專利名稱：：胃癌基因ZNF312b、由該基因翻譯的蛋白以及使用所述基因和蛋白的診斷試劑盒和篩選抗...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種含有胃癌基因ZNF312b或其片段的胃癌診斷標(biāo)記物、使用該標(biāo)記物診斷胃癌的方法和使用該標(biāo)記物篩選胃癌誘導(dǎo)劑或抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
：包括人類在內(nèi)的高級(jí)動(dòng)物具有大約30，000個(gè)基因。在這些基因中，只有約15%在各種個(gè)體內(nèi)得到表達(dá)。因此，通過被選擇表達(dá)的基因可確定各種生物學(xué)現(xiàn)象，例如發(fā)育、分化、體內(nèi)平衡、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、老化和細(xì)胞凋亡(程序性細(xì)胞死亡XLiang,P.和A.B.Pardee,^/e"ce,257:967-971,1992)。病理現(xiàn)象例如腫瘤生成由基因突變引起，并最終誘發(fā)基因表達(dá)的改變。這種基因改變導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)異常。因此，對(duì)不同細(xì)胞之間的基因表達(dá)進(jìn)行比較是理解各種生物學(xué)現(xiàn)象的基本、有效的方法。根據(jù)現(xiàn)有對(duì)腫瘤生成的研究結(jié)果，各種基因改變(諸如染色體雜合缺失、致癌基因活化和包括p53在內(nèi)的腫瘤抑制基因失活等)均集中在腫瘤組織上，從而導(dǎo)致人體內(nèi)的癌癥(Bishop,J.M.，Ce//，64:235-248,1991和Hunter,T"Ce〃，64:249-270,1991)。據(jù)預(yù)測(cè)，10-30%的癌癥是由致癌基因擴(kuò)增導(dǎo)致的致癌基因活化引起的。由于致癌基因活化是研究癌癥病因的重要因素，因此它已經(jīng)成為癌癥研究的主要目標(biāo)。胃癌是包括韓國(guó)和日本在內(nèi)的亞洲國(guó)家中最頻繁發(fā)生的癌癥，具有最高的致死率(Parkin等人，,Omcw80:827-841,1999;Neugut等人，Sem/".(9"co/.23:281-291,1996)。目前只有少數(shù)涉及胃癌的基因被披露。然而，最近發(fā)現(xiàn)諸如p53(Yokozaki等人，/"tiev.C^o/.204:49-95，2001)、p-連環(huán)蛋白(Park等人，Ca證r版59:4257-4260,1999)、E-鈣黏蛋白(Berx等人，F(xiàn)wm.MwtaL12:226-237,1998)、三葉因子1(Park等人，Gosfroe"^ra/ogy119:691-698，2000)和c陽(yáng)met(Lee等人，O"coge"e19:4947-4953,2000)等基因在胃癌病例中顯示出發(fā)生基因改變。還有報(bào)道認(rèn)為CA11(Yoshikawa等人，C朋cer及"91:459-463，2000;Shiozaki等人，0"co/.19:701-707,2001)以及在胃粘膜中合成的三葉因子TFF1和TFF2(Shiozaki等人，,<9腳/.19:701-707,2001;Kirikoshi和KatohKirikoshi,Int.21:655-659,2002)在胃癌患者體內(nèi)減少。Hasegawa等人使用腸型胃癌中表達(dá)的23,040個(gè)基因通過cDNA微陣列證實(shí)了RPL10、HSPCB、LOC56287、IGHM、PGC、REGIA、RNA酶1、TFF1和TFF2的表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移有關(guān)(Hasegawa等人，Cawcer62:7012-7017，2002)。然而，單獨(dú)使用這些基因來(lái)診斷或治療胃癌還不夠，而胃癌的特異性靶基因仍然沒有建立起來(lái)。ZNF312b基因也稱為Fezfl(前腦胚胎鋅指樣蛋白1)基因，是非洲爪蟾(Xenopus)前腦的嗅感覺神經(jīng)元(OSN)中第一個(gè)被鑒定的基因，并且已知編碼具有鋅離子的蛋白(Matsuo-Takasaki等人，Mec/z.Z)ev.93:201-204,2000)。該基因?qū)π嵘窠?jīng)的適當(dāng)終止(properterminationoftheolfactorynerve)、嗅球的形成和中間神經(jīng)元祖細(xì)胞的經(jīng)頭端遷移流來(lái)說是必不可少的，并且對(duì)軸突導(dǎo)向(axonalprojection)細(xì)胞自我控制和嗅球膜形成控制來(lái)說也是重要因素(TsutomuHirata等人，Deve/opmeW133:1433-1443,2006)。ZNF312b的表達(dá)在胚胎發(fā)育階段可觀察到，但在成體內(nèi)很微弱。在其他組織中均不能觀察到ZNF312b的表達(dá)。己知有少量的關(guān)于ZNF312b基因功能的報(bào)道，但是它們均與胃癌或癌的發(fā)展無(wú)關(guān)。本發(fā)明者注意到胃癌組織內(nèi)ZNF312b的表達(dá)有所提高。因此，本發(fā)明者將我們的研究聚焦到與癌的發(fā)展相關(guān)的ZNF312b基因的功能上。結(jié)果，本發(fā)明者通過證實(shí)ZFN312b基因表達(dá)在胃癌中特異性提高，暗示了該基因具有與腫瘤生成相關(guān)的功能，是細(xì)胞增殖信號(hào)系統(tǒng)的重要因子，并且通過結(jié)合到K-ras啟動(dòng)子使K-ras表達(dá)提高，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供1)一種用于診斷和篩查胃癌的含有ZNF312b基因或其片段的基因標(biāo)記物；2)—種用于診斷和篩查胃癌的含有ZNF312b蛋白或其片段的蛋白標(biāo)記物；3)—種使用上述標(biāo)記物診斷胃癌的方法、一種使用上述標(biāo)記物篩選胃癌誘導(dǎo)劑的方法和一種使用上述標(biāo)記物篩選胃癌抑制劑的方法；以及4)一種用于預(yù)防和治療胃癌的組合物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種胃癌診斷試劑盒，包括具有SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段的核苷酸序列的寡聚核苷酸或能擴(kuò)增該寡聚核苷酸的引物組(primerset)。本發(fā)明還提供一種胃癌診斷試劑盒，包括特異性結(jié)合到SEQ.ID.NO:2表示的ZNF312b蛋白或其片段的抗體。本發(fā)明還提供一種診斷胃癌的DNA微陣列，其中，所述微陣列整合有具有SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段的核苷酸序列的寡聚核苷酸或其互補(bǔ)的寡聚核苷酸。本發(fā)明還提供一種胃癌標(biāo)記物的篩選方法，所述方法包括使特異性結(jié)合到由SEQ.ID.NO:2表示的ZNF312b蛋白或其片段的抗體與生物樣品接觸的步驟，所述生物樣品選自于由胃組織、胃細(xì)胞、尿、血、血清和血漿構(gòu)成的組。本發(fā)明還提供一種胃癌診斷方法，包括以下步驟1)測(cè)量受試者樣品中標(biāo)記基因的表達(dá)水平；以及2)與對(duì)照組相比較，選擇顯示標(biāo)記物表達(dá)較高的受試者。本發(fā)明還提供一種胃癌誘導(dǎo)劑或抑制劑的篩選方法，所述包括以下步驟.-■1)將樣品組合物或樣品化合物處理到來(lái)源于胃的細(xì)胞中(實(shí)驗(yàn)組)；2)對(duì)步驟l)的實(shí)驗(yàn)組和未處理的對(duì)照組之間的標(biāo)記基因的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)量和比較；以及3)與對(duì)照組相比較，選擇實(shí)驗(yàn)組中顯著提高或降低所述標(biāo)記基因表達(dá)水平的樣品組合物或樣品化合物。本發(fā)明還提供一種胃癌誘導(dǎo)劑或抑制劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)制備含有報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，所述報(bào)告基因可操作地連接(operablylinkedto)到ZNF312b啟動(dòng)子及其片段上，所述ZNF312b啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:9表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)通過用插入步驟l)的基因構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)制備轉(zhuǎn)化體；3)通過用樣品組合物或樣品化合物處理步驟2)的轉(zhuǎn)化體來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)組，以及不用任何物質(zhì)處理來(lái)準(zhǔn)備對(duì)照組；4)測(cè)量步驟3)所述的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中報(bào)告基因的表達(dá)水平；以及5)與對(duì)照組相比較，選擇所述實(shí)驗(yàn)組中顯著提高或降低所述基因表達(dá)水平的樣品組合物或樣品化合物。本發(fā)明還提供一種胃癌誘導(dǎo)劑或抑制劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟-1)制備含有報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，所述報(bào)告基因可操作地連接到K-ras啟動(dòng)子及其片段上，所述K-ras啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)通過用插入步驟l)所述的基因構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)制備轉(zhuǎn)化體，所述動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列構(gòu)成的ZNF312b蛋白或其片段；3)通過用樣品組合物或樣品化合物處理步驟2)的轉(zhuǎn)化體來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)組，以及不用任何物質(zhì)處理來(lái)準(zhǔn)備對(duì)照組；4)測(cè)量步驟3)所述的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中報(bào)告基因的表達(dá)水平；以及5)與對(duì)照組相比較，選擇步驟4)所述的實(shí)驗(yàn)組中顯著提高或降低所述基因表達(dá)水平的樣品組合物或樣品化合物。本發(fā)明還提供一種胃癌誘導(dǎo)劑或抑制劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)用ZNF312b蛋白或其片段以及樣品組合物或樣品化合物處理含有K-ras啟動(dòng)子或其片段的寡聚核苷酸，所述ZNF312b蛋白含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列，所述K-ras啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和未處理的對(duì)照組之間ZNF312b蛋白或其片段與K-ras啟動(dòng)子或其片段的結(jié)合水平進(jìn)行測(cè)量和比較；以及3)與對(duì)照組相比較，選擇實(shí)驗(yàn)組中顯著提高或降低結(jié)合水平的樣品組合物或樣品化合物。本發(fā)明還提供用于診斷和篩査胃癌的動(dòng)物模型，其中通過對(duì)除人類以外的動(dòng)物的皮膚注射含有SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段的載體來(lái)移植胃癌。本發(fā)明還提供具有與mRNA全長(zhǎng)或部分序列互補(bǔ)的序列的反義基因，所述mRNA由SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段轉(zhuǎn)錄得到，所述反義基因通過結(jié)合到所述mRNA來(lái)抑制ZNF312b基因或其片段的表達(dá)。本發(fā)明還提供具有與inRNA全長(zhǎng)或部分序列互補(bǔ)的序列的siRNA序列，所述mRNA由SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段轉(zhuǎn)錄得到，所述siRNA序列通過被Dicer蛋白識(shí)別來(lái)抑制ZNF312b基因或其片段的表達(dá)。本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防和治療胃癌的組合物，所述組合物含有通過上述方法篩選的胃癌抑制劑作為活性成分。本發(fā)明還提供一種預(yù)防和治療胃癌的方法，所述方法包括將藥學(xué)上有效劑量的用于預(yù)防和治療胃癌的組合物給予受試者的步驟。此外，本發(fā)明提供一種通過上述方法篩選的胃癌抑制劑用于制備預(yù)防和治療胃癌的組合物的用途。下文描述了本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)。在本發(fā)明中，"標(biāo)記物"是便于區(qū)別胃癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的物質(zhì)，可以是ZNF312b基因的核酸標(biāo)記物以及ZNF312b蛋白的多肽標(biāo)記物。與正常細(xì)胞相比較，這些標(biāo)記物在胃癌細(xì)胞中被特征性地過表達(dá)。在本發(fā)明中，"診斷"表示證實(shí)了胃癌的存在或胃癌的特征。在本發(fā)明中，"基因表達(dá)水平"表示樣品中ZNF312b胃癌標(biāo)記基因13的mRNA的表達(dá)水平。在本發(fā)明中，"引物"表示具有短的游離的3'羥基的核酸序列，可與互補(bǔ)模板形成堿基對(duì)，并且可作為模板復(fù)制的起點(diǎn)。在本發(fā)明中，"蛋白表達(dá)水平"表示樣品中從ZNF312b胃癌標(biāo)記基因翻譯得到的蛋白的表達(dá)水平。在本發(fā)明中，"抗體"表示表位特異性的蛋白分子。在下文中具體描述本發(fā)明。本發(fā)明提供一種胃癌診斷試劑盒，所述試劑盒含有具有SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因(GeneBank登錄號(hào)AY726588)或其片段的寡聚核苷酸或能擴(kuò)增所述寡聚核苷酸的引物組。ZNF312b基因片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列的羧基端區(qū)域(SEQ.ID.NO:20)，但不總限于此。ZNF312b基因作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子能夠激活參與細(xì)胞增殖的基因。對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列中核苷酸#104的開放閱讀框是全長(zhǎng)的蛋白編碼區(qū)，SEQ.ID.NO:2表示由開放閱讀框翻譯得到的氨基酸序列，由475個(gè)氨基酸構(gòu)成(ZNF312b蛋白)。然而，考慮到表達(dá)致癌基因的密碼子或優(yōu)選密碼子的簡(jiǎn)并，只要修飾不影響致癌蛋白的氨基酸表達(dá)，就可在編碼區(qū)對(duì)本發(fā)明的基因進(jìn)行修飾。