專利名稱：猿猴亞家族C腺病毒SAdV-40、-31和-34及其應用的制作方法
猿猴亞家族C腺病毒SAdV-40、-31和-34及其應用
背景技術：
腺病毒是雙鏈DNA病毒，基因組大小約為36千堿基(1Λ)，由于能夠在多種靶組織 中實現高效基因轉移以及較大的轉基因容量，它被廣泛用于基因轉移應用。通常，腺病毒的 El基因缺失，被取代為由所選啟動子、感興趣基因cDNA序列和聚A信號組成的轉基因盒，產 生復制缺陷型重組病毒。腺病毒的形態(tài)特征是由三種主要蛋白和許多群體小蛋白VI、VIII、IX、IIIa和 Iva2組成的二十面體衣殼，這三種主要蛋白是六鄰體(II)、五鄰體基質(III)和突結尾絲 (knobbed fibre)(IV)[W. C. Russell, J.Gen Virol.，81 :2573-3704(2000 年 11 月)]。病 毒基因組為線性雙鏈DNA，末端蛋白共價連接于含有末端反向重復(ITR)的5’末端。病毒 DNA與高堿性蛋白VII和小肽pX(之前稱為mu)密切相連。另一種蛋白V與此DNA-蛋白 復合物包裝在一起，并通過蛋白VI提供與衣殼的結構連接。該病毒也含有病毒編碼的蛋白 酶，這種蛋白酶是加工某些結構蛋白以產生成熟的感染性病毒所必需的。已經開發(fā)了一種對包括人、猿猴、牛、馬、豬、羊、犬和負鼠腺病毒在內的哺乳動物 腺病毒家族進行分類的方法。這種分類方法的開發(fā)基礎是該家族內的腺病毒序列凝集紅 血細胞的能力不同。結果得到了六個亞組，現在稱為亞組A、B、C、D、E和F。參見T. Sienk φ, Adenoviridae =The Viruses and theirR印Iication (腺病毒科病毒及其復制)，第 67章，選自FIELD' S VIROLOGY(菲爾德病毒學)，第6版，B. N Fields等編，(LR出版社 (Lippincott Raven Publishers)，費城，1996)，第 111-2112 頁。已報道可使用重組腺病毒將異源分子遞送至宿主細胞。參見美國專利6，083，716， 它描述了兩種黑猩猩腺病毒的基因組。猿猴腺病毒C5、C6和C7已經描述于美國專利 7，247, 472，它可用作疫苗載體。其他黑猩猩腺病毒描述于WO 2005/1071093，可用于制造腺
病毒疫苗載體。本領域需要能有效遞送分子到靶點并盡可能降低人群中已有的免疫力對所選腺 病毒血清型的影響的載體。發(fā)明概述本文提供了亞家族C中三種新型猿猴腺病毒的分離的核酸序列和氨基酸序列以 及含有這些序列的載體。還提供了許多使用本發(fā)明所述載體和細胞的方法。這些腺病毒包 括 SAdV-40、SAdV-31和 SAdV-34。本文所述方法包括通過給予本發(fā)明所述載體將一種或多種所選異源基因遞送到 哺乳動物患者。用本文所述組合物進行接種能夠呈遞所選抗原從而引發(fā)保護性免疫反應。 基于這些猿猴腺病毒的載體也可用于在體外制造異源基因產物。這種基因產物本身可用于 各種目的，例如本文所述的。本文將更加詳細地描述本發(fā)明的這些和其他實施方式以及優(yōu)點。
具體實施例方式本發(fā)明提供了全部分離自黑猩猩排泄物的猿猴腺病毒40、SAdV-31和SAdV_34的新的核酸和氨基酸序列。還提供了新型腺病毒載體和產生基于這些序列的載體的包裝細胞系，用于在體外 產生重組蛋白質或片段或其它制劑。本發(fā)明還提供了用于遞送治療或疫苗目的的異源分子 的組合物。這些治療性或疫苗組合物含有攜帶插入的異源分子的腺病毒載體。此外，所述 新型SAdV序列可用于提供產生重組腺相關病毒(AAV)載體所必需的輔助功能。因此，提供 了在此種產生方法中利用這些序列的輔助構建物、方法和細胞系。由于這些病毒來自亞組C，可將腺病毒亞組C衣殼遞送給對象從而將這些病毒的 衣殼(任選完整的或重組的病毒顆?；蚩找職?用于誘導免疫調節(jié)效應或增強的免疫應答 的方法。SAdV-40、SAdV-31或-34衣殼可單獨遞送或與活性劑組合遞送以增強其免疫應答。 在另一方面，提供了在有此需要的對象中誘導產生干擾素α的方法，包括遞送SAdV-40、 SAdV-31或SAdV-34衣殼到對象。再在另一個方面，提供了在培養(yǎng)物中產生一種或多種細胞 因子的方法。該方法包括在適合產生包括干擾素α等在內的細胞因子/趨化因子的條件 下培養(yǎng)含有樹突細胞和本文所述SAdV衣殼的培養(yǎng)物。術語“基本上同源”或“基本上相似”指核酸或其片段時，表示當任選地將含相應核 苷酸插入或缺失的序列與另一核酸(或其互補鏈)排列對比時，對比的序列至少約95-99% 核苷酸序列相同。