一種多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型提供了一種多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，該微流控芯片由玻璃基片、第一膜片、第二膜片和多孔膜組成；第一膜片上有細(xì)胞三維培養(yǎng)單元；第二膜片上有梯度濃度生成器和細(xì)胞二維培養(yǎng)通道；在第一膜片和第二膜片之間有一層多孔膜；細(xì)胞三維培養(yǎng)單元的個(gè)數(shù)與細(xì)胞二維培養(yǎng)通道相同；細(xì)胞二維培養(yǎng)通道分別位于細(xì)胞三維培養(yǎng)單元上方。該微流控芯片類似一個(gè)處于流動(dòng)狀態(tài)的多濃度藥物透過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障作用于管周組織的仿生模型，可同時(shí)考察多濃度藥物對(duì)三維培養(yǎng)病變細(xì)胞的作用和對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性。該產(chǎn)品具有操作簡(jiǎn)單、低消耗、高通量、仿生性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)多種濃度藥物作用于三維培養(yǎng)及二維培養(yǎng)的細(xì)胞的微流控芯片。

【背景技術(shù)】
[0002]目前，檢測(cè)藥物敏感性的常用體外模型為96孔板，將細(xì)胞培養(yǎng)于孔板中，然后于每個(gè)孔中分別加入不同種類或不同濃度的藥物，觀察藥物對(duì)細(xì)胞的影響。但是這樣的方法有很多缺點(diǎn):1)操作繁瑣，工作量大，例如孔板中的一個(gè)孔只能代表一種濃度，為遵循生物學(xué)研究的三個(gè)平行復(fù)孔實(shí)驗(yàn)原則，同一種濃度需要3個(gè)孔，如果需要檢測(cè)6種藥物濃度，就需要18個(gè)孔，即18次進(jìn)樣過(guò)程；2)孔板的底面積大，試劑消耗多；3)藥物在孔板中是呈靜止?fàn)顟B(tài)，不能現(xiàn)體內(nèi)藥物在血管中隨血液流動(dòng)的狀態(tài)；4)藥物直接作用于細(xì)胞，而在體內(nèi)藥物需要透過(guò)血管內(nèi)皮屏障后才能作用于細(xì)胞。因此，96孔板方法在考察藥物的作用和毒性方面有很大的局限性。
[0003]微流控芯片技術(shù)起始于20世紀(jì)90年代，是近年來(lái)發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)，也是目前已被公認(rèn)的系統(tǒng)生物學(xué)研究的主要技術(shù)平臺(tái)之一。它是指把常規(guī)生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本功能如樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)的一種技術(shù)，具有耗量少、通量高、集成化、仿生性強(qiáng)等特性。微流控芯片制作材料具有透氣、透光、透明等特征，可清楚地觀察到細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，方便數(shù)據(jù)采集。
[0004]本實(shí)用新型構(gòu)建了一種多維多種藥物檢測(cè)微流控芯片，在該芯片上可以生成多種濃度的藥物，進(jìn)而不同濃度的藥物透過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞屏障作用于三維培養(yǎng)的細(xì)胞，該模型可用來(lái)模擬體內(nèi)血液內(nèi)的藥物透過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞屏障作用于病變組織的過(guò)程，即可以考察藥物對(duì)病變組織的作用效果，同時(shí)也可以考察藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的毒性。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0005]本實(shí)用新型的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單方便的微流控芯片，實(shí)現(xiàn)多種類、多濃度藥物同時(shí)作用于二維及三維培養(yǎng)的細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)藥效和藥物毒性。
[0006]一種多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，該微流控芯片由玻璃基片1、第一膜片2、第二膜片3和多孔膜4組成，其特征在于:第一膜片2上有η個(gè)細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5 ;細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5由細(xì)胞進(jìn)樣口 6、三個(gè)相連的細(xì)胞三維培養(yǎng)池7和細(xì)胞出樣口 8構(gòu)成；第二膜片3上有可以生成η種濃度的梯度濃度生成器9和η條細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10 ;細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10的一端與梯度濃度生成器9相連，另一端與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)樣口 11相連；η條細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10分別位于η個(gè)細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5的上方；多孔膜4位于細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10和細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5中間；以上η為大于零的整數(shù)。