此外，只要不影響區(qū)域內(nèi)的基因表達(dá)，還可對(duì)非編碼區(qū)進(jìn)行修飾。該修飾的基因可包括在本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。因此，本發(fā)明包括具有與SEQ.ID.NO:l表示的致癌基因及其片段相同核苷酸序列的多聚核苷酸。本文相同的"多聚核苷酸"表示具有至少80%、更優(yōu)選90%和最優(yōu)選至少95%序列同源性的多聚核苷酸。為檢驗(yàn)ZNF312b基因是否在胃癌細(xì)胞內(nèi)被特異性地過表達(dá)，本發(fā)明者測(cè)量了胃癌細(xì)胞系和臨床組織中ZNF312b基因的mRNA的表達(dá)。結(jié)果，ZNF312b基因在胃癌細(xì)胞中被特異性地過表達(dá)(參見圖l和圖2)。為考察ZNF312b基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)效果，本發(fā)明者構(gòu)建了具有ZNF312b基因核苷酸序列的表達(dá)載體和ZNF312bshRNA(小發(fā)夾狀RNA)的表達(dá)載體。用這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系。然后考察胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果，與正常細(xì)胞相比較，ZNF312b基因的過表達(dá)加速了胃癌細(xì)胞系的增殖，縮短了細(xì)胞周期中的G1期但延長(zhǎng)了G2+M期，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率提高。同時(shí)，ZNF312b基因表達(dá)的抑制導(dǎo)致了胃癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖減少、細(xì)胞周期中的Gl期延長(zhǎng)但G2+M期縮短，因此細(xì)胞生長(zhǎng)速率相應(yīng)降低(參見圖3-11)。本發(fā)明者還使用裸鼠進(jìn)行群落形成(colonyformation)試驗(yàn)和腫瘤形成實(shí)驗(yàn)，從而考察ZNF312b作為致癌基因的功能。結(jié)果，與對(duì)照相比較，裸鼠的ZNF312b過表達(dá)使群落形成增加并且顯著增加了腫瘤尺寸(參見圖12-17)。因此，本發(fā)明的ZNF312b基因可有效地用作胃癌診斷的標(biāo)記基因。本文的胃癌診斷試劑盒是對(duì)用于胃癌診斷和篩查的ZNF312bmRNA進(jìn)行定量，但不總限于此。本文的胃癌診斷試劑盒優(yōu)選包括特異性結(jié)合到ZNF312bmRNA的SEQ.ID.NO:3或NO:4表示的附加的核苷酸，但不總限于此。本文的胃癌診斷試劑盒優(yōu)選包括一種或多種附加組分，選自于由用于生成對(duì)應(yīng)于ZNF312bmRNA的cDNA的引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶、PCR引物和dNTP構(gòu)成的組，但不總限于此。本文的胃癌診斷試劑盒優(yōu)選包括能夠擴(kuò)增標(biāo)記基因的引物組，但不總限于此。引物是具有針對(duì)標(biāo)記基因的核苷酸序列的、具有特定序列的核苷酸，優(yōu)選由大約7-50個(gè)堿基對(duì)的核苷酸序列構(gòu)成，更優(yōu)選由10-30個(gè)堿基對(duì)的核苷酸序列構(gòu)成，但不總限于此。引物能于適當(dāng)?shù)臏囟认隆⑦m合的緩沖液中、在PCR試劑和4種不同核苷三磷酸的存在下啟動(dòng)DNA的合成。引物可具有其他特征，只要它們不改變引物作為DNA復(fù)制起點(diǎn)的基本特征。本文的引物可通過亞磷酰胺固相載體法(phosphoramiditesolidsupportmethod)或其他公知方法進(jìn)行修飾或化學(xué)合成。胃癌診斷試劑盒還可另外包括一種或多種組分，所述組分選自于由試管、適合的容器、反應(yīng)緩沖液、dNTP、Taq聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA酶、RNA酶抑制劑、DEPC水和無(wú)菌水構(gòu)成的組，但不總限于此。本發(fā)明還提供一種胃癌診斷試劑盒，所述的試劑盒包括特異性結(jié)合到SEQ.ID.NO:2表示的ZNF312b蛋白或其片段的抗體。ZNF312b蛋白片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的羧基端區(qū)域，但不總限于此。為考察ZNF312b蛋白或其片段作為轉(zhuǎn)錄因子的功能和該功能的耙區(qū)域，本發(fā)明者將過表達(dá)所述蛋白或其片段的重組載體轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞系中，然后通過核分級(jí)分離染色(nuclearfractionstaining)和免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位的確認(rèn)。結(jié)果證實(shí)，ZNF312b蛋白或含有該蛋白羧基端區(qū)域(SEQ.ID.NO:20)的片段被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中(參見圖18-20)。為考察ZNF312b蛋白或其片段對(duì)胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖和群落形成的影響，本發(fā)明者將過表達(dá)所述蛋白或其片段的重組載體轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞系中，然后測(cè)量細(xì)胞增殖和群落形成。結(jié)果，ZNF312b蛋白或其含有羧基端區(qū)域的片段的過表達(dá)提高了細(xì)胞增殖和群落形成(參見圖21-23)。為了通過ZNF312b蛋白或其片段檢驗(yàn)胃癌細(xì)胞系內(nèi)的細(xì)胞增殖信號(hào)系統(tǒng)，本發(fā)明者將ZNF312b或其片段的過表達(dá)載體或siRNA轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞系中，然后使用不同抗體進(jìn)行免疫印跡(Westernblotting)。結(jié)果，ZNF312b及其片段的減少導(dǎo)致了K-ras表達(dá)的降低，暗示了ERK信號(hào)系統(tǒng)的失活，而ZNF312b及其片段的過表達(dá)誘導(dǎo)了K-ms表達(dá)的激活，顯示了ERK信號(hào)系統(tǒng)的激活(參見圖24-25)。因此，本發(fā)明的ZNF312b蛋白和含有該蛋白的羧基端區(qū)域(SEQ.ID.NO:20)的片段可作為用于胃癌診斷和篩查的蛋白標(biāo)記物。另外，所述試劑盒優(yōu)選含有ZNF312b蛋白或其片段，但不總限于此。包含于所述試劑盒中的抗體優(yōu)選多克隆抗體、單克隆抗體或重組抗體，但不總限于此。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法可以容易地制備抗體。例如，可通過包括以下步驟的方法獲得多克隆抗體將ZNF312b蛋白抗原注射16到動(dòng)物體內(nèi)；以及采取動(dòng)物血樣以獲得含有針對(duì)該抗原的抗體的血清。此時(shí)，所述動(dòng)物選自于由羊、兔和豬等構(gòu)成的組?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的雜交瘤法(hybridomamethod)(Kohler&Milstein,EuropeanJ.Immunology6:511-519,1976)或噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)(Clackson等人，Nature:352:624-628,1991;Marks等人，J.Mol.Biol.,222:58，1-597,1991)制備單克隆抗體。根據(jù)雜交瘤法，可使用免疫學(xué)上適合的宿主動(dòng)物的細(xì)胞以及癌或骨髓瘤細(xì)胞系，所述的動(dòng)物例如注射有ZNF312b蛋白抗原的小鼠。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法，例如使用聚乙二醇使這兩類細(xì)胞融合，然后通過標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)方法對(duì)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞進(jìn)行增殖。利用有限稀釋技術(shù)(limiteddilutiontechnique)通過亞克隆獲得同源細(xì)胞。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)能產(chǎn)生ZNF312b蛋白特異性抗體的雜交瘤進(jìn)行體外或體內(nèi)大量培養(yǎng)。根據(jù)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，獲得ZNF312b蛋白特異性抗體基因，將其表達(dá)為噬菌體表面上的融合蛋白從而構(gòu)建體外抗體庫(kù)。然后，從該庫(kù)中分離特異性結(jié)合到ZNF312b蛋白的單克隆抗體?？赏ㄟ^電泳法、透析法、離子交換層析法、親和層析法等分離由上述方法生成的抗體。本發(fā)明的包含于試劑盒中的抗體含有2條全長(zhǎng)的輕鏈和2條全長(zhǎng)的重鏈以及抗體分子的功能片段。功能片段表示的是保留抗原結(jié)合能力的片段，可通過Fab、F(ab')、F(ab')2、F(ab)2和Fv等得到例證。試劑盒優(yōu)選用于ELISA，并且除含有用于檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的試劑(例如標(biāo)記的二抗、發(fā)色團(tuán)、結(jié)合了抗體的酶和該酶的底物或其他結(jié)合抗體的物質(zhì))夕卜，可含有調(diào)節(jié)蛋白(controlprotein)特異性抗體。本發(fā)明還提供一種診斷胃癌的DNA微陣列，其中，所述的微陣列整合有具有全長(zhǎng)或部分標(biāo)記基因核苷酸序列的寡聚核苷酸或其互補(bǔ)的寡聚核苷酸。本發(fā)明還提供一種胃癌標(biāo)記物的篩選方法，所述方法包括使特異性結(jié)合到SEQ.ID.NO:2表示的ZNF312b蛋白或其片段的抗體與生物樣品接觸的步驟，所述生物樣品選自于由胃組織、胃細(xì)胞、尿、血、血清和血漿構(gòu)成的組。具體而言，胃癌標(biāo)記物的篩選方法由以下步驟組成1)使生物學(xué)樣品與特異性結(jié)合到ZNF312b蛋白或其片段的抗體接觸；2)對(duì)通過步驟l)的接觸形成的抗原-抗體復(fù)合物進(jìn)行定量；以及3)通過比較步驟2)和對(duì)照的定量水平來(lái)選擇標(biāo)記物。在上述方法中，用于對(duì)步驟2)的抗原-抗體復(fù)合物進(jìn)行定量的方法優(yōu)選選自于由免疫印跡法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析法)、RIA(放射性免疫分析法)、放射性免疫擴(kuò)散法、奧克特洛尼(ouchterlony)免疫擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、免疫組織染色法、免疫沉淀法、補(bǔ)體結(jié)合分析法、FACS和蛋白芯片法所構(gòu)成的組，但不總限于此。在本方法中，可通過檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量步驟2)的抗原-抗體復(fù)合物的量?？赏ㄟ^使用一種或多種成分進(jìn)行檢測(cè)，所述成分選自于由酶、熒光物質(zhì)、配體、發(fā)光物質(zhì)、微粒、氧化還原分子和放射性同位素構(gòu)成的組，但不總限于此。本文的酶優(yōu)選選自于由P-葡糖苷酸酶、P-D-葡糖苷酶、(3-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化酶、堿性磷酸酶、乙?；憠A脂酶、葡糖氧化酶和己糖激酶構(gòu)成的組，但不總限于此。本文的熒光物質(zhì)優(yōu)選選自于由熒光素、藻藍(lán)蛋白和熒光胺構(gòu)成的組，但不總限于此。所述配體優(yōu)選生物素衍生物，但不總限于此。所述發(fā)光物質(zhì)優(yōu)選蟲熒光素，但不總限于此。所述微粒優(yōu)選膠體金，但不總限于此。所述氧化還原分子優(yōu)選醌、1,4-苯醌或氫醌，但不總限于此。所述放射性同位素為311或14C，但不總限于此。本發(fā)明還提供一種胃癌診斷方法，所述方法包括以下步驟1)測(cè)量受試者樣品中ZNF312b標(biāo)記基因的表達(dá)水平；以及2)與對(duì)照組相比較，選擇顯示標(biāo)記物表達(dá)較高的受試者。在上述方法中，步驟l)的樣品優(yōu)選選自于由胃組織、胃細(xì)胞、尿、血、血清和血漿構(gòu)成的組，但不總限于此。在上述方法中，可以mRNA水平和蛋白水平測(cè)量步驟1)的表達(dá)水平。以mRNA水平測(cè)量表達(dá)優(yōu)選通過以下方法進(jìn)行，例如RT-PCR法、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR法、實(shí)時(shí)RT-PCR法、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)法、RNA印跡法(Northernblotting)和DNA芯片法，但不總限于此。通過這些方法中的一種，可將胃癌疑似患者的mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組中的mRNA表達(dá)相比較。即，通過使用ZNF312b基因標(biāo)記物測(cè)量mRNA表達(dá)可診斷胃癌疑似患者是否為真正的胃癌患者，這意味著當(dāng)mRNA表達(dá)顯著提高時(shí)可診斷為胃癌。以蛋白水平測(cè)量表達(dá)優(yōu)選通過以下方法進(jìn)行，例如二維電泳、蛋白芯片、ELISA和使用標(biāo)記物蛋白特異性抗體的方法，但不總限于此?？墒褂脴?biāo)記抗體通過直接夾心ELISA法測(cè)量蛋白表達(dá)水平，所述標(biāo)記抗體能識(shí)別固定于固相載體上的抗體-抗原復(fù)合物中的抗原，或者通過間接夾心ELISA法測(cè)量蛋白表達(dá)水平，在該間接夾心ELISA法中，固定于固相載體上的抗原-抗體復(fù)合物與識(shí)別抗體-抗原復(fù)合物中的抗原的另一抗體反應(yīng)，然后使用識(shí)別上述抗體的標(biāo)記二抗。更優(yōu)選地，可通過另一種夾心ELISA法測(cè)量蛋白表達(dá)水平，其中，將抗體固定于固相載體上，然后與樣品反應(yīng)；將識(shí)別抗體-抗原復(fù)合物中的抗原的標(biāo)記抗體粘附在上面，然后用酶進(jìn)行顯色；或?qū)⒆R(shí)別抗體-抗原復(fù)合物中的抗原的標(biāo)記二抗粘附在上面，然后用酶進(jìn)行顯色?？墒褂玫鞍仔酒瑢?duì)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量，在所述蛋白芯片上，針對(duì)ZNF312b蛋白標(biāo)記物的至少一種抗體以高密度排列并固定在底物的耙區(qū)域上。上述使用蛋白芯片分析樣品的方法由以下步驟組成從樣品中分離出蛋白；將分離的蛋白與蛋白芯片混合以形成抗原-抗體復(fù)合物；以及確認(rèn)蛋白的表達(dá)以診斷胃癌。可使用ZNF312b的抗體通過免疫印跡對(duì)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量。具體而言，由樣品分離出總蛋白；對(duì)分離的蛋白進(jìn)行電泳以使蛋白按大小分開；然后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，使其與抗體反應(yīng)。