術語“基本上同源”或“基本上相似”指氨基酸或其片段時，表示當任選地將含相 應氨基酸插入或缺失的序列與另一氨基酸(或其互補鏈)排列對比時，對比的序列至少約 95-99 %的氨基酸序列相同。優(yōu)選在全長序列，或其蛋白，或其至少8個氨基酸、或更理想至 少15個氨基酸長度的片段上具有上述同源性。本文描述了合適片段的實例。本文核酸序列所用術語“序列同一性百分率”或“相同”指當作最大排列對比時兩 個序列中的殘基相同。當將一個序列與另一個序列進行比對需要缺口時，根據沒有缺口罰 分的較長序列計算評分程度。保留多核苷酸或由其編碼的多肽的功能的序列最相同。序列 同一性比較的長度需要是基因組全長(例如，約361Λρ)、基因的開放讀框的全長、蛋白、亞 基、或酶[參見，例如提供腺病毒編碼區(qū)域的表]、或至少約500到5000個核苷酸的片段。 然而，也可能要求較小片段之間的同一性，例如至少約9個核苷酸、通常至少約20到M個 核苷酸、至少約觀到32個核苷酸、至少約36或更多核苷酸的片段。類似地，蛋白全長或其 片段的氨基酸序列的“序列同一性百分比”可容易地確定。適宜的是，片段長度至少為大約 8個氨基酸，也可長達大約700個氨基酸。本文描述了合適片段的實例。同一性可使用文中所述用默認設置的算法和計算機程序來容易地確定。優(yōu)選在蛋 白質、酶、亞基的全長或至少約8個氨基酸長度的片段上具有這種同一性。然而，這種同一 性可基于較短的區(qū)域，適合產生相同的基因產物的區(qū)域。如本文所述，用各種從公共渠道獲得或購得的多序列比對程序 (MultipleSequence Alignment Programs)進行比對，例如可通過互聯網Web服務器 獲得的“Clustal W”} 1Z20DDifef^A或者，也可使用載體NTI 實用程序[英杰公司 (InVitrogen)].還有許多本領域已知的算法也可用于測量核苷酸序列同一性，包括包含在 上述程序中的算法。作為另一個實例，可使用GCG 6. 1版中的程序i^asta 來比較多核苷酸 序列。hsta 可得出查詢序列與檢索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百分比。例如，可使用GCG 6. 1版提供的i^asta 及默認參數(字長為6和用于計分矩陣的NOPAM系 數)來確定核酸序列之間的序列同一性百分比，該程序此處引用作為參考?？刹捎孟嗨瞥?序進行氨基酸比對。雖然本領域技術人員可視需要改變設置，但通常這些程序都以默認設 置使用?；蛘?，本領域技術人員也可采用能夠象上述算法和程序一樣得出同一性水平或進 行比對的其他算法和計算機程序。“重組”用于多核苷酸時表示該多核苷酸是克隆、限制或連接步驟以及產生不同于 天然發(fā)現的多核苷酸的構建物的其他過程的不同組合的產物。重組病毒是包含重組多核苷 酸的病毒顆粒。該術語分別包括原始多核苷酸構建物的復制物以及原始病毒構建物的子 代?！爱愒础北硎狙苌砸环N與其所比較的實體的其余部分在基因型上不同的實體。例 如，通過遺傳工程技術引入來源于不同物種的質?；蜉d體的多核苷酸是異源多核苷酸。從 其天然編碼序列上取下并操作性連接于天然情況下不連接的編碼序列的啟動子是異源啟 動子。已被克隆入病毒基因組或病毒載體中的位點特異性重組位點是異源重組位點，其中 所述病毒基因組在天然情況下不含該位點。當具有重組酶編碼序列的多核苷酸被用于遺 傳改變正常情況下不表達該重組酶的細胞時，多核苷酸和重組酶對于該細胞而言都是異源 的。如本說明書和權利要求書中所用的術語“包含”和其變形形式，包括“含有”、“包 括”等其它形式指包含其它組分、元素、數值、步驟等。術語“由…組成”不包括其它組分、元 件、整數、步驟等。I.猿猴腺病毒序列本發(fā)明描述了分離自與腺病毒天然相關的其它材料的猿猴腺病毒40(SAdV_40)、 SAdV-31或SAdV-34的核酸序列和氨基酸序列。A.核酸序列本發(fā)明的SAdV-40核酸序列包括SEQ ID NO 1的核苷酸1-37718。本發(fā)明的 SAdV-31核酸序列包括SEQ ID NO 32的核苷酸1-37828。本發(fā)明的SAdV-34核酸序列包括 SEQ ID NO :63的核苷酸1-37799。見納入本文參考文獻中的序列表。一實施方式中，所述核酸序列還包括分別與SEQ ID NO :1、32或63的序列互補的 鏈，以及與以下序列和它們的互補鏈的序列相對應的RNA和cDNA序列。在另一個實施方式 中，所述核酸序列還包括與序列表有98. 5%以上，更優(yōu)選約99%以上同一性的序列。一個 實施方式中還包括SEQ ID NO :1、32或63中所提供序列以及它們互補鏈的天然變體和工程 構建修飾物。例如，這種修飾包括本領域已知的標記、甲基化、以及用簡并核苷酸取代一個 或多個天然產生的核苷酸。