[0007]本實(shí)用新型所述的多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:所述梯度濃度生成器9由2個(gè)藥物進(jìn)樣口 9a、2條進(jìn)樣通道9b和藥物混合通道9c組成；其中藥物混合通道9c由多層藥物混合單元構(gòu)成，每層藥物混合單元包括一條橫向通道以及多條與該條橫向通道垂直相連的曲線形藥物混合通道，且每層曲線形藥物混合通道同時(shí)與下一層的橫向通道相連通；第一層藥物混合單元有三條曲線形藥物混合通道，最末一層有η條曲線形藥物混合通道，且每條曲線形藥物混合通道均與一條細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10相連；每條進(jìn)樣通道9b的一端設(shè)有藥物進(jìn)樣口 9a，另一端與藥物混合單元的第一條橫向通道相連。
[0008]本實(shí)用新型所述多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:第一膜片2上各細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5相互獨(dú)立，且平行排列；第二膜片3上的各細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10相互獨(dú)立，且平行排列。
[0009]本實(shí)用新型所述的多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:所述多孔膜4為允許液體和細(xì)胞因子在第一膜片2的細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5和第二膜片3的細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10之間傳送的膜，優(yōu)選為聚碳酸酯膜。
[0010]本實(shí)用新型所述的多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:第一膜片2和第二膜片3的材料為聚二甲基硅氧烷；玻璃基片1、第一膜片2和第二膜片3為不可逆封接。
[0011]采用本實(shí)用新型所述微流控芯片研究多維多濃度藥敏檢測(cè)方法為:分別在第一膜片2的細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5內(nèi)加入第一預(yù)定類型材料，在第二膜片3的通道內(nèi)加入第二預(yù)定類型材料，在第二膜片細(xì)胞二維培養(yǎng)通道內(nèi)多孔膜4表面接種一層第三預(yù)定類型材料，驅(qū)動(dòng)第二預(yù)定類型材料在通道內(nèi)流動(dòng)，然后考察第二預(yù)定類型材料對(duì)第一預(yù)定類型材料和第三預(yù)定類型材料的作用情況。
[0012]所述第一預(yù)定類型材料為細(xì)胞、組織、器官；第二預(yù)定類型材料為培養(yǎng)基、藥物、趨化因子或生長(zhǎng)因子；第三預(yù)定類型材料為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0013]具體研究過(guò)程如下:
[0014]——通過(guò)細(xì)胞進(jìn)樣口 6將第一預(yù)定類型材料和細(xì)胞外基質(zhì)替代物加入第一膜片細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5內(nèi)；
[0015]——通過(guò)藥物進(jìn)樣口 9a將第二預(yù)定類型材料加入第二膜片的通道內(nèi)；
[0016]——通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)樣口 11將第三預(yù)定類型材料加入第二膜片的細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10內(nèi)，靜置12?24小時(shí)，使第三預(yù)定類型材料充分貼附于多孔膜4表面；
[0017]—將注射泵與藥物進(jìn)樣口9a相連接，驅(qū)動(dòng)第二預(yù)定類型材料在通道內(nèi)流動(dòng)。
[0018]本實(shí)用新型所述微流控芯片類似于一個(gè)多濃度藥物透過(guò)血管內(nèi)皮屏障作用于管周三維病變組織的仿生模型，且同時(shí)考察藥物對(duì)病變組織的效果和對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性。本實(shí)用新型解決了傳統(tǒng)模型通量低、消耗大、仿生性差等問(wèn)題，具有操作簡(jiǎn)單、低消耗、高通量、仿生性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1實(shí)施例1所述微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖，其中包括玻璃基片1、第一膜片2、第二膜片3、多孔膜4 ；