使用標(biāo)記的抗體對(duì)產(chǎn)生的抗原-抗體復(fù)合物進(jìn)行定量，從而診斷胃癌。本發(fā)明還提供一種胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)將樣品組合物或樣品化合物處理到來(lái)源于胃的細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)；2)對(duì)步驟1)的實(shí)驗(yàn)組和未處理的對(duì)照組之間的ZNF312b標(biāo)記基因或其片段的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)量和比較，所述的ZNF312b標(biāo)記基因具有SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列；以及3)與對(duì)照組相比較，選擇所述實(shí)驗(yàn)組中顯著提高所述標(biāo)記基因表達(dá)水平的樣品組合物或樣品化合物。在上述方法中，步驟2)的ZNF312b基因優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列或其片段，所述片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列的羧基端區(qū)域，但不總限于此。在上述方法中，可通過以下方法中的一種方法測(cè)量步驟2)的基因表達(dá)，所述方法選自于由RT-PCR法、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR法、實(shí)時(shí)RT-PCR法、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)法、RNA印跡法和DNA芯片法構(gòu)成的組，但不總限于此。通過這些方法中的一種，對(duì)正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間的mRNA表達(dá)進(jìn)行比較。可通過檢測(cè)ZNF312b基因標(biāo)記物的mRNA表達(dá)的顯著提高來(lái)篩選胃癌誘導(dǎo)劑。本發(fā)明還提供一種胃癌抑制劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)將樣品組合物或樣品化合物處理到來(lái)源于胃的細(xì)胞中(實(shí)驗(yàn)組)；2)對(duì)步驟1)的實(shí)驗(yàn)組和未處理的對(duì)照組之間的ZNF312b標(biāo)記基因或其片段的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)量和比較，所述的ZNF312b標(biāo)記基因具有SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列；以及3)與對(duì)照組相比較，選擇所述實(shí)驗(yàn)組中顯著降低所述標(biāo)記基因表達(dá)水平的樣品組合物或樣品化合物。在上述方法中，步驟2)的ZNF312b基因優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列或其片段，所述片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列的羧基端區(qū)域，但不總限于此。在上述方法中，可通過以下方法中的一種來(lái)測(cè)量步驟2)的基因表達(dá)，所述方法選自于由RT-PCR法、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR法、實(shí)時(shí)RT-PCR法、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)法、RNA印跡法和DNA芯片法構(gòu)成的組，但不總限于此。通過這些方法中的一種，對(duì)正常對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組之間的mRNA表達(dá)進(jìn)行比較。可通過檢測(cè)ZNF312b基因標(biāo)記物的mRNA表達(dá)的顯著減少來(lái)篩選胃癌抑制劑。本發(fā)明還提供一種胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)制備含有報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，所述報(bào)告基因可操作地連接到ZNF312b啟動(dòng)子及其片段上，所述ZNF312b啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:9表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)通過用插入步驟l)的基因構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)制備轉(zhuǎn)化體；3)通過用樣品組合物或樣品化合物處理步驟2)的轉(zhuǎn)化體來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)組，以及不用任何物質(zhì)處理來(lái)準(zhǔn)備對(duì)照組；4)測(cè)量步驟3)所述的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的報(bào)告基因的表達(dá)水平；以及5)與對(duì)照組相比較，選擇步驟4)所述的實(shí)驗(yàn)組中顯著提高所述基因表達(dá)水平的樣品組合物或樣品化合物。在上述方法中，步驟l)的片段優(yōu)選含有從SEQ.ID.NO:9表示的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起的倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)至第1個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域(SEQ.ID.NO:12)，但不總限于此。在上述方法中，步驟1)所述的報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛富颍豢傁抻诖?。為建立?xì)胞系和選擇顯示高轉(zhuǎn)錄活性的ZNF312b啟動(dòng)子區(qū)域，將啟動(dòng)子的不同片段插入編碼熒光素酶報(bào)告基因的載體，然后用該載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系。接下來(lái)考察熒光素酶活性。結(jié)果，ZNF312b啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性最高的區(qū)域?yàn)閺霓D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)至第1個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域(SEQ.ID.NO:12)。而且，持續(xù)表達(dá)載體的細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄活性高于瞬時(shí)表達(dá)載體的細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄活性。21本發(fā)明還提供一種胃癌抑制劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟-1)制備含有報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，所述報(bào)告基因可操作地連接到ZNF312b啟動(dòng)子及其片段上，所述ZNF312b啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:9表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)通過用插入步驟l)所述的基因構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)制備轉(zhuǎn)化體；3)通過用樣品組合物或樣品化合物處理步驟2)的轉(zhuǎn)化體來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)組，以及不用任何物質(zhì)處理來(lái)準(zhǔn)備對(duì)照組；4)測(cè)量步驟3)所述的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的報(bào)告基因的表達(dá)水平；以及5)與對(duì)照組相比較，選擇步驟4)所述的實(shí)驗(yàn)組中顯著降低所述基因表達(dá)水平的樣品組合物或樣品化合物。在上述方法中，步驟1)所述的片段優(yōu)選含有從SEQ.ID.NO:9表示的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)至第1個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域(SEQ.ID.NO:12)，但不總限于此。在上述方法中，步驟1)所述的報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛富?，但不總限于此。為篩選抑制ZNF312b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的化合物，本發(fā)明者將ZNF312b啟動(dòng)子及其具有從起始位點(diǎn)起倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)至第1個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域(SEQ.ID.NO:12)的片段插入編碼熒光素酶報(bào)告基因的載體中，顯示了持續(xù)的轉(zhuǎn)錄活性，然后用載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系。用不同化合物處理細(xì)胞系，測(cè)量那些化合物對(duì)熒光素酶報(bào)告子活性的抑制作用。結(jié)果，實(shí)驗(yàn)所用的那些化合物中的大約50%抑制了熒光素酶報(bào)告子活性的至少40%，并且那些候選抑制劑中的大約60%顯示了低于10%的非常低的細(xì)胞毒性(參見表1和表2)。因此，可通過檢驗(yàn)ZNF312b啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性篩選抑制ZNF312b表達(dá)的化合物。本發(fā)明還提供一種胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)制備含有報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，所述報(bào)告基因可操作地連接到K-ras啟動(dòng)子及其片段上，所述K-ras啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)通過用插入步驟l)所述的基因構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)制備轉(zhuǎn)化體，所述動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列構(gòu)成的ZNF312b蛋白或其片段；3)通過用樣品組合物或樣品化合物處理步驟2)所述的轉(zhuǎn)化體來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)組，以及不用任何物質(zhì)處理來(lái)準(zhǔn)備對(duì)照組；4)測(cè)量步驟3)所述的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的報(bào)告基因的表達(dá)水平；以及5)與對(duì)照組相比較，選擇步驟4)所述的實(shí)驗(yàn)組中顯著提高所述基因表達(dá)水平的樣品組合物或樣品化合物。在上述方法中，步驟1)所述的K-ras啟動(dòng)子片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:19表示的核苷酸序列，但不總限于此。在上述方法中，步驟1)所述的報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛富?，但不總限于此。在上述方法中，ZNF312b片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的SEQ.ID.NO:20表示的羧基端區(qū)域，但不總限于此。在上述方法中，步驟2)的ZNF312b的片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的SEQ.ID.NO:19表示的羧基端區(qū)域，但不總限于此。本發(fā)明還提供一種胃癌抑制劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)制備含有報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，所述報(bào)告基因可操作地連接到K-ras啟動(dòng)子及其片段上，所述K-ras啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)通過用插入步驟l)所述的基因構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)制備轉(zhuǎn)化體，所述動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列構(gòu)成的ZNF312b蛋白或其片段；3)通過用樣品組合物或樣品化合物處理步驟2)所述的轉(zhuǎn)化體來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)組，以及不用任何物質(zhì)處理來(lái)準(zhǔn)備對(duì)照組；4)測(cè)量步驟3)所述的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的報(bào)告基因的表達(dá)水平；以及5)與對(duì)照組相比較，選擇步驟4)所述的實(shí)驗(yàn)組中顯著降低所述基因表達(dá)水平的樣品組合物或樣品化合物。在上述方法中，步驟1)所述的K-ras啟動(dòng)子片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:19表示的核苷酸序列，但不總限于此。在上述方法中，步驟1)所述的報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛富?，但不總限于此。在上述方法中，ZNF312b片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的SEQ.ID.NO:20表示的羧基端區(qū)域，但不總限于此。為解釋ZNF312b蛋白或其片段對(duì)K-ras表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，本發(fā)明者將K-ras啟動(dòng)子插入到編碼熒光素酶報(bào)告基因的載體中，然后用該載體轉(zhuǎn)染表達(dá)ZNF312b蛋白或其片段的胃癌細(xì)胞系，接下來(lái)測(cè)量熒光素酶活性。結(jié)果，K-ras啟動(dòng)子被ZNF312b蛋白或其片段的表達(dá)激活。