權利要求
1.一種腺病毒，其具有包含選自下組的衣殼蛋白的衣殼(a)SAdV-40的六鄰體蛋白，SEQID NO :11的氨基酸1-960 ;SAdV_31的六鄰體蛋白，SEQ ID NO 42的氨基酸1-954 ；SAdV-34的六鄰體蛋白，SEQ IDNO 73的氨基酸1-958 ；(b)SAdV-40的五鄰體蛋白，SEQ ID NO 6的氨基酸1-593 ；SAdV-31的五鄰體蛋白，SEQ ID NO 37的氨基酸1-589 ；SAdV-34的五鄰體蛋白，SEQ ID NO 68的氨基酸1-617 ；禾口(c)SAdV-40的尾絲蛋白，SEQ ID NO 20的氨基酸1-543 ；SAdV-31的尾絲蛋白，SEQ ID NO 51的氨基酸1-596 ；SAdV-34的尾絲蛋白，SEQ ID NO 82的氨基酸1-596 ；和所述衣殼將攜帶操作性連接于指導其在宿主細胞內轉錄、翻譯和/或表達的表達控制 序列的異源分子衣殼化。
2.如權利要求1所述的腺病毒，其特征在于，還包含復制和衣殼化必需的5’和3’腺病 毒順式元件。
3.如權利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒缺乏所有或部分El基因。
4.如權利要求3所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒是復制缺陷型的。
5.如權利要求5所述的腺病毒，其特征在于，所述病毒具有雜交衣殼。
6.如權利要求5所述的腺病毒，其特征在于，所述載體包含選自SAdV-40、SAdV-31和 SAdV-34中多于一種的衣殼蛋白。
7.—種重組腺病毒，其具有含六鄰體的衣殼和SAdV的異源核酸序列，所述六鄰體含 有猿猴腺病毒六鄰體蛋白片段，其中所述SAdV六鄰體蛋白片段是具有長約50個氨基酸的 N-末端或C-末端截短的SEQ ID NO: 11、42或73所示的SAdV六鄰體蛋白，或選自下組SEQ ID NO :11、42 或 73 的氨基酸殘基 125-443 ；SEQ ID NO :11、42 或 73 的氨基酸殘基 138-441 ；SEQ ID NO :11、42 或 73 的氨基酸殘基 138-163 ；SEQ ID NO :11、42或73的氨基酸殘基170-176 ；和SEQ ID NO :11、42 或 73 的氨基酸殘基 404-430。
8.如權利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述衣殼還包含SAdV-40、SAdV-31或 SAdV-34尾絲蛋白。
9.如權利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述衣殼還包含SAdV-40、SAdV-31或 SAdV-34五鄰體蛋白。
10.如權利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述腺病毒是包含復制和衣殼化必 需的5’和3’腺病毒順式元件的假型腺病毒，所述順式元件包含腺病毒5’末端反向重復和 腺病毒3’末端反向重復。
11.如權利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述腺病毒包含編碼產物的核酸序 列，所述核酸序列操作性連接于指導所述產物在宿主細胞內表達的序列。
12.如權利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述重組腺病毒包含一個或多個腺 病毒基因。
13.如權利要求7所述的重組腺病毒，其特征在于，所述重組腺病毒是復制缺陷型的。
14.如權利要求13所述的重組腺病毒，其特征在于，所述重組腺病毒的腺病毒El缺失。
15.一種組合物，其包含權利要求1-14中任一項所述的病毒和藥學上可接受的載體。
16.一種靶向具有腺病毒受體的細胞的方法，所述方法包括給對象遞送如權利要求1-14中任一項所述的病毒。
17.一種選自下組的分離的猿猴腺病毒核酸SEQ ID NO 1的猿猴腺病毒40核酸1-37718及其互補序列； SEQ ID NO 32的猿猴腺病毒31核酸1_37擬8及其互補序列；和 SEQ ID NO 63的猿猴腺病毒34核酸1-37799及其互補序列。
