nèi)進(jìn)行給藥的。根據(jù)又另一個(gè)實(shí)施方案， 該組合物是全身給藥的。根據(jù)又另一個(gè)實(shí)施方案，該組合物是通過關(guān)節(jié)內(nèi)進(jìn)行給藥的。根 據(jù)又另一個(gè)實(shí)施方案，該組合物是通過椎間盤內(nèi)進(jìn)行給藥的。根據(jù)又另一個(gè)實(shí)施方案，該組 合物是全身給藥的。在一個(gè)實(shí)施方案中的是將一種多硫酸化多糖與多個(gè)祖細(xì)胞相組合注射到該患者 的一個(gè)關(guān)節(jié)或多個(gè)關(guān)節(jié)中的方法。該多硫酸化多糖幫助調(diào)節(jié)這些祖細(xì)胞的分化和/或增殖。額外地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多硫酸化多糖還能夠在分化的細(xì)胞中生成、向下調(diào)節(jié) 透明質(zhì)酸物或透明質(zhì)酸(HA)、或刺激透明質(zhì)酸物或透明質(zhì)酸(HA)的產(chǎn)生。這種透明質(zhì)酸 (HA)可以在一種動(dòng)物或細(xì)胞中(即一種動(dòng)物體內(nèi)或在一種體外的細(xì)胞中)產(chǎn)生。這個(gè)出乎意料的發(fā)現(xiàn)意味著本發(fā)明的組合物可用于替換關(guān)節(jié)中(特別是滑液中) 由于正常磨損和撕裂、退行性疾病或其他急性外傷的HA損失。因?yàn)榛和嘶?，它保護(hù)并潤 滑關(guān)節(jié)的能力被降低。這使關(guān)節(jié)進(jìn)一步退化，并且還可以刺激產(chǎn)生又造成進(jìn)一步損傷的自 身抗原在過去，克服或至少減輕這個(gè)問題的一種方法是替換該滑液。然而，本發(fā)明提供了一種刺激生成透明質(zhì)酸物或透明質(zhì)酸(HA)、而不需要替換該 滑液其自身的手段。本發(fā)明的組合物可以與祖細(xì)胞進(jìn)行接觸，然后這些祖細(xì)胞分化成間充 質(zhì)細(xì)胞(例如，軟骨細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)來增加HA的生成。這種HA是原位形成的，并且可 以用于替換滑液中損失的HA，它治療、減少或至少減輕由這些退行性疾病或組織退化所引 起的損傷。因此，根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生、向上調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸物(HA)或 刺激透明質(zhì)酸物(HA)產(chǎn)生的方法，包括給予一種如在此定義的組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這些組合物、方法和用途可以用于治療關(guān)節(jié)炎或其 他退行性疾病。然而，在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明排除了治療關(guān)節(jié)炎或其他退行性 疾病的方法。確切地，一方面，本發(fā)明包括將一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段 與多個(gè)祖細(xì)胞進(jìn)行組合給予來對治療關(guān)節(jié)炎或其他退行性疾病進(jìn)行治療的用途。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種治療患者的方法，該患者患有肌肉 骨骼系統(tǒng)疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨性關(guān)節(jié)炎(OA)、以及椎間盤退行性變(DD)；退 行性疾病、滑膜關(guān)節(jié)的骨性關(guān)節(jié)炎、眼科學(xué)、術(shù)后腹部粘連的防止、皮膚治療和修復(fù)以及細(xì) 胞外基質(zhì)的功能的恢復(fù)；或用于誘導(dǎo)軟骨修復(fù)、恢復(fù)或基質(zhì)新生，包括給予一種如在此定義 的組合物，從而調(diào)節(jié)這些祖細(xì)胞的分化和/或增殖。該患者或受試者可以是人或動(dòng)物患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該患者是一種哺乳動(dòng) 物，包括人、馬、犬、貓、綿羊、奶?；蜢`長類動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該患者是人。該患者 可能患有一種退行性疾病和/或軟骨缺損。該患者可能是一位運(yùn)動(dòng)員或可能已經(jīng)遭受一種造成關(guān)節(jié)損傷的外傷。本發(fā)明涵蓋了涉及到多硫酸化多糖和祖細(xì)胞的治療方法。本發(fā)明還涵蓋了這些多 硫酸化多糖和祖細(xì)胞用作藥物；這些多硫酸化多糖以及祖細(xì)胞在制造用于如在此所說明的 治療的藥物中的用途；并且還涵蓋了包含這些多硫酸化多糖和祖細(xì)胞的組合物和配制品。聯(lián)合治療本發(fā)明第一次鑒定了還可以調(diào)節(jié)分化和細(xì)胞增殖(特別是調(diào)節(jié)軟骨形成和細(xì)胞 增殖)的多肽或它們的一種生物學(xué)活性片段。該多肽是α IX膠原的一種非膠原NC4結(jié)構(gòu) 域或它的一種生物學(xué)活性分子片段(以下稱NC4)。術(shù)語“一種生物學(xué)活性片段”與術(shù)語“一 種生物學(xué)活性分子片段”是同義的。出人意料的是，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)盡管兩個(gè)獨(dú)立的家族可以獨(dú)立地進(jìn)行它們對軟骨 形成和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)，當(dāng)組合在一起時(shí)它們能夠協(xié)同地發(fā)揮作用，不僅增加它們各自的 效應(yīng)而且提供了更大的作用特異性。這些未曾預(yù)料的發(fā)現(xiàn)開啟了在許多新的應(yīng)用中將一種多硫酸化多糖與NC4進(jìn)行 組合使用的可能性，因?yàn)橥ㄟ^調(diào)節(jié)軟骨形成，除了其他事項(xiàng)之外還有可能重建軟骨和椎間 盤、防止關(guān)節(jié)的退化并且增強(qiáng)無血管結(jié)締組織的修復(fù)。在本發(fā)明之前，并不知道一種多硫酸 化多糖和NC4的組合可以調(diào)節(jié)軟骨形成和細(xì)胞增殖，并且顯然不知道該組合會具有一種協(xié) 同效應(yīng)。相應(yīng)地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包括多個(gè)祖細(xì) 胞以及一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段、以及NC4或它的一種生物學(xué)活性分 子片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包括一種載體介質(zhì)、培養(yǎng)基、深冷保存介質(zhì) 和/或藥學(xué)上可接受的載體。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包括多個(gè)祖細(xì) 胞、一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段、以及NC或它的一種生物學(xué)活性分子片 段、連同一種載體介質(zhì)。該載體介質(zhì)可以是一種培養(yǎng)基、深冷保存介質(zhì)或藥學(xué)上可接受的載體。對本發(fā)明的組合物(這些組合物涉及祖細(xì)胞和多硫酸化多糖)的任何提及也涉及 包含多個(gè)祖細(xì)胞、多硫酸化多糖和NC4的組合物，包括濃度、細(xì)胞數(shù)和/或類型以及任選的 其他成分的量。此外，如在此定義的這些組合物的方法和用途也涉及包括一種多硫酸化多 糖和NC4這兩者的組合物。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種調(diào)節(jié)軟骨形成和/或細(xì)胞增殖 的方法，該方法包括給予一種組合物，該組合物包括多個(gè)祖細(xì)胞、一種多硫酸化多糖或它的 生物學(xué)活性分子片段、以及NC4或它的一種生物學(xué)活性分子片段。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)祖細(xì)胞增殖的方法，該方法包 括將一種祖細(xì)胞暴露于一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段、以及NC4或它的一 種生物學(xué)活性分子片段。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)祖細(xì)胞分化的方法，這是通過 將這些祖細(xì)胞暴露于一種多硫酸化多糖或它的生物學(xué)活性分子片段、以及NC4或它的一種 生物學(xué)活性分子片段來進(jìn)行的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，NC4的生物學(xué)活性分子片段具有與SEQ IDNO 1的片段至少 65%的氨基酸一致性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NC4的生物學(xué)活性分子片段具有與SEQID NO 2的片段至少 65%的氨基酸一致性。