為確定影響K-ras啟動(dòng)子活性的ZNF312b蛋白或其片段的活性區(qū)域，本發(fā)明者將K-ras啟動(dòng)子的不同片段插入編碼熒光素酶報(bào)告基因的載體中，然后用該載體轉(zhuǎn)染表達(dá)ZNF312b蛋白或其片段的胃癌細(xì)胞系，接下來(lái)測(cè)量熒光素酶活性。對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果，影響K-ras啟動(dòng)子活性的ZNF312b蛋白或其片段的活性區(qū)域被確定為SEQ.ID.NO:16表示的具有57個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域。因此，可通過分析ZNF312b蛋白或其片段的活性區(qū)域來(lái)篩選胃癌誘導(dǎo)劑或抑制劑，確切地說是通過測(cè)量K-ras啟動(dòng)子的SEQ.ID.NO:19表示的具有57個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)篩選胃癌誘導(dǎo)劑或抑制劑。本發(fā)明還提供一種胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)用ZNF312b蛋白或其片段以及樣品組合物或樣品化合物處理含有K-ras啟動(dòng)子或其片段的寡聚核苷酸，所述ZNF312b蛋白含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列，所述K-ras啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)對(duì)步驟1)所述的實(shí)驗(yàn)組和未處理的對(duì)照組之間ZNF312b蛋白或其片段與K-ras啟動(dòng)子或其片段的結(jié)合水平進(jìn)行測(cè)量和比較；以及3)與對(duì)照組相比較，選擇所述實(shí)驗(yàn)組中顯著提高所述結(jié)合水平的樣品組合物或樣品化合物。在上述方法中，步驟l)的K-ras啟動(dòng)子片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:16表示的核苷酸序列，但不總限于此。在上述方法中，ZNF312b片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的SEQ.ID.NO:20表示的羧基端區(qū)域，但不總限于此。在上述方法中，優(yōu)選通過選自于由二維電泳法、蛋白芯片法、ELISA法所構(gòu)成的組的方法以及使用標(biāo)記物蛋白特異性抗體的方法進(jìn)行步驟2)的測(cè)量，但不總限于此。本發(fā)明還提供一種胃癌抑制劑的篩選方法，所述包括以下步驟1)用ZNF312b蛋白或其片段以及樣品組合物或樣品化合物處理含有K-ras啟動(dòng)子或其片段的寡聚核苷酸，所述ZNF312b蛋白含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列，所述K-ras啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)對(duì)步驟1)所述的實(shí)驗(yàn)組和未處理的對(duì)照組之間ZNF312b蛋白或其片段與K-ras啟動(dòng)子或其片段的結(jié)合水平進(jìn)行測(cè)量和比較；禾口3)與對(duì)照組相比較，選擇所述實(shí)驗(yàn)組中顯著降低所述結(jié)合水平的樣品組合物或樣品化合物。在上述方法中，步驟1)的ZNF312b片段優(yōu)選含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的SEQ.ID.NO:20表示的羧基端區(qū)域，但不總限于此。在上述方法中，優(yōu)選通過選自于由二維電泳法、蛋白芯片法、ELISA法所構(gòu)成的組的方法以及使用標(biāo)記物蛋白特異性抗體的方法進(jìn)行步驟2)的測(cè)量，但不總限于此。為確定ZNF312b蛋白或其片段在K-ras啟動(dòng)子上作用的活性區(qū)域，本發(fā)明者利用DNA結(jié)合區(qū)域分析試劑盒進(jìn)行了考察。結(jié)果，證實(shí)ZNF312b蛋白及其片段結(jié)合于K-ras啟動(dòng)子的SEQ.ID.NO:19表示的具有57個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域。因此，可通過分析ZNF312b蛋白或其片段的活性區(qū)域來(lái)篩選胃癌誘導(dǎo)劑或抑制劑，確切地說，通過測(cè)量ZNF312b蛋白或其片段與K-ras啟動(dòng)子的SEQ.ID.NO:19表示的具有57個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域的結(jié)合水平來(lái)篩選胃癌誘導(dǎo)劑或抑制劑。本發(fā)明還提供一種用于診斷和篩查胃癌的動(dòng)物模型，其中通過對(duì)除人類以外的動(dòng)物胚胎注射含有SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段的載體來(lái)構(gòu)建動(dòng)物模型。可通過將本發(fā)明的ZNF312b基因或其片段引入哺乳動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物如小鼠等)來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此時(shí)，優(yōu)選在8細(xì)胞胚胎之前的階段注射該基因。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可有效用于致癌基因、該基因的抑制劑和抗癌劑的篩選。本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防和治療胃癌的組合物，所述組合物含有通過上述方法篩選的胃癌抑制劑作為活性成分。本文的抗癌劑優(yōu)選含有與mRNA全長(zhǎng)或部分序列互補(bǔ)的序列以及反義基因，但不總限于此，所述mRNA由SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段轉(zhuǎn)錄得到，所述反義基因通過與該mRNA結(jié)合來(lái)抑制ZNF312b基因或其片段的表達(dá)。有研究認(rèn)為，反義基因與mRNA結(jié)合從而引入DNA序列以治療由ZNF312b基因表達(dá)引起的胃癌，所述的DNA序列含有能抑制核糖體翻譯的序列。本文的胃癌抑制劑優(yōu)選含有與mRNA全長(zhǎng)或部分序列互補(bǔ)的序列以及siRNA,但不總限于此，所述mRNA由ZNF312b基因或其片段轉(zhuǎn)錄得至lj,所述siRNA通過被Dicer蛋白識(shí)別來(lái)抑制ZNF312b基因或其片段的表達(dá)。所述siRNA被轉(zhuǎn)染為具有21-30個(gè)核苷酸的RNA片段，然后被Dicer識(shí)別，導(dǎo)致基因的mRNA降解，暗示了基因表達(dá)受到抑制。除了在胃癌抑制劑中所選擇的活性成分外，本發(fā)明用于預(yù)防和治療胃癌的組合物還可包括一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，例如鹽水、無(wú)菌水、林格氏液(Ringer's溶液)、緩沖鹽水、右旋葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂質(zhì)體和含有一種或多種上述組分的混合物。如果需要，還可加入通常的添加劑(例如抗氧化劑和緩沖液)。通過與稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤(rùn)滑劑混合，可配制不同形式的本發(fā)明組合物，包括注射用的水溶液劑、懸浮劑和乳劑；丸劑；膠囊劑；顆粒劑或片劑。耙器官特異性抗體或其他配體可與所述載體中的一種混合從而被運(yùn)送到靶器官。所述的組合物還可通過賓州伊士頓的Mack出版公司(MackPublishingCompany,EastonPA)出版的Remington'sPharmaceuticalScience(最新版)中所示的方法根據(jù)組分制備成合適的形式。本發(fā)明還提供一種治療胃癌的方法，該方法包括將藥學(xué)上有效劑量的用于預(yù)防和治療胃癌的組合物給予受試者的步驟。本發(fā)明還提供一種預(yù)防胃癌的方法，該方法包括將藥學(xué)上有效劑量的用于預(yù)防和治療胃癌的組合物給予受試者的步驟?？山?jīng)口或胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、皮下、腹膜或局部注射)給予本發(fā)明的組合物。可根據(jù)體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法、排泄物和疾病的嚴(yán)重程度確定該組合物的有效劑量。劑量為每天0.1100mg/kg，優(yōu)選為每天0.5-10mg/kg，給藥頻率為每天一次或優(yōu)選為每天幾次。在使用本發(fā)明組合物的治療方法中，利用常規(guī)方法將組合物給予受試者以實(shí)現(xiàn)siRNA或反義基因的基因治療，從而抑制致癌基因的表達(dá)。例如，根據(jù)J.S.Kim等人的方法(J.S.Kim等人，JCW^ra//^ie/eaw,53,175-182(1998))，通過靜電作用使反義寡聚脫氧核苷酸(ODN)與聚L-賴氨酸衍生物混合，并將該混合物通過靜脈內(nèi)注射給予受試者。本發(fā)明用于診斷和治療胃癌的新標(biāo)記物ZNF312b在胃癌患者體內(nèi)得到過表達(dá)。胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖和腫瘤形成能力被所述基因的過表達(dá)激活。同時(shí)，基因的低表達(dá)抑制了細(xì)胞增殖和腫瘤形成能力。因此，ZNF312b可有效用于胃癌診斷、胃癌動(dòng)物模型的構(gòu)建、胃癌的預(yù)防和治療以及胃癌特異性抗癌劑的研發(fā)。27參考附圖可更好地理解本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的應(yīng)用，其中圖1和圖2是顯示使用從胃癌患者體內(nèi)提取的總RNA、用ZNF312b基因進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR的結(jié)果圖。圖3和圖4是顯示用載體shZNF312b轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞系SNU668-shZNF312b內(nèi)ZNF312b基因表達(dá)的圖(圖4)，所述載體shZNF312b使用ZNF312bsiRNA(圖3)和所述siRNA的si-ZNF312b-l序列進(jìn)行構(gòu)建。圖5-圖8是顯示隨ZNF312b基因的細(xì)胞增殖的圖。圖5是顯示向其引入si-ZNF312b-l寡聚體后，胃癌細(xì)胞系SNU668的細(xì)胞增殖的圖。圖6是顯示SNU668-shZNF312b的細(xì)胞增殖的圖，ZNF312b的表達(dá)在所述細(xì)胞系中受到抑制。圖7和圖8是顯示SNU638-ZNF312b和SNU668-ZNF312b的細(xì)胞增殖的圖，所述細(xì)胞系使ZNF312b過表達(dá)。進(jìn)行顯著性試驗(yàn)以證實(shí)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。*PS0.05:95%的可靠性；**PS0.05:99%的可靠性;P^0.01:99.9%的可靠性。圖9-圖11是顯示利用ZNF312b基因的細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。通過PI對(duì)DNA染色，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。圖9和圖IO是顯示向其引入si-ZNF312b-l后，胃癌細(xì)胞系SNU668的細(xì)胞周期圖。在這些圖中，通過流式細(xì)胞術(shù)考察細(xì)胞周期，并將分析后的細(xì)胞周期計(jì)算成細(xì)胞增殖率(G2+M+S的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)x100)，如下面的曲線所示。圖ll是顯示過表達(dá)ZNF312b的細(xì)胞系SNU638-ZNF312b和SNU668-ZNF312b細(xì)胞周期的圖。圖12-圖15是顯示群落形成試驗(yàn)結(jié)果的圖，以檢驗(yàn)ZNF312b基因的腫瘤形成能力。圖12和圖13是顯示ZNF312b抑制的細(xì)胞系SNU668-shZNF312b群落形成的圖，圖14和圖15是顯示過表達(dá)ZNF312b的細(xì)胞系SNU638-ZNF312b和SNU668-ZNF312b群落形成的圖。圖16和圖17是顯示將過表達(dá)ZNF312b的細(xì)胞系SNU668-ZNF312b移植到裸鼠中而進(jìn)行的腫瘤形成試驗(yàn)的結(jié)果圖。圖18-圖20是顯示ZNF312b結(jié)構(gòu)域分析及其細(xì)胞內(nèi)定位的結(jié)果圖，用于確定腫瘤相關(guān)的ZNF312b活性區(qū)域。圖18是顯示ZNF312b蛋白缺失突變的示意圖，圖19是顯示每種蛋白免疫印跡結(jié)果的圖，在通過核的分級(jí)分離(nuclearfractionation)分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核后進(jìn)行，以考察每種ZNF312b片段轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中的情況。圖20是顯示由核的分級(jí)分離獲得的ZNF312b在細(xì)胞內(nèi)定位的圖，其通過免疫染色來(lái)確定。圖21-圖23是顯示通過全長(zhǎng)的ZNF312b和含有ZNF312b羧基端區(qū)域的片段的過表達(dá)，對(duì)細(xì)胞增殖和腫瘤形成能力的活化的圖。圖21是顯示利用CCK-8試劑測(cè)量的細(xì)胞增殖的圖，所述細(xì)胞為對(duì)照組(pHA)、過表達(dá)全長(zhǎng)ZNF312b(FL)的細(xì)胞、過表達(dá)含有氨基端的ZNF312b片段(Nl)的細(xì)胞和過表達(dá)含有羧基端的ZNF312b片段(Cl)的細(xì)胞。圖22是顯示以與圖21所述方式相同的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖，使用了為持續(xù)表達(dá)DNA而建立的細(xì)胞系。圖23是顯示使用圖8b的細(xì)胞系進(jìn)行群落形成試驗(yàn)的結(jié)果圖，其中使用軟瓊脂測(cè)量群落形成效率。圖24-圖25是顯示考察ZNF312b腫瘤生成相關(guān)的機(jī)制實(shí)驗(yàn)的圖，證實(shí)了ZNF312b調(diào)節(jié)K-ras的轉(zhuǎn)錄活性，暗示了ZNF312b激活RAS-ERK-途徑從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。圖24是顯示免疫印跡結(jié)果的圖。具體而言，由于ZNF312bsiRNA的作用使ZNF312b的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)降低，然后通過免疫印跡測(cè)量RAS蛋白的水平和RAS-ERK途徑的激活。圖25是顯示暫時(shí)增加ZNF312b或含有C末端的ZNF312b片段是否會(huì)提高RAS蛋白水平和ERK途徑活化水平的圖。圖26是顯示插入不同ZNF312b啟動(dòng)子區(qū)域的pGL3b-ZNF312b的載體的圖。圖27是顯示用pGL3b-ZNF312b載體轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞系中熒光素酶報(bào)告基因活性的圖。