18.—種載體，其包含選自下組中一個或多個的猿猴腺病毒核酸序列猿猴腺病毒 40，SEQ ID NO 1 ； SAdV-31, SEQ ID NO :32 ；SAdV-34, SEQID NO :63 的(a)5，末端反向重復(ITR)序列；(b)腺病毒Ela區(qū)；(c)腺病毒Elb區(qū)，或其選自下組的片段小T、大T和IX區(qū)的開放讀框；(d)E2b區(qū)，包括pTP、聚合酶和IVa區(qū)的開放讀框；(e)Ll區(qū)，或其選自下組的片段52/55kD蛋白和IIIa蛋白的開放讀框；(f)L2區(qū)，或其選自下組的片段五鄰體、VII、VI和pX蛋白的開放讀框；(g)L3區(qū)，或其選自下組的片段VI、六鄰體和內切蛋白酶的開放讀框；(h)Eh蛋白，包括DNA結合蛋白(DBP)的開放讀框；(i)L4區(qū)，或其選自下組的片段100kD蛋白、33kD同源物、22kD同源物和VIII的開放 讀框；(j)E3 區(qū)，或其選自下組的片段12. 5K、CRl-α、gpl9K、CRl-β、CRli、RID-α、 RID-β和14. 7Κ的開放讀框；(k)L5區(qū)，或其選自下組的片段尾絲蛋白的開放讀框；(1)E4 區(qū)，或其選自下組的片段E40RF6/7、E40RF6、E40RF4、E40RF3、E40RF2 和 E40RF1 的開放讀框；和 (m)3’ ITR0
19.一種由權利要求18所述核酸序列編碼的猿猴腺病毒蛋白。
20.一種組合物，其包含選自下組的一種或多種猿猴腺病毒蛋白 Ela，選自SEQ ID NO :29、60和91所示氨基酸序列；Elb，小T/19K，選自SEQ ID NO 22、53和64所示氨基酸序列； Elb，大T/55K，選自SEQ ID NO :2、33和84所示氨基酸序列； IX，選自SEQ ID NO 3,34和65所示氨基酸序列； 52/55D，選自SEQ IDNO :4、35和66所示氨基酸序列； Illa，選自SEQ ID NO :5、36和67所示氨基酸序列； 五鄰體，選自SEQ ID NO 6,37和68所示氨基酸序列； VII，選自SEQ ID NO :7、38和69所示氨基酸序列； V，選自SEQ ID NO 8,39和70所示氨基酸序列； pX，選自SEQ ID NO 9,40和71所示氨基酸序列； VI，選自SEQ ID NO 10,41和72所示氨基酸序列； 六鄰體，選自SEQ ID NO 11,42和73所示氨基酸序列； 內切蛋白酶，選自SEQ ID N0:12、43和74所示氨基酸序列； IOOkD,選自SEQ ID NO 13、44和86所示氨基酸序列；33kD，選自SEQ ID NO :31、62和93所示氨基酸序列； 22kD，選自SEQ ID NO :24、55和75所示氨基酸序列； VIII，選自SEQ ID NO :14、45和76所示氨基酸序列; 12. 5K，選自SEQ ID NO :15、46和77所示氨基酸序列； CRl-α，選自SEQ ID NO :25、56和87所示氨基酸序列； gpl9K，選自SEQ ID NO :16、47和78所示氨基酸序列； CRl-β，選自SEQ ID NO :17、48和79所示氨基酸序列； CRl-γ，選自SEQ ID NO :26、57和88所示氨基酸序列； RID-α，選自SEQ ID NO :18、49和80所示氨基酸序列； RID-β，選自SEQ ID NO 19、50和81所示氨基酸序列； 14. 7Κ，選自SEQ ID NO :27、58和89所示氨基酸序列；和 尾絲，選自SEQ ID NO :20、51和82所示氨基酸序列；
21. —種靶向具有腺病毒受體的細胞的方法，所述方法包括給對象遞送如權利要求 20所述的組合物，所述組合物包含一種或多種選自六鄰體、五鄰體或尾絲的猿猴腺病毒 SAdV-40、-31 和-34 蛋白。
全文摘要
一種包含猿猴腺病毒SAdV-40、SAdV-31或SAdV-34序列以及受調節(jié)序列控制的異源基因的重組載體。還公開了表達猿猴腺病毒SAdV-40、SAdV-31或SAdV-34基因的細胞系。提供了使用所述載體和細胞系的方法。
文檔編號C12N7/00GK102131920SQ200880118582
公開日2011年7月20日 申請日期2008年11月24日 優(yōu)先權日2007年11月28日
發(fā)明者J·M·威爾森, L·H·范登伯格, S·羅伊 申請人:賓夕法尼亞州立大學托管會