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，NC4的生物學(xué)活性分子片段具有與以下序列的片段至少 65%的氨基酸一致性，這些序列是=SEQ IDNO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6,SEQ ID N0:7、SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11、SEQID NO :12、 SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ ID NO :15、SEQ IDNO : 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO :18、 SEQ ID NO 19,SEQ IDNO20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22,SEQ ID N0:23、或 SEQ IDNO 24。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NC4的生物學(xué)活性分子片段具有與以上列出的片段至少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100% 的氨基酸一致性。還有可能的是將本發(fā)明的組合物作為聯(lián)合治療的一部分來進(jìn)行給藥或使用。例 如，本發(fā)明的這種或這些多糖可以與一種或多種其他化合物進(jìn)行聯(lián)合給藥。這些化合物可 以是一種結(jié)構(gòu)修飾的骨性關(guān)節(jié)炎藥物(SMOAD)。本發(fā)明延伸到聯(lián)合治療用于治療在此所討論的疾病。具體地，在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā) 明延伸到使用一種多硫酸化多糖與另外一種試劑相組合用于治療不同的退行性病癥。應(yīng)當(dāng) 理解，這些試劑可以在相同的時(shí)間或不同的時(shí)間上進(jìn)行給藥。因此，該聯(lián)合治療可以包括將 這些活性劑一起進(jìn)行給予，這些活性劑處于單一的配制品中或處于多個(gè)配制品中(在相同 的或不同的時(shí)間給藥)。同樣地，該聯(lián)合治療可以包括以不同的配制品在不同時(shí)間點(diǎn)所給予 的活性試劑。這些配制品可以進(jìn)行依次給藥，并且可以被一段時(shí)間(包括數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù) 周和數(shù)月)分開。本發(fā)明也延伸到如在此討論的多硫酸化多糖與一種或多種生長因子相組合的用 途。本發(fā)明進(jìn)一步延伸到如在此所披露的方法、用途、配制品和/或組合物，它們與一種或 多種生長因子相組合?？赡艿纳L因子包括胰島素樣生長因子、胰島素、成纖維細(xì)胞樣生長 因子、BMP-TGF-β超家族(例如，81^-2，81^-7，81^-836 0)以及成纖維細(xì)胞生長因子家 族、IGF、FGF、EGF、PDGF 禾P VEGF0


圖1.多硫酸戊聚糖(PPS)對正常的人類MSC凍/融活力的作用。在37°C水浴中 將人類MSC快速融化，并且用HHF (HBSS，含有5% (體積/體積)胎牛血清)洗滌2次。隨 后，將這些細(xì)胞以8，000個(gè)細(xì)胞/cm2種于多個(gè)T-75燒瓶中。這些細(xì)胞一直生長直到70% 至80%的會合，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，并且以50xl06/ml的細(xì)胞濃度在添加指定濃度的PPS 的Profreeze Π. 5% DMSO中將這些細(xì)胞深冷保存。將安瓿從液氮庫中取回，并且快速 融化、輕輕混合，并且在時(shí)間=0、30、60、90和120分鐘時(shí)去除IOul樣品。向每一個(gè)細(xì)胞樣 品中加入290ul臺盼藍(lán)，并且進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)/活力測試。PPS并未對細(xì)胞活力產(chǎn)生不利的影 響。圖2.柱狀圖顯示在經(jīng)受凍融循環(huán)之后懸浮在含有7. 5% DMSO和不同濃度的多硫 酸戊聚糖(PPS)的深冷介質(zhì)中不同數(shù)量的鼠ATDC5祖細(xì)胞的活力。細(xì)胞活力是使用線粒體脫氫酶MTT測定來確定的。圖3.不同濃度的多硫酸戊聚糖(PPS)對祖細(xì)胞在液氮中深冷保存并且快速融化 之后(如圖1中所說明)的活力的作用。細(xì)胞活力是使用線粒體脫氫酶MTT測定來確定的。 顯示的數(shù)據(jù)=平均值士 SD* = P < 0. 05相對于對照值圖4.多硫酸戊聚糖(PPS)對人類祖細(xì)胞增殖的作用。原代人類祖細(xì)胞在24孔板 中在添加指定濃度的PPS的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在不同的時(shí)間間隔(第1、3、6天)，將 生長培養(yǎng)基去除并且用含有四唑鐺鹽WST-I的無酚紅的培養(yǎng)基替換，在37°C下/5% C02下 持續(xù)2小時(shí)。在有活力的細(xì)胞中WST-I被線粒體脫氫酶剪切從而產(chǎn)生一種甲臜(formazan) 染料，該染料可以使用ELISA酶標(biāo)儀在波長450nm處檢測到。顯示了所有濃度的PPS對于 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在450nm處的吸光度。在第6天在超過1 μ g/ml的PPS濃度下觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上 顯著的增殖增加Γρ < 0.01, AN0VA)。圖5.多硫酸戊聚糖(PPS)對在微團(tuán)培養(yǎng)(micromass culture) 4天之后人類祖細(xì) 胞DNA合成的濃度依賴性作用的柱狀圖，正如通過將3H-胸腺嘧啶核苷摻入到大分子DNA中 所確定。* = ρ < 0. 05廣=ρ < 0. 005相對于對照物。圖6.多硫酸戊聚糖(PPS)對用凋亡試劑處理的人類祖細(xì)胞的作用。將人類祖細(xì) 胞鋪板于添加指定濃度的PPS的無血清培養(yǎng)基中。祖細(xì)胞的凋亡是通過加入30ng/ml IL-4 加上30，000U/ml IFN-y的組合來誘導(dǎo)的。5天培養(yǎng)后，通過胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，并且 通過鈣磷脂結(jié)合蛋白AKArmexin V)染色來評估活力。當(dāng)祖細(xì)胞以超過lug/ml的PPS濃度 培養(yǎng)時(shí)，觀察到了 IFN-Y/IL-4-誘導(dǎo)的凋亡(鈣磷脂結(jié)合蛋白V陽性細(xì)胞)2倍的減少。圖7.多硫酸戊聚糖(PPS)對人類祖細(xì)胞分化的作用礦化測定。將原代人類祖細(xì) 胞在96孔板中在無骨誘導(dǎo)性生長培養(yǎng)基(培養(yǎng)基對照)中或在骨誘導(dǎo)性條件下(a MEM，添 加10% FCS、100 μ ML-抗壞血酸-2-磷酸酯、地塞米松ICT7M和3mM無機(jī)磷酸鹽)在指定濃 度的PPS的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。第28天，使用甲酚酞絡(luò)合酮法(Cresolphthalein Complexone method)來確定每個(gè)孔的酸可溶的鈣的濃度。(A)每yg DNA/孔的酸可溶的鈣的濃度是 在使用熒光性DNA染色(Hoeshst 33258)來評估每個(gè)孔中DNA總量之后所測定的。當(dāng)使用 lug/ml和lOOug/ml的PPS的濃度時(shí)，觀察到礦化基質(zhì)形成方面的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低Γρ <0.01, AN0VA)。(B)在Χ20放大倍率下礦化培養(yǎng)物的相差顯微照片。圖8.多硫酸戊聚糖(PPS)對人類祖細(xì)胞分化的作用脂肪細(xì)胞的形成。將原代 祖細(xì)胞在96孔板中在無脂肪形成性生長培養(yǎng)基中(培養(yǎng)劑對照)或在脂肪形成性條件下 (0. 5mM甲基異丁甲基黃嘌呤、0. 5 μ M氫化可的松、以及60 μ M吲哚美辛)在指定濃度的PPS 的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。第28天，充滿脂質(zhì)的脂肪細(xì)胞的存在是使用親脂性染料油紅0來確定 的。每μ gDNA/孔的可溶脂的相對量是在使用熒光性DNA染色(Hoeshst 33258)來評估每 孔的DNA總量之后來測定的。(A)在超過lug/ml的PPS濃度下觀察到脂肪細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì) 學(xué)上顯著的增加Γρ <0.01, AN0VA)。(A)油紅0標(biāo)記的脂肪細(xì)胞在χ20放大倍率下的相 差顯微照片。圖9.多硫酸戊聚糖(PPS)對鼠祖細(xì)胞(祖細(xì)胞C3H10T1/2)在單層培養(yǎng)生長時(shí)蛋 白聚糖(PG)的生物合成以及DNA含量的濃度依賴性作用。顯示的數(shù)據(jù)=平均值士SD。圖10.多硫酸戊聚糖(PPS)對以單層培養(yǎng)生長2天的鼠祖細(xì)胞(C3H10TV2細(xì)胞)的DNA合成的濃度依賴性作用的柱狀圖，正如通過將3H-胸腺嘧啶核苷摻入到大分子DNA中 所確定。圖11.多硫酸戊聚糖(PPS)對人類祖細(xì)胞在單層培養(yǎng)2天后進(jìn)行的蛋白聚糖(PG) 生物合成的濃度依賴性作用的柱狀圖，正如通過將放射性標(biāo)記的硫酸根(sulfate)摻入到 PG的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)所確定。