圖28是顯示插入ZNF312b啟動(dòng)子的第1個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)之間區(qū)域的pGL4.14-ZNF312b-0.85的載體的圖。圖29是顯示用pGL4.14-ZNF312b-0.85載體轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞系中熒光素酶報(bào)告基因活性的圖。圖30是顯示含有K-ras啟動(dòng)子的不同報(bào)告子載體的圖。圖31是顯示通過ZNF312b基因和含有該基因羧基端區(qū)域的片段的表達(dá)對(duì)K-ras報(bào)告子進(jìn)行激活的圖。圖32是顯示對(duì)被ZNF312b基因和含有該基因羧基端區(qū)域的片段激活的K-ras啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行確定的圖。圖33是顯示K-ras啟動(dòng)子預(yù)期的ZNF結(jié)合區(qū)域與ZNF312b蛋白直接作用，從而證實(shí)ZNF312b確實(shí)與K-ras啟動(dòng)子倒數(shù)第650個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第500個(gè)堿基對(duì)之間預(yù)期的ZNF結(jié)合區(qū)域作用的圖。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例用于說明本發(fā)明實(shí)際的和本文優(yōu)選的實(shí)施方式。但是可以理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)公開的內(nèi)容可在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)作出修改和改進(jìn)。實(shí)施例l:腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)和總RNA提取<1-1>腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)本發(fā)明者培養(yǎng)了SNU-638和SNU-668,所述細(xì)胞系于1982年從韓國(guó)胃癌患者中建立，從韓國(guó)細(xì)胞系庫(kù)分裝。細(xì)胞系保存在補(bǔ)充有10%FBS、100mg/ml鏈霉素和100IU/ml氨芐青霉素的RPMI-1640(Hyclone，美國(guó))中。<1-2>總RNA的提取使用RNeasy總RNA試劑盒(QiagenInc.,德國(guó))由胃癌患者組織中提取總RNA。使用DNA酶(Promega，美國(guó))去除DNA污染物。利用酚-氯仿法純化所述的總RNA。實(shí)施例2:逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR本發(fā)明者使用寡聚體dT引物，用實(shí)施例<1-2>中獲得的1pg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶PCR。將產(chǎn)生的cDNA稀釋到1/20，并將2pl稀釋的cDNA用作模板進(jìn)行PCR，所述PCR使用ZNF312b引物[正向5'隱CGAAGTGTGTGGAAAGGT隱3'(SEQ.ID.NO:3)，反向5'-AATACACGCGGGCTACAAAC-3'(SEQ.ID.NO:4)]。PCR按如下步驟進(jìn)行94。C下45秒、58。C下45秒和72。C下45秒(35個(gè)循環(huán))，接下來(lái)最終延伸7分鐘。將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后用EtBr染色。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行UV照射，然后用圖像分析儀分析。通過圖像分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量。以B2M為對(duì)照，對(duì)樣品之間的差異進(jìn)行校正。圖2顯示了ZNF312b在胃癌患者組織中的表達(dá)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行了定量并顯示在圖1中。如圖l所示，ZNF312b在胃癌組織中得到顯著的過表達(dá)(圖1和圖2)。實(shí)施例3:ZNF312b表達(dá)載體或抑制載體的構(gòu)建〈3-l〉ZNF312b表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明者將ZNF312b基因克隆到pcDNA載體中。首先，以總cDNA為模板、使用含有《戶"I和SamM限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的ZNF312b引物進(jìn)行PCR。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并用《p"I和^am別酶切，將其插入pcDNA載體以構(gòu)建pcDNA-ZNF312b表達(dá)載體?！?-2〉ZNF312b抑制載體為構(gòu)建表達(dá)ZNF312bshRNA的載體，將含有ZNF312bshRNA序列的si-ZNF312b陽(yáng)l寡聚體[5'-GCACTCTCTGCATCTCAAC-3'(SEQ.ID,NO:5)]插入pSilencer4.1-CMVneo中(Ambion，美國(guó))。結(jié)果，構(gòu)建了pSilent-ZNF312b載體。實(shí)施例4:轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞系的建立<4-1>過表達(dá)ZNF312b的胃癌細(xì)胞系的建立通過用實(shí)施例<3-1〉構(gòu)建的pcDNA-ZNF312b載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SNU-638和SNU-668，建立ZNF312b過表達(dá)的細(xì)胞系SNU638-ZNF312b和SNU668-ZNF312b。首先，為建立ZNF312b過表達(dá)細(xì)胞系，利用Fugene-6(Roche，德國(guó))，分別用pcDNA-ZNF312b轉(zhuǎn)染SNU-638和SNU-668細(xì)胞。為了只選擇表達(dá)該基因的那些細(xì)胞，將600pg/ml選擇標(biāo)記物G418加入培養(yǎng)液中。對(duì)群落進(jìn)行分離以獲得含有單克隆體的細(xì)胞系。每三天更換一次含有G418的培養(yǎng)基。將在培養(yǎng)基中形成的群落分離，細(xì)胞數(shù)有所增加，其中一些群落用于提取RNA或蛋白以考察基因表達(dá)，其余冷凍儲(chǔ)存。<4-2>抑制ZNF312b的胃癌細(xì)胞系的建立通過用實(shí)施例<3-2>構(gòu)建的載體pSilent-ZNF312b轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SNU-638來(lái)建立ZNF312b基因抑制(knockdown)的細(xì)胞系SNU668-shZNF312b。首先，為建立ZNF312b基因抑制的細(xì)胞系，利用Fugene-6(Roche，德國(guó))，使用pSilent-ZNF312b轉(zhuǎn)染SNU-668細(xì)胞。為了只選擇表達(dá)該基因的那些細(xì)胞，將600ng/ml選擇標(biāo)記物G418加入培養(yǎng)液中。對(duì)群落進(jìn)行分離以獲得含有單克隆體的細(xì)胞系。每三天更換一次含有G418的培養(yǎng)基。將在培養(yǎng)基中形成的群落分離，細(xì)胞數(shù)有所增加，其中一些群落用于提取RNA或蛋白以考察基因表達(dá)，其余冷凍儲(chǔ)存。對(duì)證實(shí)能夠抑制所述基因的細(xì)胞系進(jìn)行大量培養(yǎng)，冷凍儲(chǔ)存或用于檢驗(yàn)基因功能。實(shí)施例5:免疫印跡本發(fā)明者進(jìn)行免疫印跡，以評(píng)價(jià)實(shí)施例4構(gòu)建的載體的蛋白表達(dá)。首先，將裂解緩沖液A[20mMHEPES(pH7.5)、150mMNaCl、lmMEDTA、2mMEGTA、1%TritonX-100、10%甘油、蛋白酶混合物I、II(Sigma，美國(guó))]加入細(xì)胞中，在4。C下靜止20分鐘。將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到新試管中，然后在4。C下以15,000rpm離心IO分鐘從而獲得蛋白。在加入5倍樣品緩沖液后，將細(xì)胞裂解物在95。C下加熱IO分鐘，得到凝膠載樣(gelloadingsample),對(duì)其進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳。使用轉(zhuǎn)移試劑盒(Bio-Rad，美國(guó))將利用上述電泳按照分子量分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)。接下來(lái)，在4°C下將每種抗體[用于檢測(cè)ZNF312b的HA抗體和用于檢測(cè)對(duì)照微管蛋白的微管蛋白抗體]處理到硝酸纖維素膜上保持12小時(shí)。用TBST緩沖液(0.2%Tween20)洗滌該膜，然后用二抗處理1小時(shí)。用TBST洗滌該膜并用HRP檢測(cè)試劑盒(ABfrontier,韓國(guó))顯色。實(shí)施例6:細(xì)胞增殖試驗(yàn)<6-1>抑制ZNF312b基因表達(dá)的細(xì)胞增殖為考察抑制ZNF312b基因表達(dá)后胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖能力，構(gòu)建包括ZNF312b核苷酸序列(SEQ.ID.NO:1)的19個(gè)核苷酸的3種siRNA[si-ZNF312b-l:5'-GCACTCTCTGCATCTCAAC-3'(SEQ.ID.NO:6)、si-ZNF312b-2:5'-GTGTGTGGAAAGGTCTTTA國(guó)3'(SEQ.ID.NO:7)、和si-ZNF312b墨3:5'-GCAGTTCAAGTGCAATATC-3'(SEQ.ID.NO:328)]，用于考察ZNF312b基因表達(dá)的抑制。結(jié)果，如圖3所示，si-ZNF312b-l顯示出抑制活性最高，因此將其用于瞬時(shí)抑制ZNF312b表達(dá)的實(shí)驗(yàn)(圖3)。為誘發(fā)所述基因的持續(xù)抑制，從實(shí)施例<3-2>制備的SNU668-shZNF312b細(xì)胞系中提取總RNA并測(cè)量表達(dá)水平。結(jié)果，ZNF312b基因表達(dá)受到抑制，因而將其用于ZNF312b基因表達(dá)的持續(xù)抑制實(shí)驗(yàn)。將CCK-8試劑(Dqjindo，日本)用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。具體而言，該方法通過測(cè)量向親水性甲臘的轉(zhuǎn)化來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖，所述轉(zhuǎn)化利用四唑鹽通過細(xì)胞內(nèi)脫氫酶催化進(jìn)行。圖5顯示通過瞬時(shí)抑制ZNF312b基因的表達(dá)使細(xì)胞增殖受到抑制。曲線中的圖顯示了通過RT-PCR得到證實(shí)的ZNF312b的抑制水平。圖6顯示與對(duì)照相比較，ZNF312b基因表達(dá)受到持續(xù)抑制的細(xì)胞其細(xì)胞增殖減少(圖5和圖6)。<6-2>ZNF312b基因表達(dá)的過表達(dá)的細(xì)胞增殖本發(fā)明者考察了所述基因過表達(dá)后胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖能力，為此，使用了實(shí)施例4建立的細(xì)胞系SNU638-ZNF312b和SNU668-ZNF312b。將CCK-8試劑用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。具體而言，將細(xì)胞(5xl0S個(gè))接種于96孔板，然后培養(yǎng)24小時(shí)。每24小時(shí)測(cè)量一次細(xì)胞增殖。圖7顯示了SNU638-ZNF312b的細(xì)胞增殖，圖8顯示了SNU668-ZNF312b的細(xì)胞增殖。曲線中的圖顯示了檢驗(yàn)HA-ZNF312b過表達(dá)的免疫印跡結(jié)果，暗示了該基因的過表達(dá)使細(xì)胞增殖增加(圖7和圖8)。實(shí)施例7:細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)本發(fā)明者通過測(cè)量細(xì)胞周期考察了ZNF312b基因?qū)?xì)胞增殖的參與。利用PI染色法進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。具體而言，將每種細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，然后4。C下在70。/。乙醇中固定至少12小時(shí)，接下來(lái)用PI染色。通過FACS測(cè)量細(xì)胞周期。結(jié)果，如圖9-圖11所示，當(dāng)ZNF312b表達(dá)受到抑制時(shí)，Gl期延長(zhǎng)但G2+M縮短，表示細(xì)胞增殖減少。相反，當(dāng)ZNF312b過表達(dá)時(shí)，Gl期縮短，但G2+M延長(zhǎng)，表示細(xì)胞增殖增加。通過測(cè)量細(xì)胞周期來(lái)檢驗(yàn)細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了通過抑制或過表達(dá)ZNF312b基因可誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞增殖，表明了該基因參與細(xì)胞增殖(圖9、10和11)。實(shí)施例8:群落形成分析為考察ZNF312b基因是否具有致癌基因的功能，進(jìn)行群落形成分析。首先，將2xRPMI-1640(45。C)與等量的1.2%瓊脂糖溶液混合以制備0.6%1><培養(yǎng)基，將所述培養(yǎng)基放入6孔板中，然后固化l小時(shí)。將5000個(gè)細(xì)胞稀釋于0.5ml與等量的0.6%瓊脂糖混合的培養(yǎng)基中，然后置于0.6%瓊脂糖板上。在室溫下將該板固化1小時(shí)后，向其加入lx培養(yǎng)基，然后在37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在此期間觀察群落形成。在顯微鏡(100倍)下觀察群落并使所計(jì)的數(shù)進(jìn)行圖式化(schematized)。圖12和圖13顯示了ZNF312b基因抑制的細(xì)胞系SNU668-shZNF312b的群落形成，圖14和圖15顯示了ZNF312b過表達(dá)的細(xì)胞系SNU638-ZNF312b和SNU668-ZNF312b的群落形成。結(jié)果，如圖12-圖15所示，當(dāng)ZNF312b表達(dá)受到抑制時(shí)，群落形成受到抑制。同時(shí)，當(dāng)ZNF312b基因被過表達(dá)時(shí)，群落形成增加(圖12、13、14和15)。實(shí)施例9:致瘤性試驗(yàn)為證實(shí)ZNF312b基因是否具有致癌基因的功能，使用裸鼠進(jìn)行致瘤性試驗(yàn)。分別將實(shí)施例<4-1>建立的細(xì)胞系SNU668-ZNF312b和對(duì)照細(xì)胞系SNU668-Neo移植到裸鼠中，然后觀察致瘤性。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，將每種細(xì)胞系以5xl()S個(gè)細(xì)胞/小鼠的密度接種到3只裸鼠中。接種4周后，測(cè)量每個(gè)腫瘤的尺寸并進(jìn)行數(shù)字化用于比較。