[0020]圖2第一膜片2結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021]圖3第二膜片3結(jié)構(gòu)示意圖；
[0022]圖4顯示微流控芯片整體操作過(guò)程；
[0023]圖5顯示接種于多孔膜4表面的血管內(nèi)皮細(xì)胞；
[0024]圖6顯示第二膜片3梯度濃度生成情況；在第二膜片3的藥物進(jìn)樣口 9a兩側(cè)分別同時(shí)用注射泵驅(qū)動(dòng)加入磷酸鹽緩沖液(PBS)和熒光染料羅丹明-123后，熒光染料羅丹明-123通過(guò)梯度濃度生成器9形成六種逐漸增強(qiáng)的濃度的熒光強(qiáng)度情況(圖中由左到右依次為細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10a、10b、10c、1cU 10e、10f)；
[0025]圖7顯示微流控芯片中腫瘤細(xì)胞株(ACC-M)的藥物敏感性試驗(yàn)；在第一膜片2的細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5內(nèi)接種三維基質(zhì)膠包裹的腫瘤細(xì)胞株(ACC-M)，細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10內(nèi)接種血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC，初始濃度為0.Syg/ml的紫杉醇(PTX)經(jīng)過(guò)梯度濃度生成器9形成六種不同的藥物濃度，進(jìn)而作用腫瘤細(xì)胞株(ACC-M)的情況(圖中由左到右依次為細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5a、5b、5c、5d、5e、5f)。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)地描述。
[0027]實(shí)施例1
[0028]本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)及制備的微流控芯片結(jié)構(gòu)如圖1-3所示，該微流控芯片由玻璃基片1、第一膜片2、第二膜片3和多孔膜4組成，其中第一膜片2和第二膜片3的材料為聚二甲基硅氧烷，多孔膜4為聚碳酸酯膜，位于第一膜片2和第二膜片3中間。
[0029]第一膜片2上有六個(gè)相互獨(dú)立的細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5，每個(gè)細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5由細(xì)胞進(jìn)樣口 6、三個(gè)相連的細(xì)胞三維培養(yǎng)池7和細(xì)胞出樣口 8構(gòu)成；第二膜片3上有可以生成6種濃度的梯度濃度生成器9和六條細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10 ;細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10的一端與梯度濃度生成器9相連，另一端與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)樣口 11相連；其中梯度濃度生成器9由兩個(gè)藥物進(jìn)樣口 9a、兩條進(jìn)樣通道9b和藥物混合通道9c組成；六條細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10分別位于六個(gè)細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5的上方。其中藥物混合通道9c由四層藥物混合單元構(gòu)成，每層藥物混合單元包括一條橫向通道以及多條與該條橫向通道垂直相連的曲線形藥物混合通道，且每層曲線形藥物混合通道同時(shí)與下一層的橫向通道相連通；第一層有三條曲線形藥物混合通道，第四層有六條曲線形藥物混合通道；進(jìn)樣通道9b的一端設(shè)有藥物進(jìn)樣口 9a,另一端與藥物混合單元的第一條橫向通道相連。
[0030]所述芯片的制備過(guò)程為:首先，通過(guò)不可逆封接技術(shù)將第一膜片2與玻璃基片I封接；然后，將多孔膜4覆蓋于第一膜片2的細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5上方；最后，將第二膜片3的細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10對(duì)準(zhǔn)第一膜片2上的細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5進(jìn)行不可逆封接。
[0031]如圖4，通過(guò)細(xì)胞進(jìn)樣口 6加入腫瘤細(xì)胞，通過(guò)藥物進(jìn)樣口 9a加入細(xì)胞培養(yǎng)基，37°C>5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至細(xì)胞成球體；通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)樣口 11將血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC接種于多孔膜4的表面。然后將芯片置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，使HUVEC充分貼附(圖5)。
[0032]實(shí)施例2