這些數(shù)據(jù)被表示為35S-GAG放射活性，作為每分 鐘衰變數(shù)(DPM)、歸一化為 DNA 含量。* = ρ < 0. 05 廣=ρ < 0. 005 ；*** = ρ < 0. 0005。圖12.多硫酸戊聚糖(PPS)對蛋白聚糖(PG)生物合成的濃度依賴性作用的柱狀 圖，正如在6天成團(tuán)培養(yǎng)的鼠祖細(xì)胞細(xì)胞(ADTC-5)中通過將放射性標(biāo)記的硫酸根摻入到PG 的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)中所確定。* = ρ < 0. 05相對于對照物。圖13.在6天成團(tuán)培養(yǎng)(pellet culture)中用不同濃度的PPS在維持培養(yǎng)基(MM) 中孵育的、由ATDC5細(xì)胞進(jìn)行的膠原II型和Sox-9的基因表達(dá)。圖14.肝素對蛋白聚糖(PG)生物合成的濃度依賴性作用的柱狀圖，正如在6天成 團(tuán)培養(yǎng)的鼠祖細(xì)胞(ADTC-5)中通過將放射性標(biāo)記的硫酸根摻入到PG的硫酸化葡糖胺多糖 (35S-GAG)中所確定。在這個(gè)細(xì)胞系中肝素在1.25至20ug/mL的濃度范圍中并未展示出一 種軟骨形成效應(yīng)。圖15.顯示多硫酸戊聚糖(PPS)對蛋白聚糖(PG)生物合成的濃度依賴性作用的 柱狀圖，正如在7天成團(tuán)培養(yǎng)的鼠祖細(xì)胞(C3H10T1-2)中通過將放射性標(biāo)記的硫酸根摻入 到PG的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)中所確定。圖16.顯示PPS對由微團(tuán)培養(yǎng)6天和9天的鼠祖細(xì)胞(C3H10T1-2)進(jìn)行的蛋白聚 糖合成的濃度依賴性作用的柱狀圖。向該培養(yǎng)基(Ham's F12+10%FCS)中加入PPS并且每 48小時(shí)更換。在培養(yǎng)終止前24小時(shí)加入35S-S04。將合成歸一化為DNA含量。< 0. 05， **P < 0. 005, ***P < 0. 0005 相對于對照物。圖17.顯示PPS對由微團(tuán)培養(yǎng)5天的人類祖細(xì)胞進(jìn)行的蛋白聚糖合成的濃度依賴 性作用的柱狀圖。數(shù)據(jù)表示為35S-GAG放射活性，并且作為對照物的百分比(對照物取為 100% ) ο *P < 0. 05相對于對照物。圖18. A 顯示由微團(tuán)培養(yǎng)10天的人類祖細(xì)胞所進(jìn)行的多硫酸戊聚糖(PPS)濃度 依賴性刺激的膠原II型生成的柱狀圖，正如通過B中所示的掃描和數(shù)字分析免疫染色的微 團(tuán)培養(yǎng)物所確定。(詳見正文).圖19.顯示㈧透明質(zhì)酸物(Supartz )和⑶多硫酸葡聚糖對由微團(tuán)培養(yǎng)5天 的人類祖細(xì)胞進(jìn)行的蛋白聚糖合成的濃度依賴性作用的柱狀圖。數(shù)據(jù)表示為35S-GAG放射 活性，并且作為對照物的百分比(對照物取為100% )或?yàn)镈PM/ug DNA。< 0. 05相對于 對照物。圖20.顯示了添加指定濃度的PPS和/或透明質(zhì)酸(Supartz )的生長培養(yǎng)基來 培養(yǎng)原代人類祖細(xì)胞的結(jié)果。在不同的時(shí)間間隔(第3天和第5天)，除去生長培養(yǎng)基并且 用含有四唑鐺鹽WST-I的無酚紅的培養(yǎng)基替換，在37°C下/5% C02下持續(xù)2小時(shí)。顯示了 所有濃度的PPS和HA對于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在450nm處的吸光度。這個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示HA和PPS沒有 協(xié)同地作用來刺激祖細(xì)胞增殖。圖21.由乳酸克魯維斯酵母(K. Iactis)表達(dá)的rhNC4(批號PBA-1202P)在缺少 (維持培養(yǎng)基，MM)和存在胰島素(10微克/mL)(分化培養(yǎng)基，DM)時(shí)對蛋白聚糖(PG)生物合成的濃度依賴性作用的柱狀圖，正如在用鼠ATDC5祖細(xì)胞培養(yǎng)3天之后通過將放射性標(biāo) 記的硫酸根摻入到的PG的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)所確定。這些數(shù)據(jù)被表達(dá)為相對于 不含有rhNC4的對照培養(yǎng)物的％變化。P < 0. 05相對于對照培養(yǎng)物是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。圖22.由乳酸克魯維斯酵母表達(dá)的rhNC4(批號PBA-1202P)在缺少(維持培養(yǎng)基， MM)和存在胰島素(10微克/mL)(分化培養(yǎng)基，DM)下對成團(tuán)培養(yǎng)的ATDC5細(xì)胞進(jìn)行的蛋白 聚糖(PG)生物合成的濃度依賴性作用的柱狀圖。數(shù)據(jù)顯示為相對于對照物的％變化，該對 照物取為100%。圖23.由乳酸克魯維斯酵母所表達(dá)的rhNC4(批號PBA-1202P)加上多硫酸戊聚糖 (PPS) (2微克/mL)在缺少(維持培養(yǎng)基，MM)和存在胰島素(10 μ g/mL)(分化培養(yǎng)基，DM) 時(shí)對大分子DNA生物合成的濃度依賴性作用的柱狀圖，正如在用鼠ATDC5祖細(xì)胞培養(yǎng)1天 之后通過將放射性標(biāo)記的3H-胸腺嘧啶核苷摻入所確定。這些數(shù)據(jù)被表達(dá)為相對于不含有 rhNC4的對照培養(yǎng)物的％變化。P < 0. 05相對于對照培養(yǎng)物是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。圖24. rhNC4(批號PBA-1202P)與多硫酸戊聚糖(PPS)的結(jié)合對由鼠ATDC5祖細(xì)胞 的單層培養(yǎng)物進(jìn)行的35S-PG生物合成的濃度依賴性作用的柱狀圖。數(shù)據(jù)相對于對照物(維 持培養(yǎng)基，MM)表示，該對照物取為100%。圖25.由鼠ATDC5祖細(xì)胞在存在和缺少rhNC4(批號PBA-1209P)以及PPS時(shí)以單 層培養(yǎng)方式培養(yǎng)2天所表達(dá)的骨標(biāo)志物Runx2、MGP、HAS3、⑶44以及管家基因NADPH的基 因表達(dá)的RT-PCR檢測。圖26.由鼠ATDC5祖細(xì)胞在存在和缺少rhNC4(批號PBA-1209P)以及PPS時(shí)以單 層培養(yǎng)方式培養(yǎng)2天所表達(dá)的Rimx2和這些轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(Smad 2和Smad 4)以及管家基因 NADPH基因表達(dá)的RT-PCR檢測。圖27.色譜洗脫曲圖，顯示了多硫酸化多糖對由祖細(xì)胞進(jìn)行的透明質(zhì)酸物(HA)生 物合成的作用，這是通過測量3H-葡糖胺摻入HA中來進(jìn)行的。在存在不同濃度的多硫酸戊 聚糖(PPS)持續(xù)9天時(shí)來自微團(tuán)培養(yǎng)的人類祖細(xì)胞的培養(yǎng)基的Superdex-S200色譜圖展示 于在組圖A至D中。在玻璃酸酶酶解之前，放射活性曲圖顯示出由這些細(xì)胞將3H-葡糖胺 摻入到HA和PG中、但是在酶解后僅3H-PG保留在該柱的空隙體積中。在這些酶解和酶解 前樣品的曲線中在空隙體積部分上面積上的％差異代表了由PPS濃度所限定的釋放到培 養(yǎng)基中的3H-HA的量。圖28.由乳酸克魯維斯酵母細(xì)胞所表達(dá)的rhNC4(批號PBA-1202P)在缺少和存在 胰島素(10微克/mL)下對DNA合成的濃度依賴性作用的柱狀圖，正如在用鼠ATDC5祖細(xì)胞 培養(yǎng)3天之后通過將3H-胸腺嘧啶核苷摻入到大分子DNA中所確定。這些數(shù)據(jù)被表達(dá)為相 對于不含有rhNC4的對照培養(yǎng)物的％變化。P < 0. 01相對于對照培養(yǎng)物是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著 的。圖29.由乳酸克魯維酵母細(xì)胞所表達(dá)的rhNC4(批號PBA-1202P)對鼠ATDC5祖細(xì) 胞數(shù)目的濃度依賴性作用的柱狀圖，這是在缺少和存在胰島素(10微克/mL)下培養(yǎng)3天之 后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來確定的。這些數(shù)據(jù)被表達(dá)為相對于不含有rhNC4的對照培養(yǎng)物的％ 變化。P < 0. 01相對于對照培養(yǎng)物是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。圖30.相對于對照物由rhNC4 (批號PBA-1200P) (5ug/ml)或胰島素(10ug/ml)所 誘導(dǎo)的ATDC5細(xì)胞在13天內(nèi)生長的動(dòng)力學(xué)柱狀圖。將20，000個(gè)細(xì)胞/孔在第O天(開始)種下，其中每48小時(shí)更換培養(yǎng)基。在第6天，胰島素處理的培養(yǎng)物達(dá)到會合，并且在第9天 PBA-1200P達(dá)到會合。在第9天，對照培養(yǎng)物也達(dá)到會合，但是與含有胰島素或PBA-1200P 的培養(yǎng)物相反，它停止進(jìn)行復(fù)制。圖31.由乳酸克魯維斯酵母所表達(dá)的rhNC4(批號PBA-1202P)在缺少(維持培養(yǎng) 基，MM)和存在胰島素(10微克/mL)(分化培養(yǎng)基，DM)對蛋白聚糖(PG)生物合成的濃度依 賴性作用的柱狀圖，正如在用鼠ATDC5祖細(xì)胞培養(yǎng)3天之后通過將放射性標(biāo)記的硫酸根摻 入到的PG的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)所確定。