通過公式寬x高/2對(duì)腫瘤尺寸(mm3)進(jìn)行數(shù)字化。結(jié)果，如圖16和圖17所示，移植有ZNF312b過表達(dá)細(xì)胞系SNU668-ZNF312b的裸鼠的腫瘤尺寸顯著增加(圖16和圖17)。實(shí)施例10:ZNF312b缺失片段過表達(dá)載體的構(gòu)建及其胃癌細(xì)胞系的建立〈10-l〉ZNF312b缺失片段過表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明者以pcDNA-ZNF312b載體為模板對(duì)圖7a的片段進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pcDNA載體中。具體而言，以pcDNA-ZNF312b為模板、使用含有X/wI和5amM限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的ZNF312b引物進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物純化并用插入到pcDNA載體中的和5"mM進(jìn)行酶切。結(jié)果，構(gòu)建了pcDNA-ZNF312bN(Nl)、pcDNA-ZNF312bN2(N2)禾卩pcDNA-ZNF312bCl(Cl)和pcDNA-ZNF312bC2(C2)表達(dá)載體(圖18)。<10-2>過表達(dá)ZNF312b缺失片段的胃癌細(xì)胞系的建立本發(fā)明者用實(shí)施例<10-1>構(gòu)建的載體pcDNA-ZNF312-Nl和pcDNA-ZNF312b-Cl轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SNU-638，以建立過表達(dá)全長(zhǎng)ZNF312b和ZNF312b片段的細(xì)胞系SNU638-ZNF312b(SNU638-FL)、SNU638-ZNF312bN1(SNU638-N1)和SNU638-ZNF312bC1(SNU638-C1)。首先，為建立ZNF312b過表達(dá)細(xì)胞系，利用Fugene-6(Roche,德國(guó))，分別使用FL、Nl和Cl轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SNU-638。為了只選擇表達(dá)該基因的那些細(xì)胞，將600pg/ml選擇標(biāo)記物G418加入培養(yǎng)液中。對(duì)群落進(jìn)行分離以獲得含有單克隆體的細(xì)胞系。每三天更換一次含有G418的培養(yǎng)基。將在培養(yǎng)基中形成的群落分離，細(xì)胞數(shù)有所增加，其中一些群落用于提取RNA或蛋白以考察基因表達(dá)，其余冷凍儲(chǔ)存。實(shí)施例ll:ZNF312b缺失片段的細(xì)胞內(nèi)定位<11-1>核的分級(jí)分離通過核的分級(jí)分離，本發(fā)明者分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，以對(duì)ZNF312b進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位，并確定將基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中所需的蛋白區(qū)域。本發(fā)明者通過免疫印跡證實(shí)ZNF312b在細(xì)胞核中，并且通過羧基端(SEQ.ID.NO:20)的介導(dǎo)向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。首先，用ZNF312b及其片段轉(zhuǎn)染SNU-638細(xì)胞。表達(dá)所述基因和片段后，將細(xì)胞回收并用冷PBS洗滌兩次。將細(xì)胞懸浮于lmlDNB[10mMHEPES(pH7.5)、2mMMgCl2、10mMKCl、0.5mMEDTA、0.5mMEGTA、蛋白酶抑制劑混合物I、II(Sigma，美國(guó))禾P0.2%NP-40]中，然后用22號(hào)針式注射器使所述細(xì)胞破裂。將細(xì)胞勻槳在500xg下離心IO分鐘以分離細(xì)胞核。細(xì)胞核在裂解緩沖液A[20mMHEPES(pH7.5)、150mMNaCl、lmMEDTA、2mMEGTA、1%TritonX-100、10%甘油、蛋白酶混合物I、II(Sigma，美國(guó))]中裂解。在與上述相同的條件下進(jìn)行電泳，從而獲得核蛋白。結(jié)果，如圖19所示，只有含羧基端區(qū)域的ZNF312b片段被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中(圖19)。35<11-2>通過免疫染色定位將表達(dá)ZNF312b及其片段的細(xì)胞放到蓋玻片上。24小時(shí)后，用4%多聚甲醛處理20分鐘將細(xì)胞固定在玻璃上。用PBS洗滌固定后的細(xì)胞3次并用1%TritonX-100處理IO分鐘，然后用1%BSA在室溫下封閉1小時(shí)。在4°C下，使細(xì)胞與單克隆抗-HA反應(yīng)12小時(shí)。用PBS洗滌3次后，將結(jié)合有Alexa-568的抗小鼠二抗處理到細(xì)胞中，然后用PBS洗滌3次。與DPAI反應(yīng)30分鐘后，用PBS洗滌細(xì)胞3次。然后，使用熒光顯微鏡(Olympus，日本)對(duì)聚集在玻片上的細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)果，如圖20所示，與上述的核的分級(jí)分離結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)僅僅是含有羧基端區(qū)域的ZNF312b片段在細(xì)胞核內(nèi)，而發(fā)現(xiàn)含有氨基端區(qū)域的ZNF312b片段在細(xì)胞質(zhì)中(圖20)。實(shí)施例12:過表達(dá)ZNF312b缺失片段的胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖和群落形成的考察〈12-l〉過表達(dá)ZNF312b缺失片段的胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖本發(fā)明者使用實(shí)施例<10-2>建立的ZNF312b表達(dá)細(xì)胞系SNU638-FL和ZNF312b缺失片段表達(dá)細(xì)胞系SNU638-N1和SNU638-C1考察胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖。與上述實(shí)施例<6-1>相同，將CCK-8試劑用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，并用全長(zhǎng)ZNF312b及其含有羧基端區(qū)域(SEQ.ID.NO:20)的片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，如圖21所示，該基因的瞬時(shí)過表達(dá)使那些胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖增加。如圖22所示，該基因的持續(xù)表達(dá)也使胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖增加(圖21和圖22)。<12-2>過表達(dá)ZNF312b缺失片段的胃癌細(xì)胞系的群落形成分析以與實(shí)施例8所述的方式相同，本發(fā)明者對(duì)過表達(dá)全長(zhǎng)ZNF312b及其含有該基因羧基端區(qū)域的片段的胃癌細(xì)胞系SNU638-FL、SNU638-N1和SNU638-C1進(jìn)行群落形成分析。結(jié)果，如圖8c所示，當(dāng)全長(zhǎng)ZNF312b及其含有該基因羧基端區(qū)域的片段得到過表達(dá)時(shí)，群落的形成增加。因此，證實(shí)ZNF312b蛋白的羧基端區(qū)域?qū)ξ赴┑闹铝鲂云痍P(guān)鍵作用(圖23)。實(shí)施例13.*由ZNF312b及其片段的過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)系統(tǒng)<13-1〉由ZNF312b抑制引起的細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)途徑為考察參與胃癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖的信號(hào)途徑系統(tǒng)是否受ZNF312b基因抑制的影響，本發(fā)明者通過用si-ZNF312b-l轉(zhuǎn)染細(xì)胞系來(lái)抑制ZNF312b在胃癌細(xì)胞系的表達(dá)。然后，以與實(shí)施例5相同的方式進(jìn)行免疫印跡。此時(shí)，使用諸如磷酸化-MEK1/2(phospho-MEK1/2)、MEK1/2、磷酸化-ERK1/2、ERK1/2、K-ras和微管蛋白等抗體。然后，使用上述抗體考察ZNF312b蛋白是否可調(diào)節(jié)K-ms表達(dá)，如果可以調(diào)節(jié)的話，則考察調(diào)節(jié)后的K-ras是否會(huì)影響細(xì)胞增殖信號(hào)系統(tǒng)ERK途徑。結(jié)果，如圖24所示，ZNF312b的抑制導(dǎo)致K-ras的表達(dá)降低，暗示MEK1/2和ERK1/2ERK的磷酸化導(dǎo)致ERK途徑失活(圖24)。<13-2>由ZNF312b及其片段的過表達(dá)引起的細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)途徑為考察參與胃癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是否受ZNF312b基因及其片段過表達(dá)的影響，用每個(gè)片段轉(zhuǎn)染SNU-638細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞裂解。以與實(shí)施例<13-1>所述相同的方式確認(rèn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。結(jié)果，如圖25所示，全長(zhǎng)ZNF312b及其含有該基因羧基端區(qū)域的片段的過表達(dá)使K-ras的表達(dá)增加，暗示了ERK途徑被激活。因此，證實(shí)了ZNF312b調(diào)節(jié)了細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)途徑，并且羧基端區(qū)域?qū)υ撜{(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用，暗示了ZNF312b的羧基端區(qū)域參與了胃癌的發(fā)展(devdopment)(圖25)。實(shí)施例14:ZNF312b啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建<14-1>含有ZNF312b啟動(dòng)子區(qū)域的。GL3b-ZNF312b載體的構(gòu)建為了將ZNF312b啟動(dòng)子區(qū)域引入能編碼熒光素酶報(bào)告基因的載體中，本發(fā)明者使用含有條el和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物通過PCR對(duì)ZNF312b啟動(dòng)子(SEQ.ID.NO:9)及其片段(SEQ,ID.NO:10)進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物插入pGL3基本載體(Promega，美國(guó))。首先，以SNU638cDNA為模板進(jìn)行PCR，并將用和Sg/II酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物純化。然后將該片段插入pGL3基本載體以構(gòu)建含有ZNF312b啟動(dòng)子區(qū)域的6種不同的pGL3b-ZNF312b載體(圖26)。<14-2>具有瞬時(shí)ZNF312b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞系的建立為確定ZNF312b啟動(dòng)子(SEQ.ID.NO:9)及其片段(SEQ.ID.NO:10-SEQ.ID.NO:14)的活性區(qū)域，本發(fā)明者用實(shí)施例<14-1>構(gòu)建的載體pGL3-ZNF312b轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SNU-638,以建立具有瞬時(shí)ZNF312b啟動(dòng)子活性的細(xì)胞系。首先，使用6plLipofectamine2000(Invitrogen，美國(guó))，用2ngpGL3-ZNF312b載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SNU-638(2xl()5個(gè)細(xì)胞)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)。實(shí)施例15:ZNF312b啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性本發(fā)明者考察ZNF312b啟動(dòng)子在實(shí)施例〈14-2〉建立的細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄活性。使用熒光素酶分析系統(tǒng)試劑盒(Promega，美國(guó))，通過測(cè)量熒光素酶報(bào)告子的活性來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性的測(cè)量。首先，將建立的細(xì)胞系以2.5><105個(gè)細(xì)胞/孔的密度放入6孔板中，然后培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞分布均勻。加入300nl細(xì)胞裂解緩沖液使細(xì)胞裂解。將細(xì)胞裂解物在15,000rpm下離心10分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml新試管中。根據(jù)Bradford方法，通過以0、1、2、3、4和5pgBSA為對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)蛋白進(jìn)行定量。用2^細(xì)胞提取物測(cè)量OD595。對(duì)蛋白進(jìn)行定量后，測(cè)量熒光素酶活性。將20^細(xì)胞提取物與50pl熒光素酶報(bào)告子底物混合，然后使用發(fā)光儀(MolecularDevices,加拿大)測(cè)量熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。根據(jù)表達(dá)水平，熒光素酶活性計(jì)算如下。具有ZNF312b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞系的相對(duì)發(fā)光單位(RLU)/蛋白量熒光素酶活性=——一-——------~——一~^~~—------^----------一一一,,—..一一一一對(duì)照細(xì)胞系的相對(duì)發(fā)光單位/蛋白量結(jié)果，如圖27所示，與對(duì)照相比較，含有ZNF312b啟動(dòng)子的第1個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域(SEQ.ID.NO:12)的克隆體顯示出最高的熒光素酶活性(圖27)。