[0033]采用實(shí)施例1所述芯片進(jìn)行研究:通過(guò)兩側(cè)藥物進(jìn)樣口 9a，利用注射泵分別驅(qū)動(dòng)磷酸鹽緩沖液(PBS)和熒光染料羅丹明-123通過(guò)梯度濃度生成器9，一段時(shí)間后，熒光染料羅丹明-123在六條細(xì)胞二維培養(yǎng)通道10內(nèi)形成整體穩(wěn)定的逐漸增強(qiáng)的六種不同濃度熒光強(qiáng)度的情況見(jiàn)圖6。
[0034]實(shí)施例3
[0035]采用實(shí)施例1所述芯片進(jìn)行研究:通過(guò)細(xì)胞進(jìn)樣口 6在第一膜片2的6個(gè)細(xì)胞三維培養(yǎng)單元5內(nèi)加入三維基質(zhì)膠包裹的腫瘤細(xì)胞株(ACC-M)，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)三天。通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)樣口 11將血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC接種于多孔膜4的表面，將芯片置于37°C>5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，使HUVEC充分貼附。通過(guò)兩側(cè)藥物進(jìn)樣口 9a利用注射泵分別驅(qū)動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)基和紫杉醇(PTX，濃度為0.5 μ g/ml)藥物通過(guò)梯度濃度生成器9，持續(xù)灌流24小時(shí)。去除第二膜片3，用H0echst33342和PI熒光染色，在熒光顯微鏡下拍照，計(jì)算ACC-M細(xì)胞生存情況(圖7)。
[0036]上述實(shí)施例只為說(shuō)明本實(shí)用新型的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本實(shí)用新型的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本實(shí)用新型精神實(shí)質(zhì)范圍所作的等效變化、改型或修飾，都應(yīng)涵蓋在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，該微流控芯片由玻璃基片(I)、第一膜片(2)、第二膜片(3)和多孔膜(4)組成，其特征在于:第一膜片(2)上有η個(gè)細(xì)胞三維培養(yǎng)單元(5);細(xì)胞三維培養(yǎng)單元(5)由細(xì)胞進(jìn)樣口(6)、3個(gè)相連的細(xì)胞三維培養(yǎng)池(7)和細(xì)胞出樣口(8)構(gòu)成；第二膜片(3)上有可以生成η種濃度的梯度濃度生成器(9)和η條細(xì)胞二維培養(yǎng)通道(10);細(xì)胞二維培養(yǎng)通道(10)的一端與梯度濃度生成器(9)相連，另一端與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)樣口(11)相連；η條細(xì)胞二維培養(yǎng)通道(10)分別位于η個(gè)細(xì)胞三維培養(yǎng)單元(5)的上方；多孔膜(4)位于細(xì)胞二維培養(yǎng)通道(10)和細(xì)胞三維培養(yǎng)單元(5)中間；以上η為大于零的整數(shù)。
2.按照權(quán)利要求1所述的多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:所述梯度濃度生成器(9)由2個(gè)藥物進(jìn)樣口(9a)、2條進(jìn)樣通道(9b)和藥物混合通道(9c)組成；其中藥物混合通道(9c)由多層藥物混合單元構(gòu)成，每層藥物混合單元包括一條橫向通道以及多條與該條橫向通道垂直相連的曲線形藥物混合通道，且每層曲線形藥物混合通道同時(shí)與下一層的橫向通道相連通；第一層藥物混合單元有三條曲線形藥物混合通道，最末一層有η條曲線形藥物混合通道，且每條曲線形藥物混合通道均與一條細(xì)胞二維培養(yǎng)通道(10)相連；每條進(jìn)樣通道(％)的一端設(shè)有藥物進(jìn)樣口(9a)，另一端與藥物混合單元的第一條橫向通道相連。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:第一膜片(2)上各細(xì)胞三維培養(yǎng)單元(5)相互獨(dú)立，且平行排列；第二膜片(3)上的細(xì)胞二維培養(yǎng)通道(10)相互獨(dú)立，且平行排列。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:所述多孔膜(4)為允許液體和細(xì)胞因子在第一膜片(2)的細(xì)胞三維培養(yǎng)單元(5)和第二膜片(3)的細(xì)胞二維培養(yǎng)通道(10)之間傳送的膜。
5.按照權(quán)利要求4所述的多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:所述多孔膜為聚碳酸酯膜。
6.按照權(quán)利要求1或2所述的多維多濃度藥敏檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:第一膜片(2)和第二膜片(3)的材料為聚二甲基硅氧烷；玻璃基片(I)、第一膜片(2)和第二膜片(3)為不可逆封接。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK204097450SQ201420262631
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】劉婷姣, 金冬, 林炳承, 羅勇 申請(qǐng)人:大連醫(yī)科大學(xué)