這些數(shù)據(jù)被表達(dá)為相對于不含有rhNC4 的對照培養(yǎng)物的％變化。P <0.05相對于對照培養(yǎng)物是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。圖31.顯示由這 些祖細(xì)胞ATDC5細(xì)胞在存在和缺少胰島素時(shí)進(jìn)行的rhNC4刺激的PG合成，但是在缺少胰島 素時(shí)在更高的濃度下更有效。圖32.多硫酸戊聚糖(PPS)在存在胰島素(10微克/mL)時(shí)對蛋白聚糖(PG)的 生物合成的濃度依賴性作用的柱狀圖，正如在用鼠ATDC5祖細(xì)胞培養(yǎng)3天之后通過將放射 性標(biāo)記的硫酸根摻入到PG的硫酸化葡糖胺多糖(35S-GAG)中所確定。這些數(shù)據(jù)被表達(dá)為 35S-GAG放射活性，作為相對于不含有PPS的對照培養(yǎng)物每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)以及每分鐘衰變 數(shù)(DPM)。P <0.05是相對于對照培養(yǎng)物統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。圖32.顯示了在PPS存在下由 鼠ATDC5祖細(xì)胞進(jìn)行的PG合成的濃度依賴性刺激。圖33.由乳酸克魯維斯酵母所表達(dá)的rhNC4(批號PBA-1202P)加上多硫酸戊聚糖 (PPS) (2微克/mL)在缺少(維持培養(yǎng)基，MM)和存在胰島素(10微克/mL)(分化培養(yǎng)基， DM)時(shí)對蛋白聚糖(PG)的生物合成的濃度依賴性作用的柱狀圖，正如在用鼠ATDC5祖細(xì)胞 培養(yǎng)1天之后通過將放射性標(biāo)記的葡糖胺摻入到PG的葡糖胺多糖(3H-GAG)中所確定。這 些數(shù)據(jù)被表達(dá)為相對于不含有rhNC4的對照培養(yǎng)物的％變化。P <0.05相對于對照培養(yǎng)物 是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。圖34.多硫酸戊聚糖(PPS)在缺少和存在胰島素(10微克/mL)時(shí)對DNA合成(細(xì) 胞復(fù)制)的濃度依賴性作用的柱狀圖，正如在用鼠ATDC5祖細(xì)胞培養(yǎng)3天之后通過將3H-胸 腺嘧啶核苷摻入到大分子DNA中所確定。這些數(shù)據(jù)被表達(dá)為相對于不含有PPS的對照培養(yǎng) 物的％變化。圖35. SEQ ID NO 無信號肽的全長人類NC4的氨基酸序列。圖36. SEQ ID NO :2_在乳酸克魯維斯酵母培養(yǎng)物表達(dá)期間通過脯氨酸肽鏈內(nèi)切酶 推定的作用所獲得的截短的hNC4的氨基酸序列。圖37.在牛、人、鼠和雞NC4的序列之間的序列組合物。
具體實(shí)施例方式如在本說明書和權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“一種/個(gè)”(“a"，‘‘ an")和 “該”包括復(fù)數(shù)的引用，除非在上下文中的其他地方清楚地指出。例如，術(shù)語“一種多肽”包 括多個(gè)多肽，包括它們的混合物。如在此所使用的，術(shù)語“衍生自”應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是指一個(gè)指明的整體(integer)是從 一個(gè)特定的來源獲得的，盡管不需要直接地從該來源獲得。一種“組合物”旨在是指活性試劑與另一種惰性的(例如，一種可檢出的試劑或標(biāo) 記)或活性的(例如，一種佐劑)化合物或組合物的組合。
除非上下文在其他地方或明確地進(jìn)行相反地說明，在此所敘述的本發(fā)明的整數(shù)、 步驟、或元素作為單數(shù)的整數(shù)、步驟或元素清楚地涵蓋了單數(shù)和復(fù)數(shù)這兩種形式的所敘述 的整數(shù)、步驟或元素。相對于任何單一的實(shí)施方案，在此說明的本發(fā)明的實(shí)施方案應(yīng)當(dāng)為認(rèn)為參照在此 說明的本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案進(jìn)行施用。貫穿本說明書，除非上下文另外需要，詞語“包括”、或變體例如“包括了”或“包括 著”應(yīng)當(dāng)理解為意指包括一個(gè)所述的步驟或元素或整數(shù)、或多個(gè)步驟或元素或整數(shù)的組，但 不排除任何其他一個(gè)步驟或元素或整數(shù)、或多個(gè)元素或整數(shù)的組。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在此說明的本發(fā)明是容易進(jìn)行改變和變更的，除 外確切地說明的那些。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括所此類的改變和變更。本發(fā)明還包括在本說 明書中逐個(gè)地或共同地提及或指出的所有這些步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟 或特征的任何和所有的組合或其中的任何兩種或多種。本發(fā)明并非局限于在此說明的特定實(shí)例的范圍內(nèi)。功能上等效的產(chǎn)物、組合物和 方法清楚地在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如在此所說明。無需過多的實(shí)驗(yàn)過程即可進(jìn)行本發(fā)明，本發(fā)明使用了(除非另外指出)分子生物 學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)、重組DNA技術(shù)、溶液中肽合成、固相肽合成、以及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。 例如，此類操作說明于以下文件中，它們通過引用結(jié)合在此。1. Sambrook，F(xiàn)ritsch&Maniatis，Molecular Cloning :A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Second Edition(1989)，whole of Vols I，II， and III ；2. DNA Cloning :A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed. ,1985), IRL Press, Oxford,whole of text ；3. Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach (M. J. Gait, ed. , 1984) IRL Press，Oxford，whole of text,and particularly the paperstherein by Gait，pp 1-22 ； Atkinson et al.，pp35_81 ；Sproat et al.，pp83_115 ；and Wu et al.，pp 135151 ；4. Nucleic Acid Hybridization :A Practical Approach(B. D.Hames&S. J. Higgins，eds.，1985)IRL Press，Oxford, whole of text ；5. Perbal, B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；6. Wiinsch,E. ,ed. (1974)Synthese von Peptiden in Houben-WeylsMetoden der Organischen Chemie (MiiIer，E.，ed.)，vol. 15，4th edn.，Parts 1 and 2，30 Thieme， Stuttgart。7. Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weirand C. C. Blackwell, eds. ,1986,Blackwell Scientific Publications)。袓細(xì)胞本發(fā)明涉及了袓細(xì)胞。在它的最廣泛的實(shí)施方案中，術(shù)語袓細(xì)胞旨在涵蓋包括任 何多能細(xì)胞。因此，術(shù)語袓細(xì)胞涵蓋了成體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。這種袓細(xì)胞可以是一種間充質(zhì)的袓細(xì)胞。該袓細(xì)胞可以是一個(gè)內(nèi)源性或外源性的胚胎的、或成體間充質(zhì)的、或間充質(zhì)的袓 細(xì)胞。該袓細(xì)胞可以是一種多能間質(zhì)細(xì)胞。該袓細(xì)胞可以是一種成體未分化的間充質(zhì)袓細(xì)胞。該祖細(xì)胞可以是一種軟骨祖細(xì)胞。這些祖細(xì)胞可以衍生自骨髓?？商娲兀@些祖細(xì)胞可以衍生自軟骨、滑膜組織、 肌肉、脂肪組織、皮膚、臍帶、牙髓、或其他可獲得的來源。這些祖細(xì)胞可以是一種體細(xì)胞，例如被內(nèi)源性因子抑制分化的結(jié)締組織細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些祖細(xì)胞是富集Stro-Itoi的細(xì)胞、或同質(zhì)的Stro-Itoi細(xì) 胞、或Stro-Itoi子代細(xì)胞的群體?！N類型的祖細(xì)胞是一種間充質(zhì)的祖細(xì)胞(MPC)。