實(shí)施例16:含有ZNF312b啟動(dòng)子的第1個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)之間區(qū)域的載體的構(gòu)建及其胃癌細(xì)胞系的建立<16-1>含有ZNF312b啟動(dòng)子片段的pGL4-ZNF312b載體的構(gòu)建為建立具有持續(xù)的啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞系，本發(fā)明者使用包括7Wzel和if/m/ni限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物，將ZNF312b啟動(dòng)子的第1個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域(SEQ.ID.NO:12)插入pGL4.14載體(Promega，美國(guó))。結(jié)果，構(gòu)建了pGL4.14-ZNF312b-0.85載體(圖28)。<16-2>具有持續(xù)的ZNF312b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞系的建立為建立具有持續(xù)的ZNF312b啟動(dòng)子的第1個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)之間區(qū)域(SEQ.ID.NO:12)的轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞系，本發(fā)明者利用Lipofectamine2000(Invitrogen，美國(guó))，用實(shí)施例<16-1>構(gòu)建的pGL4.14-ZNF312b-0.85轉(zhuǎn)染SNU-638。培養(yǎng)48小時(shí)后，將100ug/ml選擇標(biāo)記物潮霉素加入培養(yǎng)液，來(lái)選擇僅僅表達(dá)該基因的細(xì)胞。為獲得含有單克隆體的細(xì)胞系，每3天更換一次含有潮霉素的培養(yǎng)基，然后分離群落。建立的細(xì)胞系用于選擇有效的化合物。實(shí)施例17:ZNF312b啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性以與實(shí)施例10所述的相同方式，測(cè)量ZNF312b啟動(dòng)子的第1個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域(SEQ.ID.NO:12)在實(shí)施例<16-2>建立的細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄活性。此時(shí)，使用含有pGL4.14-ZNF312b-0.85的、具有持續(xù)的ZNF312b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞系。結(jié)果，如圖29所示，與對(duì)照相比較，熒光素酶活性大約增加了15倍(圖29)。實(shí)施例18:抑制ZNF312b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的化合物的選擇將實(shí)施例<16-2〉建立的pGL4.14-ZNF312b-0.85細(xì)胞系以^104個(gè)細(xì)胞/孔的密度放入96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)，以使細(xì)胞分布成均勻的層。將樣品化合物處理到100^d培養(yǎng)基中，使其終濃度為10uM。此時(shí)，將含有溶解化合物的DMSO的終濃度調(diào)整到0.3%。將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)，使其在25pl細(xì)胞裂解緩沖液中裂解。將25pl細(xì)胞裂解物與20pl熒光素酶報(bào)告子底物混合。然后，以與實(shí)施例IO所述的相同方式測(cè)量熒光素酶報(bào)告子活性。選擇有效的化合物。對(duì)于對(duì)照組，僅用沒有樣品化合物的DMSO處理細(xì)胞系。當(dāng)用每種化合物處理時(shí)，報(bào)告子活性的抑制水平有所顯示。通過以下公式計(jì)算熒光素酶報(bào)告子的抑制活性。用化合物處理的細(xì)胞系的RLU/蛋白量熒光素酶報(bào)告子的抑制活性=100%-—---■--------------------------——"00%僅用DMSO處理的細(xì)胞系的RLU/蛋白量結(jié)果，如表l所示，54種化合物中的27種(50%)抑制了熒光素酶報(bào)告子活性的至少40%(表1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實(shí)施例19:抑制轉(zhuǎn)錄活性的化合物的細(xì)胞毒性CCK-8試劑(Dojindo，日本)用于測(cè)量預(yù)期能抑制ZNF312b轉(zhuǎn)錄活性的所選化合物的細(xì)胞毒性。該方法使用四唑鹽，確切地說，該方法通過測(cè)量在內(nèi)源脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為親水性甲臘，使細(xì)胞毒性的考察變得方便。具體而言，該方法使用四唑鹽，通過測(cè)量細(xì)胞內(nèi)脫氫酶催化其轉(zhuǎn)化為親水性甲脂來(lái)確定細(xì)胞毒性。首先，將實(shí)施例<16-2>建立的pGL4.14-ZNF312b-0.85細(xì)胞系以1.5xl()4個(gè)細(xì)胞/孔的密度放入96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞分布成均勻的層。將樣品化合物處理到100pl培養(yǎng)基中，使其終濃度為10uM。此時(shí)，將含有溶解化合物的DMSO的終濃度調(diào)整為0.3%。將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)后，將10^CCK-8試劑處理到其中，然后測(cè)量細(xì)胞毒性。結(jié)果，如表2所示，16種化合物顯示出細(xì)胞毒性低于10%(表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實(shí)施例20:含有K-ras啟動(dòng)子區(qū)域的PGL3b-K-ras載體的構(gòu)建及其胃癌細(xì)胞系的建立<20-1>含有K-ras啟動(dòng)子區(qū)域的PGL3b-K-ras載體的構(gòu)建為揭示K-ras過表達(dá)和ZNF312b調(diào)節(jié)的機(jī)制，本發(fā)明者制備了K-ras啟動(dòng)子報(bào)告子。如圖30所示，構(gòu)建K-ras啟動(dòng)子片段Ras2.0(-2000~+1堿基對(duì)；SEQ.ID.NO:15)、Ras1.0(-1000+1堿基對(duì)；SEQ.ID.NO:16)、Ras0.65(-650~+1堿基對(duì)；SEQ.ID.NO:17)和Ras0.5(-500~+1堿基對(duì)；SEQ.ID.NO:18)(圖30)。使用熒光素酶基因作為報(bào)告子系統(tǒng)以證實(shí)啟動(dòng)子是否起作用。以人類基因組DNA為模板，通過PCR對(duì)每種啟動(dòng)子片段寡聚體進(jìn)行擴(kuò)增，使用滿el/5g/11將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGL3基本載體中。<20-2>具有瞬時(shí)K-ras啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的胃癌細(xì)胞系的建立本發(fā)明者用實(shí)施例<20-1>的K-ras報(bào)告子(Ras2.0)和實(shí)施例<10-1>的ZNF312(FL)及其片段(N1、N2、C1和C2)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SNU-638,然后培養(yǎng)48小時(shí)。實(shí)施例21:K-ras啟動(dòng)子報(bào)告子活性<21-1>通過ZNF312b及其片段作用的K-ras啟動(dòng)子的活性為測(cè)量實(shí)施例<20-2>建立的細(xì)胞系中K-ras啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，本發(fā)明者檢驗(yàn)了熒光素酶活性。根據(jù)試劑盒的方案，利用熒光素酶分析試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)。具體而言，將實(shí)施例<20-2〉培養(yǎng)的細(xì)胞裂解，然后在4。C下以15000rpm離心10分鐘以分離蛋白。對(duì)蛋白進(jìn)行定量，然后用發(fā)光儀(MolecularDevice,加拿大)測(cè)量熒光素酶活性。此時(shí)，使用20pl裂解物和50pi熒光素酶底物。結(jié)果，如圖31所示，ZNF312b表達(dá)誘導(dǎo)了K-ras啟動(dòng)子的激活，并相應(yīng)地增加了熒光素酶活性。含有羧基端區(qū)域的ZNF312b片段得到了同樣的結(jié)果，即，增加了熒光素酶活性(圖31)。<21-2>ZNF312b的K-ras啟動(dòng)子反式作用因子(trans-element)用每個(gè)K-ras報(bào)告子(Ras2.0、Ras1.0、Ras0.65和Ras0.5)和ZNF312b-Cl—起轉(zhuǎn)染SNU-638細(xì)胞。48小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)胞裂解，然后進(jìn)行熒光素酶分析和免疫印跡以測(cè)量ZNF312b-Cl的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以確保結(jié)果可靠。結(jié)果，如圖32所示，ZNF312b-Cl的表達(dá)增加了K-ras報(bào)告子熒光素酶活性。然而，Ras0.5減少了該活性。因此，證實(shí)ZNF312b的K-ras啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)為從倒數(shù)第650個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第500個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域(圖32)。<21-3>證實(shí)K-ras啟動(dòng)子與其在ZNF312b上的結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合本發(fā)明者使用TransAMflexiDNA結(jié)合分析試劑盒(Activemotif，美國(guó))證實(shí)ZNF312b的K-ras活性位點(diǎn)是否為倒數(shù)第650個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第500個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域。首先，用ZNF312b片段轉(zhuǎn)染SNU638細(xì)胞，48小時(shí)后，進(jìn)行核的分級(jí)分離以獲得核蛋白。核蛋白與HA抗體反應(yīng)1小時(shí)。同時(shí)，從K-ras啟動(dòng)子的倒數(shù)第650個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第500個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域選擇57個(gè)堿基對(duì)區(qū)域[5'-tgtttatttacatgcagtcaatgatagtaaatggatgcgcgccagtataggccgacc-3'(SEQ.ID.NO:19)]，該區(qū)域推測(cè)為鋅指蛋白(ZNF)結(jié)合位點(diǎn)，并將其合成到結(jié)合有5'生物素的寡聚體上。該寡聚體在TansAMFlexiDNA結(jié)合分析試劑盒中，與96孔板中的鏈霉親和素反應(yīng)。向其加入抗體和核蛋白混合物，然后反應(yīng)1小時(shí)。用洗滌緩沖液洗滌反應(yīng)物兩次，向其加入二抗，然后反應(yīng)l小時(shí)。將底物加入，然后觀察顏色反應(yīng)。培養(yǎng)1小時(shí)后，用ELISA酶標(biāo)儀(microplatereader)測(cè)量顏色反應(yīng)。通過免疫印跡對(duì)核蛋白中的ZNF312b蛋白進(jìn)行定量。結(jié)果，如圖33所示，證實(shí)推測(cè)的與寡聚體DNA結(jié)合的ZNF結(jié)合位點(diǎn)在ZNF312b和含有羧基端區(qū)域的ZNF312b片段內(nèi)，暗示了ZNF312b結(jié)合到了K-ras啟動(dòng)子的ZNF結(jié)合位點(diǎn)上，該結(jié)合位點(diǎn)為倒數(shù)第650個(gè)堿基對(duì)至倒數(shù)第500個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域(圖33)。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明用于診斷和治療胃癌的新標(biāo)記物ZNF312b在胃癌患者體內(nèi)得到過表達(dá)。胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖和腫瘤形成能力通過所述基因的過表達(dá)而被激活。同時(shí)，細(xì)胞增殖和腫瘤形成能力受到基因抑制的抑制。因此，ZNF312b可有效用于診斷胃癌、構(gòu)建胃癌動(dòng)物模型、預(yù)防和治療胃癌以及研發(fā)胃癌特異性抗癌劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，上述說明書中公開的概念和具體實(shí)施方式可容易地用作修改或設(shè)計(jì)其它可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明相同目的的實(shí)施方式的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解的是，這些等同的實(shí)施方式?jīng)]有偏離所附權(quán)利要求書所表明的本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求1.一種胃癌診斷試劑盒，包括具有SEQ.ID.NO1表示的ZNF312b基因或其片段的核苷酸序列的寡聚核苷酸或能擴(kuò)增所述寡聚核苷酸的引物組。2.如權(quán)利要求1所述的胃癌診斷試劑盒，其中，所述片段特征性地含有SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列的羧基端區(qū)域(SEQ.ID.NO:20)。3.—種胃癌診斷試劑盒，包括特異性結(jié)合到SEQ.ID.NO:2表示的ZNF312b蛋白或其片段的抗體。4.如權(quán)利要求3所述的胃癌診斷試劑盒，其中，通過測(cè)量ZNF312b蛋白或其片段的水平，將所述水平與正常對(duì)照組的水平進(jìn)行比較來(lái)診斷所述胃癌。5.—種診斷胃癌的DNA微陣列，其中，所述微陣列整合有具有SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段的核苷酸序列的寡聚核苷酸或其互補(bǔ)的寡聚核苷酸。6.—種胃癌標(biāo)記物的篩選方法，所述方法包括使特異性結(jié)合到SEQ.ID.NO:2表示的ZNF312b蛋白或其片段的抗體與生物樣品接觸的步驟，所述生物樣品選自于由胃組織、胃細(xì)胞、尿、血、血清和血漿構(gòu)成的組。7.—種胃癌診斷方法，包括以下步驟1)測(cè)量受試者樣品中SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段的表達(dá)水平；以及2)與對(duì)照組相比較，選擇顯示所述標(biāo)記基因表達(dá)水平較高的受試者。