最初地衍生自骨髓，MPC和MPC 樣細(xì)胞已經(jīng)被鑒定出存在于大量的成體組織中并且可以從其中分離出，其中它們被假定執(zhí) 行了替換和再生局部細(xì)胞的功能，這些局部細(xì)胞由于正常的組織更新、損傷、或老化而損 失。這些組織包括脂肪、骨膜、滑膜、滑液(SF)、肌肉、真皮、乳牙、周皮細(xì)胞、骨小梁、髕下脂 肪體以及關(guān)節(jié)軟骨。MPC可以反過來由一系列體外特征進(jìn)行定義，這些特征包括表型標(biāo)志物和多潛能 的分化功能特性的組合。盡管塑料附著對于間充質(zhì)細(xì)胞而言是最常使用的并且是簡單的分離操作，不同的 陽性和陰性表面標(biāo)志物(例如Stro-Ι、⑶146/黑色素瘤細(xì)胞粘附分子、⑶271/低親和力 神經(jīng)生長因子、以及階段特異性胚胎抗原-4)也已經(jīng)被用于富集MPC產(chǎn)量和同質(zhì)性。此外， 另一組表面標(biāo)志物，包括⑶140b (血小板衍生的生長因子受體-D)、⑶340 (HER-2/erbB2)、 以及CD349 (卷曲蛋白-9 (frizzled-9))與CD217相結(jié)合也可以用于MPC富集。其他的祖細(xì)胞包括鼠祖細(xì)胞，包括細(xì)胞系C3H10T1/2和ATDC5或Mill祖細(xì)胞。C3H 10T1/2是由具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)的雌性C3H/He小鼠品系所衍生的骨髓祖干細(xì)胞系。 ATDC5細(xì)胞是具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)的小鼠胚胎衍生的軟骨祖細(xì)胞系。C3H10T1/2細(xì)胞系是在1973年從14至17天大的C3H小鼠胚胎建立的。這些細(xì) 胞在細(xì)胞培養(yǎng)中展示了成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，并且功能類似于間充質(zhì)的干細(xì)胞。用5-氮 雜胞苷抑制C3H10T1/2細(xì)胞中的甲基化產(chǎn)生了肌肉、脂肪、骨骼、或軟骨細(xì)胞的穩(wěn)定的形 態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。提示了這種表型的變更是由響應(yīng)于阻斷甲基化的內(nèi)源基因的激活 引起的。此外，已經(jīng)顯示骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)，轉(zhuǎn)化生長因子型β超級家族的一個(gè) 成員，可以誘導(dǎo)將C3H10T1/2細(xì)胞定型為前脂肪細(xì)胞，當(dāng)經(jīng)歷一個(gè)脂肪分化的科學(xué)試驗(yàn)計(jì) 劃時(shí)，發(fā)展成該脂肪細(xì)胞表型的細(xì)胞(Tang Qi-Qun, Otto TC，Lane MD. Commitment of C3H10Tl/2pluripotent stem cells to theadipocyte lineage. Pro Natl Acad Sci USA, 2004 ；101 9607-9611)。這種ATDC5細(xì)胞系最初是從AT805畸胎癌的一種分化的培養(yǎng)株中分離的。 ATDC5細(xì)胞在生長期表達(dá)一種成纖維細(xì)胞表型。有關(guān)這種ATDC5細(xì)胞系的其他信息可見 于 Atsumi T, Miwa Y, Kimata K, Ikawa Y.A chondrogenic cell line derived from a differentiating cultureof AT805 teratocarcinoma cells. Cell Differ Dev. 1990 ；30 109-16。這些祖細(xì)胞可以是富集Stro-Itoi的細(xì)胞群。這些祖細(xì)胞可以是同質(zhì)的Stro-Itoi 細(xì)胞，或Stro-Itoi子代細(xì)胞。Stro-Itoi細(xì)胞是在骨髓、血液、牙髓細(xì)胞、脂肪組織、皮膚、脾臟、胰、腦、腎、肝、心、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結(jié)、胸腺、骨骼、韌帶、腱、骨骼肌、真皮、以及骨膜中發(fā)現(xiàn)的細(xì) 胞；并且是能夠典型地分化成多個(gè)種系，例如中胚層和/或內(nèi)胚層和/或外胚層。因此， Stro-Ibri細(xì)胞能夠分化成大量的細(xì)胞類型，包括但不限于脂肪的、骨的、軟骨的、彈性的、 肌肉的、以及纖維的結(jié)締組織。這些細(xì)胞進(jìn)入的特異性譜系定型和分化途徑取決于不同的 影響，這些影響來自于機(jī)械影響和/或內(nèi)源性生物學(xué)活性因子，例如生長因子、細(xì)胞因子、 和/或由宿主組織建立的局部微環(huán)境條件。因此，Stro-Itoi細(xì)胞可以是非造血祖細(xì)胞，這些 祖細(xì)胞分裂生成子細(xì)胞，這些子細(xì)胞是干細(xì)胞或前體細(xì)胞，它們將及時(shí)地不可逆地分化生 成一種表型細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些Stro-Itoi細(xì)胞是從一種樣品富集的，該樣品從一位受 試者獲得，例如有待治療的受試者或相關(guān)的受試者或不相關(guān)的受試者(無論是相同的物種 還是不同的物種)。術(shù)語“富集的”、“富集”或它們的變體在此用于說明一群細(xì)胞，當(dāng)與未處 理的群體相比時(shí)其中的一種特定細(xì)胞類型的比例或多種特定細(xì)胞類型的比例是增加的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用的細(xì)胞逐個(gè)地或共同地表達(dá)了一種或多種 標(biāo)志物，這種或這些標(biāo)志物選自下組，其組成為TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、⑶45+、 ⑶146+、3G5+或它們的任何組合?！爸饌€(gè)地” 一詞是指本發(fā)明分開地涵蓋了所述的標(biāo)志物或多個(gè)標(biāo)志物的組，并且是 指盡管單獨(dú)的標(biāo)志物或多個(gè)標(biāo)志物的組可能并未在此分開列出，所附的權(quán)利要求可以分開 地定義此類標(biāo)志物或多個(gè)標(biāo)志物的組并且可以彼此分開?！肮餐亍币辉~是指本發(fā)明涵蓋了任何數(shù)目或組合的所述的標(biāo)志物或多個(gè)肽的組， 并且是指盡管此類數(shù)目的或組合的標(biāo)志物或多個(gè)標(biāo)志物的組未能在此確切地列出，所附的 權(quán)利要求可以分開地定義此類組合或亞組合，并且可以與標(biāo)志物或標(biāo)志物的組的任何其他 組合分開。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些Stro-Itoi細(xì)胞額外地是TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+ 和/或⑶146+中的一種或多種。對于一種給定的標(biāo)志物被稱為是“陽性”的細(xì)胞，它可以表達(dá)低水平(Io或暗)或 高水平(亮，bri)的這種標(biāo)志物，這取決于該標(biāo)志物在細(xì)胞表面上存在的程度，其中這些術(shù) 語涉及在細(xì)胞分選過程中所使用的熒光強(qiáng)度或其他標(biāo)志物。Lo (或暗或弱)與bri的區(qū)別 應(yīng)當(dāng)在有待分選的一種特定的細(xì)胞群上所使用的標(biāo)志物的背景下進(jìn)行理解。對于給定的標(biāo) 志物稱為“陰性”的一種細(xì)胞并不是該細(xì)胞完全不存在的。這些術(shù)語是指該標(biāo)志物以一個(gè) 相對非常低的水平由該細(xì)胞表達(dá)，并且它在可檢測地標(biāo)記時(shí)產(chǎn)生一個(gè)非常低的信號或是可 檢測高于背景水平。術(shù)語“亮”當(dāng)在此使用時(shí)是指在細(xì)胞表面上的一種標(biāo)志物，它在可檢測地標(biāo)記時(shí)產(chǎn) 生了一個(gè)相對高的信號。盡管不希望被理論束縛，提出“亮”的細(xì)胞與該樣本中其他細(xì)胞相 比表達(dá)更多的靶標(biāo)志物蛋白(例如，被STRO-I識別的抗原)。例如，STRO-Itoi細(xì)胞當(dāng)用一 種FITC-偶聯(lián)的STRO-I抗體進(jìn)行標(biāo)記時(shí)與不亮的細(xì)胞(STRO-1^ )相比產(chǎn)生了一種更大 的熒光信號，正如通過熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)分析所確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，“亮” 的細(xì)胞構(gòu)成了至少約0. 的最多亮標(biāo)記的、包含在起始樣品中的骨髓單核細(xì)胞。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，“亮”的細(xì)胞構(gòu)成了至少約0. 至少約0.5%、至少約至少約1.5%、或至 少約2%的最亮標(biāo)記的包含在起始樣品中的骨髓單核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，STRO-Is細(xì)胞相對于“背景”(即STRO-Γ細(xì)胞)具有2個(gè)對數(shù)量級的更高表達(dá)的STR0-1表面表達(dá)。 通過比較，STR0-1 @和/或STR0-1 +13]#細(xì)胞所具有的與2個(gè)對數(shù)量級更高表達(dá)的STR0-1表 面表達(dá)更低，典型地是約1個(gè)對數(shù)或低于“背景”。如在此所使用的，術(shù)語“TNAP”旨在涵蓋組織非特異性堿性磷酸酶的所有同種型。 例如，該術(shù)語涵蓋了肝同種型(LAP)、骨同種型(BAP)和腎同種型(KAP)。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，該TNAP是BAP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如在此所使用的，TNAP是指一種可以與由以下 雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的STR0-3抗體相結(jié)合的分子，該雜交瘤細(xì)胞系在布達(dá)佩斯條約的規(guī)定 下于2005年12月19日保藏于ATCC，保藏登錄號為PTA-7282。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些Stro-Itoi細(xì)胞能夠產(chǎn)生克隆性CFU-F。在一個(gè)實(shí)施方案中，顯著比例的多潛能細(xì)胞能夠分化成至少2種不同的種系。這 些多潛能細(xì)胞可以定型的譜系的非限制性例子包括骨前體細(xì)胞；肝祖細(xì)胞，它們對于膽管 上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞是多能的；神經(jīng)限制的細(xì)胞，它們能夠生成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體，該細(xì)胞前 體發(fā)展成少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)元前體，它們發(fā)展成神經(jīng)元；心肌和心肌細(xì) 胞的前體，葡萄糖應(yīng)答胰島素分泌型胰腺細(xì)胞系。其他譜系包括但不限于成齒質(zhì)細(xì) 胞、生成牙本質(zhì)的細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞、以下以下各項(xiàng)的前體細(xì)胞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、成 纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞(例如，角質(zhì)化細(xì)胞)、樹突細(xì)胞、發(fā)囊細(xì)胞、輸尿管上皮細(xì)胞、平滑肌和 骨骼肌的細(xì)胞、睪丸祖細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、腱細(xì)胞、韌帶細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維 細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、周皮細(xì)胞、血管細(xì)胞、上皮細(xì)胞、 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些Stro-Itoi細(xì)胞當(dāng)培養(yǎng)時(shí)不能產(chǎn)生造血細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些細(xì)胞是從有待治療的患者處獲得的，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行 體外培養(yǎng)，并且用于獲得擴(kuò)展出的細(xì)胞用于作為一種自體的或異體的組合物給予該受試 者。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，使用了這些已建立的人類細(xì)胞系中一種或多種的細(xì)胞。 在本發(fā)明的另一個(gè)有用的實(shí)施方案中，使用了一種非人類動(dòng)物的細(xì)胞(或若該患者不是人 類，則來自另一個(gè)物種)。本發(fā)明也考慮使用獲自或衍生自Stro-Itoi細(xì)胞和/或它們的子代細(xì)胞(后者也 稱為擴(kuò)展出的細(xì)胞)的上清液或可溶的因子，它們是由與這些祖細(xì)胞相組合進(jìn)行體外培養(yǎng) 而產(chǎn)成的。本發(fā)明的擴(kuò)展出的細(xì)胞可以具有多種多樣的表型，這取決于培養(yǎng)條件(包括在 培養(yǎng)基中的數(shù)目和/或刺激因子的類型)、傳代次數(shù)、以及類似因素。在某些實(shí)施方案中，這 些子代細(xì)胞是在約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、或約10次傳代后從親本群體獲 得的。然而，這些子代細(xì)胞可以在任何次數(shù)的傳代之后從親本群體獲得的。這些子代細(xì)胞可以通過在任何適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中培養(yǎng)來獲得。如在提及一種細(xì)胞培養(yǎng) 物時(shí)所使用的，術(shù)語“介質(zhì)”包括在這些細(xì)胞周圍的環(huán)境的組分。介質(zhì)可以是固體、液體、氣 體或多種相和物質(zhì)的混合物。介質(zhì)包括液體生長培養(yǎng)基連同不能維持細(xì)胞生長的液體培養(yǎng) 基。介質(zhì)也包括凝膠狀的介質(zhì)，例如瓊脂、瓊脂糖、明膠以及膠原基質(zhì)。示例性的氣體介質(zhì) 包括將在培養(yǎng)皿上或其他固體或半固體支持物上生長的細(xì)胞暴露至的氣相。術(shù)語“介質(zhì)”也 指以下材料，該材料旨在用于一種細(xì)胞培養(yǎng)中，即使它還沒有與細(xì)胞進(jìn)行接觸。換言之，一 種準(zhǔn)備用于細(xì)菌培養(yǎng)的營養(yǎng)豐富的液體是一種介質(zhì)。當(dāng)與水或其他液體混合時(shí)變成適于細(xì) 胞培養(yǎng)的一種粉末混合物可以稱為“粉末介質(zhì)”。
在一個(gè)實(shí)施方案中，對于本發(fā)明的方法有用的子代細(xì)胞是使用標(biāo)記了 STR0-3抗 體的磁珠、通過將TNAP+STRO-Γ多潛能細(xì)胞從骨髓分離、并接著培養(yǎng)擴(kuò)展這些分離的細(xì)胞 而獲得的(參見Gronthoset al. Blood 85 :929_940，1995用作適當(dāng)培養(yǎng)條件的一個(gè)例子)。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類擴(kuò)展出的細(xì)胞(子代)(可任選的是至少5代之后)可以 是 TNAP\ CC9+、HLA 類 I+、HLA 類 ΙΓ、CD14\ CD19\ CD3\ CDlla^T、CD31\ CD86\ CD34"和 / 或CD80—。然而，有可能的情況是在不同的培養(yǎng)條件下對于在此說明的那些細(xì)胞不同的標(biāo)志 物的表達(dá)可以發(fā)生變化。而且，盡管這些表型的細(xì)胞在擴(kuò)展出的細(xì)胞群中可以占絕大多數(shù)， 它并不意味著存在著較少比例的不具有這種或這些表型的細(xì)胞(例如，小百分比的擴(kuò)展出 的細(xì)胞可以是CC9_)。在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)展出的細(xì)胞仍然具有分化成不同細(xì)胞類型的能 力。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于獲得上清液或可溶性因子或細(xì)胞本身的擴(kuò)展的細(xì)胞群所 包括的細(xì)胞至少25%是CC9+，在另一個(gè)實(shí)施方案中至少50% CC9+。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于獲得上清液或可溶性因子、或細(xì)胞本身的擴(kuò)展出的細(xì) 胞群所包括的細(xì)胞至少40%是STR0-1+，在另一個(gè)實(shí)施方案中至少45%是STR0-1+。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些擴(kuò)展出的細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種標(biāo)志物，這種或這 些標(biāo)記物共同地或逐個(gè)地選自下組，其組成為LFA-3、THY-U VCAM-U ICAM-U PECAM-U P-選擇素、L-選擇素、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD 90、CD29、 CD18、CD61、整聯(lián)蛋白 β 6-19、血栓調(diào)節(jié)蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、 NGF-R、reF-R、瘦蛋白-R(STR0-2 =瘦蛋白-R)、RANKL,CD146 或這些標(biāo)志物的 任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，衍生自STRO-Itoi細(xì)胞的子代細(xì)胞對于標(biāo)志物Stro-I 是陽性 的。這些細(xì)胞被稱為組織特異性定型細(xì)胞(TSCC)，并且與STRO-Itoi相比細(xì)胞更致力于分 化，因此不太能應(yīng)答誘導(dǎo)因子。TSCC可能被定型的譜系的非限制性例子可以包括肝祖細(xì)胞， 它們對于膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞是多能性的；神經(jīng)限制的細(xì)胞，它們能夠生成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì) 胞前體，該細(xì)胞前體發(fā)展成少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞；以及神經(jīng)元前體，它們發(fā)展成神 經(jīng)元；心肌和心肌細(xì)胞的前體，葡萄糖應(yīng)答胰島素分泌型胰腺β-細(xì)胞系。