8.如權(quán)利要求7所述的胃癌診斷方法，其中，步驟l)所述的樣品選自于由胃組織、胃細(xì)胞、尿、血、血清和血漿構(gòu)成的組。9.一種胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)將樣品組合物或樣品化合物處理到來(lái)源于胃的細(xì)胞中(實(shí)驗(yàn)組);2)對(duì)步驟1)所述的實(shí)驗(yàn)組和未處理的對(duì)照組之間的ZNF312b標(biāo)記基因或其片段的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)量和比較，所述的ZNF312b標(biāo)記基因用SEQ.ID.NO:1來(lái)表示；以及3)與所述對(duì)照組相比較，選擇所述實(shí)驗(yàn)組中顯著提高所述標(biāo)記基因表達(dá)水平的所述樣品組合物或樣品化合物。10.如權(quán)利要求9所述的胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，其中，步驟2)所述的片段特征性地含有SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列的羧基端區(qū)域(SEQ.ID.NO:20)。11.一種胃癌抑制劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)將樣品組合物或樣品化合物處理到來(lái)源于胃的細(xì)胞中(實(shí)驗(yàn)組)；2)對(duì)步驟1)所述的實(shí)驗(yàn)組和未處理的對(duì)照組之間的ZNF312b標(biāo)記基因或其片段的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)量和比較，所述的ZNF312b標(biāo)記基因用SEQ.ID.NO:1來(lái)表示；以及3)與所述對(duì)照組相比較，選擇所述實(shí)驗(yàn)組中顯著降低所述標(biāo)記基因表達(dá)水平的所述樣品組合物或樣品化合物。12.如權(quán)利要求9所述的胃癌抑制劑的篩選方法，其中，步驟2)所述的片段特征性地含有SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列的羧基端區(qū)域(SEQ.ID.NO:20)。13.—種胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)制備含有報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，所述報(bào)告基因可操作地連接到ZNF312b啟動(dòng)子及其片段上，所述ZNF312b啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:9表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)通過用插入步驟l)所述的基因構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)制備轉(zhuǎn)化體；3)通過用樣品組合物或樣品化合物處理步驟2)所述的轉(zhuǎn)化體來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)組，以及不用任何物質(zhì)處理來(lái)準(zhǔn)備對(duì)照組；4)測(cè)量步驟3)所述的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的所述報(bào)告基因的表達(dá)水平；以及5)與所述對(duì)照組相比較，選擇步驟4)所述的實(shí)驗(yàn)組中顯著提高所述基因表達(dá)水平的所述樣品組合物或樣品化合物。14.如權(quán)利要求13所述的胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，其中，步驟l)所述的片段含有從SEQ.ID.NO:9表示的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起的倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)至第1個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域(SEQ.ID.NO:12)。15.如權(quán)利要求13所述的胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，其中，步驟l)所述的報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛富颉?6.—種胃癌抑制劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)制備含有報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，所述報(bào)告基因可操作地連接到ZNF312b啟動(dòng)子及其片段上，所述ZNF312b啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:9表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)通過用插入步驟1)所述的基因構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)制備轉(zhuǎn)化體；3)通過用樣品組合物或樣品化合物處理步驟2)所述的轉(zhuǎn)化體來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)組，以及不用任何物質(zhì)處理來(lái)準(zhǔn)備對(duì)照組；4)測(cè)量步驟3)所述的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的所述報(bào)告基因的表達(dá)水平；以及5)與所述對(duì)照組相比較，選擇步驟4)所述的實(shí)驗(yàn)組中顯著降低所述基因表達(dá)水平的所述樣品組合物或樣品化合物。17.如權(quán)利要求16所述的胃癌抑制劑的篩選方法，其中，步驟l)所述的片段含有從SEQ.ID.NO:9表示的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起的倒數(shù)第850個(gè)堿基對(duì)至第l個(gè)堿基對(duì)之間的區(qū)域(SEQ.ID.NO:12)。18.如權(quán)利要求13所述的胃癌抑制劑的篩選方法，其中，步驟l)所述的報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛富颉?9.一種胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)制備含有報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，所述報(bào)告基因可操作地連接到K-ras啟動(dòng)子及其片段上，所述K-ras啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)通過用插入步驟1)所述的基因構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)制備轉(zhuǎn)化體，所述動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列構(gòu)成的ZNF312b蛋白或其片段；3)通過用樣品組合物或樣品化合物處理步驟2)所述的轉(zhuǎn)化體來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)組，以及不用任何物質(zhì)處理來(lái)準(zhǔn)備對(duì)照組；4)測(cè)量步驟3)所述的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中所述報(bào)告基因的表達(dá)水平；以及5)與所述對(duì)照組相比較，選擇步驟4)所述的實(shí)驗(yàn)組中顯著提高所述基因表達(dá)水平的所述樣品組合物或樣品化合物。20.如權(quán)利要求19所述的胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，其中，步驟l)所述的片段含有SEQ.ID.NO:19表示的核苷酸序列。21.—種胃癌抑制劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)制備含有報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，所述報(bào)告基因可操作地連接到K-ras啟動(dòng)子及其片段上，所述K-ras啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)通過用插入步驟l)所述的基因構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)制備轉(zhuǎn)化體，所述動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列構(gòu)成的ZNF312b蛋白或其片段；3)通過用樣品組合物或樣品化合物處理步驟2)所述的轉(zhuǎn)化體來(lái)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)組，以及不用任何物質(zhì)處理來(lái)準(zhǔn)備對(duì)照組；4)測(cè)量步驟3)所述的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中所述報(bào)告基因的表達(dá)水平；以及5)與所述對(duì)照組相比較，選擇步驟4)所述的實(shí)驗(yàn)組中顯著降低所述基因表達(dá)水平的所述樣品組合物或樣品化合物。22.如權(quán)利要求19所述的胃癌抑制劑的篩選方法，其中，步驟l)所述的片段含有SEQ.ID.NO:19表示的核苷酸序列。23.—種胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)用ZNF312b蛋白或其片段以及樣品組合物或樣品化合物處理含有K-ras啟動(dòng)子或其片段的寡聚核苷酸，所述ZNF312b蛋白含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列，所述K-ras啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)對(duì)步驟1)的實(shí)驗(yàn)組和未處理的對(duì)照組之間的ZNF312b蛋白或其片段與K-ras后動(dòng)子或其片段的結(jié)合水平進(jìn)行測(cè)量和比較；以及3)與所述對(duì)照組相比較，選擇所述實(shí)驗(yàn)組中顯著提高結(jié)合水平的所述樣品組合物或樣品化合物。24.如權(quán)利要求23所述的胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，其中，步驟l)所述的K-ras啟動(dòng)子片段含有SEQ.ID.NO:19表示的核苷酸序列。25.如權(quán)利要求23所述的胃癌誘導(dǎo)劑的篩選方法，其中，步驟l)所述的ZNF312b蛋白片段含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的羧基端區(qū)域(SEQ.ID.NO:20)。26.—種胃癌抑制劑的篩選方法，所述方法包括以下步驟1)用ZNF312b蛋白或其片段以及樣品組合物或樣品化合物處理含有K-ras啟動(dòng)子或其片段的寡聚核苷酸，所述ZNF312b蛋白含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列，所述K-ras啟動(dòng)子由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列構(gòu)成；2)對(duì)步驟1)所述的實(shí)驗(yàn)組和未處理的對(duì)照組之間的ZNF312b蛋白或其片段與K-ras啟動(dòng)子或其片段的結(jié)合水平進(jìn)行測(cè)量和比較；以及3)與所述對(duì)照組相比較，選擇所述實(shí)驗(yàn)組中顯著降低所述結(jié)合水平的所述樣品組合物或樣品化合物。27.如權(quán)利要求26所述的胃癌抑制劑的篩選方法，其中，步驟l)所述的K-ras啟動(dòng)子片段含有SEQ.ID.NO:19表示的核苷酸序列。28.如權(quán)利要求26所述的胃癌抑制劑的篩選方法，其中，步驟l)所述的ZNF312b蛋白片段含有SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的羧基端區(qū)域(SEQ.ID.NO:20)。29.—種用于診斷和篩查胃癌的動(dòng)物，其中，通過用含有SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段的載體轉(zhuǎn)染除人類以外的動(dòng)物來(lái)誘導(dǎo)胃癌。30.—種具有與mRNA全長(zhǎng)或部分序列互補(bǔ)的序列的反義基因，所述mRNA由SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段轉(zhuǎn)錄得到，所述反義基因通過結(jié)合到所述mRNA來(lái)抑制所述ZNF312b基因或其片段的表達(dá)。31.—種含有與mRNA全長(zhǎng)或部分序列互補(bǔ)的序列的siRNA序列，所述mRNA由SEQ.ID.NO:1表示的ZNF312b基因或其片段轉(zhuǎn)錄得到，所述siRNA序列通過被Dicer蛋白識(shí)別來(lái)抑制ZNF312b基因或其片段的表達(dá)。32.—種用于預(yù)防和治療胃癌的組合物，所述組合物含有作為活性成分的胃癌抑制劑，所述的胃癌抑制劑通過權(quán)利要求11、權(quán)利要求16、權(quán)利要求21或權(quán)利要求26的方法篩選得到。33.—種治療胃癌的方法，所述方法包括將藥學(xué)上有效劑量的權(quán)利要求32所述組合物給予胃癌受試者的步驟。34.—種預(yù)防胃癌的方法，所述方法包括將藥學(xué)上有效劑量的權(quán)利要求32所述的組合物給予受試者的步驟。35.—種將權(quán)利要求32所述的胃癌抑制劑用于制備預(yù)防和治療胃癌的組合物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種含有ZNF312b基因及其片段的診斷標(biāo)記物、一種胃癌診斷方法和一種使用所述診斷標(biāo)記物篩選胃癌誘導(dǎo)劑或抑制劑的方法。ZNF312b基因表達(dá)在胃癌中特異性增加。所述基因的過表達(dá)或低表達(dá)影響胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖和腫瘤形成的激活或抑制，同時(shí)也影響細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，進(jìn)而最終誘導(dǎo)胃癌。因此，ZNF312b標(biāo)記基因可有效用于診斷胃癌、構(gòu)建胃癌動(dòng)物模型、預(yù)防和治療胃癌以及研發(fā)胃癌特異性抗癌劑。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101688207SQ200880021102公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年8月6日優(yōu)先權(quán)日2007年8月6日發(fā)明者全馀珍,吳浪琇,宋寅成,河佳喜,鄭昭泳,金南順,金哲熙,金晛宅,金楨珉申請(qǐng)人:韓國(guó)生命工學(xué)研究院