其他定型的前體 細(xì)胞包括但不限于軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞，生成牙本質(zhì)的細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞， 以及以下各項(xiàng)的前體細(xì)胞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞(例如，角質(zhì)化細(xì) 胞)、樹狀突細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、輸尿管上皮細(xì)胞、平滑肌和骨骼肌的細(xì)胞、睪丸祖細(xì)胞、血管內(nèi) 皮細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、韌帶細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、破骨細(xì)胞和 造血-支持間質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、周皮細(xì)胞、血管細(xì)胞、上皮細(xì)胞、 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞。前體包括可以特異性地導(dǎo)向 結(jié)締組織的那些前體，特別是包括脂肪組織、蜂窩組織、骨組織、軟骨組織、彈性組織以及纖 維結(jié)締組織。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些子代細(xì)胞是如WO 2006/032092中所定義和/或說明的 多潛能擴(kuò)展出的STRO-Γ多潛能細(xì)胞子代(MEMP)。用于制備衍生出子代的、STRO-Γ多潛能 細(xì)胞的富集群的方法可以在WO 01/04268和WO 2004/085630中說明。在一種體外的背景 中，STRO-I+多潛能細(xì)胞將很少作為一種絕對純的制備物出現(xiàn)，并且將通常與其他細(xì)胞一起 出現(xiàn)，這些其他細(xì)胞是組織特異性定型細(xì)胞(TSCC)。WO 01/04268涉及從骨髓以約0. 至90%的純度水平收獲此類細(xì)胞。衍生出子代的、包括祖細(xì)胞的群體可以直接從組織來源獲 得，或可替代地，它可以是一個(gè)已經(jīng)在體外擴(kuò)展出的群體。例如，這種子代是可以從一種收獲的、未擴(kuò)展的、基本上純的STRO-Γ多潛能細(xì)胞 群獲得的，包括它們所在群體的總細(xì)胞的至少約0. 1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、 50 %、60 %、70 %、80 %或95 %。這個(gè)水平可以通過以下方式達(dá)到，例如，通過選擇對至少 一種標(biāo)志物呈陽性的細(xì)胞，該標(biāo)記物逐個(gè)地或共同地選自下組，其組成為TNAP、STR0-1氣 3G5+、VCAM-I、THY-I、CD146 和 STR0-2。MEMPS可以與新收獲的Stro-Itoi細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別，因?yàn)樗鼈儗τ跇?biāo)志物STRO-Itoi是 陽性的并且對于標(biāo)志物堿性磷酸酶(ALP)是陰性的。相比之下，新分離的Stro-Itoi細(xì)胞對 STRO-Itoi和ALP這兩者都是陽性的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，至少5%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的所給予的細(xì)胞具有表型STRO-Ibri, ALP—。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，這些MEMPS對于以下標(biāo)志物中的一種或多種是陽性的，這些標(biāo)志物是: Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、α 3β I0在又另一個(gè)實(shí)施方案中，這些MEMPs未展 示出TERT活性和/或?qū)τ跇?biāo)志物⑶18是陰性的。這種Stro-Itoi細(xì)胞起始群可以衍生自任何一種或多種組織類型，包括骨髓、牙髓 細(xì)胞、脂肪組織和皮膚、或可能更廣泛地來自脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心臟、視網(wǎng) 膜、腦、毛囊、腸、肺、脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、胰、骨骼、韌帶、骨髓、腱以及骨骼肌。應(yīng)當(dāng)理解，在進(jìn)行本發(fā)明中，分離帶有任何給定細(xì)胞表面標(biāo)志物的細(xì)胞可以受到 許多不同的方法的影響，然而某些方法依賴于將一種結(jié)合劑(例如，一種抗體或它的抗原 結(jié)合片段)結(jié)合到所關(guān)心的標(biāo)志物上、之后跟隨展示出結(jié)合的那些物質(zhì)的分離，該結(jié)合是 高水平的結(jié)合、或是低水平的結(jié)合或者不結(jié)合。最便捷的結(jié)合劑是抗體或基于抗原的分子， 優(yōu)選地是單克隆抗體或基于單克隆的抗體，這是由于后面這些試劑的特異性的緣故。抗體 可以用于兩個(gè)步驟，然而其他試劑也是可以使用的，因此也可以采用這些標(biāo)志物的配體從 而富集帶有它們、或缺乏它們的細(xì)胞。可以將這些抗體或配體連接到一種固體支持物上，從而允許一種粗分離。這些分 離技術(shù)優(yōu)選地將有待收集的餾分的活力的保留最大化?？梢圆捎貌煌实牟煌夹g(shù)來獲 得相對粗的分離。所采用的具體的技術(shù)將取決于分離的效率、相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞毒性、實(shí)行的容 易程度和速度、以及對復(fù)雜設(shè)備和/或技術(shù)技能的需要。用于分離的操作可以包括但不限 于磁性分離(使用抗體涂覆的磁珠)、親和層析以及用連接到固體基質(zhì)上的抗體進(jìn)行“淘 選”。提供精確分離的技術(shù)包括但不限于FACS。用于進(jìn)行FACS的方法對于本領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員是清楚的。對抗在此說明的標(biāo)志物中每一種的抗體是可商購的(例如，對抗STR0-1的單克隆 抗體是可以從R&D Systems,USA商購)、從ATCC或其他保藏機(jī)構(gòu)獲得和/或可以使用本領(lǐng) 域公認(rèn)的技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)的。優(yōu)選的是用于分離Stro-Itoi細(xì)胞的方法，例如包括第一步是使用例如磁性激活細(xì) 胞分選(MACS)、識別高水平表達(dá)的STR0-1的一個(gè)固相分選步驟。然后，可以進(jìn)行第二個(gè)分 選步驟，該步驟應(yīng)該是令人希望的，從而造成更高水平的前體細(xì)胞表達(dá)。這種第二個(gè)分選步 驟可能涉及使用兩種或多種標(biāo)志物。獲得Stro-Itoi細(xì)胞的方法還可以包括在第一個(gè)富集步驟之前使用已知的技術(shù)來收獲該細(xì)胞的來源。因此，該組織將通過手術(shù)除去。然后，將包含該來源組織的細(xì)胞分成一 種所謂的單細(xì)胞懸浮液。這種分離是可以通過物理和/或酶促的方法來實(shí)現(xiàn)的。一旦已經(jīng)獲得一種適當(dāng)?shù)腟tro-Itoi細(xì)胞群，可以通過任何適當(dāng)?shù)氖侄芜M(jìn)行培養(yǎng)或 擴(kuò)展來獲得MEMP。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些細(xì)胞是從有待治療的受試者獲得的，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行 體外培養(yǎng)并且用于獲得上清液或可溶性因子或擴(kuò)展出的細(xì)胞，用于作為一種自體的或異體 的組合物給予該受試者。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，使用這些已建立的人類細(xì)胞系中一 種或多種細(xì)胞系的細(xì)胞來獲得這些上清液或可溶的因子。在本發(fā)明的另一個(gè)有用的實(shí)施方 案中，使用一種非人類動(dòng)物的細(xì)胞(或若該患者不是人類，則來自其他物種)來獲得上清液 或可溶的因子。本發(fā)明可以使用來自任何非人類的動(dòng)物物種的細(xì)胞來進(jìn)行，這些非人類的動(dòng)物物 種的細(xì)胞包括但不限于非人類的靈長類動(dòng)物細(xì)胞、有蹄動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、兔形目 動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、禽類和魚類的細(xì)胞。本發(fā)明可以使用來進(jìn)行的靈長類動(dòng)物細(xì)胞包括但不限 于黑猩猩、狒狒、食蟹猴、以及任何其他新或舊大陸猴(Newor Old World monkey)的細(xì)胞。 本發(fā)明可以使用來進(jìn)行的有蹄動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于牛、豬、綿羊、山羊、馬、水牛和野牛 的細(xì)胞。本發(fā)明可以使用來進(jìn)行的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠和沙 土鼠的細(xì)胞。本發(fā)明可以使用來進(jìn)行的兔形目動(dòng)物的例子包括家兔、長腿野兔、野兔、白尾 野兔、雪鞋兔和鼠兔。雞(Gallus gallus)是禽類的一個(gè)例子，可以使用它來進(jìn)行本發(fā)明。對于本發(fā)明的方法有用的細(xì)胞可以在使用之前、或在獲得該上清液或可溶的因子 之前進(jìn)行儲存。用于保存和儲存真核細(xì)胞、并且特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法和科學(xué)試驗(yàn)計(jì) 劃在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(參見，例如 Pollard，J. W. and Walker, J. Μ. (1997)Basic Cell CultureProtocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J. ；Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, ffiley-Liss, Hoboken, N.J.)。遺傳修飾的細(xì)胞在一個(gè)實(shí)施方案中，這些Stro-Itoi細(xì)胞和/或它們的子代細(xì)胞是被遺傳修飾的， 從而例如表達(dá)和/或分泌一種感興趣的蛋白，例如一種提供治療益處和/或預(yù)防性益處的 蛋白，例如，胰島素、高血糖素、生長抑素、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰 脂肪酶或淀粉酶、或與增強(qiáng)的血管新生相關(guān)聯(lián)或其成因的一種多肽、或與一種細(xì)胞分化成 胰細(xì)胞或血管細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的一種多肽。用于遺傳修飾細(xì)胞的方法對于普通技術(shù)人員而言將是清楚的。例如，將有待在細(xì) 胞中表達(dá)的一種核酸可操作地連接到一種啟動(dòng)子上用于在該細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。例如，將該 核酸連接到一種啟動(dòng)子上，該啟動(dòng)子在受試者的不同細(xì)胞中是可操作的，例如病毒啟動(dòng)子， 例如CMV啟動(dòng)子(例如，CMV-IE啟動(dòng)子)或SV-40啟動(dòng)子。額外的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子在本領(lǐng)域 內(nèi)是已知的，并且應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為參照本發(fā)明的現(xiàn)有實(shí)施方案進(jìn)行施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸以一種表達(dá)構(gòu)建體的形式提供。如在此所使用的，術(shù) 語“表達(dá)構(gòu)建體”是指一種核酸，該核酸在細(xì)胞中具有在與其可操作地連接的核酸上賦予表 達(dá)的能力(例如，報(bào)告基因和/或可以反選擇的報(bào)告基因)。在本發(fā)明的上下文中，應(yīng)當(dāng)理 解，一種表達(dá)構(gòu)建體可以包括或者是一種質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、黏粒、病毒亞基因組的或基 因組的片段，或能夠以一種可表達(dá)的形式保持和/或復(fù)制異源DNA的其他核酸。
用于構(gòu)建一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)構(gòu)建體來進(jìn)行本發(fā)明的的方法對于普通技術(shù)人員 而言應(yīng)該是清楚的，并且說明于例如Ausubel等人的文件中(在Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338,1987),或 Sambrook 等 人的文件(在:MoIecularCloning :Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)。例如，該表達(dá)構(gòu)建體的元 件中每一種元件是使用例如PCR從一種適當(dāng)?shù)哪０搴怂釘U(kuò)增的，并且隨后被克隆到一種適 當(dāng)?shù)谋磉_(dá)構(gòu)建體中，例如像，一種質(zhì)?；蚴删！＿m用于這種表達(dá)構(gòu)建體的載體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的和/或在此進(jìn)行了說明。例 如，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一個(gè)適用于本發(fā)明的方法的表達(dá)載體是例如PcDNA載體套件的載體 (由Invitrogen提供)、pCI載體套件的載體(Promega)、pCMV載體套件的載體(Clontech)、 pM 載體(Clontech)、pSI 載體(Promega)、VP16 載體(Clontech)或 pcDNA 載體套件的載體 (Invitrogen)。專業(yè)的行家應(yīng)該知道額外的載體以及此類載體的來源，例如Invitrogen Corporation、Clontech 或 Promega0用于將這種分離的核酸分子或包括以上物質(zhì)的一種基因構(gòu)建體引入到細(xì)胞中 用于表達(dá)的手段對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是已知的。用于一種給定的生物體 的技術(shù)取決于已知的成功的技術(shù)。用于將重組DNA引入到細(xì)胞中的手段除了其他之 外還包括微注射、由DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、由脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(例如通過使用 Lipofectamine (Gibco, MD, USA)和 / 或 Cellfectin(Gibco，MD, USA))、PEG-介導(dǎo)的 DNA 攝取、電穿孔和微粒轟擊(例如通過使用DNA-涂覆的鎢或金顆粒(Agracetus Inc.，WI, USA))?？商娲?，本發(fā)明的一種表達(dá)構(gòu)建體是一種病毒載體。適當(dāng)?shù)牟《据d體在本領(lǐng)域 內(nèi)是已知的并且是可商購的。用于遞送一種核酸并且將該核酸整合到宿主細(xì)胞基因組中的 常規(guī)的基于病毒的系統(tǒng)包括例如一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體或腺相關(guān)病毒載體?？?替代地，一種腺病毒載體對于引入一種核酸是有用的，該核酸仍然是附加型地進(jìn)入宿主細(xì) 胞中。病毒載體是在靶細(xì)胞和組織中一種有效的和多用途的基因轉(zhuǎn)移方法。額外地，已經(jīng) 在許多不同的細(xì)胞類型和靶組織中觀察到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。例如，一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體大體上包括順式作用長末端重復(fù)(LTR)，其中包裝能力 達(dá)到6kb至IOkb的外來序列。最小的順式作用LTR對于載體的復(fù)制和包裝是足夠的，然 后用它將該表達(dá)構(gòu)建體整合到該靶細(xì)胞中從而提供長時(shí)程表達(dá)。廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猴免疫缺陷病毒(SrV)、 人免疫缺陷病毒(HIV)、以及它們的組合的那些載體(參見，例如Buchscher et al. , J Virol. 56 2731-2739(1992) Johann et al, J. Virol. 65 1635-1640(1992) ；Sommerfelt et al, Virol. 76 58-59(1990) ；Wilson et al, J. Virol. 63 274-2318(1989) ；Miller et al.，J. Virol. 65 2220-2224(1991) ；PCT/US94/05700 ；Millerand Rosman BioTechniques 7:980-990,1989 ；Miller,A. D. HumanGene Therapy 7 5-14,1990 ；Scarpa et al Virology 75 849-852,1991 ；Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA90 :8033_8037，1993)。也已經(jīng)開發(fā)了不同的腺病毒相關(guān)聯(lián)的病毒(AAV)載體系統(tǒng)用于核酸遞送。使 用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)可以容易地構(gòu)建AAV載體。參見例如美國專利No. 5，173，414和 No. 5，139，941 ；國際
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